CN102199668B - 纳米颗粒分子单倍型分型方法 - Google Patents

Abstract

一种生物遗传技术领域的纳米颗粒分子单倍型分型方法，以待测样本的基因组DNA为模板，用对应目的DNA片段中的SNP等位基因的正向等位基因特异性引物和反向通用引物，通过长片段AuNP ASPCR处理实现目的DNA片段的染色单体的分离和扩增。本发明创新地在ASPCR体系中加入AuNP，有效的提高了单倍型分型的特异性；得到的单倍体PCR产物可直接用于SNP基因分型，如TaqMan探针和测序等，来获得待测两倍体个体的一个单倍型。待测样本的另一个单倍型可以用同样的方法得到，或者从基因型来推测。

Description

纳米颗粒分子单倍型分型方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物遗传技术领域的方法，具体是一种纳米颗粒分子单倍型分型方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组序列上单个碱基的颠换，插入或者缺失。常见SNP在人群中的最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)大于5％，具有较高的多态性。在人类的染色体中，绝大多数SNP只具有两个等位基因，这给基因分型和统计分析带来便利。而且，SNP在人类基因组中分布广泛，从2006年的数据可以得知，平均每1000个碱基就会发生一个SNP。随着“1000个基因组”计划和第二代测序技术的出现，这一密度还可能增加。SNP的这三大优点，高多态性、两等位基因性和分布广泛性，使它成为寻找复杂遗传疾病易感基因的利器。

复杂遗传疾病通常由多个微效致病基因和环境因素共同作用而形成。这些微效致病基因对疾病发生的贡献都很小，通常单独一个微效致病基因的致病突变并不足以导致疾病的发生，而多个微效致病基因的致病突变与环境因素的共同作用增大了发病的可能性。

在寻找复杂遗传疾病易感基因的过程中，人们大量的以SNP作为分子标记，关联分析作为统计方法。关联分析通过观察多态性标记的等位基因频率在病例组和对照组中的差异，来确定某个等位基因是否与致病突变处于连锁不平衡，从而确定致病突变所在的染色体区段。关联分析的结果能在一定程度上和一定概率上缩小目标范围，甚至可以确定风险基因。然而，对于精神疾病这类拥有众多微效基因，遗传模式还不十分清楚的复杂遗传疾病来说，从单个位点的关联分析结果很难得到启示性的结果。这时，就需要一种可以提高统计效力并具有更多多态性的分子标记，单倍型。SNP的单倍型是染色单体上多个SNP的等位基因的排列。分析表明，单倍型关联分析相比于单个位点的关联分析具有更高的统计效力。对于存在强连锁不平衡的染色体区域，单倍型分析也可以过滤掉由SNP位点之间的连锁不平衡而出现的多个阳性位点，从而凸显出真正的致病突变。

然而，获得个体的单倍型信息对基因分型技术来说还是个严峻的挑战。大多数现在的基因分型技术对于分离两条染色单体都无能为力，特别是SNP分型技术在这方面更是欠缺。因此，通过分子单倍型分型，获得个体真正的单倍型信息就显得尤为重要。截至目前，几乎所有的SNP分子单倍型分型方法都处于实验室阶段，它们或者不能完全分离两条染色单体(ASPCR)，或者程序繁琐，涉及多步反应，成本高昂(酶切-连接法和体细胞杂交)，或者技术本身具有很大不确定性(单分子PCR法)。这些缺点阻碍了它们成为高通量单倍型分型技术的核心。

ASPCR的作用在于区别多个等位基因。最初，ASPCR主要被用于基因分型。以SNP为例，它们通常有两个等位基因。设计一个通用反向引物(universal reverse primer)，一对分别对应两个等位基因的正向特异性引物(specific forward primer)，这些正向引物通过3’端序列与其中一个等位基因特异性杂交。在进行PCR反应前，分别向两个PCR反应体系中加入一条特异性引物和通用引物。正向引物特异性地与染色体上两个等位基因中的一个杂交，并在聚合酶的作用下扩增出这个等位基因所在染色体的DNA片段。通过检查由特异性引物所产生的PCR产物的量来检测等位基因。ASPCR反应易于自动化，而且可以形成高通量。

ASPCR反应的特异性主要由特异性引物的3’端决定。对于多个碱基的突变，由于序列变化幅度较大，使得两个等位基因特异性引物的碱基互补特性有很大不同。因而ASPCR可以很好的分离多碱基突变的两条染色单体。不过，ASPCR在分离单个碱基突变的两条染色单体时，特异性随突变碱基的类型而变化。比如G:G或者A:A就不能用ASPCR方法分离，明显的错误延伸也在G:T、C:A、A:C和T:G组合中发现。所以，如果用ASPCR来分离染色单体，产物中会有来自另一条染色单体的污染，从而使得单倍型分型结果仍然带有不明确位点(ambiguous loci)。

