CN111979313B - 一种基于多重pcr及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用，可以高效率、低成本、全面化的诊断大部分遗传性耳聋；还可以用于新生儿筛查，早发现早治疗，减少“因聋致哑”，其解决的技术方案是，该多重PCR特异性引物包括34对特异性引物，分成两个Pool，Pool‑1包含18对引物，核酸序列如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：36所示；Pool‑2包含16对引物，核酸序列如SEQ ID NO：37‑68所示，本发明可有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤，是检测耳聋基因致病变异的特异性引物上的创新。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别是一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用。
背景技术
耳聋是最常见的残疾之一，会严重影响人类的认知和交流，全球听力障碍者多达3.6亿人(WHO，2017)。大约500名新生儿中就有1名受到听力损失的影响。在中国，大约有80万名不到7岁的听力障碍儿童，并且这一数字每年以30,000例的速度增加。与遗传因素相关的非综合症或综合症性耳聋约占60％。非综合性耳聋通常是指没有其他临床症状的耳聋，占遗传性耳聋的70％。感音神经性耳聋中约80％是常染色体隐性遗传(AR)，除此之外，接近20％耳聋为常染色体显性遗传(AD)和少于1％的X染色体连锁或线粒体。除佩戴助听器、人工电子耳蜗植入，目前对于遗传性耳聋尚无特效治疗方法。因此，早期诊断和预防对遗传性耳聋的临床干预至关重要。
根据解放军总医院聋病分子诊断中心关于中国聋病分子流行病学的调查研究，GJB2和SLC26A4基因突变是导致中国人耳聋的第一位和第二位致病原因，GJB3是最先由我国学者克隆出的耳聋致病基因，而12SrRNA突变是导致中国人药物性致聋的主要原因，USH2A基因也是在中国耳聋人群中检出率较高的基因。
国外研究表明约有50％的常染色体隐性遗传性耳聋是由于GJB2基因突变导致的，在中国耳聋人群中GJB2检出率达21.6％，明确由该基因致聋的比例达18.2％。由于GJB2基因短小，而且突变热点多，成为耳聋基因检测的最基本项目。
GJB3基因编码间隙连接蛋白，位于1p34.3，最先是由我国学者克隆出的耳聋致病基因，可以导致常染色体显性和常染色体隐性遗传的耳聋。
SLC26A4是中国人群中第二位致聋基因，该基因突变后可以导致Pendred综合征和常染色体隐性耳聋DFNB4，患者均有前庭导水管扩大，前庭导水管扩大的病人约有96％是由于该基因突变导致的。该基因在中国耳聋患者中检出率为20.35％，SLC26A4：c.919-2A>G是该基因的热点突变，15.23％耳聋患者携带此突变，前庭导水管扩大病人中有74.8％携带此突变。
12SrRNA突变是导致中国人药物性致聋的主要原因，携带此基因突变的人在使用氨基糖苷类抗生素抗生素后会导致耳聋，分为用药过量致聋和个体对该类抗生素过敏而致聋。该基因主要存在A1555G和C1494T两种突变类型，检出率分别为1.72％和0.15％。
Usher综合征即感音神经性耳聋-视网膜色素变性综合征，遗传方式为常染色体隐性，除感音神经性耳聋外还伴有视网膜色素变性和不同程度的前庭功能障碍。UAH2A基因是导致Usher2型综合征最常见的致病基因，在Usher2型综合征患者中检出率为74-90％，因此UAH2A基因筛查尤为重要。
一代测序是遗传性耳聋基因检测的传统方法，是基因检测的金标准；然而，该技术费时费力，通量低价格高，从而限制了其临床应用。结合耳聋基因的微阵列芯片诊断技术能够快速取得结果,但是该方法包含的基因和位点数量有限，不能检测出患者携带的罕见变异，致使在许多患者无法得到诊断。变性高效液相色谱法具有自动化高，检测成本低的特点，并且能够同时检测多个变异位点，但是其技术要求高，且需要特殊仪器，限制了其在临床应用，现多用于实验室检测。飞行时间质谱法具有较高的通量，每台仪器单日可检测3000例样本，可检测位点多、并且高效准确，但对人员技术和检测样品纯度要求高，并且仪器昂贵，不适合在一般的医疗机构开展，限制了其广泛应用。
事实证明，下一代测序(NGS)的最新应用在鉴定耳聋患者的致病突变方面具有强大的功能。多重PCR可同时扩增同一反应管中的多个区域，从而显著节省时间和试剂，并提供更准确的诊断信息。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用，可以高效率、低成本、全面化的诊断大部分遗传性耳聋；还可以用于新生儿筛查，早发现早治疗，减少“因聋致哑”。
本发明解决的技术方案是，该多重PCR特异性引物包括34对特异性引物，分成两个Pool，Pool-1包含18对引物，核酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：36所示；Pool-2包含16对引物，核酸序列如SEQ ID NO：37-68所示。
