CN103045763A - 一种新发鸭坦布苏病毒rt-lamp检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明生物技术领域，特别是涉及一种检测新发鸭坦布苏病毒的RT-LAMP的检测方法，该方法采用针对病毒E基因设计3对LAMP引物，配合LAMP反应液构成检测体系，具有快速、灵敏的检测特点，且其操作简单，成本低廉，反应易于观察，特异性好，非常适合于出口检疫、食品卫生以及畜牧饲养场的现场检测，易于大范围推广应用。

Description

一种新发鸭坦布苏病毒RT-LAMP检测方法

技术领域：

本发明涉及的是生物技术领域，具体的是一种新发RNA病毒的检测方法。

背景技术：

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)是2010年在中国大陆新发生的主要针对产蛋鸭和雏鸭的一种新的疫病。临床上主要侵害脑、卵巢、肝脏、心脏等实质器官，以出现脑炎、瘫痪等神经症状和产蛋下降为主要危害特征。

鸭坦布苏病毒的基因组为不分节段的具有感染性的单股正链RNA，由10 990 个核苷酸(nt)组成。基因组由5'端和3'端非编码区(UTR)及一个开放阅读框(ORF)组成，基因组的顺序为5'-UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3- NS4ANS4B-NS5-UTR-3'。结构蛋白编码位于基因组5'端，非结构蛋白编码区位于3'端。5'端UTR长为142 nt，有一个I型m7GpppNp帽子结构。3'端UTR长618 nt，无poly(A) 结构。UTR是黄病毒基因组复制起始调控位点，影响病毒的复制、翻译及其致病性。鸭坦布苏病毒的5'端、3'端UTR与Bagaza病毒的5'端、3'端UTR 同源性分别为76.3%和77.4%。多数黄病毒的3'端UTR 含有长度约为20nt的保守序列。鸭坦布苏病毒的3'端UTR含有3个保守序列(CS1、CS2、CS3)，长度分别为25nt、23nt和28nt，其中CS2和CS3为串联重复序列(RCS)，从5'→3' 依次为RCS3-CS3-RCS2-CS2-CS1。CS的组成形式是区分黄病毒属由哪种传播媒介传播的重要依据，蚊传播的黄病毒常含有CS1。 

目前，鸭坦布苏病毒检测主要依赖病毒分离和分子生物学检测。 

病毒分离是鸭坦布苏病毒的传统检测方法。病鸭的卵泡膜、脑、脾脏、肝脏等病变组织适宜分离病毒，卵泡膜中最易分离和检测到病毒。鸭坦布苏病毒在鸭胚、鸡胚、鸭胚成纤维细胞及Vero细胞中初次分离的成功率仅为20.6%，低于临床样品RT-PCR 检出率。初次病毒分离阴性时继续盲传3代。 

鸭坦布苏病毒的分子生物学检测方法有RT-PCR、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR等。Maher-Sturgess等根据报道的257个黄病毒的NS5基因中编码甲基转移酶和聚合酶基因的核苷酸序列设计了一对可检测所有黄病毒成员的通用兼并RT-PCR 引物，上游引物为AAYTCIACICAIGARATGTAY，下游引物为CCIARCCACATRWACCA，扩增片段大小为800 bp。胡旭东等、万春和等和Cao 等分别根据E、NS3 基因保守序列，设计引物，建立了可直接检测感染鸭组织中鸭坦布苏病毒的特异、敏感的RT-PCR 检测方法。颜丕熙等建立的套式RT-PCR 方法，灵敏度比常规PCR高10倍，临床样品阳性检出率高于病毒分离率。Yan 等建立了TaqMan 探针荧光定量PCR 方法，灵敏度是常规PCR的100倍。Tang 

黄病毒的血清学检测方法有ELISA、琼扩试验、血凝抑制试验、补体结合试验和中和实验等。姬希文等以纯化的FX2010株作为包被抗原，建立了检测鸭坦布苏病毒血清抗体的间接ELISA法，敏感性和特异性较高，阴阳性临界值判定标准为0.432。

但到目前为止还没有确定一种最具有临床使用价值的基层分子生物学诊断方法。 

反转录-环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)技术是一种等温核酸扩增新技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计3对特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件(63 ℃左右) 保温30～60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，由于不依赖任何专门的仪器设备可实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，目前这一技术已经被用于多种病原微生物的检测。 

