CN101246142A - 一种检测单核苷酸多态性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种联合内切酶和外切酶以及质谱法方法来检测单核苷酸多态性的新方法。本发明要点在于参与PCR反应的其中一条引物含限制性内切酶的识别位点，通过对PCR产物进行限制性内切酶消化，以及随后的双链DNA外切酶消化，产生两个含多态位点的单链核苷酸片段，并通过纯化、点靶等步骤，制备可直接用于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测的样本。与现有方法相比，本发明具有存在耗时短、成本低、分辨率高、操作简便的优点。

Description

一种检测单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明涉及到基因组学和分子生物学中有机生物分子特别是核酸分子的质谱分析，具体是提供一种联合限制性酶切法、核酸外切法和质谱法以检测单核苷酸多态性的方法，更具体地说，提供一种在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)中对基因组单核苷酸多态性进行检测的方法。

技术背景

人类的遗传信息储存在基因组中，2002年国际合作项目人类基因组计划的最终完成，绘制出了人类基因组结构的精细图，为相关研究提供了参考序列。人类基因组序列共由30亿个位点组成，研究表明，任意两个人之间的基因组差异在0.1％左右，即大约300万个位点的差异。这些差异极有可能是造成两个人之间个体差异的遗传因素。发现这些位点，可广泛地应用于遗传标记的研究、评估个体遗传关系、评估物种进化等研究领域。

在人类基因组中，约90％的差异是以单个核苷酸的形式体现出来的，这样的差异位点被称作单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。SNP具有两个显著的特点：一是数目众多，据估计人类基因组中的SNP数目约在1100万左右，目前国际数据库dbSNP中已收录来源于人类基因组的SNP达1083万，其中经过确认的为644万(截至2007年8月22日)，如此大量的SNP方便了研究这选择合适的位点进行研究，也使得绝大多数基因组区域在SNP效力的覆盖范围内；另外一个特点是SNP位点大多数为双态，即在一个位点上仅有两种表现形式(基因型)，这样很容易就能设计出高通量自动化的检测方法。正因为这两个特点，使得SNP位点越来越受到研究者的青睐，被誉为是继限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)和短串联重复序列(short tandem repeat，STR)之后的第三代分子标记物。人类基因组计划完成前后，基因组学研究的重点逐渐转向SNP领域，因此，SNP在遗传标记学、生物群体遗传学、生物分类学、遗传育种学、物种或人类进化学、法科学、药物基因组学等领域都有重要的应用。

例如，SNP的丰富性和双等位基因特性使作物或家畜遗传作图更加精细，使得育种工作者能够更精确的进行标记辅助选择(MAS)和标记辅助导入(MAI)，降低或消除了目的基因之外的遗传背景对这些技术带来的不良影响，同时也给品种资源和品种纯度鉴定带来崭新局面。姜运良等人通过对3种“双肌臀”猪品种的肌肉生长抑制基因3个不同位点进行分析，获得肉质提高的新品种。Monna等人利用SNP标记技术成功地将水稻半矮杆基因sd-1图位克隆，Shen等人构建了水稻全基因组SNP数据库，并成功地筛选多个水稻功能基因。

例如，不同个体中存在的SNP差异，成为了法科学中身份鉴别的有力工具。Gabirel等人对105个样本的线粒体HVI/HVII区域的SNP进行分析，并用途分析了实际案例中毛发和骨骼等检材，证明了该方法用于法医检案是可行的。李莉、李成涛等人对人HLA-DR基因的SNP进行检验，在应用于亲子关系鉴定的25个案例中，成功率达到96％。

