CN112458195B - 基于高通量测序检测性传播病原体的多重pcr引物组、试剂盒及其方法 - Google Patents

基于高通量测序检测性传播病原体的多重pcr引物组、试剂盒及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学检测技术领域，公开了基于高通量测序检测性传播病原体的多重PCR引物组、试剂盒及其方法。所述多重PCR引物组包括编号为F001‑F014的上游引物和编号为R001‑R014的下游引物；每条所述引物从5’端到3’端依次包括桥接序列和靶向不同性传播病原体的特异序列；所述编号为F001‑F014的上游引物中靶向不同性传播病原体的特异序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14所示；所述编号为R001‑R014的下游引物中靶向不同性传播病原体的特异序列如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.28所示。采用所述多重PCR引物组，能够同时检测多种性传播病原体，灵敏度高，准确性好。

Description

基于高通量测序检测性传播病原体的多重PCR引物组、试剂盒 及其方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，尤其涉及基于高通量测序检测性传播病原体的多重PCR引物组、试剂盒及其方法。
背景技术
世界卫生组织(WHO)最新的研究显示，全球每日有超过100万宗可治愈的性传播感染新病例，相当于每年有3亿7000多万宗新病例，全球平均约25人中便有一人患上至少一种性病，部分人甚至可能同时患上多种性病。国际上将20多种通过性行为或类似性行为引起的感染性疾病列入性病范畴，包括淋病、梅毒、非淋菌性尿道炎、尖锐湿疣、沙眼依原体、软下疳、生殖器疱疹、滴虫病、乙型肝炎和艾滋病等。在我国，已有8种性病纳入重点防治范围：包括梅毒、淋病、生殖器疱疹、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎、性病性淋巴肉芽肿和艾滋病。
这些性病主要透过各种不安全性接触传播，感染后一般会损害生殖器官及尿道。不过，世界卫生组织指大部分感染病例都没有症状，如果病情持续而不接受治疗，会带来严重心血管及神经疾病，也可能导致女性盆腔炎及不育。由于部分性病，如衣原体感染、淋病和梅毒，也可在怀孕和分娩期间传播，如果孕妇感染的话，有机会导致难产，婴儿失明或畸胎等问题。
传统对于这些微生物的检测都是基于病原体培养或者镜检，或者通过抗原/抗体检测等方法学。这些方法学的缺陷比较明显，基于培养的方法学检测的周期比较长，而抗原/抗体检测的方法学在检测灵敏度和准确性不够高。基于核酸检测的方法学逐渐成为主流技术，主要的方法学包括荧光PCR法，核酸扩增-杂交法，基因芯片杂交法等，每一种方法各有优劣之处。
其中荧光PCR法操作简便，结果判读都比较简单，检测灵敏度高。但是仪器的荧光通道有限，造成每一管中能够同时检测的目标有限，需要同时检测多个靶标的话，则需要分多管操作。而核酸扩增-杂交法检测灵敏度、准确性较低，而且杂交后的实验终点不靠控制，结果判读上人为主观因素的影响较大。而基因芯片杂交法检测的型别较多，但是无法检测未知的检测型别，一次性检测样本的数量有限；另外一张芯片通常只能处理一个样本，在成本上相对高一些。
目前国内基于这些方法开发的试剂盒，大部分都是检测单一病原微生物的，仅有少数是能够同时检测多种微生物的，仅有少数几家厂家有多种微生物联检的试剂盒产品得以上市，其中检测范围最大的是一款同时检测沙眼衣原体，解脲脲原体，淋球菌，人型衣原体，生殖支原体，单纯疱疹病毒2等6种病原体的试剂盒，但这款试剂盒是基于PCR-杂交方法的，在结果判读上标准不够清晰，容易受到人为因素的影响。
近年也有文献报道 利用高通量测序方法对生殖道微生物群落进行全景分析的研究，但是这些研究更倾向于利用通用序列(细菌的16S rRNA或者真菌的18s rRNA序列)，首先研究每个样本会产生大量的数据，需要专业的数据分析人员进行分析；二来结果呈现的方式不够清晰，不能以简单的方式呈现检测结果；三是这种基于宏基因组研究的方式操作流程复杂，需要经过专业训练的操作人员才能完成操作。
根据以上问题，本发明致力于研究一种基于高通量测序，具有简便、准确性好优势的性传播病原体检测方法。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出基于高通量测序检测性传播病原体的多重PCR引物组、试剂盒及其方法。本发明通过一步法多重PCR 完成对多种微生物基因组的特异性序列进行靶向富集，再通过二代测序进行序列测定，能够同时检测多种性传播病原体，灵敏度高，准确性好。
本发明所采取的技术方案是：
本发明第一个方面，提出了基于高通量测序检测性传播病原体的多重PCR引物组，包括编号为F001-F014的上游引物和编号为R001-R014的下游引物；每条所述引物从5’端到3’端依次包括桥接序列和靶向不同性传播病原体的特异序列；
所述编号为F001-F014的上游引物中靶向不同性传播病原体的特异序列如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.14所示；
所述编号为R001-R014的下游引物中靶向不同性传播病原体的特异序列如SEQ IDNO.15～SEQ ID NO.28所示。
本发明所述多重PCR引物组可用于同时检测包括沙眼衣原体(ChlamydiaTrachomatics，CT)，解脲脲原体(Ureaplasma Urealyticum，UU)，细小脲原体(UreaplasmaParvum，UP)，淋球菌(Neisseria Gonorrhoeae，NG)，梅毒螺旋体(Treponema Pallidum，TP)，生殖支原体(Mycoplasma Genitalium，MG)，阴道毛滴虫(Trichomonas Vaginalis，TV)，单纯疱疹病毒1(Herpes Simplex Virus 1，HSV1)，单纯疱疹病毒2(Herpes SimplexVirus 2，HSV2)，单纯疱疹病毒3(Herpes Simplex Virus 3，HSV3)，人型衣原体(Mycoplasma Hominis，MH)，杜氏嗜血菌(Haemophilus Ducreyi，HD)，性病淋巴肉芽肿衣原体1(Lymphogranuloma Venereum 1，LGV1)和性病淋巴肉芽肿衣原体2(LymphogranulomaVenereum 2，LGV2)在内的14种性传播病原体，具有很强的适用性。
