KR20210006964A - 클라미디아 트라코마티스의 증폭 및 검출을 위한 폴리뉴클레오티드 - Google Patents

클라미디아 트라코마티스의 증폭 및 검출을 위한 폴리뉴클레오티드 Download PDF

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다니엘 카풀레
안드레아 씨. 데덴트
매튜 비. 리
슈위안 마
헤디아 마아마르
다나 켈리 바나타
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탈리스 바이오메디컬 코포레이션
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Abstract

본 발명은 시료에서 클라미디아 트라코마티스의 검출을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 샘플에서 그의 존재 또는 부재는 23S 리보솜 유전자 또는 유전자 전사체에 결합하는 프라이머 및/또는 프로브 및 또는 분자 비콘을 사용하는 핵산 기반 검사 방법에 의해 결정된다.

Description

클라미디아 트라코마티스의 증폭 및 검출을 위한 폴리뉴클레오티드
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 이의 개시 내용이 본원에 그 전문이 참고로서 포함된, 2018년 5월 9일에 출원된, 미국 가출원 번호 62/669,236 및 2018년 5월 10일에 출원된, 미국 비-가출원 번호 15/976,733의 이익을 주장한다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 제출되고, 그 전문이 본원에 참고로서 포함된 서열 목록을 함유한다. 2019년 5월 8일 작성된, 상기 ASCII 사본은 TSM-045WO_CRF_sequencelisting.txt로 명명되며 29,937 바이트 크기이다.
발명의 분야
본 발명은 분자 생물학 및 핵산 화학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 병원체, 예를 들어 클라미디아 트라코마티스를 검출하기 위한 방법 및 시약을 제공하며 따라서, 또한 의료 진단 및 예후 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 클라미디아 트라코마티스를 증폭 및 검출하기 위한 폴리뉴클레오티드 및 방법에 관한 것이다.
성병 감염 (STI)에 대한 신속하고, 구하기 쉬운, 샘플-인 응답-아웃 현장 (POC) 진단 플랫폼의 개발이 긴급히 필요하다. 세계 보건기구 (WHO)는 4억 9,900 만 건 이상의 치료 가능한 STI, 즉 나이세리아 고노르호애 (NG), 클라미디아 트라코마티스 (CT), 트리코모나스 바지날리스 (TV) 및 매독으로 인한 것들이 15 - 49세의 남성과 여성에서 전세계적으로 매년 발생하며, 심각한 이환율과 사망률을 유발하는 것으로 추정한다. 사하라 사막 이남 아프리카　여성의　치료되지 않은 임균 및 클라미디아　감염은 불임 중재를 찾는 여성에서 최대 85%의 불임의 원인으로 간주되고 있다.
C. 트라코마티스는 미국에서 가장 흔한 성병 감염의 원인이다. 클라미디아는 남성에서 요도염 및 여성에서 골반 염증성 질환, 자궁외임신 및 불임을 유발할 수 있다. 무증상 감염이 남성과 여성 모두에게 흔하며 질병의 확산을 예방하기 위한 선별 검사가 타당하다 (CDC에서 권장하는 바와 같이).
본 발명은 일부 양태에서, 세트-1 내지 세트-81로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 세트를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 프로브를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 프로브는 표지를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 프로브는 표지된 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 구현에서, 상기 표지는 바람직하게는 폴리뉴클레오티드의 말단에 공유적으로 부착되는, 형광단이다. 특히 바람직한 양태에서, 상기 프로브 또는 폴리뉴클레오티드는 형광단, ??처, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자 비콘이다. 한 양태에서, 상기 형광단은 FAM이고 상기 ??처는 BHQ1이다. 대체 구현에서, 상기 형광단은 ATTO 565 또는 알렉사 594이고 상기 ??처는 BHQ1 또는 BHQ2이다.
일부 구현에서, 조성물은 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 및 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28, 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28, 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27, 및 서열 번호 131의 뉴클레오티드 8-29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 표지된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가 구현에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97 내지 131로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열 번호 97 내지 131로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열 번호 97 내지 131로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트-12, 세트 14-27, 세트-39, 세트 41-54, 세트-66, 및 세트 68-81로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조성물은 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 및 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 표지된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 103, 서열 번호 104, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 114, 서열 번호 115, 서열 번호 116, 서열 번호 117, 서열 번호 118, 서열 번호 119, 서열 번호 123, 서열 번호 124, 서열 번호 128, 및 서열 번호 129로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열 번호 103, 서열 번호 104, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 114, 서열 번호 115, 서열 번호 116, 서열 번호 117, 서열 번호 118, 서열 번호 119, 서열 번호 123, 서열 번호 124, 서열 번호 128, 및 서열 번호 129이다. 바람직한 구현에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열 번호 115이고, 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트-20, 세트-24, 세트-47, 세트-51, 세트-74 및 세트-78로 이루어진 군으로부터 선택된다. 훨씬 더 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트-20 또는 세트-24이다.
또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트 12-27, 세트 39-54, 및 세트 66-81로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조성물은 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 및 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 표지된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 더욱 특히, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101, 서열 번호 106, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 120, 서열 번호 121, 및 서열 번호 122로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101, 서열 번호 106, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 120, 서열 번호 121, 및 서열 번호 122로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 구현에서, 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트-12, 세트 14-18, 세트-20, 세트-24, 세트-27, 세트-39, 세트 41-45, 세트-47, 세트-51, 세트-54, 세트-66, 세트 68-72, 세트 74, 세트-78, 및 세트-81로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조성물은 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28 및 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 표지된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 125 및 서열 번호 126으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열 번호 125 또는 서열 번호 126이다.
다른 구현에서, 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트 14-27, 세트 41-54, 및 세트 68-81로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조성물은 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31 및 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 표지된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 113 및 서열 번호 127로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열 번호 113 또는 서열 번호 127이다.
또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트 12-20, 세트 22-27, 세트 39-47, 세트 49-54, 세트 66-74, 및 세트 76-81로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조성물은 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27을 포함하는 표지된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 130을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열 번호 130이다.
한 구현에서, 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트-13, 세트-40 및 세트-67로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조성물은 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30 및 서열 번호 131의 뉴클레오티드 8-29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 표지된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 양태에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 102 및 서열 번호 131로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열 번호 102 또는 서열 번호 131이다.
본 발명의 다른 측면은 형광단, ??처, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자 비콘을 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 및 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 시료에서 클라미디아 트라코마티스를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 시료로부터 핵산을 추출하는 단계, (b) 단계 (a)에서 추출된 상기 핵산을 가닥 치환 DNA 중합효소 및 서열 특이적 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물과 반응시켜 표적 서열을 증폭하는 단계, 여기서 상기 서열 특이적 프라이머 세트는 세트-1 내지 세트-81 로 이루어진 군으로부터 선택되며, (c) 단계 (b)의 증폭된 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하며; 여기서 상기 증폭 생성물의 존재는 시료에서 클라미디아 트라코마티스의 존재를 표시한다. 한 양태에서, 상기 표적 서열의 단계 (b)에서의 증폭은 30분 미만 동안 약 60℃ 내지 약 67℃에서 수행된다. 바람직하게는, 상기 증폭 단계는 15분 미만, 10분 미만 또는 6분 미만 동안 수행된다. 일부 구현에서, 상기 반응 혼합물은 역전사효소를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 클라미디아 트라코마티스는 시료에서 ≤100 IFU/mL, ≤50 IFU/mL, ≤5 IFU/mL, 또는 심지어 ≤2 IFU/mL의 농도로 존재한다. 한 구현에서, 클라미디아 트라코마티스는 시료에서 ≤5 IFU/ml의 농도로 존재하며 증폭 단계는 15분 미만 동안 수행된다. 다른 구현에서, 클라미디아 트라코마티스는 시료에서 ≤10 IFU/ml의 농도로 존재하며 증폭 단계는 6분 미만 동안 수행된다.