为了提高ASPCR的特异性，人们使用了DNA的等价物，如LNA(Linked nucleic acid)和PNA(Peptide nucleic acid)，来代替特异性引物3’端碱基。LNA和PNA有效的提高了ASPCR反应的特异性，不过这类引物的合成过程很复杂，显著的提高了分型成本。

2007年，李海阔等发现了纳米金粒子(gold nano-particle，AuNP)可以显著提高再扩增PCR体系的特异性。纳米金粒子是一种金的纳米颗粒。块状的金几乎没有任何催化活性，原因在于它的化学吸附能力太小。但是，当金以纳米颗粒的形式存在，被分散于过渡金属氧化物载体上时，具有超常的催化活性，以至于近年来对纳米金作为催化材料的研究激增。金的纳米粒子表面带有大量负电荷。作为DNA骨架的碱基集团与纳米金粒子表面有较强的亲和作用。又因为双链DNA的碱基位于双螺旋内部，DNA双链比单链更不容易弯曲，所以纳米金粒子才可以特异性的吸附单链DNA(如引物分子)，而不是双链DNA(如未变性的模板分子)。利用这一特性，在PCR反应中纳米金将引物吸附在它的表面，而这一过程是动态的，也就是随着溶液中引物浓度的降低，纳米金不断的把引物从它的表面释放出来，使得实际的引物浓度长时间保持一个相对低的理想的值。这样就减少了引物二聚体的形成和引物非特异性结合模板导致的扩增。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种纳米颗粒分子单倍型分型方法，针对ASPCR无法完全分离染色体的缺点，本发明创新地在ASPCR体系中加入AuNP，有效的提高了单倍型分型的特异性；得到的单倍体PCR产物可直接用于SNP基因分型，如TaqMan探针和测序等，来获得待测两倍体个体的一个单倍型。待测样本的另一个单倍型可以用同样的方法得到，或者从基因型来推测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种纳米颗粒分子单倍型分型方法，以待测样本的基因组DNA为模板，用对应目的DNA片段中的SNP等位基因的正向等位基因特异性引物和反向通用引物，通过长片段AuNP ASPCR处理实现目的DNA片段的染色单体的分离和扩增。

所述的待测样本的基因组是指：多倍体生物的基因组，优选两倍体基因组。

所述的正向等位基因特异性引物，如SEQ ID No.1所示，是指3’末端第一个碱基与目的DNA片段5’端第一个SNP位点的一个等位基因互补而与另一个等位基因不互补的一条单链寡核苷酸，它的其他碱基特别是位于3’端附近的碱基都与目的片段上对应的碱基互补。

所述的反向通用引物，如SEQ ID No.2所示，它的Tm值尽量接近后者的Tm值，它的序列要尽量避免与后者发生互补或反向互补，并且避免自身的回文结构或颈环结构。

所述的长片段AuNP ASPCR处理是指：针对目的片段的长度超过数Kb的情况，可以用待测样本染色体上分别具有两个不同等位基因的SNP位点，将多个长片段ASPCR片段连接起来，使之可以扩增出长度达到数Kb以上DNA片段的等位基因特异性PCR反应，具体步骤包括：

i)测定待测样本染色体不同等位基因的基因型；

ii)以第一个SNP作为起点，设计3’末端第一个碱基与目的DNA片段5’端第一个SNP位点的一个等位基因互补而与另一个等位基因不互补的一条单链寡核苷酸，反向引物根据实际情况设计，但至少要包含第二个SNP位点；

iii)用步骤ii)设计的特异性引物加入AuNP进行等位基因特异性PCR扩增，再对产物中第一个SNP位点后面的SNP位点进行测序，即得到该样本染色体这一段区域的单倍型；

iv)同样，再以步骤iii)的这段区域中其它SNP位点(除第一个外)为起点，进行步骤ii)、iii)，即得到该样本染色体新的一段区域的单倍型，依次类推，可以得到所需要区域的全部单倍型。

所述的AuNP是指粒径在5nm和13nm之间的纳米金粒子的胶液。

本发明的优点在于：利用商品化或者自制的纳米金粒子溶液通过ASPCR反应可以快速，高通量，准确得到待测样本染色体的单倍型数据，和已有其它方法得到的数据相比都要更可靠，更便捷，对实验仪器和操作技术要求不高，成本也要更低。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

用本发明的分子单倍型分型技术获得“年龄相关性黄斑变性”(age-related maculardegeneration，AMD)74个病例和73个对照样品，在跨越ARMS2和HTRA1基因的长度约为34Kb的区段上的17个SNP的单倍型信息。

