CN102808041A - 一种利用基因芯片方法检测登革热的方法 - Google Patents

一种利用基因芯片方法检测登革热的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102808041A
CN102808041A CN2012100658731A CN201210065873A CN102808041A CN 102808041 A CN102808041 A CN 102808041A CN 2012100658731 A CN2012100658731 A CN 2012100658731A CN 201210065873 A CN201210065873 A CN 201210065873A CN 102808041 A CN102808041 A CN 102808041A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene chip
dengue
hemorrhagic fever
seq
hybridization
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2012100658731A
Other languages
English (en)
Inventor
杨春江
祁军
柴洪森
詹曦菁
刘寅
窦勇鹰
周君野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TIANJIN EXIT-ENTRANCE CHECK AND GUARANTINE BUREAU
Original Assignee
TIANJIN EXIT-ENTRANCE CHECK AND GUARANTINE BUREAU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TIANJIN EXIT-ENTRANCE CHECK AND GUARANTINE BUREAU filed Critical TIANJIN EXIT-ENTRANCE CHECK AND GUARANTINE BUREAU
Priority to CN2012100658731A priority Critical patent/CN102808041A/zh
Publication of CN102808041A publication Critical patent/CN102808041A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用基因芯片方法检测登革热的方法，设计了通用引物组序列，5’ACAGCMGGIITGGGACACAAGAAT；5’GGTTTRACRCARTCRTCYCCRCT；和用于检测4个不同登革热病毒型的特异性探针5’CCAACCTAGCTGAGAGYGRTCTTGACT；5’TGGTAACYAACCACATGYAAGGATAACARAAGA；5’AGGYGTGTTYTCYAAGYCAGACCTCGAGAACCC；5’AAGGGCTGAAAGAAAGAGTTGAGAAATGGCTGA。针对登革热，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种快速高通量能够分型检测登革热的检测方法。