특정 양태에서, 상기 증폭 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계는 표지에 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브를 가지는 증폭된 생성물을 혼성화하는 것을 포함한다. 바람직한 구현에서, 상기 표지는 형광단이고, 이는 바람직하게 상기 폴리뉴클레오티드의 말단에 공유적으로 부착된다. 특히 바람직한 양태에서, 상기 프로브 또는 폴리뉴클레오티드는 형광단, ??처, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자 비콘이다. 한 양태에서, 상기 형광단은 FAM이며 상기 ??처는 BHQ1이다. 대안적 구현에서, 상기 형광단은 ATTO 565 또는 알렉사 594이며 상기 ??처는 BHQ1 또는 BHQ2이다. 이러한 방법은 프라이머 세트 및 표지된 폴리뉴클레오티드의 임의의 조합, 예를 들어 본원에 기술된, 분자 비콘을 사용하여 실행될 수 있다. 도 1은 각각의 프라이머 세트로부터 생성된 앰플리콘에 결합 가능하며, 따라서 시료에서 클라미디아 트라코마티스의 존재를 검출하는 데 유용한, 표지된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 분자 비콘을 식별한다.
본 발명의 또 다른 측면은 세트-1 내지 세트-81 로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 세트를 포함하는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 키트는 가닥 치환 중합효소 및, 선택적으로, 역전사효소를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 상기 키트는 형광단, ??처, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자 비콘을 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28, 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28, 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27, 및 서열 번호 131의 뉴클레오티드 8-29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 상기 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 97 내지 서열 번호 131로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 97 내지 서열 번호 131로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진다. 한 양태에서, 상기 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 115로 이루어지고 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트-20 또는 세트-24이다.
본 발명의 또 다른 측면은 시료에서 클라미디아 트라코마티스를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 시료로부터 핵산을 추출하는 단계, (b) 단계 (a)에서 추출된 핵산을 가닥 치환 DNA 중합효소 및 서열 특이적 LAMP 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물과 10분 미만 동안 반응시킴으로써 표적 서열을 증폭하는 단계, 및 (c) 단계 (b)의 증폭된 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하며; 상기 증폭 생성물의 존재는 시료에서 클라미디아 트라코마티스의 존재를 표시한다. 일부 구현에서, 클라미디아 트라코마티스는 시료에서≤100 IFU/mL, ≤50 IFU/mL, ≤5 IFU/mL, 또는 심지어 ≤2 IFU/mL의 농도로 존재한다. 특정 구현에서, 증폭 단계는 단계 (a)에서 추출된 핵산을 가닥 치환 DNA 중합효소 및 서열 특이적 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물과 반응시키는 단계를 포함하며, 상기 서열 특이적 프라이머 세트는 세트-1 내지 세트-81로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 구현에서, 증폭 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계는 증폭된 생성물을 서열 번호 97 내지 서열 번호 131로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자 비콘과 혼성화하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 증폭 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계는 증폭된 생성물을 서열 번호 99 내지 서열 번호 120로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자 비콘과 혼성화하는 것을 포함한다.
본원에 기술된 방법의 일부 양태에서, 시료는 클라미디아 트라코마티스이외에 하나 이상의 다른 미생물을 포함하며, 여기서 클라미디아 트라코마티스로부터의 표적 서열은 하나 이상의 다른 미생물의 폴리뉴클레오티드보다 우선적으로 증폭된다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열 번호 1-96 중 임의의 하나에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9% 동일한 핵산 서열 및 시료에서 클라미디아 트라코마티스를 검출하기 위해 이러한 핵산 서열을 사용하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 및 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30으로 이루어진 그룹 중 임의의 하나에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9% 동일한 핵산 서열 및 시료에서 클라미디아 트라코마티스를 검출하기 위해 이러한 핵산 서열을 사용하는 방법을 제공한다.
도 1은 각각의 프라이머 세트로부터 생성된 앰플리콘에 결합 가능한, 표지된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 분자 비콘을 식별한다.
낮은 농도의 종의 검출 (샘플에서 소수 분자 또는 미생물까지)은 의학에서 도전이다. 본 발명은 클라미디아 트라코마티스의 선택적 검출에 관한 것이다. 특히, 핵산 증폭, 특히 RT-LAMP, 및 분자 비콘 검출을 활용하는 새로운 검출 전략을 기반으로, 클라미디아 감염이 본원에 기술된 방법 및 시약을 사용하여 진단될 수 있다. 표적 영역으로서 RNA (리보솜 RNA (rRNA) 또는 메신저 RNA)를 사용하여 C. 트라코마티스 게놈 당 다중 카피의 표적을 제공한다. 따라서, 이는 게놈 당 다중 카피로 존재하는 경우에도, 게놈 DNA를 표적으로 하는 기술과 관련하여 본원에 기술된 접근법을 활용하여 샘플에서 C. 트라코마티스의 검출을 가능하게 한다. 또한, 본원에 기술된 분자 비콘 검출 시약은 추가 특이성을 제공하여, 대부분의 경우, 표적이 아닌 증폭된 DNA에 결합하지 못하게 하여, 예를 들어, 위양성의 발생을 최소화한다. 이러한 특이성은 그 중에서도, 하기 제공되는 실시예 4에서 설명된다. 본 발명의 많은 다른 특징이 또한 본원에 기술된다.
본원에 사용된 바와 같이, "핵산"은 비표준 뉴클레오티드를 함유하는 DNA 및 RNA를 비롯하여 DNA 및 RNA 모두를 포함한다. "핵산"은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 ("핵산 가닥"을 함유한다. "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 용어 "핵산"은 예를 들어, 데옥시리보핵산 (DNA) 거대분자 및 리보핵산 (RNA) 거대분자를 구성하는 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드를 지칭한다. 가장 흔한 핵산은 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)이다. 본 발명은 이들 중에서 펩티드 핵산 (PNA), 모르폴리노, 잠금 핵산 (LNA), 글리콜 핵산 (GNA) 및 트레오스 핵산 (TNA)와 같은 인공 뉴클레오티드를 함유하는 생물학적 서열을 위해 사용될 수 있음을 추가로 이해해야 한다. 바람직하게는, 인공 뉴클레오티드는 [알파]-L-LNA를 비롯한, 잠금 핵산 분자이다. LNA는 리보스 고리가 2'-산소와 4'-탄소 사이의 메틸렌 가교―즉, 적어도 하나의 LNA 단량체, 즉, 하나의 2'-O,4'-C-메틸렌-β-D-리보푸라노실 뉴클레오티드를 함유하는, 올리고뉴클레오티드에 의해 “잠긴” 리보핵산 유사체로 구성된다. LNA 염기는 표준 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하지만 잠금 배열은 염기쌍　반응의 속도와 안정성을 증가시킨다 (Jepsen et al., Oligonucleotides, 14, 130-146 (2004)).
본원에 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드"는 둘 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 중합체 사슬을 지칭하며, 이는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및/또는 이들의 유사체, 예를 들어 변형된 백본 (예를 들어 펩티드 핵산 (PNA) 또는　포스포로티오에이트) 또는 변형된 염기를 함유하는 것을 함유한다. "폴리뉴클레오티드"는 프라이머, 올리고뉴클레오티드, 핵산 가닥, 등을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 표준 또는 비표준 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 따라서, 용어는 mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, DNA, cDNA, 재조합 핵산, 분지 핵산, 플라스미드, 벡터, 프로브, 프라이머, 등을 포함한다. 보통, 폴리뉴클레오티드는 하나의 말단 ("5 '말단")의 5' 포스페이트 및 사슬의 다른 말단 ("3' 말단")의 3' 히드록실기를 함유한다. 대부분의 폴리뉴클레오티드의 5' 뉴클레오티드는 본원에서 폴리뉴클레오티드의 "5' 말단 뉴클레오티드"로 지칭될 수 있다. 대부분의 폴리뉴클레오티드의 3' 뉴클레오티드는 본원에서 폴리뉴클레오티드의 "3' 말단 뉴클레오티드"로 지칭될 수 있다. 본 발명의 핵산이 RNA의 형태를 취하는 경우, 이는 5' 캡을　가질 수도 있고 가지지 않을 수도 있다.
