CN112029856A - 一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物及其应用 - Google Patents
一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112029856A CN112029856A CN202010802253.6A CN202010802253A CN112029856A CN 112029856 A CN112029856 A CN 112029856A CN 202010802253 A CN202010802253 A CN 202010802253A CN 112029856 A CN112029856 A CN 112029856A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- artificial synthesis
- primer
- lung cancer
- colorectal cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提出了一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物，包括103对引物或包含其中部分引物的组合，每对引物的正向引物与反向引物序列均包括扩增引物对，以及与所述扩增引物对5’端连接的其他序列；每对所述引物的正向引物与反向引物中的特异性序列选自SEQ ID NO.1～206所示的序列，优选地，为所述序列其中的18‑25个碱基序列。本发明精选22个肺癌或结直肠癌相关基因的突变热点区域，可检测低起始量或低质量的FFPE样本，也可检测ctDNA样本，满足肺癌、结直肠癌的早筛、诊断、用药、预后的一般需要。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物及其应用。
背景技术
下一代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)，又称二代测序技术，是近年来兴起的可以一次对数十万乃至数亿条DNA分子进行测序的高通量检测技术，目前已广泛地应用于产前检测，肿瘤突变分析和用药指导，病原体微生物筛查等领域。Illumina平台现在是国内最常用的NGS测序仪，市场占有率较高。Ion Torrent平台和国产的MGI平台也各自具有独特的优点，国内的应用比率也在稳步增长中。
进行NGS测序前，通常需要先对样本DNA的特定区域进行富集和扩增，这个过程称为文库构建。目前主流的建库技术包括两种：探针杂交捕获技术和多重PCR技术。杂交捕获技术的优点是探针序列的设计难度较低，一套探针库适合多种类型的样本，因此是国内主流的建库技术。但是杂交捕获的建库流程比较复杂，经常耗时需48小时甚至更长，而且整体成本高；同时由于建库之前通常需要对组织样本进行超声、酶解等预处理，因此对样本的起始量和质量都有较多的要求。
相比之下，多重PCR技术无需对样本进行预处理，较少量的样本或者一定程度降解的样本也可使用，适合临床上绝大部分情况；同时建库流程简单，数小时即可完成，总体成本也较低。但多重PCR技术对扩增引物池的设计提出了较高的要求，稍有差错就容易产生大量引物二聚体导致目的片段急剧减少，或者不得不分管操作，削弱了原本具有的优势。目前国内基于多重PCR的建库技术以转移Thermo Fisher(赛默飞)的AmpliSeq系列试剂为主，自研的产品尚处于空白状态。
肿瘤患者基因检测过程中，最常见的是样本类型是石蜡包埋样本(Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded，FFPE)。FFPE样本有以下一些特点：一是由于该型样本在制作过程中需要使用福尔马林处理，因此样本中的DNA或多或少都存在一定程度的片段化现象，制作过程中福尔马林处理时间过长，或者保存年限过久的样本，其片段化程度尤其严重；二是FFPE样本通常是由手术切离组织或者细针穿刺组织条制作而来，总量有限，使用时受到一定的限制。综上所述，如何克服FFPE样本输入量和质量的限制，是评判NGS检测技术的重要因素。
液体活检(Liquid Biopsy)是收集外周血中从肿瘤脱落的循环肿瘤细胞(CTC)、外泌体(Exosome)，或是提取肿瘤组织凋亡释放到血液中的循环肿瘤DNA(ctDNA)进行基因检测的技术。与传统的肿瘤组织手术取样或穿刺取样相比，液体活检具有创伤小，时效性高，能克服肿瘤异质性(可反映肿瘤整体而不仅是取样局部的信息)等特点，在癌症早筛、疗效评估、复发监测等领域可以发挥重要作用。
制备完成的文库在NGS测序之前还需要在末端连接上可被测序仪识别的DNA接头，其中含有测序引物结合位点，用于区分不同样本的Barcode，某些情况下还有区分样本中不同DNA分子的UID(unique identifier)等。其中UID片段是由6-18个随机碱基序列(A、G、C或T)组成的分子标记，在扩增ctDNA样本时，可以为每一条ctDNA分子带上不同的独特序列标记，减少由于扩增错误带来的测序背景噪音。由于各测序仪厂商加接头的原理、试剂、以及Barcode、UID片段的序列、长度都有所差别，故而设计在一种测序平台上使用的文库构建试剂(杂交捕获探针库/多重PCR引物池)通常不适合在其他平台上使用，造成了一定的不便。
发明内容
本发明的目的在于提出一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物及其应用，是根据NCCN指南、FDA/NMPA指南，结合多个权威数据库，精选22个肺癌或结直肠癌相关基因的突变热点区域，满足肺癌早筛、诊断、用药、预后的一般需要。扩增子的比对率、中靶率和均一度都较好。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物，包括103对引物或包含其中部分引物的组合，每对引物的正向引物与反向引物序列均包括扩增引物对，以及与所述扩增引物对5’端连接的其他序列；每对所述引物的正向引物与反向引物中的特异性序列选自SEQ ID NO.1～206所示的序列。
作为本发明的进一步改进，每对所述引物的正向引物与反向引物中的特异性序列为所述序列其中的18-25个碱基序列。
本发明所述的引物组合物共计206条，又分为两组各103条：第一组引物3’端DNA序列分别如SEQ ID 1～103所示，5’端DNA序列如SEQ ID 207所示；第二组引物3’端DNA序列分别如SEQ ID 104～206所示，5’端DNA序列如SEQ ID208所示，中间可选择性地连入6-18个碱基的UID序列。
该引物组合物可通过多重PCR的方法，特异性地扩增肺癌患者DNA样本中多个肺癌或结直肠癌相关基因的热点区域，可测的突变类型包括点突变(SNPs)和插入/缺失(In_dels)。该引物组合物的整体设计使得对低样本输入量和中重度片段化的FFPE样本的检测成为可能。引物组合物中的UID序列可使每条DNA分子具有唯一的分子标签，保证测序之后可以追溯到原始的DNA模板，从而降低背景噪音，排除假阳性突变。因此该引物组合物既可以检测肿瘤组织样本，又适用于液体活检。
作为本发明的进一步改进，所述扩增引物对的正向引物包括SEQ ID NO.207所示的序列，优选地，为所述序列其中的16-25个碱基序列。
作为本发明的进一步改进，所述扩增引物对的反向引物包括SEQ ID NO.208所示的序列，优选地，为所述序列其中的16-25个碱基序列。