Description

一种利用基因芯片方法检测登革热的方法
技术领域
本发明涉及病毒检验技术，具体地说是运用基因芯片方法来检测登革热病毒的方法。
背景技术
登革热是登革热病毒引起、依蚊传播的一种急性传染病。临床特征为起病急骤，高热，全身肌肉、骨髓及关节痛，极度疲乏，部分患可有皮疹、出血倾向和淋巴结肿大。本病于1779年在埃及开罗、印度尼西亚雅加达及美国费城发现，并据症状命名为关节热和骨折热。1869年由英国伦敦皇家内科学会命名为登革热。1943年日本科学家首次发现登革热病毒，美国也相继发现这病毒。其病因学直至1944年才被了解，1952年登革热病毒首次被分离了出来，也依血清学方法定出一型登革热病毒(dengue 1 virus)及二型登革热病毒(dengue 2 virus)；1956年在马尼拉从患有出血性疾病的病人身上分别分离出三型登革热病毒(dengue 3 virus)及四型登革热病毒(dengue 4 virus)。
20世纪，登革热在世界各地发生过多次大流行，病例数百万计。在东南亚一直呈地方性流行。我国于1978年在广东流行，并分离出第IV型登革热病毒。此后，于1979、1980、1985年小流行中分离出I、II、III型病毒。
登革热病毒属B组虫媒病毒，现在归入披盖病毒科(togaviridae)黄热病毒属(flavivirus)。病毒颗粒呈哑铃状(700×20--40nm)、棒状或球形(直径为20--50nm)。髓核为单股线状核糖核酸(RNA)。病毒颗粒与乙型脑炎病毒相似，最外层为两种糖蛋白组成的包膜，包膜含有型和群特异性抗原，用中和试验可鉴定其型别。登革病毒可分为4个血清型，与其他B组虫媒病毒如乙型脑炎病毒可交叉免疫反应。其中II型病毒引起登革出血热，其他型病毒引起登革热。按世界卫生组织标准分为典型登革热、登革出血热和登革休克综合征3型。患者有肝、肾、心和脑的退行性变；心内膜、心包、胸膜、胃肠粘膜、肌肉、皮肤及中枢神经系统不同程度的出血；皮疹内小血管内皮肿胀，血管周围水肿及单核细胞浸润。重症患者可有肝小叶中央坏死及淤胆，小叶性肺炎，肺小脓肿形成等。登革出血热病理变化为全身微血管损害，导致血浆蛋白渗出及出血。消化道、心内膜下、皮下、肝包膜下、肺及软组织均有渗出和出血，内脏小血管及微血管周围水肿、出血和淋巴细胞浸润。脑型患者尸检可见蛛网膜下腔及脑实质灶性出血，脑水肿及脑软化。
登革热现在还没有有效的治疗方法，因此快速检测和及时控制传染源对有效的控制该疾病有着重要的意义。
发明内容
针对登革热，本发明提供一种能够简单快速区分4种血清型登革热的检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
(1)制备登革热检测基因芯片；
(2)设计通用引物用于扩增4种不同血清型登革热特异性基因片段；
(3)将扩增产物与基因芯片进行杂交；
(4)扩增完毕后将产物与芯片杂交，杂交后，进行免疫反应，通过芯片上的颜色变化判断检测结果。
该方法包括：应用该方法检测登革热病毒所需要的通用引物和与之配套的PCR反应条件。其中引物序列如下：
引物：
SEQ ID NO.1：5’ACAGCMGGHTGGGACACAAGAAT
SEQ ID NO.2：5’GGTTTRACRCARTCRTCYCCRCT。
核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下：
Figure BSA00000683083700031
核酸扩增程序为：
(1)95℃  10min
(2)95℃  30s
(3)55℃  20s
(4)72℃  30s
(5)回到第(2)步，重复35次
(6)72℃  2min
以及制备检测基因芯片所用的寡核苷酸探针：
登革1型探针
SEQ ID NO.3：5’CCAACCTAGCTGAGAGYGRTCTTGACT
登革2型探针
SEQ ID NO.4：5’TGGTAACYAACCACATGYAAGGATAACARAAGA
登革3型探针
SEQ ID NO.5：5’AGGYGTGTTYTCYAAGYCAGACCTCGAGAACCC
登革4型探针
SEQ ID NO.6：5’AAGGGCTGAAAGAAAGAGTTGAGAAATGGCTGA。
基因芯片的制备方法为将设计的特异性寡核苷酸基因探针点在带有正电荷的尼龙膜(Amersham公司，美国)上，点好样的尼龙膜在长波紫外灯下进行交联5-10min，同时将0.2μL标记有地高辛基团的基因片段也点在每一张尼龙膜上，作为阳性对照，将双蒸水也点在每一张尼龙膜上，作为阴性对照。
3、杂交和杂交斑点的酶联免疫显色，按照地高辛DNA标记与检测试剂盒的说明书进行。
地高辛标记PCR产物和寡核苷酸探针杂交方法如下：
预杂交
预杂交液先预热到50℃，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入预杂交袋中，加入预杂交液，封好口，于50℃预杂交30min。
PCR扩增产物的变性
DIG标记的PCR产物加热到95℃，10min，迅速插入冰浴。
地高辛标记的靶DNA分子与尼龙膜杂交
把预杂交好的尼龙膜放入杂交袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10μL，再加入1mL杂交液(Roche公司的Dig Easy Hyb溶液)，封好口。50℃杂交1hr，温和摇动。
杂交阳性斑点的酶联免疫显色
杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。
结果判读
尼龙膜上的深蓝色斑点为阳性杂交结果，表明探针已检出样品中所含有的特异性序列。
该引物序列及探针序列参照GenBank EU677174.1 Dengue virus 1 isolateDENV-1/VN/BID-V1550/2007，complete genome中的序列中的NS5基因。
本发明用特异性的芯片检测登革热病毒，反应后目测结果未发现假阳性和假阴性的结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：相比传统生理生化检测方法，基于基因芯片方法适用于高通量检测登革热病毒能够一次检出相关病毒属于哪种血清型。大大提高了效率节约了时间，避免了反复培养，节约时间；该鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。
附图说明
图1基因芯片模式图，P系列为3个平行的阳性参照点，N系列为3个平行的阴性参照点，1系列点为3个平行的登革热1型探针点，2系列点为3个平行的登革热2型探针点，3系列点为3个平行的登革热3型探针点，4系列点为3个平行的登革热3型探针点。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
实施例1
样本：某待测样品。
1.样品处理
将样品混匀处理。
2.核酸抽提
取样品在PBS中重悬，使用RNA抽提试剂盒根据说明书要求进行RNA抽提。
3.cDNA的制备
将总RNA使用RNA逆转录试剂盒，根据说明书要求逆转录RNA为cDNA。
4.PCR扩增
等温扩增体系中反应体系中各组分构成比例如下
核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下：
核酸扩增程序为：
(1)95℃  10min
(2)95℃  30s
(3)55℃  20s
(4)72℃  30s
(5)回到第(2)步，重复35次
(6)72℃  2min
5.预杂交
预杂交液先预热到50℃，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入预杂交袋中，加入预杂交液，封好口，于50℃预杂交30min。
PCR扩增产物的变性
DIG标记的PCR产物加热到95℃，10min，迅速插入冰浴。
地高辛标记的靶DNA分子与尼龙膜杂交
把预杂交好的尼龙膜放入杂交袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10μL，再加入1mL杂交液(Roche公司的Dig Easy Hyb溶液)，封好口。50℃杂交1hr，温和摇动。
杂交阳性斑点的酶联免疫显色
杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。
结果判读
尼龙膜上阳性参照和登革1型探针呈现的深蓝色斑点为阳性杂交结果，表明探针已检出样品中所含有的特异性序列，样品含有登革1型核酸。
实施例2
样本：某待测样品。
1.样品处理
将样品混匀处理。
2.核酸抽提
取样品在PBS中重悬，使用RNA抽提试剂盒根据说明书要求进行RNA抽提。
3.cDNA的制备
将总RNA使用RNA逆转录试剂盒，根据说明书要求逆转录RNA为cDNA。
4.PCR扩增
等温扩增体系中反应体系中各组分构成比例如下
核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下：
Figure BSA00000683083700071
Figure BSA00000683083700081
核酸扩增程序为：
(1)95℃  10min
(2)95℃  30s
(3)55℃  20s
(4)72℃  30s
(5)回到第(2)步，重复35次
(6)72℃  2min
5.预杂交
预杂交液先预热到50℃，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入预杂交袋中，加入预杂交液，封好口，于50℃预杂交30min。
PCR扩增产物的变性
DIG标记的PCR产物加热到95℃，10min，迅速插入冰浴。
地高辛标记的靶DNA分子与尼龙膜杂交
把预杂交好的尼龙膜放入杂交袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10μL，再加入1mL杂交液(Roche公司的Dig Easy Hyb溶液)，封好口。50℃杂交1hr，温和摇动。
杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。
结果判读
尼龙膜上阳性参照和登革1型探针呈现的深蓝色斑点为阳性杂交结果，表明探针已检出样品中所含有的特异性序列，样品含有登革1型核酸。
Figure ISA00000683083900011
Figure ISA00000683083900021