所述的特异性引物均为经过修饰的引物(如硫代修饰)，引物与引物之间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，引物与模板之间不发生错配，且引物设计区域不存在突变位点。同时，在引物设计时，每对引物之间的退火温度差异小于2摄氏度，扩增产物长度在200-300bp之间。
一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的试剂盒：至少包括34对特异性引物中的一对，除特异性引物之外，所述试剂盒还包括通用引物、Index、酶混合物、质控品、无核酸酶水；其中通用引物用于对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增，Index用于对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记，为8个碱基的核苷酸序列。酶混合引物包括：高保真DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTP混合物等，阴性质控品为正常人基因组DNA，阳性质控品为3个分别携带GJB2:c.235delC、SLC26A4:c.919-2A>G和MT:1555A>G变异的人类基因组DNA，空白质控品为无核酸酶水。
一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的检测方法，包括以下步骤：
1)使用磁珠法对待测样本进行核酸提取，然后使用Nanodrop进行浓度及纯度的测定，合格后按操作标准进行定量稀释至1-10ng/μl，终体积大于11μl，备用；建库时应尽量使用最新制备或者质量优良的模板，如不能及时建库，模板短期可2-8℃保存，长期可在-20℃保存，避免反复冻融。
2)第一轮PCR:
用所述特异性引物及试剂盒中的其他相关试剂配制如下反应体系，按照如下PCR反应程序对所提取的DNA的目标区域进行PCR扩增，备用；
3)第二轮PCR：将第一轮PCR中Pool-1和Pool-2混合，并配制如下反应体系，进行末端修饰，通用接头与Index连接。
4)纯化
使用磁珠法对第二轮PCR中扩增产物进行纯化，将纯化后的扩增子文库使用
4.0Fluorometer Qubit(dsDNA HS Assay Kit)进行浓度测定，记录文库浓度。Agilent 4200TapeStation(Agilent 4200TapeStation D1000 ScreenTape)或Agilent2100Bioanalyzer system(Agilent DNA1000 Kit)进行片段长度测定，若片段长度主要分布在300-500bp，主峰在380±10bp，质检合格，定量混样，上机测序；若长度分布超出300-500bp，或者主峰不在380±10bp之间，重复建库并质检若再次不合格，检测中止，空白质控组(BC)应为不合格，无需测序上机，否则代表有核酸污染。
上述检测方法中的检测样本包含但不限于血液、石蜡包埋组织和冰冻切片组织等。高通量测序平台包含但不限于Illumina HiSeq/MiSeq、Life的Ion Torrent/Proton平台、华大基因的BGISEQ-500/50等测序平台。
本发明针对的是常见耳聋致病基因(GJB2，SLC26A4和MT)的全外显子区域和其他常见耳聋基因(GJB3和USH2A)的检测，可有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤，是检测耳聋基因致病变异的特异性引物上的创新。
附图说明
图1为本发明的PCR扩增原理示意图。
图2为本发明试剂盒使用流程图。
图3为本发明34对引物扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1使用特异性引物对目的区域扩增：
由于引物扩增区域之间距离太近或者互相重叠，需分成2个primer pool，分别进行PCR，引物为文库扩增引物I(18对引物)、文库扩增引物II(16对引物)。
将耳聋特异性引物I、耳聋特异性引物II、多重PCR酶混合液、阳性质控品(PC)、阴性质控品(NC)及空白质控品(BC)解冻后上下颠倒十次混匀，短暂离心，置冰盒上备用。
1)DNA模板准备：将提取的核酸定量至1-10ng/μl，终体积大于11μl；
2)取耳聋特异性引物I和多重PCR酶混合液于PCR管中配制如下反应(记为：文库扩增产物1)：
注意：取试剂盒中阳性质控品和阴性质控品(NC)、空白质控品(BC)原液各5.5μl与待测样本同步检测。
3)取耳聋特异性引物II和多重PCR酶混合液于PCR管中配制如下反应(文库扩增产物2)：
4)使用移液器吹打10次，分别混匀两管反应液，注意更换移液器吸头，置于掌式离心机离心5秒，将反应液收集至管底；
5)将以上两管混匀的PCR反应体系分别置于PCR仪中，进行下述反应：
6)扩增结束后，将PCR样品置于掌式离心机离心5秒，准备进行第二轮PCR。
实施例2扩增产物末端修复、通用引物及Index连接
1)这一步骤将在PCR产物末端连接接头，将扩增酶混合液、通用端接头和所需的标签接头解冻后上下颠倒十次混匀，短暂离心，置于冰上备用；
2)在新的PCR管中配制如下反应(记为：PCR Mix管)：
3)使用移液器吹打混匀10次，置于掌式离心机离心5秒；
4)将文库扩增产物1和文库扩增产物2的两管反应液，依次全部转移至PCR Mix管中，使用移液器吹打混匀10次，置于掌式离心机离心5秒；