本发明进一步保护一种上述的肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物在检测肺癌或结直肠癌突变基因中的应用。
本发明进一步保护一种用于肺癌或结直肠癌基因检测的试剂，包括上述的引物组合物。
作为本发明的进一步改进，还包括三对接头中的至少一对，所述三对接头分别对应Illumina、Ion Torrent、MGI三种测序平台，所述接头内部含有与上述的序列配对的DNA片段。
本发明的另一个目的在于提供一种试剂，包括上文所述的引物组合物，还包括三种接头。三种接头分别对应Illumina、Ion Torrent、MGI三种测序平台，3’端可分别与上述引物组合物中的部分序列匹配。利用这3种接头，结合通用扩增反应液以及对应的PCR反应程序，可以对引物组合物扩增肿瘤患者样本得到的产物分别加上对应平台的接头，达成一种试剂同时适用于三种主流NGS测序平台的效果。
作为本发明的进一步改进，所述试剂适用于新鲜或冰冻组织、FFPE、及外周血ctDNA的分子检测。
本发明进一步保护一种上述的试剂在基于NGS方法的肺癌或结直肠癌相关基因检测中的应用。
本发明具有如下有益效果：
1.本发明所述的引物组合物的设计，是根据NCCN指南、FDA/NMPA指南，结合多个权威数据库，精选22个肺癌或结直肠癌相关基因的突变热点区域，满足肺癌早筛、诊断、用药、预后的一般需要。扩增子的比对率、中靶率和均一度都较好。
2.本发明采用在引物组合物的反向引物中选择性地加入UID标记。检测组织样本时，一般不使用UID以进一步降低成本，灵敏度为2％。检测ctDNA样本时加入UID，能有效去除背景噪音，此时灵敏度最高可达到0.1％，实现肺癌及结直肠癌早筛、手术后疗效评估以及肺癌及结直肠癌复发监测。
3.本发明所述的试剂适用于来自肺癌及结直肠癌患者的新鲜或冰冻组织、FFPE、及外周血ctDNA等多种类型样本中相关基因的突变检测，且对样本的要求较低。单个患者的样本输入量可低至2.5ng(组织)或10ng(ctDNA)，对中重度片段化的FFPE样本也能有效地检测。
4.本发明所述的试剂可根据实际需求，通过更换接头和加接头反应程序无缝适应多种NGS测序平台，扩大了市场受众。
5.本发明所涉及方法简单，操作便捷，可在数小时内完成NGS文库构建，总体成本低，填补了国内肺癌及结直肠癌领域多重PCR技术构建NGS文库的空白。本发明有助于实现试剂从实验室向临床应用和体外诊断试剂的转化，具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明引物组合物中各引物的结构示意图；
图2为本发明测序平台接头的结构示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中，使用Qiagen公司的GeneRead DNAFFPE Kit(货号：180134)提取FFPE样本DNA；使用Qiagen公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(货号：55114)提取血浆ctDNA；使用Thermo Fisher公司的Qubit dsDNA HS Assay Kit(货号：Q32851/Q32854)对提取的DNA进行定量；使用Beckman Coulter公司的AgencourtAM Pure XP磁珠(货号：A63880)对文库构建过程中的各PCR步骤的产物进行纯化。
实施例1
本发明多重PCR建库测序流程采取的验证方法如下：
1.样本准备
1.1样本提取
提取Horizon公司商业化参考品Quantitative Multiplex Reference Standard和来自医院的临床样本，Qubit定量。
1.2样本质控
对来自医院的临床样本，使用KAPA公司的Human Genomic DNA Quantificationand QC Kit(货号：KK4960)对样本片段化程度进行分析；使用Bio-Rad Digital PCRAssays对样本部分基因热点的突变频率进行检测。
1.3样本设置
1.3.1参考品
Horizon参考品分别取20ng、5ng、2.5ng检测。
1.3.2临床样本
检测的临床样本如下表1，每例样本分别取20ng、2.5ng检测。
表1
| Q-129/41 | Q-305/41 | 备注 | |
| 样本A | 0.263 | 0.014 | 重度片段化FFPE样本 |
| 样本B | 0.545 | 0.125 | 中度片段化FFPE样本 |
| 样本C | 0.576 | 0.221 | 轻度片段化(高质量)阴性FFPE样本 |
注：根据KAPAHuman Genomic DNA Quantification and QC Kit说明书，Q-129/41>0.5，Q-305/41>0.2为高质量FFPE样本。
2.文库构建
2.1第一轮基因特异性PCR
2.1.1按下表2所示配制基因特异性PCR反应液，每管加入相应的DNA样本。
表2
2.1.2盖上管盖，震荡混匀后，快速离心。
2.1.3按以下表3程序运行PCR反应。
表3
2.2基因特异性PCR产物纯化
2.2.1各管从PCR仪中取出后快速离心将液体甩至管底。
2.2.2每管加入1.2倍体积的纯化磁珠，震荡混匀并快速离心。室温静置5分钟。
2.2.3将各管转移至磁力架上，室温放置5分钟或至液体澄清。小心吸去上清，注意避免碰到磁珠。
2.2.4每管加入150μL 70％乙醇清洗，孵育30秒后吸去乙醇，注意避免碰到磁珠。重复清洗一次。
2.2.5盖上管盖，将各管快速离心后放置于磁力架上，小心地将管中剩余的乙醇吸净。
2.2.6室温放置2-3分钟至磁珠干燥。各管加入64μL无核酶水，盖上管盖，震荡混匀并快速离心。
2.2.7将各管转移至磁力架上，室温放置5分钟。转移上清至新管中。
2.3第二轮加接头PCR
2.3.1按下表4所示配制加接头PCR反应液。
表4
2.3.2盖上管盖，震荡混匀后，快速离心。
2.3.3按以下表5程序运行PCR反应。
表5
2.4文库纯化和质控
2.4.1各管从PCR仪中取出后快速离心将液体甩至管底。
2.4.2每管加入1倍体积的纯化磁珠，震荡混匀并快速离心。室温静置5分钟。
2.4.3将各管转移至磁力架上，室温放置5分钟或至液体澄清。小心吸去上清，注意避免碰到磁珠。
2.4.4每管加入150μL 70％乙醇清洗，孵育30秒后吸去乙醇，注意避免碰到磁珠。重复清洗一次。
2.4.5盖上管盖，将各管快速离心后放置于磁力架上，小心地将管中剩余的乙醇吸净。
2.4.6室温放置2-3分钟至磁珠干燥。各管加入32μL无核酶水，盖上管盖，震荡混匀并快速离心。
2.4.7将各管转移至磁力架上，室温放置5分钟。转移上清至新管中。
2.4.8使用Qubit对文库进行定量；使用Qseq100对文库片段大小和纯度进行分析。
3.上机测序
3.1将各文库根据浓度统一稀释至5nM，各取少量等体积混合。
3.2加入等体积0.2N NaOH变性，再用HT1溶液稀释至15pM。
3.3取594μL 15pM混合文库，加入6μL 12.5pM PhiX library control。
3.4将上述600μL加样至测序试剂盒，装载入Illumina Miseq测序仪测序。测序读长PE150，测序深度不少于2000x。
4.检测结果
4.1参考品数据(表6)
表6
4.2临床样本数据(表7)
表7
样本C样本未测出致病突变。
4.3结果说明
(1)分别投入2.5、5、20ng参考品，使用实施例中方法都可成功建库，各组样本突变检出频率与理论值基本一致。