LAMP는 Bst DNA 중합효소, 또는 다른 가닥 대체 중합효소에 의해 수행되는 자동 사이클 가닥-대체 DNA 합성에 의존하는 핵산 증폭 방법이다. 증폭된 생성물은 표적의 여러 반복 서열을 갖는 스템-루프 구조이며, 다중 루프를 가진다. 이 방법의 주요 장점은 DNA 주형의 변성이 필요하지 않으므로, 따라서 LAMP 반응이 등온 조건 (60 내지 67℃ 범위) 하에서 수행될 수 있다. LAMP는 오직 1개의 효소 및 표적 서열에서 6개의 별개의 혼성화 부위를 인식하는 4가지 유형의 프라이머를 필요로 한다. 반응은 2개의 추가 프라이머의 첨가에 의해 가속될 수 있다. 다량의 증폭 산물을 생성하므로 용이한 검출, 예를 들어 반응 혼합물의 탁도 또는 형광의 시각적 판단에 의한 검출을 초래한다.
간단하게, 반응은 한 쌍의 '루프-형성' 프라이머 (각각, 정방향 및 역방향 내부 프라이머, FIP 및 BIP)의 어닐링 및 연장에 의해 개시되고, 한 쌍의 플랭킹 프라이머 (F3 및 B3)의 어닐링 및 연장이 이어진다. 이들 프라이머의 연장은 루프-형성 요소의 가닥-대체를 초래하고, 이는 말단 헤어핀 루프 구조를 형성하기 위해 접힌다. 이러한 핵심 구조가 나타나면, 증폭 과정이 자체적으로 유지되고, 반응 혼합물의 모든 뉴클레오티드 (dATP, dTTP, dCTP & dGTP)가 증폭된 DNA로 통합될 때까지 (PCR과 같은 주기적 방식이 아닌) 연속적이고 지수적인 방식으로　일정한 온도에서 진행된다. 선택적으로, 프라이머의 추가 쌍이 반응을 가속하기 위해 포함될 수 있다. 루프 프라이머라고 하는, 이들 프라이머는 내부 프라이머 덤벨 모양 생성물의 비내부 프라이머 결합 말단 루프에 혼성화된다.
본원에서 사용되는 용어 "프라이머"는 합성 핵산 가닥 (주형)에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성이 도입되는 조건, 즉, 뉴클레오티드 및 중합제, 예를 들어 DNA 중합효소의 존재, 및 적절한 온도 및 pH 하에 발생하는 경우, 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
LAMP는 가장 빠른 실시간 PCR 검사에 상당하는 30분 이하의 반응 시간을 갖는, PCR보다 더 높은 감도 및 특이성을 가지는 표적 DNA 서열의 증폭을 허용한다. 증폭된 표적 서열은 보통 200-300 염기 쌍 (bp) 길이이며, 반응은 증폭 과정 동안 동시에 여러 프라이머에 의한 이 서열의 120 bp 내지 160 bp 사이의 인식에 의존한다. 이러한 높은 수준의 엄격함은 증폭을 매우 특이적으로 만들어, 전체 표적 서열이 처음에 존재하는 경우에만 반응에서 증폭된 DNA의 출현이 발생한다.
LAMP 적용은 역전사효소 효소 (RT)의 첨가에 의한 RNA 분자의 검출을 포함하도록 확장되어 왔다. RNA 검출을 포함함으로써, LAMP가 적용될 수 있는 표적의 유형도 확장될 수 있고 RNA 기반 바이러스, 중요한 조절 비-코딩 RNA (sRNA, miRNA), 및 특정 질병 또는 생리적 상태와 연관된 RNA 분자를 부가적으로 표적화할 수 있는 능력도 추가된다. RNA를 검출하는 능력은 또한 예를 들어 고도로 발현된, 안정적인, 및/또는 풍부한 메신저 RNA (mRNA) 또는 리보솜 RNA (rRNA) 표적을 선택할 때 분석 감도를 증가시키는 잠재력도 가진다. 이러한 증폭의 예비 단계는 RNA 분자를 상보적 DNA (cDNA)로 역전사하는 것을 포함한다. 그런 다음 cDNA는 DNA 중합효소를 대체하는 가닥에 대한 주형으로 역할을 한다. 내열성 RT 효소 (즉, NEB RTx)의 사용은 반응을 단일 온도 및 1단계, 단일 혼합 반응으로 완료할 수 있도록 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "표적 서열"은 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 사용하여 증폭되고, 검출된, 또는 모두 증폭되고 검출된, 클라미디아 트라코마티스, 또는 이의 보체의 핵산 서열을 의미한다. 부가적으로, 용어 표적 서열이 때때로 이중 가닥 핵산 서열을 지칭하지만, 당업자는 표적 서열이 또한 단일 가닥, 예를 들어, RNA일 수 있음을 인식할 것이다. 표적 서열은 특정 유기체에 대해 다소 특이적인 것이 선택될 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 전체 속, 하나 이상의 속, 종 또는 아종, 혈청군,　보조형, 혈청형, 균주, 분리체 또는 기타 유기체 서브셋에　대해 특이적일 수 있다.
본원에 기술된 프라이머/프로브 조성물 및 방법의 속도, 특이성 및 감도는 여러 측면으로부터 기인한다. 발명에 따른 조성물 및 방법에 사용하기 위한 예시적인 프라이머는 하기를 포함한다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
LAMP 증폭된 생성물의 검출은 다양한 방법을 통해 달성될 수 있다. 바람직한 양태에서, 생성물의 검출은 프라이머 믹스에 형광 표지된 프로브를 첨가함으로써 수행된다. 본원에 사용된 용어 "프로브"는 표적 서열에 대해 상보적, 또는　실질적으로 상보적인 부분 또는 부분들을 포함하는 단일 가닥 핵산 분자를 지칭한다. 특정 구현에서, 형광 표지된 프로브는 분자 비콘이다.
본원에 사용된 바와 같이, "분자 비콘"은 용액에서 특정 핵산의 존재를 보고하기 위해 설계된 단일 가닥 헤어핀 모양 올리고뉴클레오티드 프로브를 지칭한다. 분자 비콘은 4개의 구성 요소로 이루어진다; 스템, 헤어핀 루프, 말단 표지 형광단 및 반대 말단 표지 ??처 (Tyagi et al., (1998) Nature Biotechnology 16:49-53). 헤어핀 유사 비콘이 표적에 결합하지 않는 경우, 형광단 및 ??처는 함께 가깝게 놓여 형광이 억제된다. 상보적 표적 뉴클레오티드 서열의 존재 시, 비콘의 스템이 표적에 혼성화하기 위해 개방된다. 이것이 형광단과 ??처를 분리시켜, 형광단이 형광을 발하게 한다. 대안적으로, 분자 비콘은 또한 말단 표지 공여자의 근접에서 방출하는 형광단을 포함한다. "파장-변환 분자 비콘"은 형광단이 더욱 강하게 방출하도록 하는 추가 수확기 형광단을 포함한다. 분자 비콘의 현재 검토 문헌은 Wang et al., 2009, Angew Chem Int Ed Engl, 48(5):856-870; Cissell et al., 2009, Anal Bioanal Chem 393(1):125-35; Li et al., 2008, Biochem Biophys Res Comm 373(4):457-61; 및 Cady, 2009, Methods Mol Biol 554:367-79를 포함한다.
한 구현에서, 분자 비콘은 형광단, ??처, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 및 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 한 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 99 내지 서열 번호 120으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 99 내지 서열 번호 120으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진다. 상기 기술된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의　비천연 뉴클레오시드 또는 연결, 예를 들어 그 중에서도 펩티드 핵산 (PNA), 모르폴리노, 잠금 핵산 (LNA), 글리콜 핵산 (GNA) 및 트레오스 핵산 (TNA)을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드는 1 내지 6개의 잠금 핵산을 포함한다. 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드는 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드는 바람직한 양태에서, 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드는 3개의 잠금 핵산을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드는 4개의 잠금 핵산을 포함한다.