为了抢占市场，各大生物学公司都推出了自己的SNP检测方法。其中质谱仪被认为是很有发展前途的仪器，尤其是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。基于MALDI-TOF MS，开发了一些SNP检测方法，如美国Sequenom公司的hME和iPLEX方法，德国Bruker公司的GOOD assay方法，韩国GeneMatrix公司的RFMP方法。这些方法的原理是设计一条与待检测SNP位点上游的基因组序列匹配的寡核苷酸探针，根据SNP位点的基因型差异，探针将在待检测SNP位点处连接上不同的脱氧核苷酸。其中，组成DNA片段的四种脱氧核苷酸的分子量分别是：dAMP 313.21Da，dCMP 289.19Da，dGMP329.21Da，dTMP 304.20Da。不同脱氧核苷酸之间是存在分子量差异的，其中差异最小的是dAMP与dTMP之间的9.01Da，差异最大的是dCMP与dGMP之间的40.02Da，通过质谱仪能检测到这种差异，从而将分子量不同的探针区分开来。质谱仪的检测效果与探针的分子量相关，探针片段越短，分子量越小，区分效果越明显：例如，在图1中，A图标示的两个峰，对应的两个寡核苷酸片段为5’-ACGT-3’和5’-ACGA-3’，分子量分别为1174.699和1183.770Da，相差9.071Da，B图标示的两个峰，对应的两个寡核苷酸片段为5’-ACGTACGT-3’和5’-ACGTACGA-3’，分子量分别为2410.628和2419.821Da，相差9.193Da，C图标示的两个峰，对应的两个寡核苷酸片段为5’-ACGTACGTACGT-3’和5’-ACGTACGTACGA-3’，分子量分别为3645.917和3654.736Da，相差8.819Da，同样相差9Da左右，但如图所示，A图中两个峰之间的差异最明显，B图次之，C图中两个峰之间的差异相对不明显，也就是说，分子量越小，质谱仪的区分效果越明显，即分辨率越高。为了提高质谱仪的分辨率，对SNP位点进行检测倾向于检测分子量较小的寡核苷酸片段，如RFMP方法通过对含SNP位点的PCR产物进行限制性酶切，产生2000～4000Da左右的寡核苷酸片段进行检测，而GOOD assay方法通过磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)将含SNP位点的寡核苷酸片段切割成1000～2000Da左右的小片段进行检测。

然而，国外公司利用质谱仪对SNP位点进行检测的方法，在实际应用中存在不少缺陷：

(1)Sequenom公司的hME、iPLEX两种方法采用的是两步PCR，即第一次PCR放大待检测SNP位点的拷贝数，第二次PCR对待检测的SNP位点进行检测，在两次PCR之间，还要使用虾碱性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)除去第一次PCR反应体系中剩余的dNTP，这样就造成总检测时间的延长，以及单个检测成本的增加；此外，这两种方法没有对含SNP位点的寡核苷酸片段进行切割，检测范围在4000～9000Da之间，因而分辨率不高；

(2)GOOD assay方法也采用了两步PCR，而且，为了提高分辨率，采用磷酸二酯酶切割含SNP位点的寡核苷酸片段，提高了成本，延长了时间，不利于快速检测；

(3)RFMP方法只有一步PCR，但是同GOOD assay方法(1000～2000Da)相比，产生待检测片段过长(2000～4000Da)，相应的，分辨率不如GOOD assay方法。

因此，基于MALDI-TOF MS，目前需要开发一种分辨率高、准确、成本低、快速的方法来检测基因组中SNP位点。

发明内容

本发明是在针对以往基于MALDI-TOF MS检测基因组SNP位点的方法存在的前期处理速度慢或检测分辨率不够高等问题提出的相应的解决方案。

本发明原理在于：利用酶切位点位于识别位点下游的一类特殊限制性内切酶的独特性质，通过将识别位点引入用于扩增SNP位点的正向引物中的5’端，并联合与互补链中的SNP位点5’端上游序列的反向引物，扩增得到包含识别位点+酶切位点+SNP+部分保护碱基的产物。然后对产物分别进行特殊限制性内切酶得到获得具有粘性末端的双链核酸片段，其中粘性末端中包含SNP位点。随后，通过双链核酸外切酶切下粘性末端，获得包含SNP位点的短片段，从而实现只经过一次PCR即获得适于用质谱仪(MALDI-TOF MS)检测SNP位点的探针短片段。

