CN111041085A - 小胖威利综合征长非编码rna标记物及检测试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于小胖威利综合征诊断研究领域，具体提供了一系列可用于血液样本检测的小胖威利综合征长非编码RNA标记物及检测试剂。sno‑lncRNA1、sno‑lncRNA2、sno‑lncRNA3、sno‑lncRNA4和sno‑lncRNA5，它们在人源胚胎干细胞中表达量极高，且异常稳定。小胖威利综合征病人中15号染色体q11‑q13区域基因表达缺失，最小核心缺失区域为108kb。正常情况下，sno‑lncRNAs等长非编码RNA均产生自该区域，可以作为小胖威利综合征的分子标记物。该系列分子标记物的检测试剂为特异性引物对。该类RNA标志物不仅稳定、微创、易于检测，而且定量精确。这些特征将提高小胖威利综合征检测的敏感性和特异性。该基因检测试剂具有特异、灵敏、快速和简单方便的优点。

Description

小胖威利综合征长非编码RNA标记物及检测试剂
技术领域
本发明属于小胖威利综合征诊断研究领域，具体涉及小胖威利综合征长非编码RNA标记物及检测试剂。
背景技术
小胖威利综合征(Prader-Willi syndrome，简称“PWS”)是一种多系统紊乱的复杂临床综合征，新生儿发病率为1/12000到1/15000。2018年5月11日，国家卫生健康委员会、科学技术部、工业和信息化部、国家药品监督管理局、国家中医药管理局等五部委联合制定发布的《第一批罕见病目录》，包括小胖威利综合征等121种疾病被收入其中。小胖威利综合征主要的临床特征包括：新生儿或婴幼儿肌张力低下、发育缓慢、有明显的面部特征(窄面、前额窄、长头、杏仁眼)、童年期开始体重迅速增加、青春期发育迟缓、性腺发育不良，智力发育缓慢。临床上易将小胖威利综合征误诊为脑瘫、肌无力、简单性肥胖等或漏诊。PWS患者的主要遗传类型有：父源染色体15q11-13区域缺失(65％～75％)、母源单亲二倍体(20％～30％)、印记中心微缺失或突变(1％～3％)、染色体平衡易位(<1％)。
与常见疾病相比，罕见病的相关医学研究水平明显滞后。医学界对许多罕见病(例如小胖威利综合征)的发病机制认识受限，检测手段不足，更缺乏有效的治疗方法，因此不少患者及其家庭面临长期辗转求医而无法明确检测的困境；同时因医疗资源分布不均衡等原因，还有许多罕见病(例如小胖威利综合征)患者没有被及时确诊，耽误了治疗干预时间。因此建立简单、高效、易于操作、覆盖范围广的检测检测方法显得尤为重要。目前，检测检测小胖威利综合征的方法包括甲基化特异性扩增(Methylation-specific PCR，MS-PCR)及甲基化特异性多重连接探针(Methylation-specific multiplex ligation-dependentprobe amplification，MS-MLPA)。MS-PCR与MS-MLPA技术是利用15号染色体q11-q13区域基因印记中心(Imprinting center，IC)在父源、母源染色体上甲基化情况存在差异这一分子特征来检测小胖威利综合征。以上两种方法存在样品投入量大、操作复杂、微缺失难以检测等缺点。开发新类型的小胖威利综合征检测标志物及相关试剂十分必要，对小胖威利综合征的及早检测与尽快干预治疗具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种小胖威利综合征长非编码RNA标记物及检测试剂。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4和sno-lncRNA5的任意一个或多个联合用于制备或筛选小胖威利综合征检测试剂的用途。所述多个是指两个、三个、四个或五个。
在一种实施方式中，sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4和sno-lncRNA5中的任意一个或多个联合作为生物标志物。所述多个是指两个、三个、四个或五个。
在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂用于小胖威利综合征的判断、诊断。
在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂适用于检测新鲜血液样本或干血斑样本。
需要说明的是，所述小胖威利综合征检测试剂并不限定为必须为液体形式。
在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂包括以下之任一项或多项：(1)特异性识别sno-lncRNA1的试剂、(2)特异性识别sno-lncRNA2的试剂、(3)特异性识别sno-lncRNA3的试剂、(4)特异性识别sno-lncRNA4的试剂和(5)特异性识别sno-lncRNA5的试剂。所述多项是指两项、三项、四项或五项。
sno-lncRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
sno-lncRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
sno-lncRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
sno-lncRNA4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
sno-lncRNA5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA1的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA1的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA1的引物对包括序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物sno-lncRNA1-qF1和序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物sno-lncRNA1-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.8所示的上游引物sno-lncRNA1-qF2和序列如SEQ ID NO.9所示的下游引物sno-lncRNA1-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.10所示的上游引物sno-lncRNA1-qF3和序列如SEQ IDNO.11所示的下游引物sno-lncRNA1-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.12所示的上游引物sno-lncRNA1-qF4和序列如SEQ IDNO.13所示的下游引物sno-lncRNA1-qR4。
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA1的引物对为sno-lncRNA1-qF1和sno-lncRNA1-qR1。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA2的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA2的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA2的引物对包括序列如SEQ ID NO.14所示的上游引物sno-lncRNA2-qF1和序列如SEQ ID NO.15所示的下游引物sno-lncRNA2-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.16所示的上游引物sno-lncRNA2-qF2和序列如SEQ IDNO.17所示的下游引物sno-lncRNA2-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.18所示的上游引物sno-lncRNA2-qF3和序列如SEQ IDNO.19所示的下游引物sno-lncRNA2-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.20所示的上游引物sno-lncRNA2-qF4和序列如SEQ IDNO.21所示的下游引物sno-lncRNA2-qR4。
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA2的引物对为sno-lncRNA2-qF4和sno-lncRNA2-qR4。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA3的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA3的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA3的引物对包括序列如SEQ ID NO.22所示的上游引物sno-lncRNA3-qF1和序列如SEQ ID NO.23所示的下游引物sno-lncRNA3-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.24所示的上游引物sno-lncRNA3-qF2和序列如SEQ IDNO.25所示的下游引物sno-lncRNA3-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.26所示的上游引物sno-lncRNA3-qF3和序列如SEQ IDNO.27所示的下游引物sno-lncRNA3-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.28所示的上游引物sno-lncRNA3-qF4和序列如SEQ IDNO.29所示的下游引物sno-lncRNA3-qR4。
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA3的引物对为sno-lncRNA3-qF4和sno-lncRNA3-qR4。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA4的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA4的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA4的引物对包括序列如SEQ ID NO.30所示的上游引物sno-lncRNA4-qF1和序列如SEQ ID NO.31所示的下游引物sno-lncRNA4-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.32所示的上游引物sno-lncRNA4-qF2和序列如SEQ IDNO.33所示的下游引物sno-lncRNA4-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.34所示的上游引物sno-lncRNA4-qF3和序列如SEQ IDNO.35所示的下游引物sno-lncRNA4-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.36所示的上游引物sno-lncRNA4-qF4和序列如SEQ IDNO.37所示的下游引物sno-lncRNA4-qR4。