(2)2.5ng中重度片段化的临床样本也可成功建库，突变检测结果与20ng组相似，部分位点突变频率经ddPCR验证，2.5ng与20ng组基本一致。
实施例2
1.样本准备
提取Horizon公司商业化参考品Quantitative Multiplex Reference Standard，Qubit定量，取20ng检测。Horizon公司商业化参考品另取Tru-Q 7(1.3％Tier)ReferenceStandard 20ng检测。
2.文库构建
2.1第一轮基因特异性PCR
参见实施例1。
2.2基因特异性PCR产物纯化
参见实施例1。
2.3第二轮加接头PCR
2.3.1按下表8所示配制加接头PCR反应液。
表8
2.3.2盖上管盖，震荡混匀后，快速离心。
2.3.3按以下表9程序运行PCR反应。
表9
2.4文库纯化
参见实施例1。
3上机测序
3.1使用MGI Easy环化试剂盒(货号：1000005259)执行环化操作。
3.2根据标准操作步骤，将环化后的文库装载入MGISEQ-2000测序仪测序。测序读长PE100，测序深度不少于2000x。
4检测结果
4.1参考品数据(表10)
表10 Quantitative Multiplex Reference Standard
表11 Tru-Q 7(1.3％Tier)Reference Standard
4.2结果说明
本专利的引物组合物扩增产物通过改换接头和反应程序，可直接用于Illumina平台之外的测序仪。MGI平台检测参考品时，检出的各位点突变频率与理论值基本一致。
实施例3
1.样本准备
提取肺腺癌初诊患者血浆临床样本3例，分别取20ngDNA建库检测。
2.文库构建
2.1第一轮基因特异性PCR
2.1.1按下表12所示配制基因特异性PCR反应液，每管加入相应的DNA样本。
表12
2.1.2盖上管盖，震荡混匀后，快速离心。
2.1.3按以下表13程序运行PCR反应。
表13
2.1基因特异性PCR产物纯化
参见实施例1。
2.2第二轮加接头PCR
2.2.1按下表所示配制加接头PCR反应液。
表14
2.3.2盖上管盖，震荡混匀后，快速离心。
2.3.3按以下表15程序运行PCR反应。
表15
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 95℃ | 2分钟 | 1 |
| 95℃ | 30秒 | 5 |
| 66℃ | 30秒 | |
| 72℃ | 60秒 | |
| 72℃ | 5分钟 | 1 |
| 8℃ | Hold | 1 |
2.3文库纯化
参见实施例1。
3上机测序
3.1将各文库根据浓度统一稀释至5 nM，各取少量等体积混合。
3.2加入等体积0.2 N NaOH变性，再用HT1溶液稀释至25 pM。
3.3取594μL 25 pM混合文库，加入6μL 20 pM PhiX library control。
3.4将上述600μL加样至测序试剂盒，装载入Illumina Miseq测序仪测序。测序读长PE150，测序深度不少于10000x。
4检测结果
4.1临床样本数据(表16)
表16
4.2结果说明
三例临床样本均检出肺癌相关热点基因的突变，证实了试剂的检测效果。
与现有技术相比，本发明所述的引物组合物的设计，是根据NCCN指南、FDA/NMPA指南，结合多个权威数据库，精选22个肺癌或结直肠癌相关基因的突变热点区域，满足肺癌早筛、诊断、用药、预后的一般需要。扩增子的比对率、中靶率和均一度都较好。本发明采用在引物组合物的反向引物中选择性地加入UID标记。检测组织样本时，一般不使用UID以进一步降低成本，灵敏度为2％。检测ctDNA样本时加入UID，能有效去除背景噪音，此时灵敏度最高可达到0.1％，实现肺癌及结直肠癌早筛、手术后疗效评估以及肺癌及结直肠癌复发监测。本发明所述的试剂适用于来自肺癌及结直肠癌患者的新鲜或冰冻组织、FFPE、及外周血ctDNA等多种类型样本中相关基因的突变检测，且对样本的要求较低。单个患者的样本输入量可低至2.5ng(组织)或10ng(ctDNA)，对中重度片段化的FFPE样本也能有效地检测。本发明所述的试剂可根据实际需求，通过更换接头和加接头反应程序无缝适应多种NGS测序平台，扩大了市场受众。本发明所涉及方法简单，操作便捷，可在数小时内完成NGS文库构建，总体成本低，填补了国内肺癌及结直肠癌领域多重PCR技术构建NGS文库的空白。本发明有助于实现试剂从实验室向临床应用和体外诊断试剂的转化，具有良好的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海真固生物科技有限公司
<120> 一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物及其应用
<160> 208
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
tgcaaactct tgcacaaatg ctgaaagctg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
gtttcccact agcaccatag gtacatcatc 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
ggaagccttc gcctgtcctc atgtattggt 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
tctgtaagaa tcctgggggt gtggagggta 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
cgggctacca ctgggcctca cctctatggt 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 6
tttcacacca gcaagaacct gttggaaacc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 7
ttgacttgca caccctccat tttatcactc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 8
aggaagaaga gacatccaga tcctggatgt 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 9
ctcctggcct gagcagcatg acagaagggc 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 10
gagagtgcca ccaatggcta cattgagatc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 11
cagcctttcc ctgccaagtg attctagcat 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 12
acgaaaactc ccagaatttg ctccagggga 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 13
ctgcagcggt gttgtgaagc cagtccagcc 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 14
