CN102021249B

CN102021249B - 反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的引物组

Info

Publication number: CN102021249B
Application number: CN 201010553870
Authority: CN
Inventors: 任晓峰; 李鹏冲; 李广兴
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2010-11-22
Filing date: 2010-11-22
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2030-11-22
Also published as: CN102021249A

Abstract

本发明提供一种反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的方法。根据PEDV N蛋白保守区域基因，设计针对靶基因上6个区域的3对引物，合成两条RT-PCR引物，使用RT-LAMP技术鉴定PED病毒；RT-PCR反应；获得的RNA进行反转录；获得的cDNA用于PCR反应；确保了扩增的特异性，扩增速度快，可在30～60min内获得结果，无需电泳实现肉眼观察扩增效果。使用酶混合物，可在恒温65℃情况下，1h内实现反转录和核酸扩增，RT-LAMP的检测是在LAMP扩增DNA的基础上，加入了反转录酶而实现扩增检测RNA，反转录和扩增一步完成，省去了传统RT-PCR要先进行的反转录步骤。

Description

反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的引物组

(一)技术领域

本发明涉及分子生物学，具体说就是一种反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的方法。

(二)背景技术

环介导恒温扩增技术(LAMP，Loop-mediated Isthermal Amplification)是一种敏感的链取代核酸扩增技术，是由日本学者Notomi等于2000年发明的。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件保温几十分钟，即可完成扩增反应，可以在1h之内，将靶DNA片段扩增10⁹～10¹⁰倍，不需要模板的热变性、长时间的温度循环等过程，便于推广应用。RT-LAMP是在LAMP扩增检测DNA的基础上，加入反转录酶而达到扩增检测RNA的效果，在恒温(65℃)条件下同时进行反转录和核酸扩增。

1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mllis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(PCR)。该法是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸，直至完成新的DNA合成。PCR的缺点：(1)常引起非特异性扩增。(2)需要比较昂贵的PCR仪。(3)扩增时间较长，一般需要几小时，不利于在基层实验室推广应用。(4)产物需要在琼脂糖凝胶上进行电泳，在紫外线下观察条带。(5)RT-PCR需要先进行反转录步骤，得到cDNA才能当做PCR的模板进行扩增。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的方法。

本发明的目的是这样实现的：

步骤一：设计引物：根据PEDV N蛋白保守区域基因，设计针对靶基因上6个区域(下划线部分)的3对引物：FIP、BIP、F3、B3、F-loop、B-loop；根据文献(张素芳等，2004.猪流行性腹泻病毒嵌套式RT -PCR检测方法的建立.中国病毒学.19(2)：174-176)合成两条RT-PCR引物(PED1、PED2)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，模板及引物序列如下：

AATCCAGGGCCACTTCGAAGGAACGTGACCTCAAAGACATCCC

AGAGTGGAGGAGAATTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTAGCAGCT

TGCTTCGGACCCAGAGGGGGCTTCAAAAACTTTGGAGATGCGG

AATTTGTCGAAAAAGGTGTTGATGCGTCAGGCTATGCTCAGATC

GCCAGTTTAGC

步骤二：病毒的制备：状态良好的Vero细胞接种于6孔板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞长满单层后，弃去培养液，用PBS洗涤一次，加入PED病毒液500μl/孔，含无EDTA胰酶40μg/ml，37℃孵育1小时，每孔补加DMEM 2.5ml，含无EDTA胰酶40μg/ml，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待80％以上细胞产生病变时取出培养板，冻融3次，收集病毒液用于RNA提取；

步骤三：RNA的提取：取3mlPED病毒液，3000rpm离心10分钟去细胞碎片，上清转移至新离心管中，加入等体积预冷的PEG8000，颠倒混匀，室温放置30min或4℃放置过夜，12000rpm离心5min，弃去上清，沉淀用100μlDEPC水重悬，使用RNA抽提试剂盒提取总RNA；