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA4的引物对为sno-lncRNA4-qF4和sno-lncRNA4-qR4。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA5的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA5的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA5的引物对包括序列如SEQ ID NO.38所示的上游引物sno-lncRNA5-qF1和序列如SEQ ID NO.39所示的下游引物sno-lncRNA5-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.40所示的上游引物sno-lncRNA5-qF2和序列如SEQ IDNO.41所示的下游引物sno-lncRNA5-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.42所示的上游引物sno-lncRNA5-qF3和序列如SEQ IDNO.43所示的下游引物sno-lncRNA5-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.44所示的上游引物sno-lncRNA5-qF4和序列如SEQ IDNO.45所示的下游引物sno-lncRNA5-qR4。
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA5的引物对为sno-lncRNA5-qF1和sno-lncRNA5-qR1。
本发明的第二方面，提供特异性识别sno-lncRNA1的试剂、特异性识别sno-lncRNA2的试剂、特异性识别sno-lncRNA3的试剂、特异性识别sno-lncRNA4的试剂和特异性识别sno-lncRNA5的试剂中的任一项或多项联合用于制备小胖威利综合征检测试剂盒的用途。所述多项是指两项、三项、四项或五项。
在一种实施方式中，sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4和sno-lncRNA5中的任意一个或多个联合作为生物标志物。所述多个是指两个、三个、四个或五个。
在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂盒用于小胖威利综合征的判断、诊断。
在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂适用于检测新鲜血液样本或干血斑样本。
需要说明的是，所述特异性识别sno-lncRNA1的试剂、特异性识别sno-lncRNA2的试剂、特异性识别sno-lncRNA3的试剂、特异性识别sno-lncRNA4的试和特异性识别sno-lncRNA5的试剂并不限定为必须为液体形式。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA1的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA1的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA1的引物对包括序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物sno-lncRNA1-qF1和序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物sno-lncRNA1-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.8所示的上游引物sno-lncRNA1-qF2和序列如SEQ ID NO.9所示的下游引物sno-lncRNA1-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.10所示的上游引物sno-lncRNA1-qF3和序列如SEQ IDNO.11所示的下游引物sno-lncRNA1-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.12所示的上游引物sno-lncRNA1-qF4和序列如SEQ IDNO.13所示的下游引物sno-lncRNA1-qR4。
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA1的引物对为sno-lncRNA1-qF1和sno-lncRNA1-qR1。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA2的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA2的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA2的引物对包括序列如SEQ ID NO.14所示的上游引物sno-lncRNA2-qF1和序列如SEQ ID NO.15所示的下游引物sno-lncRNA2-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.16所示的上游引物sno-lncRNA2-qF2和序列如SEQ IDNO.17所示的下游引物sno-lncRNA2-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.18所示的上游引物sno-lncRNA2-qF3和序列如SEQ IDNO.19所示的下游引物sno-lncRNA2-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.20所示的上游引物sno-lncRNA2-qF4和序列如SEQ IDNO.21所示的下游引物sno-lncRNA2-qR4。
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA2的引物对为sno-lncRNA2-qF4和sno-lncRNA2-qR4。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA3的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA3的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA3的引物对包括序列如SEQ ID NO.22所示的上游引物sno-lncRNA3-qF1和序列如SEQ ID NO.23所示的下游引物sno-lncRNA3-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.24所示的上游引物sno-lncRNA3-qF2和序列如SEQ IDNO.25所示的下游引物sno-lncRNA3-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.26所示的上游引物sno-lncRNA3-qF3和序列如SEQ IDNO.27所示的下游引物sno-lncRNA3-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.28所示的上游引物sno-lncRNA3-qF4和序列如SEQ IDNO.29所示的下游引物sno-lncRNA3-qR4。
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA3的引物对为sno-lncRNA3-qF4和sno-lncRNA3-qR4。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA4的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA4的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA4的引物对包括序列如SEQ ID NO.30所示的上游引物sno-lncRNA4-qF1和序列如SEQ ID NO.31所示的下游引物sno-lncRNA4-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.32所示的上游引物sno-lncRNA4-qF2和序列如SEQ IDNO.33所示的下游引物sno-lncRNA4-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.34所示的上游引物sno-lncRNA4-qF3和序列如SEQ IDNO.35所示的下游引物sno-lncRNA4-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.36所示的上游引物sno-lncRNA4-qF4和序列如SEQ IDNO.37所示的下游引物sno-lncRNA4-qR4。
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA4的引物对为sno-lncRNA4-qF4和sno-lncRNA4-qR4。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA5的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA5的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA5的引物对包括序列如SEQ ID NO.38所示的上游引物sno-lncRNA5-qF1和序列如SEQ ID NO.39所示的下游引物sno-lncRNA5-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.40所示的上游引物sno-lncRNA5-qF2和序列如SEQ IDNO.41所示的下游引物sno-lncRNA5-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.42所示的上游引物sno-lncRNA5-qF3和序列如SEQ IDNO.43所示的下游引物sno-lncRNA5-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.44所示的上游引物sno-lncRNA5-qF4和序列如SEQ IDNO.45所示的下游引物sno-lncRNA5-qR4。或者
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA5的引物对为sno-lncRNA5-qF1和sno-lncRNA5-qR1。
本发明的第三方面，提供一种小胖威利综合征检测试剂盒，所述试剂盒中包括以下之任一项或多项：(1)特异性识别sno-lncRNA1的试剂、(2)特异性识别sno-lncRNA2的试剂、(3)特异性识别sno-lncRNA3的试剂、(4)特异性识别sno-lncRNA4的试剂、(5)特异性识别sno-lncRNA5的试剂。所述多项是指两项、三项、四项或五项。
在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂盒用于小胖威利综合征的判断、诊断。
在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂适用于检测新鲜血液样本或干血斑样本。
在一种实施方式中，sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4和sno-lncRNA5中的任意一个或多个联合作为生物标志物。所述多个是指两个、三个、四个或五个。
在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂盒用于小胖威利综合征的判断、诊断。
在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂适用于检测新鲜血液样本或干血斑样本。
