JP2019507606A - 性的感染症の病原体の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特に被験者における性的感染症の病原体、とりわけクラミジア・トラコマティス、淋菌、尿ベースの大腸菌等の細菌病原体を検出するための方法に関する。当該検出にはサンプルの精製を要さない。当該方法は、尿サンプルから性的感染症の細菌を検出する方法として最適化される。
クラミジア・トラコマティスは、男と女のいずれにも感染可能な、最も一般的な性的感染症である。クラミジア・トラコマティス患者の半数以上が症状をまったくあるいはほとんど自覚しないため、患者はこの感染症の感染源として機能し続ける。クラミジア・トラコマティス用の迅速な高感度検査が存在しないため、効率的にクラミジアの感染を診断することは困難である。
偏性細胞内病原体であるため、クラミジア・トラコマティスを実験室で培養することは困難である。クラミジア・トラコマティスの治療は、感染場所だけでなく、患者の年齢や症例の複雑さにも依存する。従って、さらなる長期の合併症の発生を防ぎ、淋菌やヒト免疫不全ウィルス等の他の感染症に感染する可能性を減らすためには、感染の早期の段階でクラミジア・トラコマティスを同定し、なるべく早く迅速な治療を開始することが非常に重要である。
従来の性的感染によるクラミジアの診断方法においては、以下のようなサンプル収集が行われる。即ち、男性からは、定期的に収集された尿道の標本または尿検体、女性からは頸管内の標本または膣の標本が収集される。スクリーニングを成功させ、クラミジアのさらなる感染や合併症の発生を防ぐことができるかどうかは、どれだけ感染の診断を精度よくかつ迅速に低コストで行うことができるかにかかっている。現代の実験室では、いまだに細胞培養や抗原ベースの検出などの従来の検査方法が用いられている。細胞培養法は、特異性が高いものの、感度が非常に低く、高コストで、遅く(結果が3日後でなければ得られない)、特殊なサンプル収集・収容・移送を要する。酵素免疫測定法アッセイや直接蛍光抗体法(DFA)アッセイなどのような免疫アッセイは、細胞培養法と同様、感度および特異性が低い。したがって、診断分野におけるこれらの検査方法の使用が限定されている。
上記従来の実験室方法に代わるものとして、抗原に特有のDNA配列またはRNA配列の検出を可能にする複数の核酸増幅検査(NAAT)が開発された。これらの検査は、ターゲットの核酸の複製を一つ検出するだけのものであり、クラミジアの性器感染のスクリーニングおよび診断において、はるかに高い感度を有する。
クラミジア・トラコマティス検出検査には、数種類の核酸増幅ベースの検査を用いることができる: Abbott RealTime CT/NGは、リガーゼ連鎖反応(LCR)法を用いる;Aptima COMBOは転写増幅(TMA)法を用いる;BD ProbeTec ETは鎖置換増幅(SDA)法を用いる;Xpert CT/NG検査およびCobas CT/NG検査はリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を用いる。
これらの方法にはいくつかの欠点がある。例えば、当該分野の専門知識のない個人がこれらの方法を用いることはできず、また、例えばPCR機器やサンプルを準備することなしに用いることはできない。
従って、わずかのサンプルを準備するだけでよいかまたは全くサンプルを要さず、簡単な検査設定をするだけで技術分野の専門知識をほとんどまたは全く要しないような性的感染症用の検査が必要とされている。例えばそれは市販の個人実施用検査キットである。
WO98/11259は、クラミジア・トラコマティス、淋菌、マイコプラズマ・ジェニタリウム、ウレアプラズマ・ウレアリチクムを含む複数の性的感染症の病原体を検出するために核酸増幅技術(NAAT)を用い、泌尿生殖器体液のサンプルを検査することを開示している。
WO2011/09588は、迅速検査によりサンプルからターゲット分子を検出するための方法および装置に関する。
WO2014/060604は、粗生体試料溶解物から直接迅速なサンプル前処理および増幅を行う方法に関する。
WO2011/038197は、細胞に溶菌酵素を施すことによりクラミジアなどを等温増幅することによりターゲットの核酸種を検出するための方法に関する。この開示によると、当該酵素が触媒反応を介して細菌細胞壁を破壊する。WO2011/038197は、当業者に、前記溶解用の代替手段を何も提供していない。
本発明は、サンプルを精製することなく被験者における性的感染症の病原体を検出するための方法であって、
前記被験者からの尿サンプルを準備するステップと、
前記尿サンプルに抗菌ペプチドを付加するステップと、
放出された核酸を前記性的感染症の病原体の核酸をターゲットとするプライマーを用いるループ介在等温増幅(LAMP)によって増幅させるステップと、