5)将PCR管至于PCR仪中，进行下述反应：
6)扩增结束后，将PCR样品置于掌式离心机离心5秒；
实施例3纯化
使用推荐纯化磁珠Vazyme DNA Clean Beads对反应产物进行纯化：
1)磁珠平衡至室温后，涡旋振荡混匀DNA Clean Beads；
2)按照1：0.8的比例，吸取64μl DNA Clean Beads至80μl PCR产物中，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
3)室温孵育5min；
4)将PCR管置于掌式离心机离心5秒并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
5)保持PCR管始终置于磁力架中，加入180μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清；
6)重复上述步骤5)，总计漂洗两次；
7)保持PCR管始终置于磁力架中，彻底清除上清，建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液，开盖空气干燥磁珠5-10min至无乙醇残留；
8)将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱：加入40μl无核酶水，使用移液器吹打10次充分混匀，于室温放置5min，将PCR管置于掌式离心机离心5秒并置于磁力架中静置，待溶液澄清后(约5min)，小心移取38μl上清至新离心管中，切勿触碰磁珠；
9)将纯化后的扩增子文库使用
4.0FluorometerQubit(dsDNA HS AssayKit)进行浓度测定，记录文库浓度；
10)Agilent 4200TapeStation(Agilent 4200TapeStation D1000 ScreenTape)或Agilent 2100Bioanalyzer system(Agilent DNA1000 Kit)进行片段长度测定；
11)若片段长度主要分布在300-500bp，主峰在380±10bp，质检合格；若长度分布超出300-500bp，或者主峰不在380±10bp之间，重复建库并质检；若再次不合格，检测中止。空白质控组(BC)应为不合格，无需测序上机，否则代表有核酸污染；
12)若文库不能立刻进行测序，应置于-20℃保存，保存时间不长于6个月，且保存期间避免反复冻融，冻融次数不超过6次。
实施例4引物特异性、准确性和重复性验证
引物特异性验证
取试剂盒中阴性质控品使用无核酸酶水稀释至5ng/μL，使用34对引物按照上述推荐引物浓度分别对阴性质控品进行扩增，分别标记为1-34，扩增后产物纯化后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。对照试验，检测方法与样本检测方法相同，检测结果见图1。
检测结果表示，阴性对照除残留引物外，无任何非特异条带，说明反应体系是无污染；阳性对照条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常。检测的34例样本扩增产物主要集中在200-300bp，无其他非特异性条带，与预期设计相符，且引物二聚体含量极少，且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显。由此可以看出，本发明的PCR扩增引物及检测方法能突破传统方法产生大量引物二聚体的限制，增强了引物特异性。
引物准确性验证
取30个企业参考品(企业参考品位点经过一代测序验证)，按照标准建库方案进行建库，并进行文库质量检测，合格后行高通量测序和生物信息学分析。
结果显示，建库后片段长度主要分布在300-500bp，主峰在380±10bp，质检合格；空白质控组(BC)为不合格。生物信息学分析结果显示，每个企业参考品测序深度达到要求，且携带变异结果与一代测序结果一致，说明引物准确性良好。
引物重复性验证
取6个重复性参考品(重复性参考品位点经过一代测序验证)，按照标准建库方案进行建库，行10次重复，并进行文库质量检测，合格后行高通量测序和生物信息学分析。
结果显示，建库后片段长度主要分布在300-500 bp，主峰在380±10bp，质检合格；空白质控组(BC)为不合格。生物信息学分析结果显示，测序深度均达到要求，每个重复性参考品携带变异结果与一代测序结果一致，说明引物重复性良好。
实施例5临床对比试验
本试验入组了112例经博奥4基因15位点耳聋基因检测试剂盒阳性和阴性DNA样本，检测合格后，按照本试剂盒标准建库方案进行建库后，并进行高通量测序及生物信息学分析。59例诊断样本本试剂盒检测结果与博奥4基因15位点一致，未诊断的53样本中，48例本试剂盒检测到额外的变异位点，5例本试剂盒检测结果同样不能诊断。
| 检测结果 | 4基因9位点检测结果 | 本试剂盒检测结果 |
| 诊断 | 59例 | 107例 |
| 未诊断 | 53例 | 5例 |
| 总数 | 112例 | 112例 |
本发明的有益效果：