步骤四：RT-LAMP反应：

RT-LAMP反应体系

FIP、BIP	各4μl
		F3、B3	各0.5μl
F-loop、B-loop	各2μl
		dNTPs(10mM)	1.5μl
Bst DNA polymerase	1μl
		10×ThermoPol	2.5μl
M-MuLV	1μl
		RNA	1μl
H₂O	补至25μl

65℃恒温水浴1小时，85℃10min终止反应，产物于2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，阴性对照用灭菌水代替RNA模板；

步骤五：RT-PCR反应：步骤三获得的RNA按照海基反转录酶说明书进行反转录，获得的cDNA用于PCR反应，反转录体系及条件如下：

PCR反应体系

2×HG PCR buffer	12.5μl
		dNTPs(2.5mM)	2.5μl
PED1	0.5μl
		PED2	0.5μl
cDNA	1μl

[0022]

super Taq DNA Polymerase	0.5μl
		H₂O	补至25μl

反应条件：95℃5min，94℃8s，47℃8s，72℃10s，72℃2min，30个循环，PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

本发明一种反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的方法，首次使用RT-LAMP技术鉴定PED病毒，并且进一步缩短了检测时间，降低了成本，为由猪流行性腹泻疾病的快速诊断提供了技术支持。根据较保守的N基因设计了针对靶基因上6个区域的3对引物，这就更大程度上的确保了扩增的特异性；扩增速度快，可在30～60min内获得结果，可无需电泳实现肉眼观察扩增效果；使用酶混合物，可在恒温(65℃左右)情况下，1h内实现反转录和核酸扩增，RT-LAMP的检测是在LAMP扩增DNA的基础上，加入了反转录酶而实现扩增检测RNA，反转录和扩增一步完成，省去了传统RT-PCR要先进行的反转录步骤，；对PED病毒的检测快速、敏感、高效、简便，在基层实验室甚至现场均可进行操作；若开发相应的检测试剂盒，有望成为简易的常规检测手段。

(四)附图说明

图1为本发明的LAMP扩增原理图；

图2为本发明的RT-LAMP反应琼脂糖凝胶电泳图，其中：M：8000marker；1：PEDV RT-LAMP；2：阴性对照；

图3为本发明的RT-LAMP反应特异性检测电泳图，其中：M：2000marker；1：PEDV；2：TGEV；3：PRRS；4：PRV；5：PrV；6：IBV；

图4为本发明的RT-LAMP敏感性检测电泳图；M：2000marker；1～8：PEDV RNA 10⁰～10^-7稀释为模板进行RT-LAMP；

图5为本发明的RT-PCR敏感性检测电泳图，其中：

M：2000marker；1～8：RNA 10⁰～10^-7稀释为模板进行RT-PCR。

(五)具体实施方式

下面结合附图举例对本发明作进一步说明。

实施例1：本发明一种反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的方法，步骤如下：

步骤一：设计引物：根据PEDV N蛋白保守区域基因，设计针对靶基因上6个区域(下划线部分)的3对引物：FIP、BIP、F3、B3、F-loop、B-loop；根据文献合成两条RT-PCR引物(PED1、PED2)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，模板及引物序列如下：

AATCCAGGGCCACTTCGAAGGAACGTGACCTCAAAGACATCCC

AGAGTGGAGGAGAATTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTAGCAGCT

TGCTTCGGACCCAGAGGGGGCTTCAAAAACTTTGGAGATGCGG

AATTTGTCGAAAAAGGTGTTGATGCGTCAGGCTATGCTCAGATC

GCCAGTTTAGC

步骤四：RT-LAMP反应：

RT-LAMP反应体系

PCR反应体系

2×HG PCR buffer

12.5μl

[0049]

dNTPs(2.5mM)	2.5μl
		PED1	0.5μl
PED2	0.5μl
		cDNA	1μl
super Taq DNA Polymerase	0.5μl
		H₂O	补至25μl