분자 비콘은 바람직하게는 서열 특이적 LAMP 프라이머의 세트를 또한 포함하는 조성물에서 사용된다. 한 구현에서, 분자 비콘은 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28, 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28, 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27, 및 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 이러한 구현에서, 분자 비콘은 서열 번호 97 내지 서열 번호 130으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 97 내지 서열 번호 130으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진다. 특히 바람직한 구현에서, 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 115이다.
세트 12-27, 세트 39-54, 및 세트 66-81로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 세트를 포함하는 조성물에 포함되는 경우, 분자 비콘은 바람직하게는 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 및 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 더욱 특히, 분자 비콘은 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101, 서열 번호 106, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 120, 서열 번호 121, 및 서열 번호 122로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현에서, 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101, 서열 번호 106, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 120, 서열 번호 121, 및 서열 번호 122로 이루어진 군으로부터 선택된다.
세트-12, 세트 14-18, 세트-20, 세트-24, 세트-27, 세트-39, 세트 41-45, 세트-47, 세트-51, 세트-54, 세트-66, 세트 68-72, 세트 74, 세트-78, 및 세트-81로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 세트를 포함하는 조성물에 포함되는 경우, 분자 비콘은 바람직하게는 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28 및 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 특정 구현에서, 분자 비콘은 서열 번호 125 및 서열 번호 126으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 125 또는 서열 번호 126이다.
세트 14-27, 세트 41-54, 및 세트 68-81로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 세트와 조합하여 사용되는 경우, 분자 비콘은 바람직하게는 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31 및 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27 로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 분자 비콘의 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 113 및 서열 번호 127로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 113 또는 서열 번호 127이다.
세트 12-20, 세트 22-27, 세트 39-47, 세트 49-54, 세트 66-74, 및 세트 76-81로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 세트를 포함하는 조성물에 포함되는 경우, 분자 비콘은 바람직하게는 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27을 포함한다. 일부 구현에서, 분자 비콘은 서열 번호 130을 포함한다. 다른 양태에서, 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 130이다.
세트-13, 세트-40 및 세트-67로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 세트와 조합하여 사용되는 경우, 분자 비콘은 바람직하게는 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30 및 서열 번호 131의 뉴클레오티드 8-29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 이러한 양태에서, 분자 비콘은 서열 번호 102 및 서열 번호 131로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 분자 비콘의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 102 또는 서열 번호 131이다.
본원에서 사용되는 용어 "표지"는 검출 및, 선택적으로, 정량이 가능한 속성 또는 특성을 가지는 분자 또는 모이어티를 의미한다. 표지는 예를 들어 (및 제한 없이), 방사성 동위원소, 형광단, 화학발광단, 효소, 콜로이드 입자, 형광 미세입자 등과 같이 직접 검출될 수 있거나; 표지는 예를 들어, 특이적 결합 구성원과 같이, 간접적으로 검출 가능할 수 있다. 직접적으로 검출 가능한 표지는 표지의 검출 및/또는 정량을 가능하게 하기 위해 예를 들어, 기질, 촉발 시약, ??칭 모이어티, 빛 등과 같은 추가 구성요소를 필요로 할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 간접적으로 검출 가능한 표지가 사용되는 경우, 이들은 보통 "접합체"와 조합하여 사용된다. 접합체는 보통 직접적으로 검출 가능한 표지에 부착되거나 커플링된 특이적 결합 구성원이다. 접합체를 합성하기 위한 커플링 화학은 당 업계에 잘 알려졌으며 예를 들어, 특이적 결합 구성원의 특이적 결합 속성 또는 표지의 검출 가능한 속성을 파괴하지 않는 임의의 화학적 수단 및/또는 물리적 수단을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "특이적 결합 구성원"은 결합 쌍의 구성원, 즉, 예를 들어, 화학적 또는 물리적 수단을 통한 분자 중 하나가 다른 분자에 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 분자를 의미한다. 항원 및 항체 특이적 결합 쌍에 더하여, 다른 특이적 결합 쌍은 아비딘 및 비오틴; 합텐 및 합텐 특이적 항체; 상보적 뉴클레오티드 서열; 효소 보조 인자 또는 기질 및 효소; 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
분자 비콘은 DNA 또는 RNA와 같은 핵산으로만 구성될 수 있거나, 펩티드 핵산 (PNA) 접합체로 구성될 수 있다. 형광단은 임의의 형광 유기 염료 또는 단일 양자점일 수 있다. ??칭 모이어티는 바람직하게는 형광단의 발광을 소멸시킨다. 형광단의 발광을 소멸시키는 임의의 적합한 ??칭 모이어티가 사용될 수 있다. 형광단은 당업계에 공지된 임의의 형광 마커/염료일 수 있다. 적합한 형광 마커의 예시는 Fam, Hex, Tet, Joe, Rox, Tamra, Max, Edans, Cy 염료 예를 들어 Cy5, 플루오레세인, 쿠마린, 에오신, 로다민, 보디피, 알렉사, 케스케이드 블루, 야키마 옐로우, 루시퍼 옐로우, 텍사스 레드, 및 ATTO 염료의 패밀리를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. ??처는 당업계에 공지된 임의의 ??처일 수 있다. ??처의 예시는 Dabcyl, Dark Quencher, Eclipse Dark Quencher, ElleQuencher, Tamra, BHQ 및 QSY (이들 모두 상표임)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 프로브를 설계할 때 어느 염료/??처의 조합이 적합한지 알 것이다. 예시적 양태에서, 플루오레세인 (FAM)은 Blackhole Quencher™(BHQ™)(Novato, Calif.)와 함께 사용된다. 그런 다음 증폭된 생성물에 대한 분자 비콘의 결합은 직접적으로, 시각적으로 평가될 수 있다. 대안적으로, 형광 수준은 감도를 개선하기 위해 분광법에 의해 측정될 수 있다.
Abingdon Health (UK; www.abingdonhealth.com), Attostar (US, MN; www.attostar.com), Biolegio (NLD; www.biolegio.com), Biomers.net (DEU; www.biomers.net), Biosearch Technologies (US, CA; www.biosearchtech.com), Eurogentec (BEL; www.eurogentec.com), Gene Link (US, NY; www.genelink.com) Integrated DNA Technologies (US, IA; www.idtdna.com), Isogen Life Science (NLD; www.isogen-lifescience.com), Midland Certified Reagent (US, TX; www.oligos.com), Eurofins (DEU; www.eurofinsgenomics.eu), Sigma-Aldrich (US, TX; www.sigmaaldrich.com), Thermo Scientific (US, MA; www.thermoscientific.com), TIB MOLBIOL (DEU; www.tib-molbiol.de), TriLink Bio Technologies (US, CA; www.trilinkbiotech.com)를 비롯한, 다양한 상업적 공급자가 표준 및 맞춤형 분자 비콘을 생산한다. 분자 비콘을 활용하는, 다양한 키트, 예를 들어 Stratagene (La Jolla, Calif.)의 SentinelTM 분자 비콘 대립 형질 구별 키트　및 Eurogentec SA (Belgium, eurogentec.com) 및 Isogen Bioscience BV (The Netherlands, isogen.com)의 다양한 키트가 또한 시판된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머는 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 선택적으로 제조된다. 특정 양태에서, 예를 들어, 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머는 예를 들어, 참고로 포함된, Beaucage 및 Caruthers (1981), Tetrahedron Letts. 22(20):1859-1862에 기술된 고체상 포스포라미다이트 트리에스터 방법에 따른, 또는 당업계에 공지된 다른 합성 기술, 예를 들어, 참고로 포함된, Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-6168에 기술된, 자동화 합성기를 사용하는 것을 포함하는, 근본적으로 임의의 핵산 합성 방법을 사용하여 화학적으로 합성된다. 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 다양한 장비가 시판된다. 다중-뉴클레오티드 합성 접근법 (예를 들어, 트리-뉴클레오티드 합성 등)이 또한 선택적으로 활용된다. 더욱이, 본원에 기술된 프라이머 핵산은 선택적으로 다양한 변형을 포함한다. 추가로 설명하기 위해, 프라이머는 예를 들어, 참고로 포함된, 1999년 12월 14일에 발행된, 미국 특허 번호 6,001,611에 기술된 바와 같이 증폭 반응의 특이성을 개선하기 위해 선택적으로 변형된다. 프라이머 및 프로브는 또한 본원에 기술된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 다양한 다른 변형으로 합성될 수 있다.
