CN103667521A - 一组用于检测虹彩病毒的引物及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一组用于检测虹彩病毒的引物及检测方法，所述的引物与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分。本发明所述检测虹彩病毒的方法，采用上述引物，通过环介导等温扩增法，特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。本发明用于检测虹彩病毒的引物灵敏度高、特异性强；本发明虹彩病毒的检测方法，采用的环介导等温扩增反应，反应时间短、操作简单，能够满足市场的需求。
Description
技术领域
本发明涉及海水鱼类感染病毒检测技术领域，特别涉及一种虹彩病毒的快速检测方法。
背景技术
虹彩病毒（Iridovirus）是近年来新发现的一种最严重的鱼类传染性病毒之一，可在野生和养殖的鱼类中引起较高的发病率和死亡率，能引起鲈脾肿大症、石首鱼暴发性传染病、真鲷虹彩病毒病、牙鲆淋巴囊肿病、石斑鱼慵懒病、甲鱼“红脖子病”等近百种水生动物疾病，症状主要表现在脾脏肿大及其细胞坏死等现象，死亡率高达30%（成年鱼）-100%（鱼苗），危害性极大。近年来，这种病毒在东亚和东南亚地区引起的鱼类疾病已呈明显上升趋势，在海水养殖鱼类中有很多报道，致使鱼类大面积的死亡，造成了严重的经济损失，因而被称为“海洋口蹄疫”。
组织培养法一直是虹彩病毒检测的“金标准”方法，虽然其特异性较强，但检测步骤复杂，耗时较长，且灵敏度偏低。
近年来，针对虹彩病毒的检测，先后建立了间接荧光抗体检测方法、酶联免疫吸附（ELISA）检测方法等。然而这些免疫学检测方法也存在缺点，比如检测时间较长，往往需要5-6小时才能出结果，而且需要制备单克隆抗体，技术成本较高。
随着分子生物学的飞速发展，对虹彩病毒的检测手段也有了快速的发展。例如采用聚合酶链式反应（PCR）和实时聚合酶链式反应（real-time PCR）检测虹彩病毒。这些方法快速简单，灵敏度高，反应时间较以前的方法短，但仍需要较长时间，而且需要使用PCR仪等贵重仪器，对使用范围有限制。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一组用于检测虹彩病毒的引物及其检测方法。
一组用于检测虹彩病毒的引物，所述的引物与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分。
作为本发明一组用于检测虹彩病毒的引物，为SEQ ID NO.1～6所示的寡核苷酸，或者SEQ ID NO.1～6所示的寡核苷酸的互补链。
本发明还提供一种检测虹彩病毒的方法，采用的引物可以与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分；通过环介导等温扩增法，特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。
作为本发明检测虹彩病毒的方法的优选实施方式，本发明检测虹彩病毒的方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）准备检测样本；
（2）提取样本的总DNA；
（3）对步骤（2）的DNA进行环介导的等温核酸扩增反应，反应温度为60～65℃，反应时间为10～60分钟；
（4）终止反应；
（5）检测所述扩增引物。
作为本发明检测虹彩病毒的方法的优选实施方式，所述的方法的步骤（5）所述的检测是通过扩增产物凝胶电泳、扩增产物浊度观测或扩增产物化学发光检测的方法进行的。
作为本发明检测虹彩病毒的方法的优选实施方式，所述的检测样本选自下列样本:
(1)海水鱼类的感染组织；或者
(2)海水鱼类的细胞培养物。
本发明用于检测虹彩病毒的引物灵敏度高、特异性强；本发明虹彩病毒的检测方法，采用的环介导等温扩增反应，反应时间短、操作简单，能够满足市场的需求。
附图说明
图1是环介导等温扩增反应产物的特征性梯状条带和酶切鉴定电泳图：泳道M：marker；泳道1：扩增产物用限制性内切酶MstⅠ酶切产物，得到217bp，252bp大小的两条主带，说明是特异性扩增；泳道2：扩增原始产物，表现出特征性的梯状条带，不能通过片段的大小来鉴别是否为非特异性扩增；
图2是等温孵育不同时间的产物含量的电泳图：在20分钟时就出现了特征性扩增条带，表明20分钟即可完成反应；泳道M:marker；泳道N：阴性对照；其他泳道为不同时间的产物，数字代表时间，单位：分钟；
图3是灵敏度实验结果的电泳图：泳道M：marker；泳道N：阴性对照；泳道0到－6表示病毒DNA模板按5倍稀释后（标号取5的对数log5，－1即稀释5倍）的扩增产物；图上半部分是利用F3和B3做PCR的电泳结果，产物约210bp；图下半部分是本发明方法的结果，可得该方法比PCR灵敏25倍左右；
图4是肉眼可视观察实验结果，省略电泳所需的时间和设备：P1和P2是阳性反应，N1和N2是阴性反应；其中，N2和P2都加了SYBR GreenⅠ荧光染料；在P1的体系中，可以看见混浊的白色副产物，稍微离心，可见沉淀于底部；P2中的染料由N2所显示的橙黄色（染料的本色）变为绿色。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