实施例2：结合图1，本发明一种反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的方法，针对靶基因上6个区域设计3对引物，提高了反应的特异性，减少了非特异反应的产生。由于LAMP反应在恒温条件下进行，所以设备简单，只需水浴锅即可。LAMP反应不像PCR反应一样需要热变性来将双链DNA变成单链，因为双链DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一条引物与双链DNA的互补部位进行碱基互补配对延伸的时候，另一条链就会脱落变成单链。LAMP方法正是利用这一特点进行反应的，不需要进行多次温度变化循环，扩增效率高，时间短。LAMP反应产物可以用肉眼观察、添加荧光染料法、琼脂糖凝胶电泳法等多种方式检测，方便快捷。并且，反转录和扩增可以一步完成，省去了RT-PCR反转录的步骤，节约时间，节省实验材料。

实施例3：技术原理：2000年日本学者Notomi等人发明了一种叫做环介导等温扩增(LAMP)的新方法。该法利用4种(或6种)不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，且可在等温条件进行扩增反应。扩增效率高，可以在15～60min扩增10⁹～10¹⁰倍。

引物的设计：

基于靶基因3’端的F3c、F2c和F1c区以及5’端的B1、B2和B3区等6个不同的位点设计3对引物。FIP引物：上游内部引物，由F2区组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，与靶基因5’端的F1c 区域序列相同。F3引物：上游外部引物，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。BIP引物：下游内部引物，由B2区组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，与靶基因5’端的B1c区域序列相同。B3引物：下游外部引物，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。F-loop、B-loop引物：环引物，分别在F1c和F2之间、B1c、B2之间。

扩增原理：

DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。在链置换型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区段的3’末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补，以3’末端为起点，通过链置换型DNA聚合酶的作用，一边置换先头FIP引物合成的DNA链。一边合成自身DNA，如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链，这条单链在5’末端存在互补的F1c和F1区段，于是发生自我碱基配对，形成环状结构。同时，BIP引物同该单链杂交结合，以BIP引物的3’端为起点。合成互补链，在此过程中环状结构被打开。接着，类似于F3，B3引物从BIP引物外侧插入，进行碱基配对，以3’端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互补链。通过上述两过程，形成双链DNA。而被置换的单链DNA两端存在互补序列，自然发生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构。该结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构。至此为止的所有过程都是为了形成LAMP法基因扩增循环的起点结构。LAMP法基因扩增循环：首先在哑铃状结构中，以3’末端的F1区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应。解离由F1区段合成的双链核酸。同样，在解离出的单链核酸上也会形成环状结构。在环状结构上存在单链形式B2c，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增。经过相同的过程，又形成环状结构。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构(图1)(Loop-mediated isothermal amplification of DNA Nucleic Acids Research，2000，Vol.28，No.12)。

RT-LAMP的检测原理是在LAMP扩增检测DNA的基础上，加入反转录酶而达到扩增检测RNA的效果，在恒温(65℃)条件下同时进行反转录和核酸扩增。由于LAMP扩增效率极高，所以只要有少量的cDNA即可实现核酸的大量扩增，所以不必需要常规RT-PCR所必须的反转录步骤，如果再加入上下游的环引物，整个RT-LAMP扩增效率会大幅度提高，在1h内实现。

LAMP扩增产物的检测

(1)荧光定量检测：利用SYBR Green I荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA双链结合时，发出较原先强800～1000倍的荧光的原理，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。在核酸大量合成时，SYBR Green I能自动掺入双链DNA，通过检测所产生的荧光强度，获取Ct值，比照标准曲线，可确定模板DNA的起始拷贝数。

(2)目视检测：在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀。反应方程式如下：(DNA)_n-1+dNTP＝(DNA)_n+P₂O₇ ^4-P₂O₇ ^4-+2Mg²⁺＝Mg₂P₂O₇(沉淀)，是反应物呈混浊状具有极高的特异性，只要用肉眼观察或浊度仪在400nm光下，检测沉淀浊度就能够判断扩增与否。

