CN112795702A - 虾血细胞虹彩病毒lamp检测引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种虾血细胞虹彩病毒LAMP检测引物组、试剂盒及方法，所述引物组包括引物OF、OR、IF、IR、LF、LR，其中，OF：5’‑AATGTTGGGAAAGTTTGCA‑3’；OR：5’‑CCTTTCCTCGTTGGAACAA‑3’；IF：5’‑CATCTAACACCATCTCCCGCCTCTGATTACGGGTAAAAAGGC‑3’；IR：5’‑AGTCATGGATGAACCAAATGCTGACGAGCCCAATACGAATCG‑3’；LF：5’‑CCAATTCGGGACTTGCAG‑3’；LR：5’‑GAACGTTAAAGGGTCTCACG‑3’；本发明不仅可以对虾血细胞虹彩病毒DNA进行特异性扩增，还可以对虾血细胞虹彩病毒产生的RNA进行特异性逆转录，解决现有技术中虾血细胞虹彩病毒感染初期病毒DNA含量往往低于检测产品检出限而出现漏检的问题，通过同时检测虾血细胞虹彩病毒DNA和虾血细胞虹彩病毒大量转录产生的与其序列相同的RNA，不仅提高了虾血细胞虹彩病毒的正确检出率，缩短了检测时间，而且特异性强、灵敏度高。

Description

虾血细胞虹彩病毒LAMP检测引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物病毒检测技术领域，尤其涉及一种虾血细胞虹彩病毒LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

近年来，在东亚、东南亚和欧洲地区，由虹彩病毒引起的鱼类疾病给水产养殖业造成重大的经济损失，严重阻碍了鱼类养殖业的健康发展，在国内外受到愈来愈大的关注。虹彩病毒科(Iridoviridae)共分为5个病毒属，即虹彩病毒属(Iridovirus)、绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)、淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)、蛙病毒属(Ranavirus)和细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)，主要感染无脊椎动物和低等脊椎动物。2017年，中科院黄海研究所科研人员在浙江省一批严重发病死亡的凡纳滨对虾样品中分离鉴定到一种新病毒，经过组织病理学研究和基因组学测序发现，这种新病毒属于虹彩病毒科，但不属于虹彩病毒科下已经建立的五个属，后将其命名为虾血细胞虹彩病毒(SHIV)。

由于虾感染虾血细胞虹彩病毒(SHIV)后出现的主要症状与感染红螯螯虾虹彩病毒(CQIV)、樱花虹彩病毒(SIV)、虾白斑综合症病毒(WSSV)等极为相似，如何检测感染症状是否由虾感染虾血细胞虹彩病毒(SHIV)引起，进而为后续的防控、治疗以及采取具有针对性的措施，是本领域技术人员需要解决的技术问题。

其中，公布号为CN108950067A的发明专利申请公开了一种检测对虾虹彩病毒的LAMP引物组、试剂盒及其方法，该LAMP引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，上述LAMP检测试剂盒虽然可以对对虾虹彩病毒进行特异性扩增，但是存在以下技术问题：感染初期病毒DNA含量低于检测产品检出限的样品时，容易出现漏检。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种虾血细胞虹彩病毒LAMP检测引物组。

本发明的另一个目的旨在提供一种虾血细胞虹彩病毒RT-LAMP检测试剂盒。

本发明的另一个目的旨在提供一种虾血细胞虹彩病毒RT-LAMP检测方法。

通过所述对虾血细胞虹彩病毒LAMP检测引物、试剂盒及方法完成对虾血细胞虹彩病毒的快速检测。

本发明的目的旨在提供一种虾血细胞虹彩病毒LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法，同时检测虾血细胞虹彩病毒DNA以及由虾血细胞虹彩病毒DNA转录产生与其序列相同的RNA，降低漏检的风险。