前記性的感染症病原体有機体に由来する前記核酸からシグナルを検出するステップと、
前記シグナルが所定の値を超えている場合には、前記被験者が性的感染症病原体に感染していることを示すステップと、
を有する方法に関する。
本発明の一つの実施形態においては、前記尿サンプルが50%超希釈される。
本発明の他の実施形態においては、合計アッセイ時間は60分未満である。
本発明のさらなる実施形態においては、前記抗菌ペプチドベースの核酸の放出は、熱処理と組み合わせられる。
本発明のさらに他の実施形態においては、前記LAMP反応はラテラルフロー・ストリップで分析または表示される。
本発明のさらなる実施形態においては、前記性的感染症の病原体の前記プライマーは、クラミジア・トラコマティスに特異的な核酸を検出するように設計される。
本発明のさらに他の実施形態においては、前記抗菌ペプチドはセクロピンである。
本発明のさらなる実施形態においては、前記感度は70%超である。
本発明の他の実施形態は、以下に関する。即ち、被験者における性的感染症の病原体の存在を判定するための方法であって、a)前記被験者から得られた尿サンプル内の細胞から核酸を放出するために前記尿サンプルに抗菌ペプチドを接触させることと、b)前記病原体の細胞から放出された非精製核酸を公知の性的感染症病原体の核酸からのプライマーを含むLAMP(ループ介在等温増幅)によって増幅させることと、c)前記放出された核酸の増幅を検出することにより、前記尿サンプルにおける前記性的感染症病原体の存在を判定することとを有する方法。
性的感染症(sexually transmitted infections:STI)は、sexually transmitted diseases (STD)や梅毒(venereal diseases:VD)とも呼ばれ、通常性行為によって広まる感染症である。
ほとんどのSTIは、初期段階において症状が現れない。これにより、病気を他人に感染させるリスクがより高くなる。本発明は、簡単に迅速に確実に性的感染症の病原体を検出する検査を提供することによりSTIを他人に感染させるリスクを減少させる。
本発明の一つの実施形態において、前記性感染病原体は、クラミジア・トラコマティスである。
本発明は、感染を引き起こす前記血清学的株を検出することにより高精度の判定と診断、そしてそれに続く治療を可能にするものである。
淋病は、淋菌感染症や、淋菌性尿道炎、淋毒(gonorrhoea、the clap)としても知られ、淋菌によって引き起こされる性的感染症である。
本発明の一つの実施形態において、前記病原体は尿ベースの大腸菌である。
ここで用いられる「サンプル」は、尿サンプル(尿サンプルから抽出されたサンプルを含む)、頸管内の標本、膣の標本、尿道の標本、および直腸の標本を含む。
ここに提供されるいくつかの例は、増幅工程において特異なポリメラーゼにターゲットを増幅させるために、尿サンプルの希釈が重要となる可能性があることを示す。
ここに記載されるLAMP(ループ介在等温増幅)は、その簡便な操作性や1時間でごく少量の病原体遺伝物質を診断できる能力の故に、新規で、高い感度を有し、特異性のある診断ツールとして際立っている。
本発明のLAMP法は、高い温度(通常55〜65℃の間)を用いるため、好熱性DNAポリメラーゼが必要とされる。これらのポリメラーゼは強い鎖置換能を有していなければならない。これらのポリメラーゼはPCR法での使用には適していない。熱安定性DNAポリメラーゼの全てが尿分析に適しているわけではない。
少量の尿はBsmポリメラーゼの活性を強めさえするため、Bsmポリメラーゼは尿分析に非常に適している。
抗菌ペプチド(AMP)は、独特かつ多様な分子群であり、アミノ酸組成および構造に基づいて亜群に分けられる。現在、ネブラスカ大学医療センターの抗菌ペプチドデータベースには、合成由来および天然由来の、様々な器官から分離された2500を超えるAMPの説明が入っている。
現在好ましい実施形態において、前記抗菌ペプチドは、セクロピンである。関連性のある溶解効果を示す他のペプチドもあるものの(図4、AMP5.02はセクロピンP1を表す)、図6に示されるように、それらはLAMP反応に対する著しい抑制効果も有する。
セクロピンは、グラム陽性の細菌とグラム陰性の細菌の両方に対して活発な、典型的には約31〜37のアミノ酸残基の小さなタンパク質である。
MPKWKVFKKIEKVGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKALG
である。
SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR
である。
配列番号1
MPKWKVFKKIEKVGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKALG
セクロピア蛾
セクロピンSB37
配列番号2
SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR
豚回虫
セクロピンP1
メリチンは、ミツバチ毒の主要なペプチド成分である。それは哺乳類の細胞に対する強力な溶血性活性および細胞溶解活性を示すだけでなく、広範な抗菌特性、抗真菌特性、抗ウィルス特性、および抗原虫特性を備えている。
ボンボリチンは、ミツバチ毒に含まれる最も豊富な成分であり、その構造および生物学的特性をメリチンと共有している。ボンボリチンは、グラム陽性の細菌とグラム陰性の細菌に対して広範囲な活性を有するとともに、植物病原性真菌、赤血球、顆粒細胞およびリポソームに対しても広範囲な活性を有する。
一つの実施形態において、前記AMPはボンボリチンである。
マガイニンは、当初、アフリカツメガエルというカエルの皮膚から分離された。マガイニン類似体MSI−78およびMSI594は、従来の抗生物質に耐性を有する菌株を含む数多くの細菌菌株に対して活発な、非常に強力なAMPである。
(処理済み)尿の中に、以下に示す範囲で開発溶解混合物(カクテル)が含まれたものを用いる:
0.5〜5μMのAMP(セクロピンP1など)
5〜50mMのEDTA
0.1〜10%の非イオン性界面活性剤
本発明の方法は、核酸精製を必要としない。ここに開示される方法が、増幅に先立つ精製や臨床サンプルからのDNAの抽出を必要としないという事実により、専用装置は不要になる。これにより、全体の手順は、著しく労力が省かれ、時間が節約され、その結果早期の検出および同定を低コストで行うことが可能になる。
本発明の方法に用いられるプライマーは、検査対象の細菌に特異的な種となるように設計される。プライマーは、例えば、どのような結果が望まれるかに応じて、細菌の種または属に特異的なものとすることができる。
配列番号5
AATATCATCTTTGCGGTTGC
クラミジア・トラコマティス
CT・LAMPプライマーF3
配列番号6
TCTACAAGAGTACATCGGTCA
クラミジア・トラコマティス
CT・LAMPプライマーB3
配列番号7
TCGAGCAACCGCTGTGACGACCTTCATTATGTCGGAGTC
クラミジア・トラコマティス
CT・LAMPプライマーFIP
配列番号8
GCAGCTTGTAGTCCTGCTTGAGTCTTCGTAACTCGCTCC
クラミジア・トラコマティス
CT・LAMPプライマーBIP
配列番号9
TACAAACGCCTAGGGTGC
クラミジア・トラコマティス
CT・LAMPプライマーLF
配列番号10
CGGGCGATTTGCCTTAAC
クラミジア・トラコマティス
CT・LAMPプライマーLB
配列番号11
GCTCTGACTCCATTATCCTATG
淋菌
NG・LAMPプライマー2086 LD39 F3
配列番号12
GCATTCAGACGTGCTTCTA
淋菌
NG・LAMPプライマー2086 LD39 B3
配列番号13
TTGCCGCCTAAGGTTCCGAGCTATGGCATTAGGATTGTC
淋菌
NG・LAMPプライマー2086 LD39 FIP
配列番号14
TGGAACGAGCCAAGGTGTTCTCTTGCATCAACTGTTCCAT
淋菌
NG・LAMPプライマー2086 LD39 BIP
配列番号15
GCGGTCATTGACGAAATGG
淋菌
NG・LAMPプライマー2086 LD39 LF
配列番号16
GGCTACAAGTGATAAGGTGCT
淋菌
NG・LAMPプライマー2086 LD39 LB
配列番号17
AATCAAGAATACCGCCTCAC
淋菌
NG・LAMPプライマー1430 LD31 F3
配列番号18
AGTTCTACGAACACTTGCTG
淋菌
NG・LAMPプライマー1430 LD31 B3
配列番号19
TTGGAGATGTGGCGTTCGGACGACATCAACAACGACC
淋菌
NG・LAMPプライマー1430 LD31 FIP
配列番号20
CGGAAGCAGGCGTCATCAGTTGTTTGGTCGCAAGGA
淋菌
NG・LAMPプライマー1430 LD31 BIP
配列番号21
TGTCCAATGCGTCGTTGA
淋菌
NG・LAMPプライマー1430 LD31 LF
配列番号22
CGCCATGCCGACAATTAC
淋菌
NG・LAMPプライマー1430 LD31 LB
配列番号23
GACGTCAAGTCCTCATGG
淋菌
NG・LAMPプライマー16S id07 F3
配列番号24
CGGTTACCCTACCTACTTCT
淋菌
NG・LAMPプライマー16S id07 B3
配列番号25
TTGTGAGATTGGCTCCGCTCTCACACGTCATACAATGGTC
淋菌
NG・LAMPプライマー16S id07 FIP
配列番号26
TCGAGTGCATGAAGTCGGAATCGAACGTATTCACCGCAGT
淋菌
NG・LAMPプライマー16S id07 BIP