(3)实时检测：由于反应的副产物——焦磷酸镁和反应产物的量成一定的比例关系，MOI等建立了实时检测方法，在LAMP反应温度下，通过实时浊度计检测产物的浊度变化，进行实时定量分析。研究表明当起始模板拷贝数在2×10³～10⁹范围内时，在扩增过程中反应液的混浊度将与扩增产物量成正比例关系；并且在这个范围内到达阈值所需要时间(thresholdtimes，Tt)与起始模板数量的对数值成线性关系。日本已利用这种特性研制出专门用于LAMP检测的实时监控浊度仪，可以实现对LAMP扩增过程的全程实时监控。

(4)电泳检测：在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，由于LAMP反应原理的特点，其扩增产物时各种不同长度的茎-环状结构，电泳后在紫外下观察可见特异性的梯状条带产生。

试验方法：

引物的设计：

根据PEDV N蛋白保守区域基因，设计了针对靶基因上6个区域的3对引物：FIP、BIP、F3、B3、F-loop、B-loop。根据文献合成两条RT-PCR引物(PED1、PED2)。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列如下：

模板的制备和RNA的提取：

状态良好的Vero细胞接种于6孔板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞长满单层后，弃去培养液，用PBS洗涤一次，加入PEDV病毒液500μl/孔，含无EDTA胰酶40μg/ml，37℃孵育1小时，每孔补加DMEM 2.5ml，含无EDTA胰酶40μg/ml。置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待80％以上细胞产生病变时取出培养板，冻融3次，收集病毒液用于实验或-70℃保存。

取3mlPED病毒液，3000rpm离心10分钟去细胞碎片，上清转移至新离心管中，加入等体积预冷的PEG8000，反复颠倒数次，室温放置30min或4℃放置过夜。12000rpm离心5min，弃去上清，沉淀用100μlDEPC水重悬，使用RNA抽提试剂盒提取总RNA。

2.2.2.3RT-LAMP反应及其优化

RT-LAMP反应体系

65℃恒温水浴1小时，85℃10min终止反应。产物于2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。阴性对照用灭菌水代替RNA模板。

在此基础上，分别对反应时间以及反应温度进行优化，并进行了反应特异性和灵敏性的检测。

RT-PCR反应体系及条件：

反转录按照海基反转录酶说明书进行。

PCR反应体系

2×HG PCR buffer	12.5μl
		dNTPs(2.5mM)	2.5μl
PED1	0.5μl
		PED2	0.5μl
cDNA	1μl
		super Taq DNA Polymerase	0.5μl
H₂O	补至25μl

反应条件：95℃5min，94℃8s，47℃8s，72℃10s，72℃2min，30个循环。PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

实施例4：本发明一种反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的方法，是根据PEDV N基因的6个区域设计了3对引物，若根据N基因的其他区域或者PEDV的其他基因，也可以设计并完成类似检测。在反应混合物的配比上，适当调整反应混合物个组分比例，也可能得到类似结果，在反应的时间和温度方面，在一定范围内，均可以得到有效扩增。本发明的技术关键点是：(1)模板6个区域的选择和引物的设计。(2)反应混合物各组分的比例。(3)反应时间和温度的选择。

Claims

1.一种反转录-环介导等温扩增检测猪传染性胃肠炎的RT-LAMP引物组，其特征在于，核苷酸序列如下所示：

(1)FIP：

AGCTGCTACGCTATTTTCGCCCTTTTGGAACGTGACCTCAAAGACA；

(2)BIP：

GGACCCAGAGGGGGCTTCAATTTTAGCCTGACGCATCAACAC；

(3)F3：

AATCCAGGGCCACTTCGA；

(4)B3：

GCTAAACTGGCGATCTGAGC；

(5)F-loop：

TTGGGAATTCTCCTCCACTCTG；

(6)B-loop：

TGGAGATGCGGAATTTGTCG。