Claims (5)

1.一种利用基因芯片方法检测登革热的方法，其特征在于，包括以下两个引物：
SEQ ID NO.1：5’ACAGCMGGHTGGGACACAAGAAT
SEQ ID NO.2：5’GGTTTRACRCARTCRTCYCCRCT。
2.根据权利要求1所述的一种利用基因芯片方法检测登革热的方法，其特征在于，包括以下四个探针：
登革1型探针
SEQ ID NO.3：5’CCAACCTAGCTGAGAGYGRTCTTGACT
登革2型探针
SEQ ID NO.4：5’TGGTAACYAACCACATGYAAGGATAACARAAGA
登革3型探针
SEQ ID NO.5：5’AGGYGTGTTYTCYAAGYCAGACCTCGAGAACCC
登革4型探针
SEQ ID NO.6：5’AAGGGCTGAAAGAAAGAGTTGAGAAATGGCTGA。
3.根据权利要求1所述的一种利用基因芯片方法检测登革热的方法，其特征在于，核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下：
Figure FSA00000683083600011
4.根据权利要求1所述的一种利用基因芯片方法检测登革热的方法，其特征在于，核酸扩增程序为：
(1)95℃  10min
(2)95℃  30s
(3)55℃  20s
(4)72℃  30s
(5)回到第(2)步，重复35次
(6)72℃  2min。
5.根据权利要求1所述的一种利用基因芯片方法检测登革热的方法，其特征在于，标记的PCR产物与芯片的杂交温度为50℃。
CN2012100658731A 2012-03-14 2012-03-14 一种利用基因芯片方法检测登革热的方法 Pending CN102808041A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012100658731A CN102808041A (zh) 2012-03-14 2012-03-14 一种利用基因芯片方法检测登革热的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012100658731A CN102808041A (zh) 2012-03-14 2012-03-14 一种利用基因芯片方法检测登革热的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102808041A true CN102808041A (zh) 2012-12-05