需要说明的是，所述特异性识别sno-lncRNA1的试剂、特异性识别sno-lncRNA2的试剂、特异性识别sno-lncRNA3的试剂、特异性识别sno-lncRNA4的试和特异性识别sno-lncRNA5的试剂并不限定为必须为液体形式。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA1的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA1的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA1的引物对包括序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物sno-lncRNA1-qF1和序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物sno-lncRNA1-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.8所示的上游引物sno-lncRNA1-qF2和序列如SEQ ID NO.9所示的下游引物sno-lncRNA1-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.10所示的上游引物sno-lncRNA1-qF3和序列如SEQ IDNO.11所示的下游引物sno-lncRNA1-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.12所示的上游引物sno-lncRNA1-qF4和序列如SEQ IDNO.13所示的下游引物sno-lncRNA1-qR4。
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA1的引物对为sno-lncRNA1-qF1和sno-lncRNA1-qR1。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA2的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA2的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA2的引物对包括序列如SEQ ID NO.14所示的上游引物sno-lncRNA2-qF1和序列如SEQ ID NO.15所示的下游引物sno-lncRNA2-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.16所示的上游引物sno-lncRNA2-qF2和序列如SEQ IDNO.17所示的下游引物sno-lncRNA2-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.18所示的上游引物sno-lncRNA2-qF3和序列如SEQ IDNO.19所示的下游引物sno-lncRNA2-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.20所示的上游引物sno-lncRNA2-qF4和序列如SEQ IDNO.21所示的下游引物sno-lncRNA2-qR4。
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA2的引物对为sno-lncRNA2-qF4和sno-lncRNA2-qR4。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA3的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA3的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA3的引物对包括序列如SEQ ID NO.22所示的上游引物sno-lncRNA3-qF1和序列如SEQ ID NO.23所示的下游引物sno-lncRNA3-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.24所示的上游引物sno-lncRNA3-qF2和序列如SEQ IDNO.25所示的下游引物sno-lncRNA3-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.26所示的上游引物sno-lncRNA3-qF3和序列如SEQ IDNO.27所示的下游引物sno-lncRNA3-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.28所示的上游引物sno-lncRNA3-qF4和序列如SEQ IDNO.29所示的下游引物sno-lncRNA3-qR4。
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA3的引物对为sno-lncRNA3-qF4和sno-lncRNA3-qR4。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA4的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA4的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA4的引物对包括序列如SEQ ID NO.30所示的上游引物sno-lncRNA4-qF1和序列如SEQ ID NO.31所示的下游引物sno-lncRNA4-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.32所示的上游引物sno-lncRNA4-qF2和序列如SEQ IDNO.33所示的下游引物sno-lncRNA4-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.34所示的上游引物sno-lncRNA4-qF3和序列如SEQ IDNO.35所示的下游引物sno-lncRNA4-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.36所示的上游引物sno-lncRNA4-qF4和序列如SEQ IDNO.37所示的下游引物sno-lncRNA4-qR4。
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA4的引物对为sno-lncRNA4-qF4和sno-lncRNA4-qR4。
在一种实施方式中，所述特异性识别sno-lncRNA5的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA5的引物对。例如，特异性扩增sno-lncRNA5的引物对包括序列如SEQ ID NO.38所示的上游引物sno-lncRNA5-qF1和序列如SEQ ID NO.39所示的下游引物sno-lncRNA5-qR1。或者
包括序列如SEQ ID NO.40所示的上游引物sno-lncRNA5-qF2和序列如SEQ IDNO.41所示的下游引物sno-lncRNA5-qR2。或者
包括序列如SEQ ID NO.42所示的上游引物sno-lncRNA5-qF3和序列如SEQ IDNO.43所示的下游引物sno-lncRNA5-qR3。或者
包括序列如SEQ ID NO.44所示的上游引物sno-lncRNA5-qF4和序列如SEQ IDNO.45所示的下游引物sno-lncRNA5-qR4。或者
优选地，所述特异性扩增sno-lncRNA5的引物对为sno-lncRNA5-qF1和sno-lncRNA5-qR1。
在一种实施方式中，所述小胖威利综合征检测试剂盒还包括(6)小胖威利综合征阳性对照品和/或(7)小胖威利综合征阴性对照品。
优选的，(1)所述阳性对照品为WT H9细胞；(2)阴性对照品为H9P-KO细胞。
实时荧光定量PCR反应的整体效率取决于RT反应和PCR扩增反应的效率。PCR扩增可指数放大RT效率的轻微差异，可能会导致错误数据的出现。PCR扩增效率100％效率代表每个循环中的模板均实现了完美倍增，但可接受的分析验证范围为90-110％。该效率范围对应的标准曲线斜率为-3.6至-3.1。因此验证生物标志物的PCR扩增反应效率显得十分重要。进一步的，所述试剂盒还包括以下特征中的一项或多项：(1)用于检测特异性扩增sno-lncRNA1的引物对扩增反应效率的引物对、(2)用于检测特异性扩增sno-lncRNA2的引物对扩增反应效率的引物对、(3)用于检测特异性扩增sno-lncRNA3的引物对扩增反应效率的引物对、(4)用于检测特异性扩增sno-lncRNA4的引物对扩增反应效率的引物对、(5)用于检测特异性扩增sno-lncRNA5的引物对扩增反应效率的引物对。
优选的，所述(1)用于检测特异性扩增sno-lncRNA1的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如SEQ ID NO.46所示的上游引物sno-lncRNA1-L和序列如SEQ ID NO.47所示的下游引物sno-lncRNA1-R；(2)用于检测特异性扩增sno-lncRNA2的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如SEQ ID NO.48所示的上游引物sno-lncRNA2-L和序列如SEQ IDNO.49所示的下游引物sno-lncRNA2-R；(3)用于检测特异性扩增sno-lncRNA3的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如SEQ ID NO.50所示的上游引物sno-lncRNA3-L和序列如SEQ ID NO.51所示的下游引物sno-lncRNA3-R；(4)用于检测特异性扩增sno-lncRNA4的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如SEQ ID NO.52所示的上游引物sno-lncRNA4-L和序列如SEQ ID NO.53所示的下游引物sno-lncRNA4-R；(5)用于检测特异性扩增sno-lncRNA5的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如SEQ ID NO.54所示的上游引物sno-lncRNA4-L和序列如SEQ ID NO.55所示的下游引物sno-lncRNA5-R。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)血液样品来源的sno-lncRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统的小胖威利综合征检测标志物---DNA甲基化。该类新型RNA标志物不仅稳定、微创、易于检测，而且定量精确。这些特征将提高小胖威利综合征检测的敏感性和特异性。该类RNA标志物的成功开发有助于小胖威利综合征的检测，同时也为其他疾病生物标志物的研发提供借鉴意义。
(2)通过检测血液中sno-lncRNAs表达来检测人类小胖威利综合征是否发生的试剂盒是一种系统、全面的检测试剂盒。该试剂盒有特异、灵敏、快速和简单方便的特点。该试剂盒的应用有助于小胖威利综合征的检测，为临床医生快速检测小胖威利综合征患者、及时采取干预措施提供支持。
(3)采用严密的设计和严格的评价体系。发明人基于前期研究成果，利用高通量测序等实验与技术对poly(A)-RNA进行分析，发现正常人体内高表达而小胖威利综合征患者体内缺失表达的sno-lncRNAs，且应用RT-qPCR的方法在小胖威利综合征患者血液样本中进行了验证；以上的方法与策略的应用保证了血液样品来源的sno-lncRNAs能成为小胖威利综合征生物标志物，并加速了新型小胖威利综合征检测试剂盒的应用。
(4)本发明经过广泛而深入的研究发现，可检测干血斑来源的血液样品长非编码RNA标记物的表达量来诊断小胖威利综合征，使得长非编码RNA标记物应用于小胖威利综合征新生儿筛查。
附图说明
图1：为sno-lncRNAs分子标志物的基因信息与PCR引物识别序列位置图。
图2：以sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4和sno-lncRNA5分子标志物联合作为生物标志物、PCR产物检测结果。