配列番号27
GCTTGGCTACCCTCTGTAC
淋菌
NG・LAMPプライマー16S id07 LF
配列番号28
CTAGTAATCGCAGGTCAGCAT
淋菌
NG・LAMPプライマー16S id07 LB
特異的ターゲット領域に加え、増幅用の適切なプライマーを設計するためには、いくつかの重要な要素がある。各領域のTmは、F1cおよびB1cに対しては65℃(64〜66℃)となるように、F2、B2,F3、B3に対しては60℃(59〜61℃)となるように、ループ・プライマーに対しては65℃(64〜66℃)となるように設計される。
クラミジア・トラコマティス・プラスミドのCDS2領域
淋菌のゲノム領域16S rRNAおよび仮定上のタンパク質領域2086、1430
・ラテラルフロー・ストリップ
ラテラルフロー・ストリップは、高価な専用機器を必要とせず、サンプル(マトリックス)におけるターゲットとなる検体の存在(または不在)を検出するための簡単な装置である。
本発明の一つの実施形態において、合計アッセイ時間は60分未満である。アッセイ応答時間は、アッセイを強化するものと抑制するものとの間の平衡の保ち具合により決定される。とりわけ、全ての成分の最適な濃度の平衡を保つことが重要である。プロセスは本来ダイナミックな原理に従う。濃度が低過ぎると効果が出ず、濃度が高過ぎると全体のプロセスが抑圧・抑制され、アッセイが失敗に終わる。従って、本発明では、アッセイ応答時間が60分を超えないように、それぞれの成分の平衡が保たれる。これは申請者による市場分析から得られたユーザーが指定するベンチマークである。かかるポイント・オブ・ケア装置のユーザーは60分未満の応答時間を期待しているということが報告されている。ただし、もちろん、より長いアッセイ時間も可能である。
サンプル前処理時間(ペプチド使用)―――通常1〜15分、または少なくとも効率的な溶解および核酸の分離を行うのに十分な時間。
増幅時間―――通常21〜40分;これより少ない時間では、低いテンプレート濃度で増幅は検出されないであろう;これより多い時間では、非特異的増幅シグナル(偽陽性)が得られる可能性がある。
検出時間―――通常2〜5分、ラテラルフロー・ストリップによって決まる(LFシグナルの読み出しが早すぎた場合には偽陰性で、LFシグナルの読み出しが遅すぎた場合には偽陽性)。
本発明の方法で検出されるシグナルは、特異的病原体への感染を示すための所定の値に対応付けられる。
定量的シグナルは、サンプル内に存在する細菌の量やレベル、数を示す。定量的ポリメラーゼ連鎖反応と同様、例えば蛍光染料を付加することにより、定量的LAMP(qLAMP)法における反応生成物の形成を、リアルタイムで定量的に監視することができる。
絶対シグナルは、選択された核酸の存在を検出する「onまたはoff」シグナルである。従って、絶対シグナルの検出は病原体の存在を示す。
通常これらの種類のシグナルは、上記の通り、所定の値またはROC曲線のような標準値に対応付けられる。
本発明の一つの実施形態において、前記感度は、70%よりも高い。
診断検査の精度は、受信者動作特性(ROC)によって最もよく示される(特にZweig, M. H., and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577を参照のこと)。ROCグラフは、観察された全範囲のデータに対して判定閾値を連続的に変化させることで得られる感度/特異性の組の全てのプロットである。
本発明の臨床的利便性は、特定の感染症に対する他の診断ツールとの比較および組み合わせによって評価することができる。
人が性的感染症の病原体に遭遇したか否かを検出する方法であって、
a)前記ヒトの尿サンプルにおけるLAMP法増幅産物のレベルを判定することと、
b)健康人集団から得られた前記LAMP法増幅産物のレベルのパーセンタイル・プロットを構築することと、
c)前記健康人集団において判定されたLAMP法増幅産物のレベルと、問題となっている前記性的感染症の病原体と診断された集団において判定された前記LAMP法増幅産物のレベルとに基づきROC(受信者動作特性)曲線を構築することと、
d)所望の特異性を選択することと、
e)前記ROC曲線から、前記所望の特異性に対応する前記感度を判定することと、
f)前記パーセンタイル・プロットから、前記判定された感度に対応する前記LAMP法増幅産物のレベルを判定することと、
g)前記サンプルにおける前記LAMP法増幅産物のレベルが前記判定された特異性に対応する前記LAMP法増幅産物のレベルと等しいかまたはそれより高いとき、前記個人が性的感染症の病原体を保有していると予測し、前記サンプルにおける前記LAMP法増幅産物のレベルが前記判定された特異性に対応する前記LAMP法増幅産物のレベルより低いとき、前記個人が性的感染症の病原体を保有している可能性が低いかまたは保有していないと予測する方法。