因此，本发明方案包括确定SNP位置、设计正向引物、设计反向引物、PCR扩增、限制性内切酶消化、双链核酸外切酶消化、质谱检测等步骤。

在一个具体实施方案中，本发明的步骤如下：

(1)确定SNP位置：针对待检核酸序列可能存在的SNP，确定SNP在待检序列中的位置；

(2)设计正向引物：根据SNP的位置，设计正向引物，其中正向引物3’端位于SNP位点5’端1-10bp处，正向引物5’端含有特殊限制性内切酶的识别位点，而在待检核酸序列中，所述的特殊限制性内切酶的酶切位点位于识别位点的3’端1-10bp，并位于SNP位点5’端1-5bp；

(3)设计反向引物：根据SNP的位置，设计与另一条核酸链(或互补链)上的SNP位点的5’端序列互补的反向引物；

(4)PCR扩增：通过PCR扩增，获得包含特殊限制性内切酶的识别位点+酶切位点+SNP位点+SNP位点的部分下游序列的扩增产物。其中具体的PCR反应体系，即含SNP位点的DNA模板、本发明的特殊引物、dNTPs、耐热保真聚合酶、缓冲液、Mg²⁺、无菌的去离子水等各种试剂的体积，都与常规PCR反应一致，而反应温度条件和反应时间根据引物Tm值和反应片段大小而定；

(5)限制性内切反应：PCR反应完成后将反应产物直接进行彻底的限制性酶切反应，酶切反应条件根据具体使用的限制性内切酶而定。其中使用所述的特殊限制性内切酶进行限制性内切反应，获得具有粘性末端的双链核酸片段，其中粘性末端中包含SNP位点；

(6)双链DNA外切反应：利用双链DNA核酸外切酶，切下双链核酸片段的粘性末端，获得两条包含SNP位点并且互补的单链短片段；

(7)质谱检测：将包含SNP的单链短片段进行质谱检测，通过与野生型单链短片段的分子量进行比较，确定SNP的基因型。

在另一个具体实施方案中，所述的特殊限制性内切酶包括但不限于Aat II、Bbs I、Bbv I、BfuA I、Bsa I、BsmA I、BsmB I、BsmF I、BspM I、BspQ I、BtgZI、Ear I、Fok I、Hga I、Sap I、SfaN I。以Hga I为例，该限制性内切酶的酶切位点在识别序列3’端之后的5bp核苷酸处。识别序列在正向引物中的具体位置，视实际操作中所使用的限制性内切酶而定，并使酶切后SNP位点位于内切酶的酶切位点之后。

在另一个具体实施方案中，所述的双链DNA核酸外切酶包括λ噬菌体核酸外切酶(λexo)。通过酶切反应，消除上一步酶切反应产物的双链DNA部分，保留单链的粘性末端，酶切反应条件根据具体使用的双链DNA外切酶而定。

在另一个具体实施方案中，在进行质谱检测之前，还包括对酶切产物进行纯化处理，以减少对最终检测结果的干扰，提高分辨率。未经纯化的产物进行质谱检测，将出现含有钠离子(Na⁺)、钾离子(K⁺)等各种阳离子的质谱峰，这些阳离子质谱峰与不含阳离子的主质谱峰相差数十个Da(钠离子：23Da，钾离子：39Da)，很容易造成误判。而纯化后的产物，阳离子峰的比例将大大降低，甚至检测不到，从而提高检测的准确性。以树脂纯化法为例，在酶切产物中加入适量树脂，然后用微量移液器吹打均匀，来回颠倒eppendorf管使充分混匀，上下颠倒15分钟。1600rpm离心3分钟，然后取上清液进行下一步操作。

在另一个具体实施方案中，所述的质谱检测包括：将基质与纯化后的酶切产物点到质谱仪所用的检测靶上，供下一步的质谱检测，基质的具体配方和与用量视样品浓度、样品用量、环境条件、机器状态而定。例如，所述的质谱检测是利用高分辨率的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测酶切片段的分子量，由于单个SNP的分子量变化在9个或9个Da以上，而高分辨率的质谱仪能很好的区分单个碱基的差异，因此通过与野生型短片段分子量的比较，可确定所检测SNP在特定个体中的基因型。离心后的上清液可用于质谱仪检测。先在样品靶上点0.5ul基质，基质组成为柠檬酸铵(Ammoniumcitrate)1.6g/L，3-羟基吡啶羧酸(3-hydroxypicolinic acid，3-HPA)6g/L，以1∶1的乙腈-水混合溶解，待基质在自然状态下结晶后，在结晶后的基质上点1ul样品(即离心上清液)，自然状态下结晶。然后进行MALDI-TOF MS分析，获得酶切产物的质谱图，经质谱检测测得酶切产物分子量根据实验推测的产物分子量相比对确定相应的SNP类型，实现SNP检测。

