CN104195646A - 基因多态性区域测序文库及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基因多态性区域测序文库及其制备方法,属于分子生物学领域。本发明的基因多态性区域测序文库的制备方法包括以下步骤:(1)根据基因多态性区域特征,设计引物,通过PCR扩增得到包含保守区域和多态性区域的DNA片段;(2)向PCR扩增所得DNA片段中加入核酸外切酶,控制核酸外切酶的浓度与反应时间或者控制核酸外切酶的反应温度与反应时间,水解DNA片段;(3)向步骤(2)所得DNA片段的水解产物中加入单链核酸酶,消化DNA突出单链,得到DNA混合片段。本发明制备基因多态性区域测序文库的方法特异性高、快速,可用于高度多态性区域的测序分型。
Description
技术领域
本发明涉及一种测序文库及其制备方法,尤其涉及基因高多态性区域的测序文库及其制备方法。
背景技术
研究高多态性区域的传统方法有很多种,例如:(1)通过电泳分离不同的生物DNA分子,然后用经标记的特异DNA探针与之进行杂交,通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性的限制性片段长度多态性(RFLP);(2)利用随机引物(一般为8—10bp)通过PCR反应非定点扩增DNA片段,然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段多态性的随机扩增多态性DNA(RAPD);(3)特异引物的PCR标记方法,针对已知序列的DNA区域设计具有特性的核苷酸序列,其可在常规PCR复性温度下进行扩增,通过Genescan技术分析片段长度和克隆性或通过变性聚丙烯酰胺凝胶银染(基因谱型图)法对基因组DNA的特定区域进行多态性分析;(4)DNA芯片技术;(5)荧光定量PCR溶解曲线法;(6)PCR测序等等。上述的各种方法都有其利弊,近年来兴起高通量测序,该方法是有望为高多态性区域检测提供特异、敏感且能大量筛选目标位点的新方法。
高通量测序技术是对传统测序技术的一次革命,一次性可以对几百万到几千万的分子进行序列测定,因此又被称为为下一代测序技术(next generationsequencing)。由于测序成本的大大降低,高通量测序使得对某个物种的转录组甚至基因组得以进行全貌分析,达到前所未有的深度。利用高通量测序技术对高多态性区域进行全面深度的序列分析,便能突破以往只能抽样检测多态性的限制,对样品作全面的分析,为科研带来新的思路和策略。
生物中具有高多态性的核酸序列有很多,以T细胞受体(T cell antigenreceptor,TCR)为例,TCR是机体免疫系统特异识别和捕获特异性抗原异物的关键分子。T细胞抗原受体大多是由α和β两条多肽链组成,经典的克隆选择学说认为:TCR是在胚系的基础上,在胸腺中进行了V、D、J、C基因片段重排而形成多样性的抗原互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3),其中的“CDR3区”又称为超变区,组成了具有多样性的CDR3受体库。CDR3区域是由TRBV末端-TRBD-TRBJ前端基因和连接处核苷酸插入或剪接构成。单个人体TCRβ链本身的多样性及β链与α链组合的多样性,能形成至少1011以上种类的TCR,不同T细胞克隆具有不同序列或不同长度的TCR CDR3基因,从而决定了其特异性,进而反映了T细胞的功能状态。了解不同个体之间的TCR CDR3受体库的多样性,可以进一步研究T细胞的发生、发育过程,进而对评价免疫应答,为研究T细胞和感染、肿瘤、自身免疫病、器官移植等等相关的疾病的诊断和治疗提供基础和手段。
以往利用新一代高通量测序技术检测TCR CDR3的方法,受高通量测序长度的限制,要把待测序的分子控制在200-300bp之间,当今报道的方法主要是通过不同的可变区上设计多重引物进行多重扩增测序,或者在上下游保守区域扩增出TCR片段后进行随机打断,回收片段后测序。前者受扩增不平衡条件的限制,会产生CDR3库检测的偏差;而后者因对片段进行随机打断,耗时较长,回收率较低,需要的起始量较大。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷而提供一种特异性高、快速的制备基因多态性区域测序文库的方法,同时本发明还提供了采用所述方法制备得到的测序文库。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种基因多态性区域测序文库的制备方法,包括以下步骤:
(1)根据基因多态性区域特征,设计一对分别位于多态性区域上游以及下游保守位点的引物,通过PCR扩增得到包含基因保守区域和多态性区域的DNA片段;
(2)向步骤(1)PCR扩增所得DNA片段中加入核酸外切酶,控制核酸外切酶的的浓度与反应时间或者控制核酸外切酶的反应温度与反应时间,水解DNA片段;
(3)向步骤(2)所得DNA片段的水解产物中加入单链核酸酶,孵育,消化DNA突出单链,得到DNA混合片段;
其中,所述步骤(1)的引物中,至多一条引物带有保护DNA不被核酸酶水解的化学修饰。
本发明的多态性区域两端分别与非多态性或多样性较低的相对保守的区域相连接,引物设计在保守的区域上,以便于扩增得到的DNA片段包含基因保守区域和多态性区域。本发明特别适用于在连续多态性区域中获得高度多态性区域;对于其它特征的DNA混合片段,也适用于本方法,并不局限于在连续多态性区域中获得高多态性区域。例如,从现有一定长度的未知序列的DNA混合片段中获得其5’或者3’端的片段用于高通量测序。由于本发明能够定向地获得混合DNA片段中的某个位置的片段,所以本发明比起以往的随机打断等的方法特异性更高。
本发明引物的化学修饰即指引物的部分碱基或全部碱基进行了化学修饰,DNA片段进行本发明所述化学修饰的一边因被保护而不被水解。本发明的核酸外切酶可从脱氧核糖核酸的3’或者5’端开始水解DNA,得到DNA突出单链;对于酶切速率由浓度控制的核酸外切酶,实验中主要控制其浓度与反应时间;酶切速率由温度控制的核酸外切酶,实验中主要控制其反应温度与反应时间。单链核酸酶能消化双链DNA中突出的单链,单链核酸酶的加入量以及加入后的孵育时间根据实际需要进行选择,以充分消化DNA突出单链为标准。
由于控制了核酸外切酶的浓度、温度、时间等因素,本发明得到的DNA混合片段控制在的特定长度(得到特定长度的DNA混合片段即为DNA文库)。DNA片段需控制的长度根据实际测序过程的需要进行限定。例如到目前为止,高通量测序时,Illumina公司的MISEQ平台,插入片段要求在200-300bp之间,Ion Torrent平台需要的插入片段在180-220bp之间;而Roche的454平台能测超过500bp的插入片段。实验过程中,所得到的DNA片段的长度是通过琼脂糖凝胶电泳或者安捷伦芯片分析仪检测得知的。
作为本发明所述基因多态性区域测序文库的制备方法的优选实施方式,所述基因多态性区域测序文库的制备方法包括以下步骤:
(1)根据基因多态性区域特征,设计一对分别位于多态性区域上游以及下游保守位点的引物,通过PCR扩增得到包含基因保守区域和多态性区域的DNA片段;
(2)纯化步骤(1)PCR扩增产物,向纯化产物中加入核酸外切酶及其缓冲体系,控制核酸外切酶的浓度与反应时间或者控制核酸外切酶的反应温度与反应时间,水解DNA片段;
(3)纯化步骤(2)所得DNA片段的水解产物,加入单链核酸酶及其缓冲体系,孵育,消化DNA突出单链;加入反应停止缓冲溶液,纯化,得到DNA混合片段;
其中,所述步骤(1)的引物中,至多一条引物带有保护DNA不被核酸酶水解的化学修饰。
制备基因多态性区域测序文库过程中,加入纯化步骤是为了纯化分离与纯化DNA。优选地,可选择磁珠进行纯化。
作为本发明所述基因多态性区域测序文库的制备方法的优选实施方式,所述基因多态性区域测序文库的制备方法还包括步骤(4):将步骤(3)所得DNA混合片段直接连接测序接头,得到测序文库。可应用包括但不限于Illumina、Roche及ABI等公司的文库制备方法制备高通量测序文库。例如:可应用Illumina公司建库试剂盒:TruSeq DNA LT Sample Prep Kit Support或Roche公司建库试剂盒:Library Prep Kit Rapid library Rgt/Adaptors或Life Tech公司建库试剂盒构建高通量测序文库。这些试剂盒的原理都是将DNA混合片段作为建库试剂盒的样品而直接补平DNA,在片段两端加上测序接头,再根据上机反应需要筛选一定大小的片段,PCR扩增,回收后得到高通量测序文库。