カットオフ点は、罹患の危険性、職業、地理上の住居または露出等の被験者の特異的条件に基づいて変動し得る。ただし、これらに限定されるものではない。
一般的に当業者には理解可能と思われることであるが、本発明の方法は比較による意思決定の過程である。どのような意思決定の過程であれ、関心のある疾患や状態を有する被験者および/または関心のある疾患や感染、状態を有さない被験者に基づく基準値が必要である。
他の病原体DNAとの交差反応は、POC診断にとって巨大な閾値である。少なくとも30の病原体のDNAが尿サンプル内に潜在的に存在する可能性がある。アッセイの高い特異性を確保するためには、ある病原体の検出に特異性を有するプライマーは、他の種のDNAを検出するものであってはならない。本発明のプライマーについては、交差反応のない十分な感度および特異性のための検査が行われる。それによりPOC検査における使用が狭められる。
本発明のさらなる実施形態において、抗菌ペプチドベースの核酸の放出は、熱処理と組み合わせられる。
本発明の他の実施形態において、前記抗菌ペプチドベースの核酸の放出は、界面活性剤と組み合わせられる。界面活性剤(例えば、トリトンX−100、トリトンX−114、NP−40、CHAPS、CTAB、Tween20、Tween80、オクチルベータチオグルコシド、オクチルベータグルコシド等)の使用は、宿主細胞の破壊を助ける細胞内の寄生虫を溶解させるのに非常に有益である。
本発明の方法を用いた病原体検出用のキットは、非常に関連性がある。
a)以下の範囲の溶解混合物と、
0.5〜5μMのAMP(セクロピンP1)
5〜50mMのEDTA
0.1〜10%の非イオン界面活性剤
b)配列番号5〜28を含む群または配列番号5〜28の任意の組み合わせから選択されたヌクレオチド配列をコードする複数のヌクレオチド配列、またはその一部、または前記配列番号5〜28と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド、および/またはLoop-mediated isothermal amplification:ループ介在等温増幅(LAMP)を介在可能なポリメラーゼを含む混合物と、
c)ラテラルフロー・ストリップを含む装置とを備える。
ここでは、「患者」と「被験者」は、人を表す用語として交換可能に用いられる。
クラミジア・トラコマティス検出用の感度試験がなければ、未処理の患者のサンプルから直接効率よくクラミジア感染の有無を診断することは難しい。
ループ介在等温増幅(LAMP)は、その簡便な操作性や1時間でごく少量の病原体遺伝物質を診断できる能力の故に、新規で、高い感度を有し、特異性のある診断ツールとして際立っている。LAMP法は、広く用いられているPCR法に対していくつかの利点を有する。LAMP法は、定温(55〜65℃)で実行され、サーマルサイクラーを要さない。LAMP法は、4〜6種類のプライマー(innerプライマー2種類、outerプライマー2種類および/または追加のループ・プライマー2種類)と、ターゲットとなる遺伝子配列上の6つの明瞭な領域を識別するために鎖置換能を有するポリメラーゼとを用いる。これにより、一本鎖ループ領域を含む増幅産物が生成され、温度変性を伴わないプライマーの結合が可能となる。ループ・プライマーを追加することにより、増幅は著しく加速され、それにより感度は高まり、反応時間は短縮される。LAMP反応の終了時点におけるDNA生産物の量は、PCR法におけるそれよりはるかに多く、また、サイバーグリーン、臭化エチジウム、ピコグリーン、ヨウ化プロピジウム、ヒドロキシナフトールブルーなどのDNA結合色素またはカルセインを用いることにより簡単に視覚化することができる。
・プライマーの設計と選択
クラミジア・トラコマティスに特化したLAMPアッセイ・プライマー・セットは全て、コーディング配列2(CDS2)内におけるクラミジア・トラコマティス潜在プラスミドの高度に保存された領域をターゲットとするように設計された。LAMP法プライマーは、ソフトウェアLAMP Designer 1.10 (PREMIER Biosoft USA)を用いて設計され、DNAターゲットに対する高い感度と、ラテラルフロー・ストリップの非特異的バックグラウンドの不在とがスクリーニングされた。最良のプライマー・セットの配列が補足表1に示されている。ラテラルフロー・ストリップ上で産物の検出が可能となるように、プライマーFIPおよびLFはビオチンで5’ラベリングされ、プライマーBIPおよびLBはFAMでラベリングされた。プライマーはMicrosynth AG (スイス、Balgach)から得られた。
市販のクラミジア・トラコマティス菌株UW-36/Cx ゲノムDNA (ATCCRVR-886D?)は、ATCC(アメリカ培養細胞系統保存機関)から得られた。また、CDS2ターゲット・コピー番号は、qPCR(アプライドバイオシステムズ)によって、pGL3−CDS2プラスミドおよび以下のプライマーを用いて決定された。