1.临床样品来源及DNA提取

AMD病例和对照的全血样品由北新泾社区医院提供。使用Qiagen DNA extraction mini Kit抽提。

2.获取病例和对照样本在这17个SNP上的基因型

获取全部样品的基因型的作用是：

i)从每个样品在这些位点的基因型可以确定每个样品的启动SNP；

ii)样品的基因型还可以作为单倍型分型结果的质控。

所有样品的单倍型都可以用主流的SNP分型方法获得，在本例中采用双脱氧链终止测序法(直接测序法)，它是基因分型的金标准。使用ABI公司(Shanghai，China)的标准测序步骤，在ABI3730测序仪上实施测序。

3.根据基因型，用相互重叠的ASPCR片段来覆盖每一个样品的目的片段。对于不同样品，这些ASPCR片段可能不同。

4.长片段AuNP ASPCR

一个15μL的长片段AuNP ASPCR体系如下：

PCR循环程序如下：

先94℃变性3分钟；

然后94℃变性20秒，57℃退火30秒，68℃延伸8分钟，共35个循环；

最后68℃延伸7分钟，保持在4℃。

5.长片段ASPCR产物基因分型

长片段ASPCR产物的基因分型仍然采用双脱氧链终止测序法，使用ABI公司(Shanghai，China)的标准测序步骤，在ABI3730测序仪上实施测序。

6.将多个长片段ASPCR产物的基因型，根据连接SNP的基因型，连接成目的片段的单倍型。

7.统计分析：

A.单位点病例-对照分析：

病例-对照分析软件使用SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/SHEsisMain.htm)。

单个位点的分析结果与之前的报道的结果相似，HTRA1基因上的rs11200638和ARMS2基因上的rs10490924具有与AMD有最强的关联。rs11200638：风险等位基因A，OR＝7.18，％95CI＝[4.06-12.71]，P值＝6.49E-13。rs10490924：风险等位基因T，OR＝5.36，95％CI＝[3.28-8.77]，P值＝6.36E-12.

B.风险单倍型分析：

单倍型关联分析软件使用由哈佛大学和麻省理工学院联合开发的Haploview(4.2版本，http://www.broadinstitute.org/haploview/haploview)。可以发现，由rs10490924-rs11200638为核心的单倍型与AMD强烈相关，其中单倍型T-A为风险单倍型，OR＝5.23，P值＝1.05E-11；单倍型G-G为保护单倍型，OR＝0.07，P值＝1.88E-7。

Claims (3)

1.一种纳米颗粒分子单倍型分型方法，其特征在于，以待测样本的基因组DNA为模板，用对应目的DNA片段中的SNP等位基因的正向等位基因特异性引物和反向通用引物，通过长片段AuNP ASPCR处理实现目的DNA片段的染色单体的分离和扩增；

所述的长片段AuNP ASPCR处理是指：针对目的片段的长度超过数Kb的情况，用待测样本染色体上分别具有两个不同等位基因的SNP位点，将多个长片段ASPCR片段连接起来，使之进行扩增出长度达到数Kb以上DNA片段的等位基因特异性PCR反应，具体步骤包括：

i)测定待测样本染色体不同等位基因的基因型；

ii)以第一个SNP作为起点，设计3’末端第一个碱基与目的DNA片段5’端第一个SNP位点的一个等位基因互补而与另一个等位基因不互补的一条单链寡核苷酸，反向引物根据实际情况设计，但至少要包含第二个SNP位点；

iii)用步骤ii)设计的特异性引物加入AuNP进行等位基因特异性PCR扩增，再对产物中第一个SNP位点后面的SNP位点进行测序，即得到该样本染色体这一段区域的单倍型；

iv)同样，再以步骤iii)的这段区域中其它除第一个外的SNP位点为起点，进行步骤ii)、iii)，即得到该样本染色体新的一段区域的单倍型，依次类推，得到所需要区域的全部单倍型；

所述针对目的片段的长度超过数Kb的情况为人基因组中跨越ARMS2和HTRA1基因的长度为34Kb的区段；

所述正向等位基因特异性引物序列如SEQ ID No.1所示，所述反向通用引物序列如SEQ IDNo.2所示；

一个15μL的长片段AuNP ASPCR体系如下：

PCR循环程序如下：

先94℃变性3分钟；

然后94℃变性20秒，57℃退火30秒，68℃延伸8分钟，共35个循环；

最后68℃延伸7分钟，保持在4℃；

所述方法为非疾病诊断方法。

2.根据权利要求1所述的纳米颗粒分子单倍型分型方法，其特征是，所述的待测样本的基因组是指：多倍体生物的基因组。

3.根据权利要求2所述的纳米颗粒分子单倍型分型方法，其特征是，所述的待测样本的基因组是指：两倍体基因组。