图3：sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4和sno-lncRNA5分子标志物实时荧光定量PCR的标准曲线。
图4：使用特异性PCR引物检测小胖威利综合征阳性对照品和阴性对照品中对应的分子标志物表达量的检测结果。
图5：使用特异性PCR引物检测小胖威利综合征患者血液样品中对应的分子标志物表达量的检测结果。
图6：利用ROC曲线分析sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4和sno-lncRNA5区分正常人组和小胖威利综合征病患组时的敏感性及特异性。
图7：测干血斑来源样品中sno-lncRNA3的表达情况。
图8：利用ROC曲线分sno-lncRNA3区分干血斑样品来源的正常人组和小胖威利综合征病患组时的敏感性及特异性。
具体实施方式
长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸，缺乏蛋白质编码能力的RNA。LncRNA能参与一系列的基因表达调控，具备复杂的生物学功能，并在生物学过程中发挥着重要作用，例如染色质修饰、X染色体失活、调控基因转录、蛋白翻译等。LncRNA的异常表达调控会导致疾病的发生、如肿瘤、萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病。长非编码RNA sno-lncRNAs转录自PWS核心区域，两端有小核仁RNA(snoRNA)帽子结构，snoRNP与snoRNA结合形成稳定复合物，使得sno-lncRNAs具有极高的稳定性。sno-lncRNAs广泛存在于人体多种组织及细胞中，sno-lncRNAs的表达缺失会导致PWS疾病的发生。这些特征使得sno-lncRNAs在小胖威利综合征检测与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。
发明人经过长期研究发现了内含子来源的两端以小核仁RNA(snoRNA)结尾的lncRNA(sno-lncRNAs)。在人类疾病小胖威利综合征紧密关联区域存在五个sno-lncRNAs，分别命名为sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4、sno-lncRNA5，它们在人源胚胎干细胞中表达量极高，且异常稳定。小胖威利综合征病人中15号染色体q11-q13区域基因表达缺失，最小核心缺失区域为108kb。正常情况下，sno-lncRNAs等长非编码RNA均产生自该区域。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1 sno-lncRNAs分子标志物的基因信息及特异性PCR引物的设计
小胖威利综合征sno-lncRNAs分子标志物组合包括5条长非编码RNA，分别为sno-lncRNA1，sno-lncRNA2，sno-lncRNA3，sno-lncRNA4，sno-lncRNA5，其染色体上定位(图1)及序列是在NCBI Gene Expression Omnibus数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/；accession number GSE38541)中获得的。小胖威利综合征长非编码RNA分子标志物组合的检测试剂为多对特异性引物，该多对引物是通过Primer3在线引物设计工具(http:// primer3.ut.ee/)设计的，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。特异性引物的核苷酸序列如下：
表1
Figure BDA0002071453490000121
Figure BDA0002071453490000131
实施例2 sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4和sno-lncRNA5分子标志物联合作为生物标志物PCR产物特异性检测
2.1干细胞H9培养及RNA的抽提
干细胞H9培养在Martigel包被的培养皿上，采用CM(fibroblast-conditionedmedium)培养基进行培养，该CM培养基为补加了4ng/mL的成纤维细胞生长因子(bFGF，LifeTechnologies)的MEF细胞培养基上清。
将3.5cm培养皿贴壁生长的H9细胞用PBS洗两次后，加入1mL TRIzol试剂(Invitrogen)，反复吹打直至细胞全部裂解。之后加入0.2mL氯仿，离心后RNA处于上层水相，并将其转移到RNase-free的1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇混匀后离心，RNA将形成片状沉淀于管底。75％乙醇漂洗两次后，室温晾干，加入适量的RNase-free水溶解。
2.2 RNA反转录、RT-PCR及凝胶电泳
反转录时，先用DNaseI(Ambion)去除基因组污染，然后用PrimeScript逆转录试剂盒(Takara)进行反转录，得到cDNA，用超纯水稀释3-4倍，放-20℃保存。具体DNaseI处理及反转录过程如下：
Figure BDA0002071453490000141
弹匀2min，最高转速离心5min，取上清，可放-80℃保存。
10μl
5×PrimeScript Buffer 2μl
PrimeScript RT Enzyme 0.5μl
Oligo dT Primer 0.5μl
Random 6mers 2μl
DNaseI treated RNA 500ng
DEPC-H20 up to 10μl
37℃反应15min，85℃反应10min。
以cDNA为模板，利用表1中的特异性PCR引物生物标志物：sno-lncRNA1特性引物对sno-lncRNA1-qF1和sno-lncRNA1-qR1、检测生物标志物sno-lncRNA2特性引物对sno-lncRNA2-qF4和sno-lncRNA2-qR4、检测生物标志物sno-lncRNA3特性引物对sno-lncRNA3-qF4和sno-lncRNA3-qR4、检测生物标志物sno-lncRNA4特性引物对sno-lncRNA4-qF4和sno-lncRNA4-qR4以及检测生物标志物sno-lncRNA5特性引物对sno-lncRNA5-qF1和sno-lncRNA5-qR1扩增待测DNA片段。PCR反应体系如下：
10μl
2×Taq Mater Mix(Vazyme) 5μl
cDNA Template 0.5μl
Forward Primer(10μM) 0.4μl
Reverse Primer(10μM) 0.4μl
ddH2O up to 10μl
反应条件如下：
Figure BDA0002071453490000151
将PCR产物在1.5％的TAE琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上电泳分离，结果如图2所示。
实施例3采用标准曲线评估扩增反应效率、灵敏度及可重复性
实时荧光定量PCR反应的整体效率取决于RT反应和PCR扩增反应的效率。PCR扩增可指数放大RT效率的轻微差异，可能会导致错误数据的出现。PCR扩增效率100％效率代表每个循环中的模板均实现了完美倍增，但可接受的分析验证范围为90-110％。该效率范围对应的标准曲线斜率为-3.6至-3.1。因此验证生物标志物的PCR扩增反应效率显得十分重要。反应效率的最佳评估方法是生成标准曲线。利用表2中的特异性PCR引物扩增待测DNA片段，作为模板，比较不同sno-lncRNAs特性引物对的扩增效率。
以cDNA为模板，利用表2中的特异性PCR引物扩增待测DNA片段，与PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(RT-PCR反应体系及条件同实施例2)，并将相应条带割胶，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN)回收，用Nanodrop2000测定DNA浓度。取10^8个核酸分子作为标准品起始模板量(原液)，将标准品连续依次进行10倍稀释，至10个核酸分子为止。用ddH2O连续稀释的样本核酸为模板，并进行实时荧光定量PCR分析。采用10μ1反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。反应体系如下:
Figure BDA0002071453490000152
扩增程序为：95℃10min,(95℃15s,60℃60s)*40个循环,溶解曲线分析。反应在ABI StepOne Plus Real Time PCR仪上进行。
数据处理以核酸量为X轴，以Ct为Y轴，绘制标准曲线(如图3所示)。检测生物标志物sno-lncRNA1特性引物对sno-lncRNA1-qF1和sno-lncRNA1-qR1、检测生物标志物sno-lncRNA2特性引物对sno-lncRNA2-qF4和sno-lncRNA2-qR4、检测生物标志物sno-lncRNA3特性引物对sno-lncRNA3-qF4和sno-lncRNA3-qR4、检测生物标志物sno-lncRNA4特性引物对sno-lncRNA4-qF4和sno-lncRNA4-qR4以及检测生物标志物sno-lncRNA5特性引物对sno-lncRNA5-qF1和sno-lncRNA5-qR1PCR扩增反应效率在90％-110％的理想窗口内，同时也确定了实时荧光定量PCR可测量的模板量的范围，反映了样本检测的灵敏度；R2>0.99证明了其有极佳的相关度，样品具有极高的可重复性。
表2
Figure BDA0002071453490000161
实施例4测定分子标志物在小胖威利综合征阳性对照品和阴性对照品中的差异表达
将WT H9细胞作为阳性对照，H9P-KO细胞作为阴性对照，两种细胞均来自发明人前期研究成果(http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.10.007)。发明人首次将以上两种细胞用于小胖威利综合征检测相关实验。
以上两种细胞的培养条件及方法、RNA抽提方法和RNA反转录反应体系及条件同实施例2。以上述cDNA为模板，分别采用检测生物标志物sno-lncRNA1特性引物对sno-lncRNA1-qF1和sno-lncRNA1-qR1、检测生物标志物sno-lncRNA2特性引物对sno-lncRNA2-qF4和sno-lncRNA2-qR4、检测生物标志物sno-lncRNA3特性引物对sno-lncRNA3-qF4和sno-lncRNA3-qR4、检测生物标志物sno-lncRNA4特性引物对sno-lncRNA4-qF4和sno-lncRNA4-qR4以及检测生物标志物sno-lncRNA5特性引物对sno-lncRNA5-qF1和sno-lncRNA5-qR1，进行实时荧光定量PCR分析。实时荧光定量PCR反应体系及条件同实施例2。从图4中可以看出，sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4和sno-lncRNA5在阴性对照品中的表达量明显低于阳性对照品。
实施例5分析sno-lncRNAs对小胖威利综合征的临床检测
5.1全血样品采集及RNA的抽提
全血样品采集自浙江大学医学院附属儿童医院，采集时间为2018年7月。小胖威利综合征患者全血样品7例，正常人全血样品4例，对应作为小胖威利综合征组与正常对照组。上述所有标本的取得均获得试验对象同意及均通过组织伦理委员会的批准。
取新鲜抗凝血液按1:3的比例加入血液RNA稳定剂(TIANGEN)(如取300μl健康人新鲜全血加入900μl血液RNA稳定剂)立即盖上管盖，上下颠倒混匀8-10次，室温放置2h。利用RNAprep Pure血液总RNA提取试剂盒(TIANGEN)抽提全血RNA(详细步骤及注意事项参考RNAprep Pure血液总RNA提取试剂盒说明书)。
5.2RNA反转录
RNA反转录反应体系及条件同实施例2。
5.3实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR反应以上述cDNA为模板，其他反应体系及条件同实施例4.