ctctcaggaa aagatgtggc tgtggaggag 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 15
tcatctctgt gaagtggagg gaatggaaaa 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 16
tctgtggtct acattttgaa ttttccttta 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 17
tctgtatcct cccaaggaat gattttctta 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 18
atctcaatca gtttctttcc cgccacgagc 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 19
tttaacaggg tgttgttgtg cacaggttat 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 20
tcaagaacag ccctattccc agctgtcaga 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 21
tcttgagggg ctgaggtgga agagacaggc 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 22
ggcagtttct ggcagcaatg tctctgggaa 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 23
ccgggcgagg gcgggtctct cggaggaagg 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 24
tttgctgcag agcagagagg gatgtaacca 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 25
tggggtgagg gtgtctctct gtggctttac 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 26
gaaggggagg gtggggagga ggaggaggct 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 27
cttacatttg accatgacca tgtaaacgtc 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 28
ctccaaaggt catcagttcc catatagtaa 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 29
cttggccagc aagaatgctt acccttgggt 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 30
cacacagttt gggccatctt taaaatgaga 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 31
gaaagatcaa attcccattg atcttggtac 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 32
attgagaaac ttatttttgg ccaataaatc 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 33
cttttgggca aatgtcagtg caaggtttac 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 34
ttaaaaaaaa aaaaaaggta aaataagcat 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 35
ttacttacgt ggacatttct tgacacagaa 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 36
acacatgctc cactgtcatt gaaattcatg 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 37
aatcaaatag ggaaggaaag gagagcagga 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 38
gtagcatctg ccgtcacatt gttctgcaca 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 39
agaacatttt gagaaattaa aaagaataat 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 40
tatcttgcca atgaatggtg tctgcataac 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 41
ataatgaaag catatttgcc attttggata 30
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 42
ttgtcccacg aataatgcgt aaattctcca 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 43
tatttatagc tgatttgatg gagttggaca 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 44
gtggtaaagg caatcctgag gaagaggatg 30
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 45
gtgttactca agaagcagaa agggaagaat 30
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 46
tacaatatcc tattctaaaa tgcaaataac 30
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 47
tcttattcca gacgcatttc cacagctaca 30
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 48
taaggtaaag tcaaatgctg atgcttatta 30
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 49
tttacatagg tggaatgaat ggctgaatta 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 50