本发明与传统PCR检测或常规质谱分析检测SNP相比，具有下列意想不到的优点：

(1)常规PCR必须扩大含SNPs位点的片段，即必须进行两次PCR，因此需要很大的模板量。而本发明仅进行一次PCR，可针对微量的SNP结果进行检测，因此简化了检测过程；

(2)本发明所用引物和条件按常规方法进行，具有较高地通用性；

(3)本发明的PCR过程无需高保真酶，在消化(酶切)过程中也无需虾碱性磷酸酶，降低的酶成本；

(4)本发明减去了单碱基延伸这一步骤，限制性内切酶的用量也降低，从而降低检测成本约20～40％左右；

(5)本发明在保持原有的检测准确度的基础上，能节约检测时间30分钟左右；

(6)本发明产生的用于质谱仪检测的DNA片段，在3～5个bp之间，分辨率很高；

(7)对于一个SNP位点，本发明产生互补的两条DNA片段，它们的分子量不一样，可以相互印证检测的准确性；

(8)对于多个位置比较靠近的SNP位点，传统的方法检测起来比较困难，本发明产生的DNA片段上可以携带多个SNP位点，因此提高了检测效率；

(9)对于多个位置相对分散的SNP位点，传统的方法要进行二次多重PCR，由于某些引物之间存在干扰，因此有些位点不能同时参与PCR，而使用本发明只需进行一次多重PCR，引物之间的干扰相对较少，可以更方便的选择SNP位点同时进行检测；

附图说明

图1分别是具有相同SNP(T/A)的不同长度的序列分子量与质谱仪分辨率关系的示意图。其中，图例A是5bp长度(5’-ACGT-3’和5’-ACGA-3’)的分子量质谱检测差异，图例B是8bp长度(5’-ACGTACGT-3’和5’-ACGTACGA-3’)的分子量质谱检测差异，图例C是12bp长度(5’-ACGTACGTACGT-3’和5’-ACGTACGTACGA-3’)的分子量质谱检测差异。

图2是实施本发明的完整实验流程图。

图3是限制性内切酶Hga I和双链DNA核酸外切酶λexo的双酶切原理图。其中，字母GACGC为限制性内切酶Hga I的识别序列，三角形为Hga I对应的酶切位点，方括号内小写字母c/a、g/t为SNP位点及其基因型。经过双酶切后，获得两条包含SNP位点并且互补的单链短片段。

图4是根据本发明的方法，所得到的阴性对照A、待测样品B、待测样品C的质谱检测结果。

具体实施方式

现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的传统分子生物学、细胞生物学、PCR扩增和突变技术等等。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。参见，例如，

Sambrook and Russell″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″(2001)；

Cloning：A Practical Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover，ed.，1985)″；

T.A Brown“Genome”BIOS Scientific Publishers Limited；

PY Kwok Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.(2001)，235-58.

实施例1：设计扩增乙肝病毒P基因669位SNP的引物

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是严重的世界性卫生问题，每年约有近百万人死于乙肝病毒感染引起的各类疾病。但是对于已经确诊的乙肝病人而言，不同个体中的乙肝病毒基因组存在多种SNP突变，导致相同疾病的病人对同一药物产生耐药性。如果对乙肝病人体内的SNP标记进行研究，揭示了人群中不同个体对相同药物的敏感性差异的根本原因，将有助于研究者筛选更合适的药物。

其中，乙肝病毒基因组编码的P基因(NCBI Gene ID：944565)上第669位核苷酸发生C→A突变，使编码氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(L180M)，从而产生对抗病毒药物拉米夫定(lamivudine，LAM)的耐药性。