从图5中可以看出，sno-lncRNA2、sno-lncRNA3和sno-lncRNA4在小胖威利综合征组中的表达量明显低于正常对照组，利用T检验(t-test)，sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4和sno-lncRNA5的P值小于0.05，证明有显著性差异。如图6所示，我们进一步通过受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC)评估sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3和sno-lncRNA4区分小胖威利综合征组和正常组时的敏感性和特异性，结果表明它们的曲线下面积(Area under Curve Roc，AUC)都为1，sno-lncRNA5的曲线下面积为0.96，具有极高的灵敏性和特异性，近似“金标准”。上述实验表明，本发明提供的标志物sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4和sno-lncRNA5用于检测小胖威利综合征的检测性能优异，准确度和灵敏度高，特异性强，能够用于开发成小胖威利综合征的检测试剂盒。
实施例6检测干血斑来源样品中sno-lncRNA3以诊断小胖威利综合征
6.1样品采集及RNA抽提
血样样品浙江大学医学院附属儿童医院，按照干血斑样品制备及保存要求制备干血斑样品。正常人干血斑样品4例，小胖威利综合征患者干血斑样品4例。上述所有标本的取得均获得试验对象同意及均通过组织伦理委员会的批准。
将干血斑用放入RNAse free 1.5mL离心管中，加入0.5mL Trizol，室温静置30min，震荡摇匀，5min。加入0.1mL的氯仿，震荡摇均匀，4℃离心，12000r/min，15min；取150μL上清液移至新的1.5mL离心管中，加入等体积预冷异丙醇，加入1μL GLYCOGEN，-20°/-80°静置20min后，12000r/min 4℃离心15min，弃上清；向沉淀中加入100μL的预冷75％乙醇漂洗沉淀，12000r/min 4℃离心15min，弃上清；重复清洗一次后，12000r/min 4℃离心，10sec，用枪吸去残液，室温干燥，约5min；干燥后，加入10μL RNase-free water进行溶解。
6.2 RNA反转录
取上述RNA 4μL加入RNAase free八连管中，加入4μL RNase-free water，加入2μL5X PrimeScript RT Master Mix，混匀离心，37°，15min，85°，5sec。加入10μL RNase-freewater，将cDNA稀释1倍。
6.3实时荧光定量PCR检测
以步骤6.2中所得cDNA为模板，采用检测生物标志物sno-lncRNA3特性引物对sno-lncRNA3-qF4和sno-lncRNA3-qR4，进行进行实时荧光定量PCR分析。
具体地，取上述cDNA 0.5μL/靶基因，THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Toyobo)5.2μL/靶基因，10μM检测引物0.4μL/靶基因，5.2μL RNase-free water。扩增程序为：95℃10min,(95℃15s,60℃60s)*40个循环,溶解曲线分析。反应在ABI StepOne Plus RealTime PCR仪上进行。从图7中可以看出，ssno-lncRNA3在正常人干血斑对照品中的表达量明显高于小胖威利综合征患者干血斑样品。也就是说，ssno-lncRNA3在小胖威利综合征组干血斑中的表达量明显低于正常人干血斑对照品。利用T检验(t-test)sno-lncRNA3的P值小于0.05，证明有显著性差异。我们进一步通过受试者工作特征曲线(Receiver operatingcharacteristic curve，ROC)评估干血斑中的sno-lncRNA3在区分小胖威利综合征组和正常组时的敏感性和特异性，结果如图8所示，曲线下面积(Area under Curve Roc，AUC)为1，具有极高的灵敏性和特异性，近似“金标准”。上述实验表明，本发明提供的标志物sno-lncRNA3应用于干血斑样本检测小胖威利综合征的检测性能优异，准确度和灵敏度高，特异性强，能够用于开发成针对干血斑样本的小胖威利综合征的检测试剂盒。
综上所述，本发明能够应用于新生儿小胖威利综合征筛查。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 小胖威利综合征长非编码RNA标记物及检测试剂
<150> 2018111899739
<151> 2018-10-12
<160> 55
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2003
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uggaucgaug augaguccuc caaaaaaaac auuccuugga aaagcugaac aaaaugagug 60
aaaacucaua ccgucauucu caucggaacu gagguccagc acauugcuuc cucuggggcc 120
uuuacuagug agggacaacu uccacuaguc ccuauagguu cuaacaccca uggcguucac 180
aggugaaggu cuccugucau auuacaaaca uuccccccac uccccuccca aaaaaaggaa 240
cauuuccucu gugucaggua cacaggucag agagucauag ggugacuggc ugcucuguga 300
uggcauagug gccguggaag uggauggaaa ugucgcaggc uuaggggagu guggggcugg 360
ccucggcuug gugagcuccc aggaaggggg accuggaaau cgcugcgggc auccuugcau 420
agaggaccag guacguguuc caguucugcu uucaaggaga gcaugaggcc caggccucag 480
acaguccuug gucuugaucu uugguuagcu gaggacaggg gagugccaag ggugauaggg 540
gagagcgcac agcaauggau guuguggcag acagcuaaag ccuuucuguc ccuccuuuca 600
cggucagucc cagggggccc ccagcacaga cuuuuuucac cucucgagcu gugagauucc 660
ugugguguug uggccaagcc ugggcaggaa gguaccccag agaaaagguu guagagggcu 720
cacguggaca ugcaugccau caguggucuu gggcugucau uuggugguga ugggcuuucc 780
agggauuucu cugguggaug acagguuggc cauugggggu cuucaagggc agguccuagg 840
gagcaugagg gucgggcuga ugccuguggu ccugggucac uccauucuuc cuggcagagu 900
aguagaagug uccaucuucc uggaaauggu cucuuggccc gccauugcca ggcggcccca 960
ccugcugcag cucgugugag caaauacugc ucuggauccc auuucccgcu uugaaagcag 1020
cuuccauccc aaaggcgucc agagggaaug ugcccuggcc cuggcccugg ccugggacuc 1080
uccgaugggg uccagucaca cuuggcguau ucauggaggu ccuugugcau uccaggcaac 1140
acaugugcaa uaccaggggc acugccgugg agagucucuu gauuugggau gccuccucgc 1200
cuuugugugu uggcgauguu ccaguauugg auucugcuac auccucaggg caaugaagcg 1260
uuucagcuca cuuagccggu uugacaucau agugcagcca ggacagccgu gccacauugg 1320
cauggcacau aguugacuua ggacagucgg aaaggguugg ugguucuaug ucucgcagcu 1380
cacuucauag cuguuugcau guaaaccugg ugaugguguu gagauggugu ugacuugcug 1440
acguuggggu gguugguagu gcaguuaagu uggcugcaug augggauguu gccucagaug 1500
ucggugcagc gaagcccugu aggugugucc aaugcaagga aaaugaaagg uggugugucc 1560
uguccaccuu gucuuuaggg guucaggcag gaauguccug uuggaaaacu agccauuccc 1620
uuuguguguc cugaaggcau ggugcgggca ugugaacuga uuggaggaag gaagugugug 1680
ucuugagguc cuuuggcugg guucagaaga cugucucugg ccuugaugcc gugugccgug 1740
uuuaagacca acgugguggc cauugcaaag gugccuucca gugcaaguuu ugguugguuu 1800
ggugucaggu gugccuuacc ugggagagcg gcgagagaca gugucugguc acgacauuau 1860
augccccgua aggaggacug ugugcuugca ccgccagggg ugcuggcugu uagucgaggg 1920
acaucaggcc aaugucuguc ugaccccuag gucaaaauuc gcauccuacu gauugaaggc 1980
cuugggucuc gagccuuuug guu 2003
<210> 2
<211> 1191
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uggaccaaug augacuucca uacaugcauu ccuuggaaag cugaacaaaa ugagugggaa 60
cucuguacua ucaucuuagu ugaacugagg uccaccgggg gcuauagagg gacaacuguc 120
auuuuuuuug augcccguug caugaagcau ucuuccaggc uuaggaaggg auuccguuug 180
ggugaaggag agucacaggg gaguugaggc uaugugcaca ggacuucugu cuacaaggcu 240
gggguagcac acaugcaguc cgugggacua ggugaaugug cagguugcuc agggagaguu 300
aaccuguagc cugccucugg guggccaaga uuguccuuga cuccuggcuc uggguuccca 360
caaccccugg aggaagacaa guaauugugc uugggaagag agaacaaggc cauacuuuug 420
ccuuucuuuu uuucauucuu aguuugagaa caguggaguu ccaaucaccu ggcauagcuu 480
ucauguugug uuccaugcau ugugaguaca ugcauauggc aggaacacac agguucccac 540
ugcaagcuga gccugauagg caaggagucu cuagcuuaac cccagcccag uguacgucaa 600
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auguaagggu guugagaggg augcucaaug ucagugcucu uuagugugcu gaugcacuac 720
uacaagggca ccugagcccu uguccaugca uuucuguguc caaaaucagg uaaagccaga 780
guuggguauc aaccagauac acugcagggg aucagaggac auggccuuug uguacugcac 840
aucugucaga uuuucucaag cacacccgug uuuccucuuc accucccacg uggaagugau 900
gaauuggcca ggaccauguu ggugagggac aaucaucauc ucauguuaac cucagagaag 960
ccaggaagcu ccuggacaca caugguguag gcuuccuugg aggcuguugg aucucuccug 1020
aauguaagca auuccuuccc agugcacccu gauuuuccuc auuugcagaa acaaagauug 1080
uguguggauc gaugaugacu uccauauaua cauuccuugg aaagcugaac aaaaugagug 1140
aaaacucuau accgucauuc ucgucgaacu gagguccagc acauuacucc a 1191