为了实现本发明的目的，本发明采用的一种技术方案如下：

一种虾血细胞虹彩病毒LAMP检测引物组，其特征在于：所述引物组包括0F、0R、IF、IR、LF、LR，其中：

0F：5’-AATGTTGGGAAAGTTTGCA-3’；

0R：5’-CCTTTCCTCGTTGGAACAA-3’；

IF：5’-CATCTAACACCATCTCCCGCCTCTGATTACGGGTAAAAAGGC-3’；

IR：5’-AGTCATGGATGAACCAAATGCTGACGAGCCCAATACGAATCG-3’；

LF：5’-CCAATTCGGGACTTGCAG-3’；

LR：5’-GAACGTTAAAGGGTCTCACG-3’。

一种所述LAMP引物组在制备用于虾血细胞虹彩病毒RT-LAMP检测试剂盒中的应用。

一种虾血细胞虹彩病毒RT-LAMP检测试剂盒，所述RT-LAMP检测试剂盒包括上述LAMP检测引物组。

进一步地，所述RT-LAMP检测试剂盒还包括LAMP反应液和显色试剂。

作为具体的实施方式，所述LAMP反应液包括5×恒温扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶以及逆转录酶；所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述逆转录酶为HISCRIPT III逆转录酶；所述显色试剂包括SYBRTM Green I荧光染料。

作为具体的实施方式，所述LAMP检测引物组、LAMP反应液和显色试剂所构建的环介导等温扩增反应体系含有：100μM OF引物0.05μL、100μM0R引物0.05μL、100μM IF引物0.4μL、100μM IR引物0.4μL、100M LF引物0.2μL、100μM LR引物0.2μL、5×恒温扩增缓冲液5μL，10mM dNTP 3.5μL、0.25μL SYBRTM GREEN I(100×with DMSO)荧光染料、8U/μL Bst DNA聚合酶1μL、5U/μL HISCRIPT III逆转录酶0.2μL，模板3μL、加超纯水至25μL。

进一步地，所述RT-LAMP检测试剂盒还包括阳性对照组和阴性对照组。

进一步地，所述RT-LAMP检测试剂盒还包括核酸提取试剂。

一种虾血细胞虹彩病毒RT-LAMP检测方法，所述检测方法采用上述RT-LAMP检测试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：待检样品核酸的提取、环介导等温扩增及荧光检测。

作为具体的实施方式，所述环介导等温扩增的条件为：61℃恒温扩增30分钟。

作为具体的实施方式，所述荧光检测的条件为每分钟检测荧光。

本发明的有益效果：

本发明通过比对虾血细胞虹彩病毒和虾白斑综合征病毒(WSSV)，虾肝肠胞虫(EHP)、皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)、对虾杆状病毒(BP)、急性肝胰腺坏死细菌(EMS)的差异，设计特异性引物OF、OR、IF、IR、LF、LR，不仅可以对虾血细胞虹彩病毒DNA进行特异性扩增，还可以对虾血细胞虹彩病毒产生的RNA进行特异性逆转录，解决现有技术中虾血细胞虹彩病毒DNA含量往往低于检测产品检出限而出现漏检的问题，通过同时检测虾血细胞虹彩病毒DNA和虾血细胞虹彩病毒转录产生的与其序列相同的RNA，不仅提高了虾血细胞虹彩病毒的正确检出率，缩短了检测时间(30分钟内即可完成检测)，而且特异性强、灵敏度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面对实施例中所需要使用的附图做简单的介绍。下面描述中的附图仅仅是本发明中的实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。

图1是本发明实施例4提供的LAMP检测引物组特异性实验结果；

图2是本发明实施例5提供的本申请RT-LAMP检测方法的灵敏度实验结果；

图3是本发明实施例5提供的巢式PCR检测方法的灵敏度实验结果；

图4是本发明实施例5提供的巢式传统RT-LAMP检测方法的灵敏度实验结果。

〖具体实施方式〗

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂所建议的条件与实施步骤。

实施例1、虾血细胞虹彩病毒LAMP检测引物组的设计

本发明通过对比虾血细胞虹彩病毒的差异，设计LAMP检测引物组，该LAMP检测引物组不仅用于对虾血细胞虹彩病毒DNA进行特异性扩增，还用于对虾血细胞虹彩病毒产生的RNA进行特异性逆转录，该LAMP检测引物组包括六条特异性引物OF、OR、IF、IR、LF、LR，具体序列如下：