作为本发明所述基因多态性区域测序文库的制备方法的优选实施方式,所述化学修饰为硫代磷酸化修饰、以2'-O-甲基或以2'-O-乙基进行的修饰。作为本发明所述基因多态性区域测序文库的制备方法的更优选实施方式,所述化学修饰为前6个碱基进行了硫代磷酸化修饰。其中,硫代磷酸化指的是单核苷酸之间的磷酸二酯键中的一个氧被硫取代(这种修饰是在连接的时候进行的,而不是在合成后进行的);2'-O-甲基或2'-O-乙基进行的修饰指的是对核糖上的2-羟基进行的修饰。
作为本发明所述基因多态性区域测序文库的制备方法的优选实施方式,所述核酸外切酶为T7外切核酸酶、Lambda外切核酸酶或外切核酸酶Ⅲ;所述单链核酸酶为S1核酸酶或绿豆核酸酶。T7外切核酸酶为5’外切核酸酶,该酶的酶切速率主要由酶的浓度控制;外切核酸酶Ⅲ是3’外切核酸酶,该酶的酶切速率主要由酶的反应温度决定。
作为本发明所述基因多态性区域测序文库的制备方法的优选实施方式,所述多态性区域为T细胞TCR CDR3区域。另外,T细胞TCR CDR3区域测序文库的制备方法中,得到的DNA混合片段的长度可控制为100~500bp。
作为本发明所述基因多态性区域测序文库的制备方法的优选实施方式,T细胞TCR CDR3区域测序文库的制备方法中,所述步骤(1)中的上游引物如序列SEQ ID NO:6所示,下游引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。SEQID NO:7和SEQ ID NO:8中,5,端前6个碱基均进行了硫代磷酸化学修饰。
作为本发明所述基因多态性区域测序文库的制备方法的优选实施方式,T细胞TCR CDR3区域测序文库的制备方法中,步骤(2)中核酸外切酶是浓度为0.06U/μl-0.10U/μl的T7外切核酸酶,反应时间为30~120min;更优选地,步骤(2)中核酸外切酶是浓度为0.08U/μl的T7外切核酸酶,反应时间为40~50min;所述步骤(3)中单链核酸酶为S1核酸酶。S1核酸酶加入量保证充分消化DNA突出单链即可,优选地,加入45U S1核酸酶,孵育时间30min。
同时,本发明还提供了一种采用上述方法制备得到的基因多态性区域测序文库。
本发明的有益效果为:本发明所述基因多态性区域测序文库的制备方法特异性高、快速,适用于基础生物学研究,尤其适用于免疫组学的生物医学研究。采用所述方法得到的DNA片段长度可控,由此方法得到的基因多态性区域测序文库可用于建立检测高多态性区域的新方法。
附图说明
图1为本发明所述基因多态性区域测序文库的制备流程图;
图2为本发明所述外切核酸酶Ⅲ在不同温度下酶切的反应速率图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果,下面将以从人的外周血淋巴细胞中获得TCR的高多态性区域CDR3库为例,结合附图对本发明作进一步说明。
实施例中,所有合成引物均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;除了标明出处的试剂,其余均为国产分析纯试剂。
实施例中,RRI(具体名称为Recombinant RNase Inhibitors)购自Takara公司(货号2313A);T4gene 32protein购于NEB公司,反转录过程中用到的其他试剂来源于invitrogen公司的SuperScriptⅢReverse Transcriptase试剂盒(货号:18080-093);合成TCR的cDNA二链及PCR扩增TCR高多态性区域CDR3过程中采用的试剂盒为Taq DNA Polymerase High Fidelity(货号:11304-011),购自Invitrogen公司。
实施例四中,采用的Agencourt AMpure XP磁珠购自Beckman Coulter公司(货号:A63880)。该实施例中使用的缓冲溶液的成分及pH为:
NEB buffer 4(10×buffer)由500mM乙酸钾、200mM三羟基氨甲烷醋酸、100mM乙酸镁、10mM DTT组成,pH值为7.9;