또한, 본질적으로 임의의 핵산 (및 사실상 임의의 표지된 핵산, 표준 또는 비표준이든)은 Integrated DNA Technologies, Midland Certified Reagent Company, Eurofins, Biosearch Technologies, Sigma Aldrich 및 기타 다수의 다양한 공급처로부터 맞춤 또는 표준품으로 주문될 수 있다.
시료는 일반적으로 클라미디아 감염된 것으로 의심되는, 대상체, 전형적으로 포유동물 대상체, 더욱 전형적으로 인간 대상체로부터 유래되거나 단리된다. 예시적인 샘플 또는 표본은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 활액, 정액, 정액 혈장, 전립선액, 질액, 자궁경부액, 자궁 액, 자궁경부 찰과도말, 양수, 항문 찰과도말, 점액, 가래, 조직 등을 포함한다. 예를 들어, 찰과, 긁기, 정맥 천자, 면봉, 생검, 또는 당업계에 공지된 다른 기술을 비롯한 포함하여 본질적으로 이들 샘플을 획득하는 임의의 기술은 선택적으로 활용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "시료"는 표적 서열을 함유하는 것으로 의심되거나 잠재적으로 함유하는 유기체 또는 생물학적 유체로부터 취한 샘플을 의미한다. 시료는 예를 들어, 조직, 혈액, 타액, 담체, 점액, 땀, 소변, 요도 면봉, 자궁 경부 면봉, 질 면봉, 비뇨 생식기 또는 항문 면봉, 결막 면봉, 안구 수정 체액, 뇌척수액, 우유, 복수액, 활액, 복막액, 양수, 발효액, 세포 배양, 화학 반응 혼합물 등과 같은 임의의 생물학적 공급원으로부터 취할 수 있다. 시료는 (i) 공급원으로부터 직접적으로 수득하거나 (ii) 샘플의 특성을 수정하기 위한 전처리 후에 사용할 수 있다. 따라서, 시료를 예를 들어, 혈액에서 혈장 또는 혈청을 준비, 세포 또는 바이러스 입자를 파괴, 고체 물질에서 액체를 제조, 점성 액체를 희석, 액체를 여과, 액체를 증류, 액체를 농축, 간섭 성분 비활성화, 시약 첨가, 핵산 정제 등을 통해 사용하기 전에 전처리할 수 있다.
유리하게, 본 발명은 임상 샘플, 예를 들어 소변 샘플 중의 클라미디아 트라코마티스의 신뢰성 있는 신속한 검출을 가능하게 한다.
추가로 설명하기 위해, 본원에 기술된 표적 핵산을 분석하기 전, 이들 핵산은 보통 상이한 구성성분의 복합 혼합물을 포함하는 샘플로부터 정제되거나 단리될 수 있다. 수집된 샘플의 세포는 보통 용해되어　세포 내용물을 방출한다. 예를 들어, 특정 샘플의　 C. 트라코마티스 및 다른 세포는 다양한 효소, 화학 물질과 접촉시킴으로써 용해될 수 있고/있거나 예를 들어, 박테리아 세포벽을 분해하는 당업계에 공지된 다른 접근법에 의해 용해될 수 있다. 일부 양태에서, 핵산은 세포 용해물에서 직접 분석된다. 다른 양태에서, 핵산은 검출 전에 세포 용해물로부터 추가로 정제되거나 추출된다. 본질적으로 임의의 핵산 추출 방법이 본 발명의 방법에서 활용되는 샘플에서 핵산을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 정제에 사용될 수 있는 예시적인 기술은, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 고체 지지체에 고정된 프로브에 대한 혼성화, 액체-액체 추출 (예를 들어, 페놀-클로로포름 추출 등), 침전 (예를 들어, 에탄올 사용 등), 여과지로 추출, 미셀 형성 시약 (예를 들어, 세틸-트리메틸-암모늄-브로마이드 등)으로 추출, 고정된 삽입 염료 (예를 들어, 에티듐 브로마이드, 아크리딘 등)에 대한 결합, 실리카 겔 또는 이원자 토에 대한 흡착, 무질서 조건 하 자기 유리 입자 또는　유기　실란 입자에의　흡착, 및/또는 등을 포함한다. 샘플 처리는 또한 예를 들어, 참고로 각각 포함된, 미국 특허 번호 5,155,018, 6,383,393, 및 5,234,809에 기술되어 있다.
시료는 선택적으로 증폭 효율 및/또는 정성적 정확도 및/또는 정량적 정확도를 개선하기 위해, 당업자에 공지된 임의의 기술에 따라 처리되고/거나 정제될 수 있다. 샘플은 따라서 정제, 단리 또는 화학적 합성에 의해 획득되든 상관없이, 독점적으로, 또는 본질적으로, 핵산(들)로 이루어질 수 있다. 예를 들어 자궁 경부 찰과도말로부터 DNA를 단리하거나 정제하기 위해, 시료로부터, 핵산, 예를 들어 DNA를 단리하거나 정제하고자 하는 당업자는 수단을 사용할 수 있다 (예를 들어, QIAamp-DNA 미니-키트; Qiagen, Hilden, 독일).
실시예:
실시예 1: 표적 선택 및 프라이머 프로브 설계
박테리아 세포에서 리보솜 유전자의 연속적이고 높은 수준의 발현을 고려하여, 이들 유전자, 특히 16S 및 23S 유전자를 증폭 분석에 대한 표적으로서 선택하였다.
C. 트라코마티스, 클라미도필라 뉴모니아 및 클라미디아 프시타시, 및 소변 또는 질액에서 일반적으로 발견되는 다른 종과 같은 밀접하게 관련된 종의 다중 혈청형에 대한 16S 및 23S 유전자 서열을 NCBI 데이터베이스로부터 검색하였다. 서열을 Clustal omega (Sievers, et al. 2011. Molecular Systems Biology 7:539)를 사용하여 정렬하였고 C. 트라코마티스 종에 대해 독특한 특이적 염기를 갖는 영역을 식별하였다. 루프 매개 증폭 프라이머를 LAMP 디자이너 (Premier Biosoft)를 사용하여 설계하였다. 특이성을 더하기 위해, 증폭된 생성물을 표적으로 하는 분자 비콘 또는 프로브를 수동으로 또는 비콘 디자이너 (Premier Biosoft)를 사용하여 설계하였다. 설계된 프라이머 세트 및 비콘은 인간 게놈 및 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스에 대해 BLAST를 사용하여 특이성을 추가로 분석하였다. 다양한 프라이머 세트 및 프로브를 설계하였고 반응 속도에 대해 스크리닝하였다.
본 발명의 프라이머 세트는 최소한으로, 정방향 내부 프라이머 (FIP) 및 역방향 내부 프라이머 (BIP)를 포함한 표 2에 요약되어 있다. 추가로, 프라이머 세트는 또한 보통 정방향 외부 프라이머 (F3), 역방향 외부 프라이머 (B3), 정방향 루프 프라이머 (LF) 및 역방향 루프 프라이머 (LB) 로부터 선택된 적어도 2개의 추가 프라이머를 포함한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 2: 증폭 반응 동역학
음성 소변 매트릭스에 두 가지 상이한 농도 (103 IFU/mL 및 10 IFU/mL)의 적정된 C. 트라코마티스 (균주 Z054, D-UW3 (Zeptometrix) 또는 ATCC 혈청형 D 균주 VR-885)를 섞었다. 표준 추출 방법을 사용하여 핵산을 추출하고 샘플을 표 2에 기술된 바와 같은 LAMP 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다. YoProTM 염료 (Life Technologies; 녹색 형광　 카보시아닌 핵산 얼룩)를 증폭된 생성물의 검출을 위해 사용하였다. 이 실시예에서 25 ㎕ 반응은 4.8 mM 또는 6 mM MgCl2, 1.4 mM 또는 1.6 mM dNTP, 200nM YO-PRO-1 염료 (Life Technologies), 프라이머 (0.2 μ의 F3 및 B3, 존재하는 경우; 1.6 μ의 FIP 및 BIP; 0.4-0.8 μ의 LF 및 LB, 존재하는 경우), 8 또는 12 단위의 Bst2 중합효소 (New England Biolabs), 7.5 단위 RTx 웜스타트 (역전사효소; New England Biolabs), 및 추출된 핵산 (주형으로서) 또는 물 (비주형 대조군으로서)로 보충된 1X 등온 증폭 완충제 (New England Biolabs)를 함유하였다. 반응을 63℃ 또는 65℃에서 배양하였고 동역학은 로슈 실시간 라이트사이클러96 (Roche)를 사용하여 모니터링하였다.