OF：5’-AATGTTGGGAAAGTTTGCA-3’；

OR：5’-CCTTTCCTCGTTGGAACAA-3’；

IF：5’-CATCTAACACCATCTCCCGCCTCTGATTACGGGTAAAAAGGC-3’；

IR：5’-AGTCATGGATGAACCAAATGCTGACGAGCCCAATACGAATCG-3’；

LF：5’-CCAATTCGGGACTTGCAG-3’；

LR：5’-GAACGTTAAAGGGTCTCACG-3’。

本发明通过设计六条特异性引物OF，OR，IF，IR，LF，LR，不仅可以对虾血细胞虹彩病毒DNA进行特异性扩增，还可以对虾血细胞虹彩病毒产生的RNA进行特异性逆转录，解决现有技术中虾血细胞虹彩病毒感染宿主初期，虾血细胞虹彩病毒DNA含量往往低于检测产品检出限而出现漏检的问题，通过同时检测病毒DNA和病毒在宿主体内大量转录与其序列相同的RNA不仅提高了虾血细胞虹彩病毒的正确检出率，缩短了检测时间，而且特异性强、灵敏度高。

实施例2、虾血细胞虹彩病毒RT-LAMP检测试剂盒的建立

虾血细胞虹彩病毒RT-LAMP检测试剂盒包括实施例1中的虾血细胞虹彩病毒LAMP检测引物组、LAMP反应液、显色试剂、阳性对照组和阴性对照组。

LAMP反应液包括5×恒温扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶以及逆转录酶；所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述逆转录酶为HISCRIPTIII逆转录酶；显色试剂包括SYBRTMGreenI荧光染料。

阳性对照组为含有虾血细胞虹彩病毒ATPase基因片段的T载体。

阴性对照组为超纯水。

实施例3、虾血细胞虹彩病毒RT-LAMP检测方法的建立

1、待检样品核酸的提取

本发明实施例中的待检样品为虾苗或成虾组织，通过研磨法提取待检样品的核酸(包括DNA和RNA)，操作如下：

1.1取约100mg待检样品，置于1.5ml灭菌离心管，使用研磨棒研磨离心管中的待检样品至匀浆；

1.2加入500ul裂解液，充分混匀；室温裂解10分钟；

1.3使用离心机12000g离心力离心1分钟，取上清液，加入核酸吸附柱；

1.4使用离心机8000g离心力进行离心处理，使上清液通过吸附柱，实现病毒DNA被核酸吸附柱吸附；

1.5加入500ul体积分数为75％的乙醇洗涤核酸吸附柱；

1.6使用离心机8000g离心力对核酸吸附柱进行2次离心洗涤；

1.7使用离心机12000g离心力对核酸吸附柱进行离心处理，清除核酸吸附柱中残留的乙醇；

1.8加入100ul TE缓冲液，静置5分钟；

1.9使用离心机12000g离心力对核酸吸附柱进行离心处理，洗脱核酸吸附柱上的核酸，洗脱液即为包括病毒DNA和RNA的核酸溶液。

在本实施例中，采用研磨法提取上清中的病毒核酸，未采用蛋白酶消化组织的方法。样品若为成年虾，主要采集消化腺、前足等，虾苗则直接研磨。对于虾仁的检测，先用匀浆机对数个虾仁进行研磨提取，节省蛋白酶作用的时间，而且可以消除大量杂质和色素，减少对后续LAMP反应的抑制。

在其它实施例中，可以采用病毒核酸提取试剂盒提取样品待检样品核酸(包括DNA和RNA)。

2.环介导等温扩增(LAMP)反应

2.1环介导等温扩增(LAMP)反应体系

以步骤1获得的病毒核酸溶液为模板，进行环介导等温扩增(LAMP)，环介导等温扩增(LAMP)反应体系为：

具体地，环介导等温扩增反应体系：25μL反应体系含有：100μM OF引物0.05μL、100μM OR引物0.05μL、100μM IF引物0.4μL、100μM IR引物0.4μL、100μM LF引物0.2μL、100μMLR引物0.2μL、5×恒温扩增缓冲液5μL，10mM dNTP 3.5μL、0.25μL SYBRTM GREEN I(100×with DMSO)荧光染料、8U/μL Bst DNA聚合酶1μL、5U/μL HISCRIPT III逆转录酶0.2μL，模板3μL、加超纯水至25μL。

2.2反应及检测

将反应管放入荧光检测设备(比如AGS4800)设置反应程序为61℃恒温30分钟，每分钟采集荧光，通过观察AGS4800软件判断扩增结果，如果出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。实际样本和阳性对照组都出现了“S”型曲线，而阴性对照组未出现扩增(如图2，3所示)。并根据Ct值(C代表Cycle，t代表threshold，Ct值代表每个反应管内荧光信号到达设定阈值时经历的循环数)具体地判断反应扩增结果。