LAMP技术具有一下特征： 

1.引物设计

针对靶基因6个特异序列(3’端的F3c、F2c和Flc区以及5’端的Bl、B2

和B3区)设计4条引物：上游内部引物(FIP)、上游外部引物(F3)、下游内部引物(BIP)、下游外部引物(B3)。后来添加了2条环状引物，上游环状引物(LF)和下游环状引物(LB)。国外已建立了LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。挑选最优组合即可。

2．扩增原理 

60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，是一种动态活性温度，因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。

扩增分两个阶段。第1阶段为起始阶段，上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换DNA聚合酶作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链，FIP上的Flc与此单链上的Fl为互补结构，自我碱基配对形成环状结构，以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链，迅速以3’末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构，该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。第2阶段是扩增循环阶段．以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合，开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构，迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板．进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。 

3．产物检测 

(1)电泳检测：LAMP的产物可以用琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察，由于产物是混合物，故呈现出特异的梯状条带，经限制性内切酶酶切之后呈现单一靶序列条带Ⅲ。

(2)荧光检测：SYBR Green I荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA双链结合时，肉眼观察荧光染料由橘黄色变为绿色，紫外线下可以发出荧光。在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量，荧光强度检测可以用实时定量PCR仪进行。 

(3)浊度检测：是其特有也是最常用最便捷的检测方法。在核酸大量合成时．从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀，其具有极高的特异性。只要用肉眼观察或浊度仪在400 nm光下检测浊度就能够判断扩增与否，并对起始模板定量，达到实时定量的检测。 

发明内容：

本发明所要解决的技术问题，就是针对现有技术所存在的不足，而提供一种新发鸭坦布苏病毒RT-LAMP检测方法，来满足临床使用的需要，该方案采用RT-LAMP检测技术，通过对疑似病毒RNA进行提取，逆转录成cDNA后，应用LAMP技术对其进行扩增，若疑似病毒中存在新发鸭坦布苏病毒，则扩增后能得到大量的拷贝，经琼脂凝胶电泳、紫外荧光或者浊度法检测即可得到阳性结果，反之，得到阴性结果，应用此方法既可定性检测，也可做相对定量检测。

本方案是通过如下技术措施来实现的： 

1、引物设计

参考LAMP引物设计原则，在http://primerexplorer对于E基因设计如下引物：

表1  LAMP三对引物详情

  引物均由上海生物工程有限公司合成，使用前用适量DEPC水溶解成20pmol/μL溶液，小量分装，-20℃保存备用。

2、RT-LAMP反应 

病毒RNA提取：参照Trizol 法提取，按照试剂说明书进行。取病毒样品200μL，加750μL的Trizol溶液充分振荡，室温作用10min，加200μL氯仿抽提1次，12,000rpm离心5min，上清液加等体积异丙醇于室温作用10min，12,000rpm离心5min，沉淀用75％的乙醇洗涤，12,000rpm离心5min，加适量的DEPC水溶解沉淀，-20℃保存备用。

RT反应体系（20μL）：25mmol/L Mg²⁺ 0.8～1.6μL、10 mmol/L dNTP 1～3μL、5×RT缓冲液4.0μL、引物BLP BIP和B3各10～30pM、RNA酶抑制剂（40U/μL）0.5μL、RNA模板100pg～1μg。置于PCR扩增仪上进行反应，AMV（5U/μL）1μL于42℃时加入；反应程序：70℃ 5min，42℃ 30min，95℃ 2min。 

LAMP反应体系：25 uL反应体系中dNTP 混合液终浓度为1.2～1.6mmol·L-1，Triton X-100 0.1%，Bst DNA聚合酶6～10U，RT反应所得模板1～5μL，甜菜碱0.5～1M，FIP和BIP各30～50pmol，F3 和B3各2～7pmol，FLP 和BLP各10～30pmol。最佳反应条件为：63℃反应50 min，80℃加热2 min终止反应。 

以上反应体系组分浓度和反应程序是在大量实验基础上优化所得的，使用本方法进行新发鸭坦布苏病毒检测，在保证灵敏度和特异性的前提下，尽量节约了成本。 

3、检测 

RT-LAMP 扩增以后，阳性分离株的扩增试管底部有清晰白色絮状沉淀。采用紫外荧光法，加入SYBR green I在紫外灯观察下可见强烈的黄绿色荧光；而对照组并无荧光显示，如图1。

采用琼脂糖凝胶电泳结果，阳性反应呈现LAMP反应特有的梯度状条带，如图2。 

本方案的有益效果可根据对上述方案的叙述得知，应用RT-LAMP方法检测鸭坦布苏病毒，具有简单、快速、敏感性和特异性强的特点。该方法在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，由于不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，而与病毒分离鉴定、酶联免疫吸附反应、中和试验等检测手段相比，更具有显而易见的优点。同时，在本发明中RNA的RT反应和LAMP反应独立进行，避免了LAMP反应过程中不必要成分的添加和参与，也达到了减少非特异性扩增的目的。 