이러한 실시예는 이러한 세트의 프라이머 및 루프 매개 증폭 방법을 사용하여, 고속 증폭 동역학이 달성되었음을 나타낸다. 결과를 표 3에 요약하였으며, 여기서 양성까지의 시간 (Tp)을 기구에 의해 계산하였다. NT는 시험되지 않은 농도를 표시한다. 결과는 양성까지의 시간에 의해 분류된다 (NT는 "시험되지 않음"을 의미하고 "호출 없음"은 증폭이 검출되지 않음을 표시함).
Figure pct00006
실시예 3: 분석 동역학 상의 비콘 설계 위치 효과
일부의 상기 프라이머 세트 및 간섭 염료를 함유하는 증폭 반응은 주형으로서 물 또는 음성 소변 추출 또는 밀접하게 연관된 종 예를 들어 C. 뉴모니아 또는 C. 프시타시의 DNA를 사용하는 경우 분석 시간 동안 컷오프 창의 가변 간격 내에서, 시간의 0% 내지 75% 범위의 빈도에서 (표 4), 증폭 생성물의 검출을 유발하였다. 결과는 양성까지의 시간에 의해 분류된다 ("호출 없음"은 증폭이 검출되지 않음을 표시함).
Figure pct00007
C. 트라코마티스 표적으로부터의 신호만 검출하도록 하기 위해 특이성을 더한 분자 비콘을 이들 프라이머 세트를 따라 설계하였다 (표 5에 열거된 서열). 각각의 분자 비콘 프로브는 표적 특이적 형광 검출을 제공하기 위해 포함된 5'형광단/3'??처 변형 (6-카복시플루오레세인 (FAM) 및 블랙홀 ??처 1 (BHQ1))와 함께 설계하였다.
Figure pct00008
음성 소변 매트릭스에 두 가지 상이한 농도 (103 IFU/mL 및 10 IFU/mL)의 적정된 C. 트라코마티스 (균주 Z054, D-UW3 (Zeptometrix) 또는 ATCC 혈청형 D 균주 VR-885)를 첨가하였다. 표준 추출 방법을 사용하여 핵산을 추출하고 샘플을 LAMP 프라이머 세트 (표 2 당)를 사용하여 증폭하였고 하나의 분자 비콘 (표 4 당)을 증폭된 생성물의 검출을 위해 사용하였다. 이 실시예에서 25 ㎕ 반응은 4.8 mM 또는 6 mM MgCl2, 1.4 mM 또는 1.6 mM dNTP, 200nM 분자 비콘 (Sigma-Aldrich), 프라이머 (0.2 μ의 F3 및 B3, 존재하는 경우; 1.6 μ 또는 2 μ의 FIP 및 BIP; 0.4-0.8 μM의 LF 및 LB, 존재하는 경우), 8 또는 12 단위의 Bst2 중합효소 (New England Biolabs), 7.5 단위 RTx 웜스타트 (역전사효소; New England Biolabs), 및 추출된 핵산 (주형으로서) 또는 물 (비주형 대조군으로서)이 보충된 1X 등온 증폭 완충제 (New England Biolabs)를 함유하였다. 반응을 63℃에서 배양하였고 동역학을 로슈 실시간 라이프사이클러96 (Roche)를 사용하여 모니터링하였다. 각각의 프라이머-프로브 조합의 양성까지의 시간을 표 6에 보고하였다. 결과는 하기와 같이 반응 개시로부터 양성까지의 시간 (Tp)에 의해 분류된다: "NT"는 이 조합이 검사되지 않았음을 표시하고 "호출 없음"은 증폭이 검출되지 않았음을 표시함.
Figure pct00009
Figure pct00010
검출을 위한 분자 비콘의 사용은 반응 Tp에서 약간 증가를 유발하지만, 분석 특이성의 유의한 향상은 합당한 트레이드오프를 제공하며, 45분의 검사 시간 내에서 물 샘플 또는 밀접하게 관련된 종으로부터의 DNA에서는 증폭이 관찰되지 않았다 (실시예 4, 표 7 참조).
실시예 4: 특이성 검사
음성 소변 매트릭스에 적정된 C. 트라코마티스 또는 성병 감염과 보통 연관된 유기체 (예를 들어, 나이세리아 고노르호애) 또는 C. 트라코마티스와 밀접하게 관련된 종 (C. 뉴모니아 또는 C. 프시타시)을 첨가하였다. 원하는 농도에서 소변 매트릭스로 첨가하기 전에 박테리아 스톡을 PBS에서 연속적으로 희석하였다. 상응하는 추출된 핵산 또는 검사 종의 DNA를 상기 실시예 3에 기술된 방법에 따른, LAMP 프라이머 및 분자 비콘 프로브를 함유하는 RT-LAMP 반응에서 주형으로서 사용하였다. NT는 반응이 검사되지 않았음을 표시한다.
Figure pct00011
이 실시예는 CT23S 분석 및 이의 반응 제제가 매우 특이적으로, 성병 감염과 밀접하게 관련된 유기체 및 보통 연관된 것들의 서열과의 교차 반응성을 제한하도록 설계될 수 있음을 나타낸다.
실시예 5: 감도 검사
RNA 분자 표준품을 표시된 프라이머 세트/분자 비콘 조합의 감도를 평가하기 위해 다양한 농도로 희석하였다 (표 8). 표준품을 PBS (Sigma)에서 0.1mg/mL 폴리 A 담체 RNA로 연속적으로 희석하고 RTLAMP 반응에서 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. 반응의 최종 농도는 40, 8, 또는 4 카피/uL이었다. 반응 조건은 실시예 3에 기술된 것도 동일하였다. 증폭 신호를 4 카피/uL의 낮은 농도에서 수득하였다 (표 8 참조).