本发明中“核酸”或“多核苷酸”是指任何长度的含嘌呤和嘧啶的聚合物，可以是多核糖核苷酸，可以是多脱氧核糖核苷酸，或是混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。它包括单链和双链分子，例如DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA杂合体，以及通过与氨基酸主链共轭碱基形成的“蛋白质核酸”（PNA）。它还包括含有修饰碱基的核酸。
本发明中“引物”是长度约为5个至50个核苷酸的寡核苷酸，优选长度为大约6个至25个核苷酸，特别优选长度为大约6个至18个核苷酸，它与相关的单链核酸序列形成一个双链体，并且可以用例如DNA聚合酶使互补链发生聚合反应。
本发明中核酸序列的“互补链”是指参与与原始序列沃森-克里克碱基配对的反义序列。
实施例1
一组用于检测虹彩病毒的引物，所述的引物与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒核苷酸序列的一部分。所述的引物，为SEQ ID NO.1～6所示的寡核苷酸。
表1引物序列
上述序列号1～6的引物对应SEQ ID NO.1～6的引物。
本发明的检测虹彩病毒引物，灵敏度高、特异性强。6条引物共识别8个区域，充分保证其特异性。其中F3和B3是外引物，在起始扩增反应时起作用；FIP和BIP称为内引物，在整个扩增过程都起作用，是最关键的一对引物，导致产生环状的茎环结构而无限扩增；FL和BL称为环状引物，用于提高反应速率。
实施例2
一种检测虹彩病毒的方法，该方法用于检测样本中是否存在虹彩病毒，所述的方法采用本发明用于检测虹彩病毒的引物组，通过环介导等温扩增法(LAMP)，特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。
LAMP扩增主要利用了Bst DNA聚合酶大片段的两大特性：一是DNA聚合酶具有5'→3'DNA聚合酶活性，能在恒温状态下扩增DNA核酸；二是Bst DNA聚合酶不具有5'→3'外切核酸酶活性，能将新合成的核酸单链从新生成的DNA双链上置换（取代）下来，形成两条独立的核酸单链以开启下一轮的DNA核酸合成；进而免去了每次扩增前的DNA变性环节。在此基础上，巧妙地设计能识别6个（或8个）独立DNA序列的LAMP引物组（4引物组或6引物组），使得Bst DNA聚合酶的两大特性充分发挥。其中，内引物（BIP、FIP）的设计是LAMP引物设计的亮点、难点。
Bst DNA聚合酶大片段是Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，来源于E.coli菌株，此菌株含有来自Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的基因，该基因不具有5'→3'外切核酸酶活性。应用基因重组技术，将麦芽糖结合蛋白(MBP)基因与该基因融合表达，纯化后再去除麦芽糖结合蛋白。
第一阶段：扩增始发物形成
1步：当双链DNA处于65℃左右的动态平衡中时，引物组中的BIP引物就能通过互补结合到目标DNA双链上，在Bst DNA聚合酶作用下，启动DNA合成。
2步：从BIP的B2区域3’端开始合成DNA模板的互补链至F3C；
3步：B3引物退火结合到模板DNA的互补区域B3C，启动链取代合成，同时释放由BIP引物引导合成的互补链。
4步：释放的DNA的B1C区域结合B1区域，形成茎环结构；1.3步释放的DNA链作为FIP引物以及F3引物的模板，按BIP端相同的模式启动DNA的合成及链取代，释放的DNA链在FIP端同样形成茎环结构。进而，形成哑铃形结构扩增始发物。
第二阶段：延伸
5步：哑铃结构通过自引导DNA合成迅速转换成茎环结构DNA；
6步：BIP引物与茎环结构的环状单链区域结合并开始新的DNA合成，由于F1及F1C的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的DNA链得以释放；
7步：FIP引物同样与对应的茎环结构的环状单链区域结合，由于B1及B1C的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的DNA链得以释放；
8步:如此周而复始扩增，最终形成不同长度（目的片断长度的自然数倍）花椰菜cauliflower状的反向重复序列。
2.引物设计：
LAMP引物的设计比常规PCR要复杂的多。一个反应至少包括4条引物，包括一对内引物（FIP和BIP，各约40bp）和一对外引物（F3和B3，各约25bp）；如果添加一对环引物（loop primer），反应便可以加速，反应时间减半，大大增加扩增检测的效率。Primer Explorer version3软件可以专门设计各种特异LAMP引物，用户只需按要求提交目的片断序列，设置相关参数，系统便能产生多种引物组合供用户选择。此外，LAMP引物可以人工设计，各引物的组成（请见表2），引物设计的其他技术细节及注意事项可参考相关文献（Tsugunori Notomi等，2000；K.Nagamine等，2002）。