本发明对以上14种性传播病原体的基因组进行分析，选取了14种性传播病原体的特异性区域。针对每个特异性区域设计了一对引物。由于本发明需要同时检测多种性传播病原体，因此在引物设计时，不仅需要考虑每一对引物的扩增特异性，确保每对引物对于目标区域以外的基因组区域(包括相应微生物的基因组区域以及其他微生物的基因组区域)不存在非特异扩增，同时还需要考虑不同引物之间的扩增效率，避免出现某一对引物扩增效率特别高，消耗过多的PCR资源的问题。
优选的，每条所述上游引物中桥接序列均相同，每条所述下游引物中桥接序列均相同。
更优选的，每条所述上游引物中桥接序列均相同，具体序列如下所示：
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.29)，
每条所述下游引物中桥接序列均相同，具体序列如下所示：
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.30)。
优选的，所述多重PCR引物组中引物还可采用硫代修饰、2-氟代核糖核酸修饰、2'-O-甲基核糖核酸修饰、5-甲基脱氧胞嘧啶修饰、脱氧次黄嘌呤修饰、2-氨基嘌呤修饰、5-溴-脱氧尿嘧啶修饰、反向dT修饰、双脱氧胞苷修饰、间臂修饰、氨基修饰、巯基修饰、磷酸化修饰、生物素修饰或锁核苷酸修饰中的一种或多种方式进行修饰。
基于本发明的第二个方面，提出了一种基于高通量测序检测性传播病原体的试剂盒，包括上述多重PCR引物组，还包括接头引物；所述接头引物从5’端到3’端依次是：测试仪相关通用序列、样本标签序列、以及与多重PCR引物组中引物5’端的桥接序列相匹配的序列；
所述接头引物包括至少一条P5接头引物和至少一条P7接头引物。
本发明通过一步法多重PCR完成对多种微生物基因组的特异性序列进行靶向富集，然后通过二代测序进行序列测定，能够同时检测多种微生物类型，操作简单。结果呈现为测序序列与目标基因组进行比对的结果，在结果判读层面上客观准确。
优选的，所述P5接头引物选自编号为P5-01～P5-08的接头引物中的至少一种，其序列分别如SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.38所示。
优选的，所述P7接头引物选自编号为P7-01～P7-12的接头引物中的至少一种，其序列分别如SEQ ID NO.39～SEQ ID NO.50所示。
本发明的第三个方面，提出了一种基于高通量测序检测性传播病原体的方法，包括以下步骤：
提取样本基因组DNA，使用上述多重PCR引物组以及接头引物进行PCR扩增反应，将扩增产物纯化，即为所构建的文库，经过测序和数据分析，确定样本中性传播病原体的类型。
上述PCR扩增反应分为两个阶段，第一阶段主要是PCR引物其作用，对目标区域进行靶向富集；第二阶段主要是接头引物其作用，通过接头引物对第一阶段产物进行再次扩增，同是通过PCR将接头引物上的“测序仪相关通用序列”和“分子标签”加到目标产物上。
优选的，所述PCR扩增的体系为：
Figure BDA0002865230370000041
其中PCR Mix可为采购自赛默飞的Platinum Multiplex PCR Master Mix，也可为其他品牌的能够用于多重PCR的酶。
优选的，所述PCR扩增的程序为：
Figure BDA0002865230370000042
Figure BDA0002865230370000051
优选的，所述文库纯化的方法为：
(1)PCR扩增完成后，合并样本，用核酸纯化试剂盒进行纯化浓缩至30～100μL；
(2)加入30μL AMpureXP beads，混匀，室温放置5min；上磁力架，待磁珠完全吸附后，分别用200μL新鲜配制80％乙醇洗2次；室温干燥后加入50μL TE洗脱(可以用移液器吹打混匀)，室温放置2min；
(3)加入50μL AMpureXP beads，混匀，室温放置5min；上磁力架，待磁珠完全吸附后，将上清转移至一个新的EP管中；
(4)在转移的上清中加入30μL AMpureXP beads，混匀，室温放置5min；上磁力架，待磁珠完全吸附后，吸弃上清；分别用200μL新鲜配制80％乙醇洗2次；室温干燥后加入50μLTE洗脱(可以用移液器吹打混匀)，室温放置2min；
(5)上磁力架，待磁珠完全吸附后，将上清转移至一个新的EP管中，所得上清即为所需要文库。
所述文库纯化所用磁珠可为AMpure XP磁珠，也可用其他品牌用于核酸纯化或者片段筛选的磁珠进行替代。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明所述基于高通量测序检测性传播病原体的方法操作简易，经过基础PCR培训的人员即可完成操作；使用本发明所述试剂盒便能一次性检测多种性传播病原体，减少因多种检测所带来的重复劳动，大大提高了检测速度，且减少了假阴性结果的发生；通过测序确定样本中性传播病原体的类型，判读标准明确，可以通过分析标准直接判读，减少人为因素的影响，判读简单，得到的结果准确性高。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
本实施例提供一种基于高通量测序检测性传播病原体的多重PCR引物组，包括编号为 F001-F014的上游引物和编号为R001-R014的下游引物；每条引物从5’端到3’端依次包括桥接序列和靶向不同性传播病原体的特异序列；
其中每条上游引物中桥接序列均相同，具体序列如下所示：
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.29)，
其中每条下游引物中桥接序列均相同，具体序列如下所示：
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.30)。
因此，编号为F001-F014的上游引物和编号为R001-R014的下游引物的具体序列见表1
表1多重PCR引物组序列
Figure BDA0002865230370000061
Figure BDA0002865230370000071
实施例2
本实施例提供一种基于高通量测序检测性传播病原体的试剂盒，包括实施例1中的多重 PCR引物组，还包括接头引物；
接头引物从5’端到3’端依次是：测试仪相关通用序列、样本标签序列、以及与多重PCR引物组中引物5’端的桥接序列相匹配的序列；接头引物包括至少一条P5接头引物和至少一条P7接头引物。