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> TALIS BIOMEDICAL CORPORATION <120> POLYNUCLEOTIDES FOR THE AMPLIFICATION AND DETECTION OF CHLAMYDIA TRACHOMATIS <130> 32582-40570/WO <140> <141> 2019-05-09 <150> 62/669,236 <151> 2018-05-09 <160> 131 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 cgaaggaatg acggagta 18 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 cgccttagaa tattcatctc g 21 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 gcgacctgat cttatgttag cgcgattgga agagtccgta 40 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 gaaccgatgg tgtggagccc acctgtgtcg gtt 33 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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Synthetic primer <400> 90 gctcggggtt gtaggattga ggatacctgt atcatccatc tttccagat 49 <210> 91 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 91 ctttcgctcg ccgctac 17 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 92 ggatcaggac tcctagttga acac 24 <210> 93 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 93 cctacaaccc cgagccttat cagaaaagaa atcgaagaga ttccctg 47 <210> 94 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 94 atcagctcgg tttaggctat tcccagagat tccctgtgta gcg 43 <210> 95 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 95 gctcggggtt gtaggattga ggatattctc tcctttcgtc tacgg 45 <210> 96 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 96 gctcggggtt gtaggattga ggatactgta tcatccatct ttccagatgt 50 <210> 97 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 97 cgcgcacatc tggaaagatg gatgatacag ggtgcgcg 38 <210> 98 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 98 cgtccaggac tcctagttga acacatctgg acg 33 <210> 99 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 99 ccggatcagg actcctagtt gaacacatct gatccgg 37 <210> 100 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 100 cggccaggac tcctagttga acacatctgg ccg 33 <210> 101 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 101 cgtccggatc aggactccta gttgaacacc ggacg 35 <210> 102 <211> 34 <212> DNA 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 108 caccgggatg atacagggtg atagtcccgg tg 32 <210> 109 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 109 tcgcgggatg atacagggtg atagtcccgc gg 32 <210> 110 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 110 cagcgggatc aggactccta gttgaacccg ctg 33 <210> 111 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 111 cacgctcgag attccctgtg tagcggcgag cgtg 34 <210> 112 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 112 caggcggatc aggactccta gttgaacacc gcctg 35 <210> 113 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 113 cagcgacaga aatcgaagag attccctgtg tcgctg 36 <210> 114 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 114 cacgggatga tacagggtga tagtcccgtc 30 <210> 115 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 115 cacgggatga tacagggtga tagtcccgtg 30 <210> 116 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 116 cacgatggat gatacagggt gatagtccat cgtg 34 <210> 117 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 117 caccgatgga tgatacaggg tgatagtccc atcggtg 37 <210> 118 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 118 cgcgatcgag gataaaggat caggactcga tcgcg 35 <210> 119 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 119 cgcgatcatt gaggataaag gatcaggact 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probe <400> 125 cgcgatccct gtgtagcggc gagcgagatc gcg 33 <210> 126 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 126 cgcgatcctg tgtagcggcg agcgaaagat cgcg 34 <210> 127 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 127 cggctcgggg ttgtaggatt gaggatacga gccg 34 <210> 128 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 128 ccggagccta caaccccgag ccttatcagc tccgg 35 <210> 129 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 129 gcgcagctcg gtttaggcta ttcccctgcg cg 32 <210> 130 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 130 cgcggtctct cctttcgtct acgggaccgc g 31 <210> 131 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 131 cgcagtgaga gaaagaccga cctcaacact gcg 33

Claims (104)

  1. 세트-20, 세트-24, 세트-47, 세트-51, 세트-74 및 세트-78로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 세트를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프로브는 표지된 폴리뉴클레오티드인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28, 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28, 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27, 및 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 프로브는 형광단, ??처, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자 비콘인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 분자 비콘은 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28, 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28, 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27, 및 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 분자 비콘은 서열 번호 97-101 및 103-130으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 115로 이루어진 조성물.
  9. 형광단, ??처, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자 비콘으로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28, 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28, 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27, 및 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 분자 비콘.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97-101 및 103-130으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 분자 비콘.
  11. 제10항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 115로 이루어진 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 형광단은 FAM이며 상기 ??처는 BHQ1인 분자 비콘.
  13. 시료에서 클라미디아 트라코마티스를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a)시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
    (b)단계 (a)에서 추출된 핵산을 가닥 치환 DNA 중합효소 및 서열 특이적 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물과 반응시킴으로써 표적 서열을 증폭하는 단계로서, 상기 서열 특이적 프라이머 세트는 세트-20, 세트-24, 세트-47, 세트-51, 세트-74, 및 세트-78로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 증폭되는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 증폭된 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계로서, 상기 증폭 생성물의 존재는 시료에서 클라미디아 트라코마티스의 존재를 표시하는, 상기 검출하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 표적 서열의 단계 (b)에서의 증폭이 15분 미만 동안 약 60℃ 내지 약 67℃에서 수행되는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 증폭 단계가 10분 미만 동안 수행되는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 역전사효소를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 증폭 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계가 증폭된 생성물을 표지에 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브와 혼성화하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28, 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28, 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27, 및 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97-101 및 103-130으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열 번호 115인 방법.
  21. 제13항에 있어서,　클라미디아 트라코마티스가 시료에서 ≤100 IFU/mL의 농도로 존재하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,　클라미디아 트라코마티스가 시료에서 ≤5 IFU/ml의 농도로 존재하고 상기 증폭 단계가 15분 미만 동안 수행되는 방법
  23. 제21항에 있어서,　클라미디아 트라코마티스가 시료에서 ≤10 IFU/ml의 농도로 존재하고 상기 증폭 단계가 6분 미만 동안 수행되는 방법.
  24. 제1항에 따른 조성물을 포함하는 키트.
  25. 제24항에 있어서, 가닥 치환 중합효소를 추가로 포함하는 키트.
  26. 제24항에 있어서, 형광단, ??처, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자 비콘을 추가로 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97-101 및 103-130으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 키트.
  27. 제26항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 115로 이루어진 키트.
  28. 시료에서 클라미디아 트라코마티스를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 추출된 핵산을 10분 미만 동안 가닥 치환 DNA 중합효소 및 세트-20 및 세트-24 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 특이적 LAMP 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물과 반응시킴으로써 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 증폭된 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계로서 상기 증폭 생성물의 존재는 시료에서 클라미디아 트라코마티스의 존재를 표시하는, 상기 검출하는 단계.
  29. 제28항에 있어서, 상기 증폭 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계는 증폭된 생성물을 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28, 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28, 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27, 및 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자 비콘과 혼성화시키는 것을 포함하는 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 증폭 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계는 증폭된 생성물을 서열 번호 97-101 및 103-130으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자 비콘과 혼성화시키는 것을 포함하는 방법.
  31. 세트-1 내지 세트-81로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 세트를 포함하는 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 프로브는 표지를 포함하는 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 프로브는 표지된 폴리뉴클레오티드인 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 및 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28, 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28, 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27, 및 서열 번호 131의 뉴클레오티드 8-29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97 내지 131로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 조성물.
  37. 제34항에 있어서, 상기 표지가 형광단인 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 형광단은 폴리뉴클레오티드의 말단에 공유적으로 부착된 조성물.
  39. 제31항에 있어서, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 및 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 표지된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트-12, 세트 14-27, 세트-39, 세트 41-54, 세트-66, 및 세트 68-81로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 103, 서열 번호 104, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 114, 서열 번호 115, 서열 번호 116, 서열 번호 117, 서열 번호 118, 서열 번호 119, 서열 번호 123, 서열 번호 124, 서열 번호 128, 및 서열 번호 129로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열 번호 115이며, 상기 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트-20, 세트-24, 세트-47, 세트-51, 세트-74 및 세트-78로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트-20 또는 세트-24인 조성물.
  43. 제31항에 있어서, 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 및 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 표지된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트 12-27, 세트 39-54, 및 세트 66-81로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101, 서열 번호 106, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 120, 서열 번호 121, 및 서열 번호 122로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 조성물.
  45. 제31항에 있어서, 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28 및 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 표지된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트-12, 세트 14-18, 세트-20, 세트-24, 세트-27, 세트-39, 세트 41-45, 세트-47, 세트-51, 세트-54, 세트-66, 세트 68-72, 세트 74, 세트-78, 및 세트-81로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 125 및 서열 번호 126으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 조성물.
  47. 제31항에 있어서, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31 및 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 표지된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트 14-27, 세트 41-54, 및 세트 68-81로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 113 및 서열 번호 127로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 조성물.
  49. 제31항에 있어서, 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27을 포함하는 표지된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트 12-20, 세트 22-27, 세트 39-47, 세트 49-54, 세트 66-74, 및 세트 76-81로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 130을 포함하는 조성물.
  51. 제31항에 있어서, 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30 및 서열 번호 131의 뉴클레오티드 8-29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 표지된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트-13, 세트-40 및 세트-67로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 102 및 서열 번호 131로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 프로브는 형광단, ??처, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자 비콘인 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 분자 비콘은 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28, 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28, 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27, 및 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 분자 비콘은 서열 번호 97 내지 서열 번호 130으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 115로 이루어진 조성물.
  57. 형광단, ??처, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자 비콘으로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 및 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 분자 비콘.
  58. 제57항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 99 내지 서열 번호 120으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 분자 비콘.
  59. 제58항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 99 내지 서열 번호 120으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 분자 비콘.
  60. 제57항에 있어서, 상기 형광단은 FAM이며 상기 ??처는 BHQ1인 분자 비콘.
  61. 제57항에 있어서, 상기 형광단은 ATTO 565 또는 알렉사 594이며 상기 ??처는 BHQ1 또는 BHQ2인 분자 비콘.