本发明提供的基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重PCR特异性引物，检测基因范围不仅包含常见的GJB2、SLC26A4、MT基因全部外显子检测，还包括其它耳聋致病相关基因GJB3和USH2A的热点区域检测，覆盖上述五种基因所有常见与罕见得突变位点；并且能够同时检测多个样本、多个遗传性耳聋易感基因，有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤等。
本发明利用高通量基因测序技术突破传统检测技术的限制，提高检测灵敏度；同时还能检测包括已知突变和未知突变位点的变异情况，得到全面准确的检测结果，通过对遗传性耳聋致病基因及其突变位点进行测序，可得到具体的基因序列信息，进而评估耳聋的遗传风险，指导耳聋患者或高风险人群的干预和治疗，同时通过对耳聋基因检测结果的分析，确定遗传方式，对患者家庭成员的患病风险，携带着风险，子代患病风险等作出科学评估，指导科学婚育，从源头上预防耳聋出生缺陷。
本发明采用磁珠纯化核酸的方式，省去了传统建库中的离心柱式纯化，操作简单；其次，本发明针对高通量测序平台设计的引物通过选取温度梯度、时间梯度、循环数经过大量正交实验，优化PCR反应程序，且本发明方法用引物直接在目标基因链中捕获目标区域并进行扩增，不需要对目标基因进行截断修饰等处理，节省了检测时间和成本，从DNA提取到出结果最快仅需三天时间。
特异性引物序列如下
序列表
<110> 郑州桑林生物科技有限公司
郑州大学
<120> 一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用
<160> 68
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 54
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggtgtgt tcagatatgt taaagccact 60
tt 62
<210> 55
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 55
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagccaataa agctaaaact cacctgagtt 60
<210> 56
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 56
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagggttga tcggggttta tcgatta 57
<210> 57
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 57
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggcttcat atccctctag aggag 55
<210> 58
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 58
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagactaag cactctactc ttagtttact 60
g 61
<210> 59
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 59
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcgatagc ccttatgaaa cttaagg 57
<210> 60
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 60
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggttgaa atctcctaag tgtaagttgg 60
<210> 61
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 61
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggtgcggt taaaaggcgc cac 53
<210> 62
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 62
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaaccgc tctgggtctc gc 52
<210> 63
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 63
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggagttcc tcttcctcta cctgctg 57
<210> 64
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 64
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtcacag atggtgagta cgatgcag 58