P5接头引物选自编号为P5-01～P5-08的接头引物中的至少一种，P7接头引物选自编号为 P7-01～P7-12的接头引物中的至少一种。编号为P5-01～P5-08，P7-01～P7-12的接头引物的序列如表2所示。
表2接头引物序列
Figure BDA0002865230370000072
Figure BDA0002865230370000081
其中编号为P5-01～P5-08的接头引物的序列标记为SEQ ID NO.31～SEQ IDNO.38，编号为P7-01～P7-12的接头引物的序列标记为SEQ ID NO.39～SEQ ID NO.50。
实施例3
本实施例提供一种基于高通量测序检测性传播病原体的方法，包括以下步骤：
提取样本基因组DNA，使用实施例2中的试剂盒进行PCR扩增反应，将扩增产物纯化，即为所构建的文库，经过测序(用illumina MiniSeq中通量测序试剂盒进行测序)和数据分析，确定样本中性传播病原体的类型。
其中PCR扩增的体系为：
Figure BDA0002865230370000082
其中PCR Mix为采购自赛默飞的Platinum Multiplex PCR Master Mix。
其中PCR扩增的程序为：
Figure BDA0002865230370000091
其中文库纯化的方法为：
(1)PCR扩增完成后，合并样本，用核酸纯化试剂盒进行纯化浓缩至30～100μL；
(2)加入30μL AMpureXP beads，混匀，室温放置5min；上磁力架，待磁珠完全吸附后，分别用200μL新鲜配制80％乙醇洗2次；室温干燥后加入50μL TE洗脱(可以用移液器吹打混匀)，室温放置2min；
(3)加入50μL AMpureXP beads，混匀，室温放置5min；上磁力架，待磁珠完全吸附后，将上清转移至一个新的EP管中；
(4)在转移的上清中加入30μL AMpureXP beads，混匀，室温放置5min；上磁力架，待磁珠完全吸附后，吸弃上清；分别用200μL新鲜配制80％乙醇洗2次；室温干燥后加入50μLTE洗脱(可以用移液器吹打混匀)，室温放置2min；
(5)上磁力架，待磁珠完全吸附后，将上清转移至一个新的EP管中，所得上清即为所需要文库。
实施例4
人工合成质粒进行特异性和灵敏度测试
人工合成14个质粒：H001(沙眼衣原体)，H002(单纯疱疹病毒1)，H003(单纯疱疹病毒2)，H004(单纯疱疹病毒3)，H005(杜氏嗜血菌)，H006(生殖支原体)，H007 (人型衣原体)，H008(淋球菌)，H009(梅毒螺旋体)，H010(阴道毛滴虫)，H011(细小衣原体)，H012(解脲脲原体)，H013(性病淋巴肉芽肿衣原体1)，H014(性病淋巴肉芽肿衣原体2)；每种质粒设置了3个测试浓度，分别为100000(105)拷贝/测试，1000(103) 拷贝/测试，100(102)拷贝/测试，共42个测试；
并设置两个阳性对照(均为14种质粒与人类基因组DNA的混合物：PC-1(200拷贝/测试)，PC-2(1000拷贝/测试)，PC-3(5000拷贝/测试)和一个阴性对照(NC)，一共46 个样本。
采用实施例3中的方法对上述46个样本进行检测，接头引物的设置如表3所示：
表3接头引物设置
Figure BDA0002865230370000101
数据分析：产生数据按照不同接头数据进行数据拆分，随后分别比对人基因组GADPH 序列和14种病原微生物基因组序列，以确定每一种目标序列的数目；
分析结果：两个阳性样本中，所有类型均有reads，阴性样本reads数为0。42个样本中，有良好的特异性，并且展示出良好的梯度效应。对于100(102)拷贝的质粒能够检出。
实施例5
临床样本一致性测试
取经过PCR-杂交法检测的临床来源的宫颈拭子样本92例，经过QIAamp DNA bloodmini kit提取基因组DNA，每例样本1个测试，总共92个测试；并设置三个阳性对照(PC-1(200 拷贝/测试)，PC-2(1000拷贝/测试)，PC-3(5000拷贝/测试))和一个阴性对照(NC)，一共96个样本，完成一个96孔板的测试。
采用实施例3中的方法对上述96个样本进行检测，接头引物的设置如表4所示：
表4接头引物设置
Figure BDA0002865230370000111
将上述92例宫颈拭子样本采用商品化试剂盒法进行检测，以验证本发明所述检测方法的准确性，该商品化试剂盒法为国内某公司开发的生殖道感染病原体核酸检测试剂盒，能够检测淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)、人型支原体(MH)、生殖支原体(MG)、单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV2)等这六种微生物；具体检测结果如表5所示：
表5本发明与商品化试剂盒的检测结果比较
Figure BDA0002865230370000112
/>
Figure BDA0002865230370000121
/>
Figure BDA0002865230370000131
结果分析：采用本发明的检测方法，与用商品化试剂盒进行检测的结果展示出良好的一致性。但是相比于只能检测6种性传播病原体的商业化试剂盒，本发明检测方法的灵敏度和准确性均更好，且对于同一样品，能够检测到更多病原体的存在(如样品4、6、12、14、16、 24、26、39、66、74和78)，其中包括有在商品化试剂盒中不能检测的阴道毛滴虫(TV) 等病原体，表明本发明的检测方法和试剂盒相比于市售商业化试剂盒更具有应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州迈景基因医学科技有限公司
<120> 基于高通量测序检测性传播病原体的多重PCR引物组、试剂盒及其方法
<130> 1
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agatgctgct agcaataatg gtgttgatca a 31
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagggccgac caaatccaat atggaa 26