对于该SNP位点的质谱检测，我们设计如下实验：

首先根据乙肝病毒基因组的序列(NCBI登录号：NC 003977)，设计PCR引物，正向引物为：GGGCCTCAGTgacgcCCGTTTC，其中的小写字母为限制性内切酶Hga I的识别序列，反向引物为：CCACTGAACAAATGGCACTA。

实施例2：扩增包含乙肝病毒P基因的669位SNP片段

PCR反应片段大小为58个核苷酸，含5个核苷酸的Hga I识别序列。PCR反应体系为：10ul体系，其中乙肝病毒基因组DNA 1.5ul(初始浓度10ng/ul)、正向引物和反向引物各1ul(初始浓度5pmol/ul)、dNTPs 0.8ul(初始浓度各2.5mM)、缓冲液lul(初始浓度1x，含Mg²⁺)、HS Taq酶0.05ul(初始浓度5U/ul)、无菌的去离子水4.65ul；PCR反应的循环参数为：95℃5min，然后95℃20s、55℃20s、72℃20s循环30次，之后72℃7min。PCR反应后，乙肝病毒基因组DNA中带有SNP位点的那段核苷酸序列的拷贝数得到放大。反应完成后的PCR产物可在4℃冷藏保存数天，也可在-20℃冷冻保存数月，也可立即直接用于后续的酶切反应。

实施例3：对扩增产物进行特殊限制性内切酶和双链核酸外切酶消化

PCR反应后经Hga I酶解，反应体系为：20ul体系，其中PCR产物10ul、酶缓冲液2ul(初始浓度10x)、Hga I酶1ul(初始浓度2U/ul)、无菌的去离子水7ul；酶切反应参数为：37℃40min，65℃20min。经过Hga I酶的消化，PCR产物将被切割成两个部分，每个部分都带有粘性末端，即双链酶切产物的反义链上带有4个核苷酸的单链部分，而SNP位点正好位于单链区域内。反应完成后的酶切产物可在4℃冷藏保存数天，也可在-20℃冷冻保存数月，也可立即直接用于后续的酶切反应。

接下来用λ噬菌体核酸外切酶(λexo)进行酶切，反应体系为：30ul体系，其中内切酶消化产物20ul、酶缓冲液3ul(初始浓度10x)、λexo酶3ul(初始浓度2U/ul)、无菌的去离子水4ul；酶切反应参数为：37℃40min，95℃20min，冰水浴20min。经过λexo酶的消化，上一步酶切产物的双链部分将被降解，这样，将得到两个5核苷酸长的单链DNA，分别是5’-TCTC[c/a]-3’和5’-[g/t]GAGA-3’，它们序列互补，并且携有SNP位点(方括号内的小写字母所示)。反应完成后的酶切产物可在4℃冷藏保存数天，也可在-20℃冷冻保存数月，也可立即直接用于后续的纯化反应。

实施例4：纯化双酶切产物

在两步酶切后的产物中加入3mg树脂，用微量移液器吹打均匀，来回颠倒eppendorf管使充分混匀，上下颠倒15分钟。经过本步反应，树脂将充分与反应体系中的阳离子结合，而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4℃冷藏保存数天，也可在-20℃冷冻保存数月，也可1600rpm离心3分钟后取出上清液直接用于后续的质谱检测。

实施例5：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测SNP

先在样品靶上点0.5ul基质，基质组成为柠檬酸铵(Ammonium citrate)1.6g/L，3-羟基吡啶羧酸(3-hydroxypicolinic acid，3-HPA)6g/L，以1∶1的乙腈-水混合溶解，待基质在自然状态下结晶后，在结晶后的基质上点lul离心上清液，自然状态下结晶。然后进行MALDI-TOF MS分析，获得酶切产物的质谱图。

判定标准如下：如没发生耐药突变，酶切产物的质谱结果应为5’-TCTCC-3’和5’-GGAGA-3’，分子量分别为1413.92和1552.00；若发生耐药突变，酶切产物的质谱结果应为5’-TCTCA-3’和5’-TGAGA-3’，分子量分别为1437.94和1526.99；如果4个分子量都在质谱图中表示，则表明样品中既有未发生耐药突变的野生株，也有发生耐药突变SNP的乙肝病毒株的存在。