Fw5’−CTCCTTGGAGCATTGTCTGG−3’
Rw5’−CGGATGCGATGAACAGTTTG−3’
クラミジア・トラコマティスに特異的なLAMP反応は、栄研化学株式会社から提供されたLAMP反応総量50μlのプロトコルに従って実施された。BstポリメラーゼはBsmポリメラーゼおよび1.2μlのgDNA(ATCC)/または5μlの前処理後の尿サンプルに替えられた。全てのLAMP反応は、製造者のプロトコルに従って指定された期間63℃で実施され、ラテラルフロー・ストリップ(AMODIA Bioservice GmbH)上で分析された。反応生成物は、生成物の特異性を確認するためにPmlI restrictase (Thermo Fisher Scientific Inc. USA)で切断された。
5人の男性と5人の女性からの、全てクラミジア・トラコマティス陰性の尿サンプルは、等量に混合された。蓄尿とも呼ばれるこれらのサンプルは、抑制およびアッセイ感度分析用のクラミジア・トラコマティスに特化したLAMPアッセイに用いられた。
臨床患者の尿サンプル(30μl)は、溶解ペプチド(最終容量から12%)を含んでいる、または90℃で5分間予熱し、氷上で冷まされた1 x 溶解混合物(SelfD Technologie GmbH、ライプツィヒ、ドイツ)と一緒に5分間培養された。しかる後5μlの各前処理された尿サンプルは、クラミジア・トラコマティスに特化したLAMP法増幅に適用された。
クラミジア・トラコマティスに特化したLAMPアッセイの検出限界に関する統計分析がXLSTATを用いて実施され、95%信頼区間(CI)がロジスティック回帰モデルを用いて計算された。アッセイの感度および特異性が、MedCalc95%信頼区間からのオンライン・ツールを用いて計算された。
朝一番に排出された尿のサンプルが、Sexual Health Clinique(Tartu、エストニア)に通う18才から25才の間の650人(女性316人、男性334人)から2013年10月から2014年12月の間に収集された。尿サンプルは、各自で清潔なポリプロピレン製容器の中に収集され(平均サンプル量は25〜35ml)、防腐剤は用いず、その日の内に患者によってSexual Health Cliniqueに持ち込まれた。当該研究に患者を組み入れる基準は、性的パートナーを最近替えた、複数の性的パートナー、避妊手段をとっていない性交、パートナーの性的感染または性的感染症の症状(多量の/異常な膣分泌物、尿道分泌物、腹痛、痛みを伴う尿排泄、排尿障害、生殖器部におけるかゆみや発赤等)、妊娠、または予防薬である。
・クラミジア・トラコマティスに特化したLAMPアッセイの開発
LAMPアッセイにはDNA精製工程は含まれていないため、開発された増幅方法は、反応混合物におけるより多量の尿に耐えなければならない。それにより、より多くのターゲットが反応に加えられるため、理論上は全体のアッセイ感度が高められる。従ってLAMP法の尿耐性が、蓄尿サンプルを用いて検査された。我々の実験設定では、LAMP反応混合物は、最高で20%の尿およびテンプレートDNAを100コピー含んでいた。その結果は、15%の尿を含む反応は、ラテラルフロー(LF)・ストリップで分析したときにシグナルを発しなかった。それは21分の増幅時間はターゲットを増幅するのに十分ではなかったということを示している。15〜20%の尿が存在するとき、増幅時間は30分に延長しなければならない(図1B)。従ってこのデータに基づき、これ以降の全ての実験では、10%の尿がLAMPアッセイにおけるサンプル材料として用いられた。必要最小限の増幅時間を決めるために、100テンプレート・コピーが用いられ、反応は15分、18分、21分、24分、または27分後に終了された。その結果、LFストリップ上で産物が形成されるのに必要な最小限の増幅時間は21分であることが分かった(補足表2)。これにより、反応感度を損なうことなしに、アッセイ増幅処理の時間を推奨された1時間から21分に減らすことができた。
次に、一番小さいクラミジア・トラコマティス・プラスミドコピー番号が、開発されたクラミジア・トラコマティスに特化したLAMPアッセイによって決定された。この目的のために、LAMP増幅効率が、水または10%蓄尿における異なる種類のクラミジア・トラコマティス・ゲノムDNA濃度について検査された。プロビット解析の結果、アッセイは水中における1反応につき25のプラスミドコピー(値0.95)を検出することができるほどの感度を有していることが分かった(図2)。開発アッセイは余分なDNA精製過程を含んでいないため、10%の粗尿が感度に影響し得るか否かを評価することが重要であった。そのため、蓄尿サンプルに、異なる種類の量のクラミジア・トラコマティス・ゲノムDNAが混入された。その結果、10%尿の存在下で、LAMPアッセイの感度は約3倍減少し、確立されたLODは1反応につき70ターゲット・コピー(値0.95)であった(表1)。これらの結果は、尿阻害実験と深い相互関係にある。尿阻害実験では、10%尿が追加されると、LAMP増幅時間(図1)が延び、増幅活動が約3倍減少した(表1)。