aaaaactcct gattataccg ctgattgaat 30
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 51
ataatttaga ctagtgaata tttttctttg 30
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 52
ggcatgggga aatataaact tgtttgatta 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 53
agaacagctc aaagcaattt ctacacgaga 30
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 54
atttggctga tctcagcatg tttttaccat 30
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 55
gaggtttggc ctgcttttgg agtcctattg 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 56
aaggatgaaa cacaaaaggt gtgtgactct 30
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 57
tttcttttct caagttggcc tgaatcacta 30
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 58
ttttgggaat tggagatcgt cacaatagta 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 59
ggctctggaa tgccagaact acaatctttt 30
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 60
ggacaacaaa aatggattgg atcttccaca 30
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 61
attggatctt ccacacaatt aaacagcatg 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 62
aactctcagc aggcaaagac cgattgcata 30
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 63
ggggtggccc ctgagcgtca tctgccccca 30
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 64
gcaaggtgta cagtgacgca cagccccaca 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 65
agccgaggag gagctggtgg aggctgacga 30
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 66
ccaagaaagg cctgggctcc cccaccgtgc 30
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 67
ctggtgaccg aggacaacgt gatgaagatc 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 68
gtcatgccag taggacgcct ggcgccaaca 30
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 69
agtctcagga cagcctgacc tcaccttccc 30
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 70
ccaactgcac acacgacctg tgagtggcat 30
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 71
caggacaccc ccagctccag ctcctcaggg 30
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 72
caacaatgtg aggggtccct agcagcccac 30
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 73
gtagaatctg cattcccaga gacaagaata 30
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 74
aagagatcca ctcaccacat ggataccatc 30
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 75
ctccactaac aaccctcctg ccatcatatt 30
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 76
agaaccgcta acaactctgc agagggagaa 30
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 77
ataatagagg aagaagtccc aaccatgaca 30
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 78
ttgagtgtcc gatctgtaga tccactaatg 30
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 79
taaacttact ttgcctgtga ctgctgacca 30
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 80
atcatcatgt cctttcagca cctataagaa 30
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 81
aataacaccc aatgaagaat gtaattgata 30
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 82
tttctctggt ccactccagc tctatcaaag 30
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 83
ggctggttat gtcctcattg ccctcaacac 30
<210> 84
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 84
taaaaccgga ctgaaggagc tgcccatgag 30
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 85
ccccactcat gctctacaac cccaccacgt 30