10×S1buffer由500mM乙酸钠、2.8M氯化钠、45mM硫酸锌组成,PH值为4.5;
S1stop buffer由300mM Tris、50mM EDTA组成;
TE溶液由10mMTris-HCl,1mM EDTA组成,PH值为8.0。
本发明基因多态性区域测序文库的制备流程如图1所示。
实施例一:提取总RNA
提取总RNA的方法包括以下步骤:
步骤1.采用AXIS-SHIELD公司的LymphoprepTM溶液(货号:1114544)从人的外周血中提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell(PBMC)),具体分为以下7步:
(1)采血针收集健康成年人外周静脉血,加入到装有1%肝素溶液的玻璃管中,肝素溶液与全血的体积比为1:20;
(2)向步骤(1)的玻璃管中加入等体积的0.9%NaCl生理盐水溶液,混匀,稀释血液;
(3)在一新的15毫升离心管中,加入3ml的Lymphoprep溶液在底部,然后小心加入6ml稀释的血液在溶液上部,注意不要扰乱液层;
(4)盖上盖子,放入吊篮式离心机中,以800×g的速度离心20min;
(5)离心后,单核白细胞位于两相溶液的中间层,用枪头吸取出来;
(6)吸出200~400μl细胞,加入5倍体积的0.9%NaCl生理盐水溶液稀释,混匀;
(7)以250×g的速度离心10min,去上清,沉淀为所得PBMC。
步骤2.采用Invitrogen公司的Trizol试剂从获得的PBMC中提取总核糖核酸(total RNA),具体分为以下9步:
(1)向5×107~10×107个细胞中加入1mlTrizol后,均匀混合(反复吹打至看不见成团细胞块,整个溶液清亮而不粘稠),室温静置5min;
(2)加入250μl氯仿,震荡均匀,充分乳化(颠倒50次),室温静置10min;
(3)以12,000×g的速度,4℃离心15min;
(4)离心后取上清至新的1.5ml EP管,切勿吸取中间层;
(5)向新EP管中加入与上清等体积的预冷的异丙醇,上下颠倒10次混匀,室温静置10~15min;
(6)于4℃温度下、以12,000×g的速度,离心10min;
(7)去掉上清,尽量去除干净,加入1ml75%乙醇,轻轻上下颠倒(RNA若需长期保存,置于75%乙醇中),用以洗涤RNA,于4℃温度下,在台式制冷小型离心机中,以7500×g的速度离心5min,倒去乙醇,尽量除尽;
(8)室温干燥RNA,待RNA由乳白色变为透明时加入20~30μl RNase-free水,溶解沉淀;
(9)用安捷伦芯片分析仪的RNA Nano6000芯片检测RNA浓度及完整度。依照RNA6000Nano芯片试剂盒(货号:Agilent5067-1511)的提示将样片点进芯片的点样孔中,上机检测。检测的软件给出RIN值≥9.0,认为提取出的RNA完整度符合要求。
实施例二:合成TCR的cDNA二链
合成TCR的cDNA二链包括以下步骤:
步骤1.以总RNA为模板,采用Target Switch方法反转录合成TCR全长cDNA一链(Target Switch方法主要利用只有完整5’序列mRNA才具有的3个碱基的G帽子,让一个具有互补3个G碱基的引物作为模板,与反转录出来的cDNA一链互补配对,让反转录酶继续往下反转录,从而获得在5’端带有特异片段的具有完整5’端的cDNA一链。),具体包括以下3步:
(1)配制以下混合反应液:
混匀反应液(反应液中,RNA的总量为1μg,若1μg的RNA体积小于4μl,则用DEPC水不足至RNA的体积为4μl),于65℃加热5min后,立刻放冰上至少1min;其中,CDS oligo(dT)引物的序列如SEQ ID NO:1所示,具体为:
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’。
(2)配制以下混合反应液:
混匀步骤(2)的反应液,于55℃预热2min后,加入到步骤(1)的体系中,混匀;混合溶液置于PCR仪中,于50℃反应60min。
(3)配制以下混合反应液:
混匀步骤(3)中的反应液,于50℃预热2min,加入步骤(2)反应60min所得体系中,再于PCR仪中在50℃温度下反应90min;反应结束后,于70℃温度下加热15min,使反转录酶失活。其中,Traget Switch Oligo的序列如SEQID NO:2所示,具体为:5’-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3’。
反应所得产物于保存于-80℃中。
步骤2.以TCR的cDNA一链为模板,合成TCR的cDNA二链,具体方法为:
配制以下混合反应液:
上述反应溶液中,UPM Long为长上游引物,UPM Short为短上游引物,MBC2表示下游引物,MBC2是TCR分子上保守位点的序列,位于TRBC1/2的3’下游,这里扩增出来的片段是为下一步的巢式PCR作模板。UPM Long的序列如SEQ ID NO:3所示,具体为:
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’;
UPM Short的序列如SEQ ID NO:4所示,具体为:
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’;MBC2的序列如SEQ ID NO:5所示,具体为:5’-TGCTTCTGATGGCTCAAACACAGCGACCT-3’。采用长短不同的两种上游引物,目的是用短引物封住长引物的3’端,从而提高反应的特异性。
上述溶液混合好后,按以下程序进行PCR反应。下述程序中,“5×”表示循环5次,“30×”表示循环30次。
步骤3.琼脂糖电泳步骤2中PCR产物,胶回收PCR产物中长度为500~700bp的片段,回收产物于-80℃下保存。
实施例三:以TCR的cDNA二链为模板,扩增TCR高多态性区域CDR3
配制以下混合反应液:
上述反应液中,Universal Primer为上游引物,TRBC1-6S与TRBC2-6S为下游引物(同时加入TRBC1-6S和TRBC2-6S可以同时扩增出两个TCR基因)。Universal Primer的序列如SEQ ID NO:6所示,具体为:5’-ACGACTCACTATAGGGCAAGCAG-3’;TRBC1-6S的序列如SEQ ID NO:7所示,具体为:5’-CGGGTGGGAACACCTTGTTCAGGT-3’;TRBC2-6S的序列如SEQ ID NO:8所示,具体为5’-CGGGTGGGAACACGTTTTTCAGGT-3’。SEQID NO:7和SEQ ID NO:8序列中的下划线表明有硫代磷酸化修饰。
配好上述混合反应液后,按以下程序进行PCR反应。下述程序中,“35×”表示循环35次。
实施例四:酶消化TCR高多态性区域CDR3的PCR扩增产物
(1)用移液枪量取200μl TCR高多态性区域CDR3的PCR扩增产物(PCR产物不足时加水补至200μl),向其中加入1.2倍体积(即240μl)AgencourtAMpure XP磁珠进行纯化;纯化后,加入137μl H2O溶解,吸出135μl纯化产物;
(2)向步骤(1)所得135μl纯化产物中加入15μl NEB buffer 4(10×buffer),得到T7核酸外切酶适合的反应体系;混匀后加入1.2μl(12U)T7核酸外切酶(T7核酸外切酶的终浓度为0.08U/ul,该酶购于NEB公司),于25℃温度下消化50min;
(3)向步骤(2)核酸外切酶消化后的体系中加入Agencourt AMpure XP磁珠进行纯化,磁珠的体积为195μl(即为步骤(2)酶反应体系体积的1.3倍);纯化后,加92μl H2O溶解,吸出90μl;
(4)向步骤(3)所得90μl纯化产物中先加入10μl10×S1buffer,再加入(45U)0.5μl(45U)S1核酸酶(购于Promega公司,货号M5761,S1核酸酶的终浓度为0.45U/ul),于30℃温度下消化30min;反应完后,再加入2μl S1stopbuffer,于70℃温度下加热10min,失活。
(5)向步骤(4)反应完毕的体系中加入180μl Agencourt AMpure XP磁珠进行纯化,最后加入30μl TE溶液溶解,得到DNA混合片段;琼脂糖凝胶电泳检测DNA混合片段,发现得到的混合片段长度为100~500bp。