<210> 3
<211> 1249
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uggaucgaug augacuuccu uauauacauu ccuuggaaag cugaacaaaa ugagugaaaa 60
cucuauaccg ucauccucgu cgaacugagg uccagcacau ugcucuuaca ggggcuagag 120
agagagggac aaauuucauu ugaugaugcc cauugcacca agggguucug uccaggcuua 180
ggaugggguc ucguuugggc aaaggagaau ggcaggggag uggaggcuau guacacagga 240
gauuccuugu uugaaggacu cuauuuguga ggccagggua ccacacaugc uguccgcagg 300
aguaggugaa ugugcaguug cccaggaaga guuagccugu agccugccuc ugcauggcag 360
uuuguccuug gguccuggcu cuggauuucc auguuccuug gaggaggaua ggugauuuug 420
cuugagaaga cagcacagua ccauacuuuu guuguuuuuc ugcucauuuc aucguccauu 480
gaggacaaug aaguuguggu cagcaggcau agcuuucagg ccagcgugcc cauguugugu 540
cccaugcauu gugagcacau gcauguggca ugaacacaua ggcugccacu ccaagcugag 600
ucugauaggc aaugagacuc uggcuuaucc ugaucccggu guagaucaaa gucuucccag 660
uaggauugca uggccccgag gcuauuguga gcugcauugc agguguggaa gcaagggugu 720
ugagagggau gcucaacauu agugcucuuu agcgagauga ugcacuauaa gggcacccug 780
aacccagacg ugcaucccua uguacgugca uuucuguguc cauaaauagu ugaagccaga 840
cagccagauu ccagauguau cgcagggggc uggaugacau ggcccuuguc accuguguac 900
cugucugccu uucugaagca cgcuuguguu uccucuacac cucccaggua gcauuggcau 960
ggaaggcagg cccauguugg ugagggacaa uuguuaucuu gugugagccg cagggauacc 1020
aggaaacccc uggacacaaa uggcaaaggc uucuuuggaa guuguuggau cccuucugca 1080
uguaagcagu ucuuucccag agcgcucuga uuuuccucau uugcagggac aaacacugug 1140
cguggaucga ugaugacuuc cauauauaca uuccuuggaa agcugaacaa aaugagugaa 1200
aacucuauac cgucauccuc gucgaacuga gguccagcac auuacucca 1249
<210> 4
<211> 1249
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uggaucgaug augacuucca uauauacauu ccuuggaaag cugaacaaaa ugagugaaaa 60
cucuauacug ucauccucgu cgaacugagg uccagcacau uacuccaaca ggggcuagac 120
agagaaggcc aacauccguu uguugacaug gguuauauca aggcgucugu ucaggcuuag 180
aauguggucu cuuaugggug auggggguca caggagagug guggcuccca uguauaggaa 240
auuucuuguu ugaaggacug ucagugaggg uggguaacac augcauuguc ugcaggacua 300
ggugaauguc cauguggccu agcaagaguu agcugguagc ccgccucugg uugccaauuu 360
guucuugagu ccuuguucug gguucucagg ucccacggag gaaaacagau cugugugguu 420
gagagguggg uacaaggccg caucuuuguc auuuguuggc uaacuuuguc cuugguugag 480
gacauuagag uuuuggucac caggcauagc cuaugugccu uugugcccgu guuguauccc 540
acguguuuug aggacaugua uuuugcacgu aaaggugagc uccugcucca agcugguucu 600
gauaccaaag gagucccugg cuuauccuaa acucauggua gguuaaagcc uuccuccuua 660
gggguucagg gccgcaaggc uuuugugagu ggcauugcag gcguugaagc agugauguug 720
agagggaugg ucaaugucag ugcucuuuag caggauggug uacugcaggg gcccccagcc 780
ccgagacgag caucccugca uccaugcauu ucugccucca ugaacagggg aggccagaga 840
caggcagaua guagauaaau ugcaggggac uggaugacau ggcccucgug accugugcac 900
cugucugucu uucugaagca cgccuguguu aacucugcac cucccaggua gcacuggcau 960
ggagggcagg cacauguugg ugagggacaa uuguuaccuu gugugagcug cggagauacc 1020
aggaagcccc uggacacaaa uggcaaaggc uccuucggaa guuguuggau cccuucugaa 1080
uguaagcacu ucuuucccag agcacucuga guuuccucau uugcagggac aaauacugug 1140
cguggaucga ugaugacuuc cacauauaca uuccuuggaa agcugaacaa aaugagugaa 1200
aacucuauac cgucauccuc gucgaacuga gguccagcac auuacucca 1249
<210> 5
<211> 2003
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uggaucgaug augacuauaa aaaaaaugga ucucaucgga aucugaacaa aaugagugac 60
caaaucauuu cugugccacu ucugugagcu gagguccagc acugggacca ugccaggcaa 120
acaugaggag ggaguuuaca gggacuaggg uauuggaaaa cuaaccuacc cauauauauu 180
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ccaaagauac uaaugagauu uuacuuuuuu uuuugagaug gagucucauu cuguugccca 480
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uaauuuuugu guuuguagua gagauggagu uucaccauau uggccaagcu ggucucgaac 660
ucccaaccuc aggugaucca gccacugcag ccucucaaag uguugggauu acaggcauga 720
gccgccgugc ccggccuuac uuuuuauuuu caauuaagug aaacaauuac auggaaauug 780
aaaaaaaaaa aagguacucu aaguagacua cucuagugua uuuuaauuuu cuugccaauu 840
cagccacuag gauuguguca cuuguuuuuu ugauuuuagu uuuucguauc aaaaagcaaa 900
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aaauagugug ggucagcaug ucc 2003
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaattcgca tcctactgat tg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagtgagtgt gtctatgtgt at 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tattcatgaa gatggaggtc tg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaagaaatca aatgcatgct tg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caagcatgca tttgatttct tt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttgcaggtct caaaattcaa aa 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagacacata cacatagaca ca 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catgaatata cctgacccat gt 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgtccttgac tcctggctct 20
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<212> DNA
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atgccaggtg attggaactc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcacaaaag ctacagggcc 20
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cgtgcatccc tatgtacgtg 20
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ctggctctgg atttccatgt 20
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gtggaagcaa gggtgttgag 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctggaatct ggctgtctgg 20
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acaccgggat caggataagc 20
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aggccagaga caggcagata 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttaacacagg cgtgcttcag 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aactctgcac ctcccaggta 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgctctggg aaagaagtgc 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcaatgccac tcacaaaagc 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
attggaaaac taacctaccc at 22
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<211> 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaataacgt cccatgaatc tc 22
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<212> DNA