检测结果如下：

其中，样品A为阴性对照样本，样品B和样品C为待测样本。

(1)对于阴性对照样本A，由于其为没有发生耐药突变的病毒株，因此酶切产物应为5’-TCTCC-3’和5’-GGAGA-3’，而实际质谱检测的分子量为1414.571和1552.194，与预期的分子量(1413.92和1552.00)仅偏差0.7Da不到，这属于可以接受的误差范围。因此，证实样品A为阴性对照样本(参见图4A)。

(2)对于样品B，实际质谱检测分子量为1437.746和1526.732，这与预期的阳性结果的分子量(1437.94和1526.99)仅偏差0.3Da不到(属于可以接受的误差范围)，因此证实样品B具有SNP突变，其酶切产物应为5’-TCTCA-3’和5’-TGAGA-3’(参见图4B)；

(3)对于样品C，实际质谱检测分子量为1414.001和1551.915、1437.813和1527.121Da，这与预期的阴性分子量(1413.92和1552.00)以及阳性分子量(1437.94和1526.99)分别相差0.2Da不到(属于可以接受的误差范围)，因此证实样品C为发生耐药突变的病毒株与未发生耐药突变的病毒株(参见图4C)。

因此，根据检测结果，揭示了样本A、B以及样本C个体对相同药物的敏感性差异的根本原因，这有助于研究者筛选更合适的药物。

Claims (7)

1、一种联合限制性酶切法和质谱法以检测单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

(1)确定SNP位置：针对待检核酸序列可能存在的SNP，确定SNP在待检序列中的位置；

(2)设计正向引物：根据SNP的位置，设计正向引物，其中正向引物3’端位于SNP位点5’端1-10bp处，正向引物5’端含有特殊限制性内切酶的识别位点，而在待检核酸序列中，所述的特殊限制性内切酶的酶切位点位于识别位点的3’端1-10bp，并位于SNP位点5’端1-5bp；

(3)设计反向引物：根据SNP的位置，设计与另一条核酸链或互补链上的SNP位点的5’端序列互补的反向引物；

(4)PCR扩增：通过PCR扩增，获得包含特殊限制性内切酶的识别位点+酶切位点+SNP位点+SNP位点的部分下游序列的扩增产物；

(5)限制性内切反应：使用所述的特殊限制性内切酶进行限制性内切反应，获得具有粘性末端的双链核酸片段，其中粘性末端中包含SNP位点；

(6)双链DNA外切反应：利用双链DNA核酸外切酶，切下双链核酸片段的粘性末端，获得两条包含SNP位点并且互补的单链短片段；

(7)质谱检测：将包含SNP的单链短片段进行质谱检测，通过与野生型单链短片段的分子量进行比较，确定SNP的基因型。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的特殊限制性内切酶包括Aat II、Bbs I、Bbv I、BfuA I、Bsa I、BsmA I、BsmB I、BsmF I、BspM I、BspQ I、BtgZ I、EarI、Fok I、Hga I、Sap I、SfaN I。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的双链DNA核酸外切酶包括λ噬菌体核酸外切酶(λexo)。

4.权利要求1-3所述的方法，其中在进行质谱检测之前，还包括对酶切产物进行纯化处理，以减少对最终检测结果的干扰，提高分辨率。

5.权利要求4所述的方法，其中纯化方法包括树脂纯化。

6.权利要求1-5所述的方法，其中所述的质谱检测包括：将基质与纯化后的酶切产物点到质谱仪所用的检测靶上，供下一步的质谱检测，基质的具体配方和与用量视样品浓度、样品用量、环境条件、机器状态而定。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的质谱检测是利用高分辨率的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测酶切片段的分子量，由于单个SNP位点的分子量变化在9个或9个Da以上，而高分辨率的质谱仪能很好的区分单个碱基的差异，因此通过与野生型短片段分子量的比较，可确定所检测SNP位点在特定个体中的基因型。

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