2.3环介导等温扩增反应条件优化

对病毒核酸溶液的环介导等温扩增反应条件进行优化，分别以61℃，63℃，65℃，67℃，69℃进行环介导等温扩增试剂，反应条件为恒温扩增30分钟，每分钟采集荧光，以检测样本荧光值到达阈值的时间作为Ct值，发现在61℃时Ct值最小，荧光检测可最快得到阳性结果，Ct值为7分钟。

综合上述反应，本发明最终将环介导等温扩增试剂的温度设置为61℃，优化后的反应条件为：61℃恒温扩增30分钟，每分钟采集荧光。

实施例4、特异性实验

为了检测本RT-LAMP检测试剂盒的引物特异性，采用实施例3中的RT-LAMP检测方法分别对虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)，虾肝肠胞虫(EHP)、皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)、对虾杆状病毒(BP)、急性肝胰腺坏死细菌(EMS)进行检测，分析本RT-LAMP检测试剂盒对虾血细胞虹彩病毒和对虾其他常见病毒的检测情况，以上6种均为对虾常见传染病，且这6种病毒在感染症状上极其相似，临床上很难区分。其中，以对虾白斑综合征病毒(WSSV)，虾肝肠胞虫(EHP)、皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)、对虾杆状病毒(BP)、急性肝胰腺坏死细菌(EMS)作为对照毒株，以虾血细胞虹彩病毒(SHIV)作为实验毒株。

按照实施例3中的方法进行检测，结果表明，只有虾血细胞虹彩病毒(SHIV)样品出现“S”型曲线，对虾白斑综合征病毒(WSSV)，虾肝肠胞虫(EHP)、皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)、对虾杆状病毒(BP)、急性肝胰腺坏死细菌(EMS)样品均未出现扩增(如图1所示)；而且，只有虾血细胞虹彩病毒(SHIV)检测Ct值＜40，其他病原在30分钟内均未检出。上述实验结果说明，本RT-LAMP检测试剂盒可以特异性扩增出虾血细胞虹彩病毒(SHIV)中的靶序列，而不与其它病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阳性。

实施例5、灵敏度实验

1、以步骤1获得的病毒核酸溶液为模板，使用RNase free water进行10倍梯度稀释，制作成浓度为原浓度的10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6的稀释梯度病毒核酸溶液，采用实施例3中的RT-LAMP检测方法(同时检测病毒DNA和RNA的逆转录恒温荧光检测方法)和巢式PCR检测方法(Qiu L，Chen M M，Wan X Y，et al.Characterization of a new member ofIridoviridae，Shrimp hemocyte iridescent virus(SHIV)，found in white leg shrimp(Litopenaeus vannamei)[J].Rep，2017，7(1)：11834.)，对稀释后的各浓度病毒核酸溶液进行扩增检测。

巢式PCR引物具体如下：

SHIV-F1：GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT；

SHIV-R1：TCGTTCGGTACGAAGATGTA；

SHIV-F2 CGGGAAACGATTCGTATTGGG；

SHIV-R2 TTGCTTGATCGGCATCCTTGA。

巢式PCR扩增程序具体如下：

步骤1：

反应体系：

2.5μL10×Ex Taq缓冲液(Mg2+free)

2mM MgCl₂

0.2mM dNTPs

0.4μM SHIV-F1引物

0.4μM SHIV-R1引物

0.625U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶

1μL模板

超纯水至25μL。

反应程序：95℃ 3min，(95℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 30s)35循环，72℃ 2min。

反应产物(扩增片段)：457bp。

步骤2：

反应体系：

2.5μL10×Ex Taq缓冲液(Mg2+free)

2mM MgCl2

0.2mM dNTPs

0.4μM SHIV-F2引物

0.4μM SHIV-R2引物

0.625U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶

1μL步骤1反应产物

超纯水至25μL

反应程序：95℃ 3min，(95℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 20s)35循环，72℃ 2min。

反应产物(扩增片段)：129bp。

待步骤2反应产物冷却后，取5ul步骤2反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

检测结果：采用实施例3中的RT-LAMP检测方法得到的检测结果如图2所示，原浓度以及10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-1，10^-6的稀释梯度的扩增结果按照从左到右的顺序依次排布。结果表明，本发明RT-LAMP检测方法的灵敏度可达到原浓度的10^-6(如图2所示)，而巢式PCR的检测灵敏度未达到原浓度的10^-5(如图3所示)。通过本发明RT-LAMP检测方法与巢式PCR的检测结果对比可知，本申请RT-LAMP检测试剂盒和检测方法对虾血细胞虹彩病毒(SHIV)的检测具有高度的灵敏性。