症状のある患者および無症状の患者におけるクラミジア・トラコマティスの有病率を判定するために、臨床研究にかけられた尿サンプル(N=650)が追加で評価された。収集されたデータを分析するために、患者と医師から受け取った重要な情報が記述統計学を用いて提供された。症状のある群に含まれる患者は、医師の診断/制御を医師に求め、以下の症状を訴えた:異常な性器分泌物、排尿障害、腹痛、月経と月経の間の出血、生殖器部におけるかゆみや発赤。症状のない患者は無症状の群に含まれた。650人の患者の内157人(24%)に性的感染症(STI)の症状が見られ、493人の患者(76%)は無症状であった。患者の51%が男性で、49%が女性、平均年齢は22才(18〜25才)であった。39人の男性患者と47人の女性患者がクラミジア・トラコマティスと診断され、そのうち男性12人(31%)と女性13人(28%)に症状が見られた。全ての収集され、分析された尿サンプルにおいて、淋菌の有病率は3%であった。淋菌/クラミジア・トラコマティスの重感染は極めて頻度が高いように思われ、全てのクラミジア・トラコマティス陽性サンプルの6〜8%であった。
臨床データにより、クラミジア・トラコマティスは主に無症状であり、そのことがヒト集団における実際の蔓延を診断し評価することを困難にしているということが確認された(表2および補足表4)。
クラミジア・トラコマティス等の性的感染症(STI)は、世界規模の公衆衛生問題において重要な位置を占めてきた問題である。クラミジア・トラコマティス感染において無症状である場合の比率は高く(我々の臨床研究では76%)、それにより診断の遅れやさらなる深刻な複合問題が引き起こされる。クラミジア感染は有病率が高いものの、この性的感染症に関する知識は、公衆衛生のセッティングにおいて、病原体検出感度の低さ、速度の遅さ、時間がかかり、高価で特別な訓練を要することなどの診断方法の様々な制約により、非常に制限されていた。従って、この病原体の検出の成功と迅速な識別が、病気の早期の診断と処置にとって必要となっている。
生物学的サンプルは、必要であれば、ペプチド処理の前に濃縮または希釈することができる。サンプル前処理法に刺激を与えるために、必要であれば、洗剤、溶菌酵素、アルカリ等の付加的成分を用いることができる。
尿サンプルや、膣や、直腸、頸部、尿道の標本を含む生物学的サンプルが収集される。尿を用いる場合には、十分な数の病原体核酸が確実に存在しているように、朝一番に排出される尿が用いられる。必要な場合、ペプチド前処理に先立って、生物学的サンプルは濃縮または希釈される。サンプルは50μMの抗菌ペプチドを用いて室温℃で5分間処理される。ナイセリア種については、デルマセプチン、LL−37、PG−1等の抗菌ペプチドを、これに限定されるものではないが用いることができる。抗菌ペプチドの濃度は変動する可能性があり、ペプチドの溶解効果を刺激するために洗剤(や他の成分)を付加することができる。前処理時間は、ペプチド濃度や生物学的サンプルのタイプに応じて増減し得る。
上記の方法では、増幅に先立ち溶解物準備成分を取り除く必要がない。従って、選択された膜活性ペプチドの効果は、ダウンストリーム増幅で評価されなければならない。
サンプルの中には、アッセイ、特に増幅反応、の故障を引き起こし、偽陰性の診断結果を出すことでアッセイの感度に影響を与える抑制成分を含んだものがあってもよい。本発明は、サンプル前処理と、抗抑制行動も伴う溶解成分カクテルとをバランスよく含んでいる。(処理済みの)尿の中に
0.1μMのAMP(セクロピンP1)
10mMのEDTA
0.4%のTX100(界面活性剤)
が含まれた、この開発された溶解混合物(カクテル)を用いることにより、未処理の尿サンプルに比較して、抑制効果が著しく抑圧された、ここで前記サンプルには、特に13%のサンプルにはCT(クラミジア・トラコマティス)DNAが入れられた。従って、前処理過程においては、ホストと病原体細胞の溶解が重要であるだけではなく、サンプル・マトリックスによって引き起こされる抑制効果と、異なる患者間における高い変動性とを抑圧することも重要である。
本発明家らは、実施例1に記載されたクラミジア・トラコマティス用の方法と同じ方法を用いて淋菌用のプライマー・セットをいくつか開発した。現在好ましいものを以下に列挙する。設定されたLOD(limit of detection:検出限界)は、230コピー/rxn(1反応当たり)である。また、他のナイセリア株に対する交差反応(偽陽性の可能性を評価するために重要である)が評価された。その結果を以下に示す。
交差反応(ナイセリア株に焦点をおいて)
Claims (15)
- サンプルを精製することなく被験者における性的感染症の病原体を検出するための方法であって、