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccatgaatgg caagcaagtt ta 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgagccatat tgcggtcgta t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgagcgattt atggacgcca t 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cggcacgtac agtacccagc ctata 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctgacggaca tttacaaggt 20
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcagaccgcc gttttaggtt tggtca 26
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggaagccgtg ttattcgcca t 21
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggacctggtt ctggtactga tgaa 24
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggggttcacg tcggtacact ta 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tggcacacat gctgccggat ta 22
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tattagtaga aaaatcaatg caag 24
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<213> 人工序列
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ggctgtgggc aaggtcatc 19
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cacgaccagc gccatcggct aat 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccgaatatcg gggcggactg gaa 23
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cctaatccca ttaaagcttc agatca 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgatcacgcc ttcacgatct aa 22
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<213> 人工序列
<400> 19
cgtatacatg aactgccacc ctt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cgttgcgttc ccgcattgat 20
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<212> DNA
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gcacgaagac gcggtagtac a 21
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<213> 人工序列
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gcctcttgtg tggccagagc tcaat 25
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcgtatttgt ctgcatccac aa 22
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gggaatcctg tatgcagtac t 21
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gtgttggcat gaccgtccac cgtt 24
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ttctgacaaa gtggcagaaa ccccataa 28
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tattatgtgc aactgcttga taaact 26
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tctccgacgc ctgcttcacc ac 22
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 31
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
caagcagaag acggcatacg agataacgtg atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 32
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
caagcagaag acggcatacg agataaacat cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 33
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
caagcagaag acggcatacg agatatgcct aagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 34
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