由此可见，本发明与现有技术相比，具有突出的实质性特点和显著的进步，其实施的有益效果也是显而易见的。 

附图说明：

图1为RT-LAMP扩增后的紫外观察结果，其中1为阳性株，2为阴性对照株。

图2为RT-LAMP扩增后的电泳结果，其中M为marker DL2000，1为阴性对照，2为阳性结果。 

具体实施方式：

　　为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

共采集不同发病鸭场的88份疑似病料，包括肝、脾、肾、脑、卵泡膜等组织，用LAMP进行检测，检测方法如下： 

1、          引物合成

由上海生物工程有限公司合成一下引物

F3：5’- AATGACATGACACCAGTTGGGCA-3’；

B3：5’- ACCATCCTTTGTGCTC-3’；

FIP：5’- ATGGAGGTTCCACTTCCACCTTTTACAGTCAACCCATACGTGT-3’；

BIP：5’- GGTAGGAAGTGGAAAAGGACTTTTTAAAAGCTTTTCCAATTGT-3’；

FLP：5’- GGCACCCGTGGAGGAGGTCG-3’；

BLP：5’- AGATCAGGTACCAGTGGCATAG-3’，

用适量DEPC水溶解成20pmol/μL溶液，小量分装，-20℃保存备用。

2、RT-LAMP反应 

病毒RNA提取：参照Trizol 法提取，按照试剂说明书进行。取88份疑似病毒样品200μL，加750μL的Trizol溶液充分振荡，室温作用10min，加200μL氯仿抽提1次，12,000rpm离心5min，上清液加等体积异丙醇于室温作用10min，12,000rpm离心5min，沉淀用75％的乙醇洗涤，12,000rpm离心5min，加适量的DEPC水溶解沉淀，转入RT反应体系中反应。

RT反应体系（20μL）：25mmol/L Mg²⁺ 1.2μL、10 mmol/L dNTP 2.0μL、5×RT缓冲液4.0μL、下游引物1.0μL、RNA酶抑制剂（40U/μL）0.5μL、RNA模板10.3μL。置于PCR扩增仪上进行反应，AMV（5U/μL）1μL于42℃时加入；反应程序：70℃ 5min，42℃ 30min，95℃ 2min，反应产物转入RT-LAMP反应体系中反应。 

LAMP反应体系：25 uL反应体系中dNTP 混合液终浓度为1.4mmol·L-1，Triton X-100 0.1%，Bst DNA聚合酶8 U，RNA酶抑制剂20U，模板2μL，0.8M甜菜碱，FIP和BIP各40 pmol，F3 和B3各5 pmol，FLP 和BLP各20 pmol。最佳反应条件为：63℃反应50 min，80℃加热2 min终止反应。 

3、检测 

RT-LAMP 扩增以后，采用琼脂糖凝胶电泳结果，阳性反应呈现LAMP反应特有的的梯度状条带，统计阳性样品个数。

4、结果 

LAMP检测结果与病毒分离检测方法和PCR法检测结果对比，如表2，

表2  LAMP检测结果与病毒分离检测方法和PCR法检测结果对比

病料来源(个数)	病毒分离	PCR	RT-LAMP
				肝（20）	p（16）n（4）	p（18）n（2）	p（19）n（1）
肾（18）	p（14）n（4）	p（15）n（3）	p（17）n（1）
				脾（18）	p（17）n（1）	p（17）n（1）	p（18）n（0）
脑（16）	p（13）n（3）	p（15）n（1）	p（15）n（1）
				卵泡膜（16）	p（14）n（2）	p（16）n（0）	p（16）n（0）
总计（88）	p（74）n（14）	p（81）n（7）	p（85）n（3）
				阳性率（%）	84.1%	92.0%	96.6%

其中，p为阳性结果个数   n为阴性结果个数

结果显示LAMP、RT-PCR、病毒分离三种方法的阳性检出率分别为96.6%、92.0%、84.1%。对LAMP法多检测出的四份扩增产物进行序列测定，证明为确诊病料，由此表明操作简单、成本低廉的新发鸭坦布苏病毒RT-LAMP检测方法具有高的灵敏度和特异性，适合大范围推广应用。