<210> 86
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 86
aactggtcag gcatccttgt cccgctctgt 30
<210> 87
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 87
ccttgggatt acgctccctc aaggagataa 30
<210> 88
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 88
acagaggtga aaacagctgc agtaagtcac 30
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 89
tgtatccagt gtgcccacta cattgacggc 30
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 90
caaactgcac ctacgggtga gtggaaagtg 30
<210> 91
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 91
ccagcttgtg gagcctctta cacccagtgg 30
<210> 92
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 92
ataaggtaag gtccctggca caggcctctg 30
<210> 93
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 93
tcacaattgc cagttaacgt cttccttctc 30
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 94
agtttctgct ttgctgtgtg ggggtccatg 30
<210> 95
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 95
cgaagccaca ctgacgtgcc tctccctccc 30
<210> 96
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 96
atgtccggga acacaaagac aatattggct 30
<210> 97
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 97
gacctggcag ccaggaacgt actggtgaaa 30
<210> 98
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 98
ttaggtcagc cagcattttc ctgacaccag 30
<210> 99
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 99
catgtctttc cccacaatca tactgctgac 30
<210> 100
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 100
tcatctgtaa aggaccggtt catcaacttc 30
<210> 101
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 101
gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg 30
<210> 102
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 102
tctccagcat ttttacggac ccaatcatga 30
<210> 103
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 103
atctgttgta ccactccttc cctgcaacag 30
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 104
gatgatctca atgggcaatg aaaatgtact 30
<210> 105
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 105
tctctctgtt ttaagatctg ggcagtgaat 30
<210> 106
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 106
agactaccga gctacttttc cagaaggtat 30
<210> 107
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 107
aagttctttc ttttgcacag ggcattttgg 30
<210> 108
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 108
tacttttgtg gtttgcaacc taataaatag 30
<210> 109
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 109
ttcacagtca aggttgctga ttttggtctt 30
<210> 110
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 110
gtttaccacc aagtcagatg tggtaatgta 30
<210> 111
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 111
cacaaaatgg atccagacaa ctgttcaaac 30
<210> 112
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 112
tcattttcct atcagagcaa gcattatgaa 30
<210> 113
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 113
tacatactta ccatgccact ttcccttgta 30
<210> 114
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 114
gtcaagtcaa gccaaacaga aaaagaaaac 30
<210> 115
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 115
cctcgatgtg ctttagccac tggatgtgcg 30
<210> 116
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 116
ctctgtggaa gatgggagag gaggcacttg 30
<210> 117
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 117