  62. 시료에서 클라미디아 트라코마티스를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a)시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
    (b)단계 (a)에서 추출된 핵산을 가닥 치환 DNA 중합효소 및 서열 특이적 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물과 반응시킴으로써 표적 서열을 증폭하는 단계로서, 상기 서열 특이적 프라이머 세트는 세트-1 내지 세트-81로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 증폭하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 증폭된 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계로서, 상기 증폭 생성물의 존재는 시료에서 클라미디아 트라코마티스의 존재를 표시하는, 상기 검출하는 단계.
  63. 제62항에 있어서, 상기 표적 서열의 단계 (b)에서의 증폭은 30분 미만 동안 약 60℃ 내지 약 67℃에서 수행되는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 증폭 단계는 15분 미만 동안 수행되는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 증폭 단계는 10분 미만 동안 수행되는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 증폭 단계는 6분 미만 수행되는 방법.
  67. 제62항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 역전사효소를 추가로 포함하는 방법.
  68. 제62항에 있어서, 상기 증폭 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계는 증폭된 생성물을 표지에 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브와 혼성화시키는 것을 포함하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 표지는 형광단인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 형광단이 폴리뉴클레오티드의 말단에 공유적으로 부착되는 방법.
  71. 제68항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28, 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28, 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27, 및 서열 번호 131의 뉴클레오티드 8-29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97 내지 130으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  73. 제68항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 및 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하며, 상기 서열 특이적 프라이머 세트는 세트-12, 세트 14-27, 세트-39, 세트 41-54, 세트-66, 및 세트 68-81로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 103, 서열 번호 104, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 114, 서열 번호 115, 서열 번호 116, 서열 번호 117, 서열 번호 118, 서열 번호 119, 서열 번호 123, 서열 번호 124, 서열 번호 128, 서열 번호 129로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열 번호 115이며, 상기 서열 특이적 프라이머 세트는 세트-20, 세트-24, 세트-47, 세트-51, 세트-74 및 세트-78로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 서열 특이적 프라이머 세트는 세트-20 또는 세트-24인 방법.
  77. 제68항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 및 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하며, 상기 서열 특이적 프라이머 세트는 세트 12-27, 세트 39-54, 및 세트 66-81로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101, 서열 번호 106, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 120, 서열 번호 121, 및 서열 번호 122로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  79. 제68항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28 및 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하며, 상기 서열 특이적 프라이머 세트는 세트-12, 세트 14-18, 세트-20, 세트-24, 세트-27, 세트-39, 세트 41-45, 세트-47, 세트-51, 세트-54, 세트-66, 세트 68-72, 세트 74, 세트-78, 및 세트-81로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 125 및 서열 번호 126으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  81. 제68항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31 및 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하며, 상기 서열 특이적 프라이머 세트는 세트 14-27, 세트 41-54, 및 세트 68-81로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 113 및 서열 번호 127로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  83. 제68항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27을 포함하며, 상기 서열 특이적 프라이머 세트는 세트 12-20, 세트 22-27, 세트 39-47, 세트 49-54, 세트 66-74, 및 세트 76-81로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 130을 포함하는 방법.
  85. 제68항에 있어서, 상기 표지된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30 및 서열 번호 131의 뉴클레오티드 8-29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하며, 상기 서열 특이적 프라이머 세트는 세트-13, 세트-40 및 세트-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 102 및 서열 번호 131로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  87. 제62항에 있어서, 클라미디아 트라코마티스가 시료에서 ≤ 100 IFU/mL의 농도로 존재하는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 클라미디아 트라코마티스가 시료에서 ≤ 50 IFU/mL의 농도로 존재하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 클라미디아 트라코마티스가 시료에서 ≤ 5 IFU/mL의 농도로 존재하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 클라미디아 트라코마티스가 시료에서 ≤ 2 IFU/mL의 농도로 존재하는 방법.
  91. 제87항에 있어서, 클라미디아 트라코마티스가 시료에서 ≤ 5 IFU/ml의 농도로 존재하며 상기 증폭 단계는 15분 미만 동안 수행되는 방법.
  92. 제87항에 있어서, 클라미디아 트라코마티스가 시료에서 ≤ 10 IFU/ml의 농도로 존재하며 상기 증폭 단계는 6분 미만 동안 수행되는 방법.
  93. 제31항에 따른 조성물을 포함하는 키트.
  94. 제93항에 있어서, 가닥 치환 중합효소를 추가로 포함하는 키트.
  95. 제94항에 있어서, 형광단, ??처, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자 비콘을 추가로 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97의 뉴클레오티드 5-34, 서열 번호 98의 뉴클레오티드 5-31, 서열 번호 99의 뉴클레오티드 3-31, 서열 번호 100의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 101의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 102의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 103의 뉴클레오티드 5-26, 서열 번호 104의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 105의 뉴클레오티드 7-30, 서열 번호 106의 뉴클레오티드 5-27, 서열 번호 107의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 108의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 109의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 110의 뉴클레오티드 6-30, 서열 번호 111의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 112의 뉴클레오티드 6-29, 서열 번호 113의 뉴클레오티드 8-31, 서열 번호 114의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 115의 뉴클레오티드 5-29, 서열 번호 116의 뉴클레오티드 4-28, 서열 번호 117의 뉴클레오티드 5-30, 서열 번호 118의 뉴클레오티드 8-28, 서열 번호 119의 뉴클레오티드 8-30, 서열 번호 120의 뉴클레오티드 8-29, 서열 번호 121의 뉴클레오티드 4-33, 서열 번호 122의 뉴클레오티드 7-34, 서열 번호 123의 뉴클레오티드 9-34, 서열 번호 124의 뉴클레오티드 8-34, 서열 번호 125의 뉴클레오티드 6-28, 서열 번호 126의 뉴클레오티드 7-28, 서열 번호 127의 뉴클레오티드 3-27, 서열 번호 128의 뉴클레오티드 7-32, 서열 번호 129의 뉴클레오티드 4-27, 서열 번호 130의 뉴클레오티드 6-27, 및 서열 번호 131의 뉴클레오티드 8-29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 키트.
  96. 제95항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97 내지 서열 번호 131로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 키트.
  97. 제96항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97 내지 서열 번호 131로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어지는 키트.
  98. 제97항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 115로 이루어지며 상기 폴리뉴클레오티드의 세트는 세트-20 또는 세트-24인 키트.
  99. 시료에서 클라미디아 트라코마티스를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 추출된 핵산을 10분 미만 동안 가닥 치환 DNA 중합효소 및 서열 특이적 LAMP 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물과 반응시킴으로써 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 증폭된 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계로서, 상기 증폭 생성물의 존재는 시료에서 클라미디아 트라코마티스의 존재를 표시하는, 상기 검출하는 단계.
  100. 제99항에 있어서, 클라미디아 트라코마티스가 시료에서 ≤ 100 IFU/mL의 농도로 존재하는 방법
  101. 제100항에 있어서, 클라미디아 트라코마티스가 시료에서 ≤ 10 IFU/mL의 농도로 존재하는 방법.
  102. 제99항에 있어서, 상기 증폭 단계는 단계 (a)에서 추출된 핵산을 가닥 치환 DNA 중합효소 및 서열 특이적 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물과 반응시키는 단계를 포함하며, 상기 서열 특이적 프라이머 세트는 세트-1 내지 세트-81로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  103. 제102항에 있어서, 상기 증폭 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계는 증폭된 생성물을 서열 번호 97 내지 서열 번호 131로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자 비콘과 혼성화하는 것을 포함하는 방법.
  104. 제102항에 있어서, 상기 증폭 생성물의 존재 여부를 검출하는 단계는 증폭된 생성물을 서열 번호 99 내지 서열 번호 120으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자 비콘과 혼성화하는 것을 포함하는 방법.
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KR102392567B1 (ko) * 2021-11-30 2022-04-29 주식회사 에이아이더뉴트리진 클라미디아 진단용 조성물 및 다중 등온증폭 프라이머 세트, 그리고 이를 이용한 신속성, 정확성 및 휴대성이 향상된 키트와 진단키트를 통한 육안진단방법

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