caagcagaag acggcatacg agatagtggt cagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 35
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
caagcagaag acggcatacg agataccact gtgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 36
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
caagcagaag acggcatacg agatacattg gcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
caagcagaag acggcatacg agatcagatc tggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 38
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
caagcagaag acggcatacg agatcatcaa gtgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 39
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gatcgcaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 40
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gcaggaaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 41
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gtcactaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 42
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca tcctgtaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ttgaggaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 44
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc aaccacaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 45
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg actagtaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
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<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc aatggaaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 47
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc acttcgaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 48
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc agcgttaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc ataccaaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69
<210> 50
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc cagttcaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatc 69

Claims (2)

1.一种基于高通量测序检测性传播病原体的试剂盒，其特征在于，包括多重PCR引物组和接头引物；
所述多重PCR引物组包括编号为F001-F014的上游引物和编号为R001-R014的下游引物；每条所述上游引物和所述下游引物从5’端到3’端依次由桥接序列和靶向不同性传播病原体的特异序列组成；
所述编号为F001-F014的上游引物中靶向不同性传播病原体的特异序列如SEQ IDNO.1~SEQ ID NO.14所示；
所述编号为R001-R014的下游引物中靶向不同性传播病原体的特异序列如SEQ IDNO.15~SEQ ID NO.28所示；
每条所述上游引物中桥接序列均相同，每条所述下游引物中桥接序列均相同；
所述接头引物从5’端到3’端依次由测序仪相关通用序列、样本标签序列和与所述多重PCR引物组中引物5’端的桥接序列相同的序列组成；
所述接头引物包括至少一条P5接头引物和至少一条P7接头引物；
所述性传播病原体包括沙眼衣原体、解脲脲原体、细小脲原体、淋球菌、梅毒螺旋体、生殖支原体、阴道毛滴虫、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、单纯疱疹病毒3、人型衣原体、杜氏嗜血菌、性病淋巴肉芽肿衣原体1和性病淋巴肉芽肿衣原体2。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述P5接头引物选自编号为P5-01~P5-08的接头引物中的至少一种，其序列分别如SEQ ID NO.31~SEQ ID NO.38所示；所述P7接头引物选自编号为P7-01~P7-12的接头引物中的至少一种，其序列分别如SEQ ID NO.39~SEQID NO.50所示。
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