Family

ID=47231910

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012100658731A Pending CN102808041A (zh) 2012-03-14 2012-03-14 一种利用基因芯片方法检测登革热的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102808041A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103898240A (zh) * 2014-04-03 2014-07-02 河北国际旅行卫生保健中心 检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法
CN104480221A (zh) * 2014-11-21 2015-04-01 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法
CN108342476A (zh) * 2018-05-02 2018-07-31 北京泱深生物信息技术有限公司 C15orf57基因在制备诊断登革热和登革出血热的产品中的应用
CN113430304A (zh) * 2021-08-16 2021-09-24 广州医科大学附属市八医院 登革病毒分型检测用的多重实时荧光定量pcr引物、探针、试剂盒及试剂盒的使用方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1963515A (zh) * 2005-11-10 2007-05-16 北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 一种登革热病毒抗体胶体金检测试纸条
WO2007133167A1 (en) * 2006-05-11 2007-11-22 National Environment Agency Antigen capture anti-dengue iga elisa (aca-elisa) for the detection of a flavivirus specific antibody
CN101100694A (zh) * 2007-08-21 2008-01-09 深圳国际旅行卫生保健中心 一种检测登革热病毒的试剂盒及其专用扩增引物与探针

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1963515A (zh) * 2005-11-10 2007-05-16 北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 一种登革热病毒抗体胶体金检测试纸条
WO2007133167A1 (en) * 2006-05-11 2007-11-22 National Environment Agency Antigen capture anti-dengue iga elisa (aca-elisa) for the detection of a flavivirus specific antibody
CN101100694A (zh) * 2007-08-21 2008-01-09 深圳国际旅行卫生保健中心 一种检测登革热病毒的试剂盒及其专用扩增引物与探针

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103898240A (zh) * 2014-04-03 2014-07-02 河北国际旅行卫生保健中心 检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法
CN103898240B (zh) * 2014-04-03 2016-04-27 河北国际旅行卫生保健中心 检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法
CN104480221A (zh) * 2014-11-21 2015-04-01 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法
CN108342476A (zh) * 2018-05-02 2018-07-31 北京泱深生物信息技术有限公司 C15orf57基因在制备诊断登革热和登革出血热的产品中的应用
CN113430304A (zh) * 2021-08-16 2021-09-24 广州医科大学附属市八医院 登革病毒分型检测用的多重实时荧光定量pcr引物、探针、试剂盒及试剂盒的使用方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106119413B (zh) 一种艾滋病病毒多重荧光pcr检测试剂盒及检测方法
CN105112559B (zh) 一种用于检测冠状病毒的试剂盒及其应用
CN107299155A (zh) 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针
US7714122B2 (en) Nucleic acid molecules and kits including VP1 and VP3 nucleic acid molecules, useful for detecting and identifying enteroviruses
KR20180052317A (ko) 메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
CN110669870B (zh) 一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒
CN102808041A (zh) 一种利用基因芯片方法检测登革热的方法
CN106755571A (zh) 一种用于检测寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒的试剂盒
CN102965451A (zh) 一种a组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒及其引物和探针
CN110106285A (zh) 一种快速检测3型人腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法
CN101328507B (zh) 肠道病毒ev71核酸荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN102242223A (zh) 手足口病lamp检测试剂盒及其检测方法
CN111304365A (zh) 新型小鹅痛风病毒的一步法环介导等温检测试剂及其应用
CN106987657B (zh) 用于鉴别牛病毒腹泻病毒和牛轮状病毒的引物组合及其应用
CN103146846A (zh) 一种基于单一标准品的四色荧光定量pcr方法和试剂盒
CN103173568A (zh) 一种快速鉴定1型登革热病毒的引物组、试剂盒及方法
CN102108420B (zh) 一种检测登革1型病毒的荧光定量pcr试剂盒
CN110643740B (zh) 帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒
CN108384893A (zh) 用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的实时荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用
CN109897914B (zh) 一种同时检测yfv、rvfv、wnv和denv四种病毒的引物及其检测方法
CN102643927A (zh) 手足口病检测试剂盒及其检测方法
CN113265488B (zh) 共同检测流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒的rpa-lfd引物、探针及试剂盒
CN102912038B (zh) 一种检测禽流感病毒的rt-hda试剂盒及引物
CN103045763A (zh) 一种新发鸭坦布苏病毒rt-lamp检测方法
CN107988429B (zh) 一种检测狂犬病毒的试剂及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
DD01 Delivery of document by public notice

Addressee: Tianjin Exit-Entrance Check and Guarantine Bureau

Document name: Notification that Application Deemed to be Withdrawn

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20121205