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ttatagaaac agctggtaga cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgctcattg accagataat tc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagattcatg ggacgttatt tc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
atctttggat ttggatgttg ac 22
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcaacatcc aaatccaaag at 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ctccatctct actacaaaca ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaaactagc cattcccttt g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctttgcagg tctcaaaatt caaaaga 27
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aggcttagga agggattccg 20
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<212> DNA
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<400> 49
atcagggtgc actgggaagg 20
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ggatggggtc tcgtttgggc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggaaaatcag agcgctctgg 20
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gaaactcaga gtgctctggg 20
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acaaaatgag tgaccaaatc attt 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gtgaaactcc atctctacta ca 22

Claims (19)

1.sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4和sno-lncRNA5中的任意一个或多个联合用于制备或筛选小胖威利综合征检测试剂的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4、sno-lncRNA5中的任意一个或多个联合作为生物标志物。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述小胖威利综合征检测试剂用于小胖威利综合征的判断、诊断；(2)所述小胖威利综合征检测试剂适用于检测新鲜血液样本或干血斑样本。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述小胖威利综合征检测试剂包括以下之任一项或多项：(1)特异性识别sno-lncRNA1的试剂、(2)特异性识别sno-lncRNA2的试剂、(3)特异性识别sno-lncRNA3的试剂、(4)特异性识别sno-lncRNA4的试剂和(5)特异性识别sno-lncRNA5的试剂。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述特异性识别sno-lncRNA1的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA1的引物对；(2)所述特异性识别sno-lncRNA2的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA2的引物对；(3)所述特异性识别sno-lncRNA3的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA3的引物对；(4)所述特异性识别sno-lncRNA4的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA4的引物对；(5)所述特异性识别sno-lncRNA5的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA5的引物对。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：
(1)特异性扩增sno-lncRNA1的引物对包括序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物sno-lncRNA1-qF1和序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物sno-lncRNA1-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.8所示的上游引物sno-lncRNA1-qF2和序列如SEQ ID NO.9所示的下游引物sno-lncRNA1-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.10所示的上游引物sno-lncRNA1-qF3和序列如SEQ ID NO.11所示的下游引物sno-lncRNA1-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.12所示的上游引物sno-lncRNA1-qF4和序列如SEQ ID NO.13所示的下游引物sno-lncRNA1-qR4；
(2)特异性扩增sno-lncRNA2的引物对包括序列如SEQ ID NO.14所示的上游引物sno-lncRNA2-qF1和序列如SEQ ID NO.15所示的下游引物sno-lncRNA2-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.16所示的上游引物sno-lncRNA2-qF2和序列如SEQ ID NO.17所示的下游引物sno-lncRNA2-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.18所示的上游引物sno-lncRNA2-qF3和序列如SEQ ID NO.19所示的下游引物sno-lncRNA2-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.20所示的上游引物sno-lncRNA2-qF4和序列如SEQ ID NO.21所示的下游引物sno-lncRNA2-qR4；
(3)特异性扩增sno-lncRNA3的引物对包括序列如SEQ ID NO.22所示的上游引物sno-lncRNA3-qF1和序列如SEQ ID NO.23所示的下游引物sno-lncRNA3-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.24所示的上游引物sno-lncRNA3-qF2和序列如SEQ ID NO.25所示的下游引物sno-lncRNA3-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.26所示的上游引物sno-lncRNA3-qF3和序列如SEQ ID NO.27所示的下游引物sno-lncRNA3-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.28所示的上游引物sno-lncRNA3-qF4和序列如SEQ ID NO.29所示的下游引物sno-lncRNA3-qR4；
(4)特异性扩增sno-lncRNA4的引物对包括序列如SEQ ID NO.30所示的上游引物sno-lncRNA4-qF1和序列如SEQ ID NO.31所示的下游引物sno-lncRNA4-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.32所示的上游引物sno-lncRNA4-qF2和序列如SEQ ID NO.33所示的下游引物sno-lncRNA4-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.34所示的上游引物sno-lncRNA4-qF3和序列如SEQ ID NO.35所示的下游引物sno-lncRNA4-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.36所示的上游引物sno-lncRNA4-qF4和序列如SEQ ID NO.37所示的下游引物sno-lncRNA4-qR4；
(5)特异性扩增sno-lncRNA5的引物对包括序列如SEQ ID NO.38所示的上游引物sno-lncRNA5-qF1和序列如SEQ ID NO.39所示的下游引物sno-lncRNA5-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.40所示的上游引物sno-lncRNA5-qF2和序列如SEQ ID NO.41所示的下游引物sno-lncRNA5-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.42所示的上游引物sno-lncRNA5-qF3和序列如SEQ ID NO.43所示的下游引物sno-lncRNA5-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.44所示的上游引物sno-lncRNA5-qF4和序列如SEQ ID NO.45所示的下游引物sno-lncRNA5-qR4。
7.特异性识别sno-lncRNA1的试剂、特异性识别sno-lncRNA2的试剂、特异性识别sno-lncRNA3的试剂、特异性识别sno-lncRNA4的试剂和特异性识别sno-lncRNA5的试剂中的任一项或多项联合用于制备小胖威利综合征检测试剂盒的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，sno-lncRNA1、sno-lncRNA2、sno-lncRNA3、sno-lncRNA4和sno-lncRNA5中的任意一个或多个联合作为生物标志物。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述小胖威利综合征检测试剂盒用于小胖威利综合征的判断、诊断；(2)所述小胖威利综合征检测试剂适用于检测新鲜血液样本或干血斑样本。
10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述特异性识别sno-lncRNA1的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA1的引物对；(2)所述特异性识别sno-lncRNA2的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA2的引物对；(3)所述特异性识别sno-lncRNA3的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA3的引物对；(4)所述特异性识别sno-lncRNA4的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA4的引物对；(5)所述特异性识别sno-lncRNA5的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA5的引物对。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)特异性扩增sno-lncRNA1的引物对包括序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物sno-lncRNA1-qF1和序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物sno-lncRNA1-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.8所示的上游引物sno-lncRNA1-qF2和序列如SEQ ID NO.9所示的下游引物sno-lncRNA1-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.10所示的上游引物sno-lncRNA1-qF3和序列如SEQ ID NO.11所示的下游引物sno-lncRNA1-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.12所示的上游引物sno-lncRNA1-qF4和序列如SEQ ID NO.13所示的下游引物sno-lncRNA1-qR4；