<210> 65
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 65
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggccagat gtgtgagtgt gattccttg 59
<210> 66
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 66
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggtagaa gccacaaacc agaaacagg 59
<210> 67
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 67
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagccacaga acagcctgag ttttgg 56
<210> 68
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 68
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagagttcc tgaataaata ttgtgccacc 60
g 61
Claims (6)
1.一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物，其特征在于，该多重PCR特异性引物包括34对特异性引物，分成两个Pool，Pool-1包含18对引物，核酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：36所示；Pool-2包含16对引物，核酸序列如SEQ ID NO：37-68所示。
2.根据权利要求1所述的基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物均为经过修饰的引物，引物与引物之间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，引物与模板之间不发生错配，且引物设计区域不存在突变位点，同时，在引物设计时，每对引物之间的退火温度差异小于2摄氏度，扩增产物长度在200-300bp之间。
3.一种基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1-2任一项所述34对特异性引物。
4.根据权利要求3所述的基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括通用引物、Index、酶混合物、质控品、无核酸酶水；其中通用引物用于对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增，Index用于对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记，为8个碱基的核苷酸序列，酶混合引物包括：高保真DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTP混合物，阴性质控品为正常人基因组DNA，阳性质控品为3个分别携带GJB2:c.235delC、SLC26A4:c.919-2A>G和MT:1555A>G变异的人类基因组DNA，空白质控品为无核酸酶水。
5.权利要求4所述的基于多重PCR及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的试剂盒在制备遗传性耳聋致病基因检测试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测试剂通过以下步骤进行检测：
1)使用磁珠法对待测样本进行核酸提取，然后使用Nanodrop进行浓度及纯度的测定，合格后按操作标准进行定量稀释至1-10ng/μl，终体积大于11μl，备用；建库时应尽量使用最新制备或者质量优良的模板，如不能及时建库，模板短期可在2-8℃保存，长期可在-20℃保存，避免反复冻融；
2)第一轮PCR:
用权利要求1所述的特异性引物及权利要求4所述的试剂盒中的其他试剂配制如下反应体系，按照如下PCR反应程序对所提取的DNA的目标区域进行PCR扩增，备用；
3)第二轮PCR：将第一轮PCR中Pool-1和Pool-2混合，并配制如下反应体系，进行末端修饰，通用接头与Index连接；
4)纯化
使用磁珠法对第二轮PCR中扩增产物进行纯化，将纯化后的扩增子文库使用用
4.0Fluorometer Qubit进行浓度测定，记录文库浓度，Agilent 4200TapeStation或Agilent 2100Bioanalyzer system进行片段长度测定，若片段长度主要分布在300-500bp，主峰在380±10bp，质检合格，定量混样，上机测序；若长度分布超出300-500bp，或者主峰不在380±10bp之间，重复建库并质检若再次不合格，检测中止，空白质控组应为不合格，否则代表有核酸污染，无需测序上机。
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