2、以步骤1获得的病毒核酸溶液为模板，使用RNase free water进行10倍梯度稀释，制作成浓度为原浓度的10^-1，10^-2，10^-3，10^-1，10^-5，10^-6的稀释梯度，采用实施例3中的RT-LAMP检测方法(加入逆转录酶，同时检测病毒DNA和RNA的逆转录恒温荧光检测方法)和传统的LAMP检测方法(未加入逆转录酶，只能检测病毒DNA的恒温荧光检测方法)，对稀释后的各浓度病毒核酸溶液进行扩增检测。

具体地，传统的LAMP检测方法的引物组采用实施1中的引物组，扩增体系中与RT-LAMP检测的区别在于：未加入5U/μL HISCRIPT III逆转录酶；扩增方法为：61℃恒温扩增30分钟；检测方法为：每分钟采集荧光。

检测结果：采用实施例3中的RT-LAMP检测方法得到的检测结果如图2所示，原浓度以及10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6的稀释梯度的扩增结果按照从左到右的顺序依次排布。结果表明，本发明RT-LAMP检测方法的灵敏度可达到原浓度的10^-6(如图2所示)，且均在30分钟内完成检测；而传统RT-LAMP检测方法的检测灵敏度仅达到原浓度的10^-5，未达到原浓度的10^-6(如图4所示)，且检测检测时间也延后至50分钟以上。

通过本发明RT-LAMP检测方法与传统RT-LAMP检测方法的检测结果对比可知，本申请RT-LAMP检测试剂盒和检测方法对虾血细胞虹彩病毒(SHIV)的检测具有高度的灵敏性。

以上所述仅是本发明的优选实施例，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种虾血细胞虹彩病毒LAMP检测引物组，其特征在于：所述引物组包括OF、OR、IF、IR、LF、LR，其中：

OF：5’-AATGTTGGGAAAGTTTGCA-3’；

OR：5’-CCTTTCCTCGTTGGAACAA-3’；

IF：5’-CATCTAACACCATCTCCCGCCTCTGATTACGGGTAAAAAGGC-3’；

IR：5’-AGTCATGGATGAACCAAATGCTGACGAGCCCAATACGAATCG-3’；

LF：5’-CCAATTCGGGACTTGCAG-3’；

LR：5’-GAACGTTAAAGGGTCTCACG-3’。

2.一种如权利要求1所述的LAMP引物组在制备用于虾血细胞虹彩病毒RT-LAMP检测试剂盒中的应用。

3.一种虾血细胞虹彩病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述RT-LAMP检测试剂盒包括权利要求1所述的LAMP检测引物组。

4.根据权利要求3所述的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述RT-LAMP检测试剂盒还包括LAMP反应液。

5.根据权利要求4所述的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述LAMP反应液包括5×恒温扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶以及逆转录酶；所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述逆转录酶为HISCRIPT III逆转录酶；所述显色试剂包括SYBRTM Green I荧光染料。

6.根据权利要求5所述的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP检测引物组、LAMP反应液和显色试剂所构建的环介导等温扩增反应体系含有：10mM OF引物1μL、10mM OR引物1μL、10mM IF引物4μL、10mM IR引物4μL、10mM LF引物2μL、10mM LR引物2μL、5×恒温扩增缓冲液5μL，10mM dNTP 3.5μL、0.25μL SYBRTM GREEN I(100×with DMSO)荧光染料、8U/μLBst DNA聚合酶1μL、5U/μL HISCRIPT III逆转录酶0.2μL，模板3μL、加超纯水至25μL。

7.根据权利要求3-6任意一项所述的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：还包括核酸提取试剂。

8.根据权利要求3-6任意一项所述的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：还包括阳性对照组和阴性对照组。

9.一种虾血细胞虹彩病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于，所述RT-LAMP检测方法采用权利要求3-8任一项所述的RT-LAMP检测试剂盒，所述RT-LAMP检测方法包括以下步骤：待检样品核酸的提取、环介导等温扩增及荧光检测。

10.根据权利要求9所述的RT-LAMP检测方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的条件为：61℃恒温扩增30分钟。

Images