表2LAMP引物组成
3.反应体系及设备：
25ul LAMP反应的基本体系如下:内引物FIP、BIP各0.8mM，外引物F3、B3各0.2mM，（需要时，环引物LF、LB各0.4mM），1.6mM dNTPs，1M betaine甜菜碱(Sigma)，反应缓冲液（20mM Tris-HCl(pH8.8),10mM KCl,10mM(NH4)2SO4,4mM MgSO4,0.1%Triton X-100），8个单位Bst DNA polymeraselarge fragment(New England Biolabs)以及模板DNA。模板DNA在恒温扩增前95℃孵育5mins（Tsugunori Notomi等，2000），但后续研究表明，未经95℃变性的DNA模板可以直接进入恒温扩增（60～65℃for45～60mins）。为防止非特异扩增，须80℃孵育2～5mins。
由于LAMP反应无需循环变温，所以仅需水浴锅或其他恒温加热器便可。
4.扩增结果判定
扩增结果有三种判定方法：1）核酸的琼脂糖凝胶电泳，染料可以是EB也可以是SYBR Green I，琼脂糖凝胶的浓度以2℅为宜，缓冲液采用TBE缓冲液。2）肉眼直接观测副产物焦磷酸镁沉淀。产物呈阳性的反应，管内液体浑浊，离心或由白色沉淀集于管底，阴性反应则无此现象。3）SYBR Green I荧光染料直接对产物进行染色，也可以通过肉眼直接观察。产物呈阳性的反应，加染料后呈绿色，阴性反应则呈橙红色。
实施例3
一种检测虹彩病毒的方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）准备检测样本:新鲜或者保存于-80℃～4℃的细胞培养物，解冻后可直接用于总DNA的抽提；新鲜或者用磷酸盐缓冲液保存于-80℃～4℃的海水鱼类组织病料，充分匀浆后，10000rpm离心10～30min，取上清液用于总DNA的抽提；
（2）提取样本的总DNA：使用D抽提试剂(大连宝生物工程公司产品)，按照试剂的说明书操作；
（3）对步骤（2）的DNA进行环介导的等温核酸扩增反应，使用Bst大片段DNA聚合酶（纽英兰公司产品），反应温度为60～65℃，反应时间为10～60分钟（图2）；
（4）终止反应；80℃持续5分钟；
（5）检测所述扩增引物：有三种方法可供选择。其一、产物可以通过电泳来观察是否有特征性梯状条带出现（见图1）。其二、产物如果出现混浊、经简短离心有白色沉淀，即可判为阳性；用浊度仪能更方便地判定。其三、加SYBRGreenⅠ染料到产物中，阴性反应仍然为原本的橙黄色，而阳性则变为绿色（见图4）。
为阐明LAMP扩增技术在检测灵敏度方面的优势，特选择灵敏度较高的PCR作为比较对象。病毒DNA模板按5倍稀释后（标号取5的对数log5，－1即稀释5倍）的扩增产物，利用F3和B3做PCR，同时采用本发明的检测方法进行实验。由图3可知，PCR的灵敏度为-4（即稀释54倍），本发明检测方法的灵敏度为-6（即稀释56倍），可得该方法比PCR灵敏25倍左右。
在本发明的其他实施例中，样本的来源还可以是选自下列样本:
(1)海水鱼类的感染组织；或者
(2)海水鱼类的细胞培养物。
对样本的准备可以参照美国冷泉港实验室出版社的《分子克隆实验指南》的实验方法进行准备。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一组用于检测虹彩病毒的引物，其特征在于：所述的引物与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分。
2.根据权利要求1所述的用于检测虹彩病毒的引物，其特征在于：所述的引物为SEQ ID NO.1～6所示的寡核苷酸，或者SEQ ID NO.1～6所示的寡核苷酸的互补链。
3.一种应用权利要求1或2所述的引物检测虹彩病毒的方法，其特征在于：采用的引物可以与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分；通过环介导等温扩增法，特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。
4.一种应用权利要求3所述的引物检测虹彩病毒的方法，其特征在于：所述的方法包括如下步骤：
（1）准备检测样本；
（2）提取样本的总DNA；
（3）对步骤（2）的DNA进行环介导的等温核酸扩增反应，反应温度为60～65℃，反应时间为10～60分钟；
（4）终止反应；
（5）检测所述扩增引物。
5.一种应用权利要求4所述的引物检测虹彩病毒的方法，其特征在于：所述的方法的步骤（5）所述的检测是通过扩增产物凝胶电泳、扩增产物浊度观测或扩增产物化学发光检测的方法进行的。
6.一种应用权利要求4所述的引物检测虹彩病毒的方法，其特征在于：所述的检测样本选自下列样本:
(1)海水鱼类的感染组织；或者
(2)海水鱼类的细胞培养物。
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