本发明并不仅限于上述具体实施方式，本领域普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。 

序列表

<110> 山东省农业科学院家禽研究所

<120> 一种新发鸭坦布苏病毒RT-LAMP检测方法

<160> 8

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> prim_bind

<400> 1

aaytc iacic aigar atgta y 21

<210> 2

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> prim_bind

<400> 2

cciar ccaca trwac ca 17　

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> prim_bind

<400> 3

aatga catga cacca gttgg gc 22

<210> 4

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> prim_bind

<400> 4

aacca tcctt tgtgc tc 17

<210> 5

<211> 43

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> prim_bind

<400> 5

atgga ggttc cactt ccacc tttta cagtc aaccc atacg tgt 43

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> prim_bind

<400> 6

ggtag gaagt ggaaa aggac ttttt aaaag ctttt ccaat tgt 43

<210> 7

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> prim_bind

<400> 7

ggcac ccgtg gagga ggtcg 20

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> prim_bind

<400> 8

agatc aggta ccagt ggcat ag 22

Claims (8)

1.一种用于新发鸭坦布苏病毒RT-LAMP检测的引物组，其特征是，所述的引物组包括以下六条引物：

F3：5’- AATGACATGACACCAGTTGGGCA-3’ 23；

B3：5’- ACCATCCTTTGTGCTC-3’ 16；

FIP：5’- ATGGAGGTTCCACTTCCACCTTTTACAGTCAACCCATACGTGT-3’ 43；

BIP：5’- GGTAGGAAGTGGAAAAGGACTTTTTAAAAGCTTTTCCAATTGT-3’ 43；

FLP：5’- GGCACCCGTGGAGGAGGTCG-3’ 20；

BLP：5’- AGATCAGGTACCAGTGGCATAG-3’ 22。

2.一种包含权利要求1所述六条引物的新发鸭坦布苏病毒RT-LAMP检测方法，其特征是，包括有步骤：疑似病毒RNA的Trizol法提取、RT反应、LAMP反应和扩增产物检测。

3.根据权利要求2所述的新发鸭坦布苏病毒RT-LAMP检测方法，其特征是：所述的RT反应为20μL的PCR反应体系，包括有：

Mg²⁺                                                 20～40pM

dNTP                         10～30pM；

5×RT缓冲液                   4.0μL；

BLP                          10～30pM；

BIP                          10～30pM；

B3                           10～30pM；

RNA酶抑制剂                   20U；

AMV 反转录酶                   5～15U；

疑似RNA模板                 100pg-1μg；

PCR反应程序为：70℃ 5min，42℃ 30min，95℃ 2min。

4.根据权利要求2所述的新发鸭坦布苏病毒LAMP检测方法，其特征是：所述LAMP反应为25μL反应体系，包括有：

dNTP                             30～40pM；

Triton X-100                  0.1%（体积分数）；

Bst DNA聚合酶                     6～10U； 

RT反应所得模板                     1～5μL；

甜菜碱                             0.5～1M；

FIP                                30～50pM；

BIP                                30～50pM；

F3                                  2～7pM；

B3                                  2～7pM；

FLP                                10～30pM；

BLP                                10～30pM；

反应条件为：63℃ 50min，80℃ 2min。

5.根据权利要求3所述的新发鸭坦布苏病毒RT检测方法，其特征是：在RT反应程序达42℃时，加入AMV反转录酶5～15U。

6.根据权利要求3所述的新发鸭坦布苏病毒RT-LAMP检测方法，其特征是：所述的RT反应为20μL的PCR反应体系，包括有：

Mg²⁺                                                 20～40pM

dNTP                         10～30pM；

5×RT缓冲液                   4.0μL；

BLP                          10～30pM；

BIP                          10～30pM；

B3                           10～30pM；

RNA酶抑制剂                   20U；

AMV 反转录酶                   5～15U；

疑似RNA模板                 100pg-1μg；

RT反应程序为：70℃ 5min，42℃ 30min，95℃ 2min。

7.根据权利要求6所述的新发鸭坦布苏病毒RT检测方法，其特征是：在PCR反应程序达42℃时，加入M-MLV 反转录酶5U。

8.根据权利要求4所述的新发鸭坦布苏病毒RT-LAMP检测方法，其特征是：所述LAMP反应为25μL反应体系，包括有：

dNTP                              35pM；

Triton X-100                  0.1%（体积份数）；

Bst DNA聚合酶                      8U； 

RNA 酶抑制剂                       20U；

RT反应所得模板                    3μL；

甜菜碱                             0.8M；

FIP                                40pM；

BIP                                40pM；

F3                                  5pM；

B3                                  5pM；

FLP                                20pM；

BLP                                20pM；

反应条件为：63℃ 50min，80℃ 2min。

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