a)前記被験者からの尿サンプルを準備するステップと、
b)前記尿サンプルに抗菌ペプチドを付加するステップと、
c)放出された核酸を前記性的感染症の病原体の核酸をターゲットとするプライマーを用いるループ介在等温増幅(LAMP)によって増幅させるステップと、
d)前記性的感染症病原体有機体に由来する前記核酸からシグナルを検出するステップと、
e)前記シグナルが所定の値を超えている場合には、前記被験者が性的感染症病原体に感染していることを示すステップと、
を有する方法。 - 前記尿サンプルが緩衝液で50%超希釈される、
請求項1に記載の方法。 - 合計アッセイ時間は60分未満である、
請求項1から2のいずれかに記載の方法。 - 抗菌ペプチドベースの核酸の放出は、熱処理と組み合わせられる、
請求項1から3のいずれかに記載の方法。 - 抗菌ペプチドベースの核酸の放出は、表面活性剤と組み合わせられる、
請求項1から4のいずれかに記載の方法。 - LAMP反応はラテラルフロー・ストリップで分析される、
請求項1から5のいずれかに記載の方法。 - 前記性的感染症の病原体の前記プライマーは、クラミジア・トラコマティスに特異的な核酸を検出するように設計される、
請求項1から6のいずれかに記載の方法。 - 前記抗菌ペプチドはセクロピンである、
請求項1から7のいずれかに記載の方法。 - 前記感度は60%超である、
請求項1から8のいずれかに記載の方法。 - 前記ループ介在等温増幅(LAMP)はBsmポリメラーゼを含む、
請求項1から9のいずれかに記載の方法。 - サンプル精製を行うことなく被験者におけるクラミジア・トラコマティスおよび/または淋菌を検出するためのポイント・オブ・ケア法であって、
a)前記被験者からの50%超希釈された尿サンプルを準備するステップと、
b)セクロピン・ペプチドを前記尿サンプルに加えるステップと、
c)放出された核酸を、Bsmポリメラーゼを用いるクラミジア・トラコマティスおよび/または淋菌の核酸をターゲットとしたプライマーを用いるループ介在等温増幅(LAMP)によって増幅させるステップと、
d)ラテラルフロー・ストリップによってクラミジア・トラコマティスおよび/または淋菌に由来する核酸からシグナルを検出するステップと、
e)前記シグナルが所定の値を超えている場合には、前記被験者がクラミジア・トラコマティスおよび/または淋菌に感染していることを示すステップとを有し、
前記ポイント・オブ・ケア法は、標準設定のCobasR4800 CT/NG検査(Roche)と比較して60%超の検出感度を有する方法。 - サンプル精製を行うことなく被験者におけるクラミジア・トラコマティスおよび/または淋菌を検出するためのポイント・オブ・ケア法であって、
a)尿サンプルを準備するステップと、
b)セクロピン・ペプチドを前記尿サンプルに加え、15分未満の間、前記ペプチドに前記細胞を溶解させるステップと、
c)ステップb)で得られた前記尿サンプルを50%超希釈するステップと、
c)放出された核酸をBsmポリメラーゼを用いるクラミジア・トラコマティスおよび/または淋菌の核酸をターゲットとしたプライマーを用いるループ介在等温増幅(LAMP)によって増幅させるステップと、
d)ラテラルフロー・ストリップによってクラミジア・トラコマティスおよび/または淋菌に由来する核酸からシグナルを検出するステップと、
e)前記シグナルが所定の値を超えている場合には、前記被験者がクラミジア・トラコマティスおよび/または淋菌に感染していることを示すステップとを有し、
前記ポイント・オブ・ケア法は、標準設定のCobasR4800 CT/NG検査(Roche)と比較して60%超の検出感度を有する方法。 - 前記抗菌ペプチドベースの核酸の放出は、界面活性剤と組み合わせられる、
請求項1から12のいずれかに記載の方法。 - 前記プライマーは、配列番号5〜28からなる群から選択される、
請求項1から13のいずれかに記載の方法。 - 以下に限定されるものではないがクラミジア・トラコマティスおよび/または淋菌等の性的感染症の同時検出および定量化のための部品キットであって、
a)以下の範囲の溶解混合物と、
0.5〜5μMのAMP(セクロピンP1)
5〜50mMのEDTA
0.1〜10%の非イオン界面活性剤
b)配列番号5〜28を含む群または配列番号5〜28の任意の組み合わせから選択されたヌクレオチド配列をコードする複数のヌクレオチド配列、またはその一部、または前記配列番号5〜28と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド、および/またはループ介在等温増幅(LAMP)を介在可能なポリメラーゼを含む混合物と、
c)ラテラルフロー・ストリップを含む装置と、
を備えた部品キット。
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