(2)特异性扩增sno-lncRNA2的引物对包括序列如SEQ ID NO.14所示的上游引物sno-lncRNA2-qF1和序列如SEQ ID NO.15所示的下游引物sno-lncRNA2-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.16所示的上游引物sno-lncRNA2-qF2和序列如SEQ ID NO.17所示的下游引物sno-lncRNA2-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.18所示的上游引物sno-lncRNA2-qF3和序列如SEQ ID NO.19所示的下游引物sno-lncRNA2-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.20所示的上游引物sno-lncRNA2-qF4和序列如SEQ ID NO.21所示的下游引物sno-lncRNA2-qR4；
(3)特异性扩增sno-lncRNA3的引物对包括序列如SEQ ID NO.22所示的上游引物sno-lncRNA3-qF1和序列如SEQ ID NO.23所示的下游引物sno-lncRNA3-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.24所示的上游引物sno-lncRNA3-qF2和序列如SEQ ID NO.25所示的下游引物sno-lncRNA3-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.26所示的上游引物sno-lncRNA3-qF3和序列如SEQ ID NO.27所示的下游引物sno-lncRNA3-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.28所示的上游引物sno-lncRNA3-qF4和序列如SEQ ID NO.29所示的下游引物sno-lncRNA3-qR4；
(4)特异性扩增sno-lncRNA4的引物对包括序列如SEQ ID NO.30所示的上游引物sno-lncRNA4-qF1和序列如SEQ ID NO.31所示的下游引物sno-lncRNA4-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.32所示的上游引物sno-lncRNA4-qF2和序列如SEQ ID NO.33所示的下游引物sno-lncRNA4-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.34所示的上游引物sno-lncRNA4-qF3和序列如SEQ ID NO.35所示的下游引物sno-lncRNA4-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.36所示的上游引物sno-lncRNA4-qF4和序列如SEQ ID NO.37所示的下游引物sno-lncRNA4-qR4；
(5)特异性扩增sno-lncRNA5的引物对包括序列如SEQ ID NO.38所示的上游引物sno-lncRNA5-qF1和序列如SEQ ID NO.39所示的下游引物sno-lncRNA5-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.40所示的上游引物sno-lncRNA5-qF2和序列如SEQ ID NO.41所示的下游引物sno-lncRNA5-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.42所示的上游引物sno-lncRNA5-qF3和序列如SEQ ID NO.43所示的下游引物sno-lncRNA5-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.44所示的上游引物sno-lncRNA5-qF4和序列如SEQ ID NO.45所示的下游引物sno-lncRNA5-qR4。
12.一种小胖威利综合征检测试剂盒，所述试剂盒中包括以下之任一项或多项：(1)特异性识别sno-lncRNA1的试剂、(2)特异性识别sno-lncRNA2的试剂、(3)特异性识别sno-lncRNA3的试剂、(4)特异性识别sno-lncRNA4的试剂和(5)特异性识别sno-lncRNA5的试剂。
13.根据权利要求12所述的小胖威利综合征检测试剂盒，其特征在于，包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述小胖威利综合征检测试剂盒用于小胖威利综合征的判断、诊断；(2)所述小胖威利综合征检测试剂适用于检测新鲜血液样本或干血斑样本。
14.根据权利要求12所述的小胖威利综合征检测试剂盒，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述特异性识别sno-lncRNA1的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA1的引物对；(2)所述特异性识别sno-lncRNA2的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA2的引物对；(3)所述特异性识别sno-lncRNA3的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA3的引物对；(4)所述特异性识别sno-lncRNA4的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA4的引物对；(5)所述特异性识别sno-lncRNA5的试剂选自特异性扩增sno-lncRNA5的引物对。
15.根据权利要求14所述的小胖威利综合征检测试剂盒，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)特异性扩增sno-lncRNA1的引物对包括序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物sno-lncRNA1-qF1和序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物sno-lncRNA1-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.8所示的上游引物sno-lncRNA1-qF2和序列如SEQ ID NO.9所示的下游引物sno-lncRNA1-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.10所示的上游引物sno-lncRNA1-qF3和序列如SEQ ID NO.11所示的下游引物sno-lncRNA1-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.12所示的上游引物sno-lncRNA1-qF4和序列如SEQ ID NO.13所示的下游引物sno-lncRNA1-qR4；
(2)特异性扩增sno-lncRNA2的引物对包括序列如SEQ ID NO.14所示的上游引物sno-lncRNA2-qF1和序列如SEQ ID NO.15所示的下游引物sno-lncRNA2-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.16所示的上游引物sno-lncRNA2-qF2和序列如SEQ ID NO.17所示的下游引物sno-lncRNA2-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.18所示的上游引物sno-lncRNA2-qF3和序列如SEQ ID NO.19所示的下游引物sno-lncRNA2-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.20所示的上游引物sno-lncRNA2-qF4和序列如SEQ ID NO.21所示的下游引物sno-lncRNA2-qR4；
(3)特异性扩增sno-lncRNA3的引物对包括序列如SEQ ID NO.22所示的上游引物sno-lncRNA3-qF1和序列如SEQ ID NO.23所示的下游引物sno-lncRNA3-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.24所示的上游引物sno-lncRNA3-qF2和序列如SEQ ID NO.25所示的下游引物sno-lncRNA3-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.26所示的上游引物sno-lncRNA3-qF3和序列如SEQ ID NO.27所示的下游引物sno-lncRNA3-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.28所示的上游引物sno-lncRNA3-qF4和序列如SEQ ID NO.29所示的下游引物sno-lncRNA3-qR4；
(4)特异性扩增sno-lncRNA4的引物对包括序列如SEQ ID NO.30所示的上游引物sno-lncRNA4-qF1和序列如SEQ ID NO.31所示的下游引物sno-lncRNA4-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.32所示的上游引物sno-lncRNA4-qF2和序列如SEQ ID NO.33所示的下游引物sno-lncRNA4-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.34所示的上游引物sno-lncRNA4-qF3和序列如SEQ ID NO.35所示的下游引物sno-lncRNA4-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.36所示的上游引物sno-lncRNA4-qF4和序列如SEQ ID NO.37所示的下游引物sno-lncRNA4-qR4；
(5)特异性扩增sno-lncRNA5的引物对包括序列如SEQ ID NO.38所示的上游引物sno-lncRNA5-qF1和序列如SEQ ID NO.39所示的下游引物sno-lncRNA5-qR1；或者
包括序列如SEQ ID NO.40所示的上游引物sno-lncRNA5-qF2和序列如SEQ ID NO.41所示的下游引物sno-lncRNA5-qR2；或者
包括序列如SEQ ID NO.42所示的上游引物sno-lncRNA5-qF3和序列如SEQ ID NO.43所示的下游引物sno-lncRNA5-qR3；或者
包括序列如SEQ ID NO.44所示的上游引物sno-lncRNA5-qF4和序列如SEQ ID NO.45所示的下游引物sno-lncRNA5-qR4。
16.根据权利要求12所述的小胖威利综合征检测试剂盒，其特征在于，所述小胖威利综合征检测试剂盒还包括对照，所述对照包括(6)小胖威利综合征阳性对照品和/或(7)小胖威利综合征阴性对照品。
17.根据权利要求16所述的小胖威利综合征检测试剂盒，其特征在于，还包括以下特征中的一项或两项：(1)所述阳性对照品为WT H9细胞；(2)阴性对照品为H9 P-KO细胞。
18.根据权利要求12所述的小胖威利综合征检测试剂盒，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：(1)用于检测特异性扩增sno-lncRNA1的引物对扩增反应效率的引物对、(2)用于检测特异性扩增sno-lncRNA2的引物对扩增反应效率的引物对、(3)用于检测特异性扩增sno-lncRNA3的引物对扩增反应效率的引物对、(4)用于检测特异性扩增sno-lncRNA4的引物对扩增反应效率的引物对、(5)用于检测特异性扩增sno-lncRNA5的引物对扩增反应效率的引物对。
19.根据权利要求18所述的小胖威利综合征检测试剂盒，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)用于检测特异性扩增sno-lncRNA1的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如SEQ ID NO.46所示的上游引物sno-lncRNA1-L和序列如SEQ ID NO.47所示的下游引物sno-lncRNA1-R；(2)用于检测特异性扩增sno-lncRNA2的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如SEQ ID NO.48所示的上游引物sno-lncRNA2-L和序列如SEQ ID NO.49所示的下游引物sno-lncRNA2-R；(3)用于检测特异性扩增sno-lncRNA3的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如SEQ ID NO.50所示的上游引物sno-lncRNA3-L和序列如SEQ IDNO.51所示的下游引物sno-lncRNA3-R；(4)用于检测特异性扩增sno-lncRNA4的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如SEQ ID NO.52所示的上游引物sno-lncRNA4-L和序列如SEQ ID NO.53所示的下游引物sno-lncRNA4-R；(5)用于检测特异性扩增sno-lncRNA5的引物对的扩增反应效率的引物对序列包括如SEQ ID NO.54所示的上游引物sno-lncRNA4-L和序列如SEQ ID NO.55所示的下游引物sno-lncRNA5-R。
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