实验发现,本实施例步骤(2)中,加入0.08U/μl的T7外切核酸酶时,反应时间在40~50min之间对步骤(2)酶切结果影响不大,故反应时间不限于40min;另外,T7外切核酸酶的浓度可为0.06U/μl-0.10U/μl,此时反应时间为30~120min时,最终也可得到100~500bp长度的DNA混合片段。
实施例五:检测基因多态性区域测序文库
按照实施例四的方法得到DNA混合片段后,应用Illumina公司建库试剂盒为TruSeq DNA LT Sample Prep Kit Support(货号:FC-121-2001),通过将DNA混合片段作为建库试剂盒的样品而直接补平DNA,在片段两端加上测序接头,再根据上机反应需要筛选一定大小的片段,PCR扩增,回收后得到高通量测序文库。
当然,对于本发明而言,酶切实验可根据需要,选择3’外切核酸酶(例如,外切核酸酶Ⅲ)为核酸外切酶,选择绿豆核酸酶为单链核酸酶。测序文库的制备流程如图1所示。外切核酸酶Ⅲ的酶切速率主要由酶的反应温度决定,酶的浓度在5U/ul--8.3U/ul时,不同温度下酶切的反应速率如图2所示;由图可见,在一定的反应体系中,温度越高,外切核酸酶Ⅲ酶切碱基的速率越快。绿豆核酸酶的用量用法和S1核酸酶一样,只是缓冲体系不同。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种基因多态性区域测序文库的制备方法,其特征在于:所述基因多态性区域测序文库的制备方法包括以下步骤:
(1)根据基因多态性区域特征,设计一对分别位于多态性区域上游以及下游保守位点的引物,通过PCR扩增得到包含基因保守区域和多态性区域的DNA片段;
(2)向步骤(1)PCR扩增所得DNA片段中加入核酸外切酶,控制核酸外切酶的浓度与反应时间或者控制核酸外切酶的反应温度与反应时间,水解DNA片段;
(3)向步骤(2)所得DNA片段的水解产物中加入单链核酸酶,孵育,消化DNA突出单链,得到DNA混合片段;
其中,所述步骤(1)的引物中,至多一条引物带有保护DNA不被核酸酶水解的化学修饰。
2.如权利要求1所述的一种基因多态性区域测序文库的制备方法,其特征在于:所述基因多态性区域测序文库的制备方法还包括步骤(4):将步骤(3)所得DNA混合片段直接连接测序接头,得到测序文库。
3.如权利要求1所述的一种基因多态性区域测序文库的制备方法,其特征在于:所述化学修饰为硫代磷酸化修饰、以2'-O-甲基或以2'-O-乙基进行的修饰。
4.如权利要求3所述的一种基因多态性区域测序文库的制备方法,其特征在于:所述化学修饰为前6个碱基进行了硫代磷酸化修饰。
5.如权利要求1所述的一种基因多态性区域测序文库的制备方法,其特征在于:所述核酸外切酶为T7外切核酸酶、Lambda外切核酸酶或外切核酸酶Ⅲ;所述单链核酸酶为S1核酸酶或绿豆核酸酶。
6.如权利要求1至5中任一项所述的一种基因多态性区域测序文库的制备方法,其特征在于:所述多态性区域为T细胞TCR CDR3区域。
7.如权利要求6所述的一种基因多态性区域测序文库的制备方法,其特征在于:所述T细胞TCR CDR3区域测序文库制备方法中,步骤(1)中的上游引物如序列SEQ ID NO:6所示,下游引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
8.如权利要求6所述的一种基因多态性区域测序文库的制备方法,其特征在于:所述T细胞TCR CDR3区域测序文库制备中,步骤(2)中核酸外切酶是浓度为0.06U/μl-0.10U/μl的T7外切核酸酶,反应时间为30~120min。
9.如权利要求8所述的一种基因多态性区域测序文库的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中核酸外切酶是浓度为0.08U/μl的T7外切核酸酶,反应时间为40~50min,所述步骤(3)中单链核酸酶为S1核酸酶。
10.一种采用如权利要求1或2所述方法制备得到的基因多态性区域测序文库。
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