gataggaaac agtgtctcac gcatacggtt 30
<210> 118
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 118
aagaagaagg ggcactgagg ttcctcctag 30
<210> 119
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 119
aggcctgcac acactgccgg ttgtcaatct 30
<210> 120
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 120
gggctgggac ccgaggcttc ctcctccccc 30
<210> 121
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 121
cgtgtgcgtc acgcttgaag accacgttgg 30
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 122
gcctctcggg tacatgctcc gcacagtcca 30
<210> 123
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 123
cgccaccagc agcttctgcc atctctctcc 30
<210> 124
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 124
catttctgcg gctgctcctc tttacctttc 30
<210> 125
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 125
tttgttaatg gtggcttttt gtttgtttgt 30
<210> 126
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 126
tgcttgcaaa tatcttctaa aacaactatt 30
<210> 127
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 127
ccttttgaag accataaccc accacagcta 30
<210> 128
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 128
acatcggggc aaatttttaa aggcacaaga 30
<210> 129
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 129
caaattttta aaggcacaag aggccctaga 30
<210> 130
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 130
ttggaaaaca gattttgggt ttcttttttt 30
<210> 131
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 131
tttttttcaa tttggcttct cttttttttc 30
<210> 132
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 132
agctacctgt taaagaatca tctggattat 30
<210> 133
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 133
gttgatttgc ttgagatcaa gattgcagat 30
<210> 134
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 134
tgtggtctgc cagctaaagg tgaagatata 30
<210> 135
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 135
aaaggtgaag atatattcct ccaattcagg 30
<210> 136
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 136
tttgtacttt actttcattg ggagaaatat 30
<210> 137
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 137
tttaggacaa aatgtttcac ttttgggtaa 30
<210> 138
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 138
agcatttgca gtatagagcg tgcagataat 30
<210> 139
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 139
atttgcagta tagagcgtgc agataatgac 30
<210> 140
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 140
ttaaacattt tgtgggggtt gttgacttgt 30
<210> 141
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 141
ctgcagagta tttgggcgaa tgcagttttt 30
<210> 142
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 142
aaggtctttc tctgtggcat catctatgaa 30
<210> 143
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 143
cggctggctg ctgaagtctg gcttcttggt 30
<210> 144
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 144
ccttttctct tccaggcgct agattgcaga 30
<210> 145
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 145
caaacccatg aaggagaccc cagttgtggg 30
<210> 146
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 146
cttttccacg tgcttgatcc actggatgtg 30
<210> 147
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 147
gatgtggggc tgggcatcac tgtaaacctt 30
<210> 148
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 148
aagaaaggag gagtggggat gggagaatga 30
<210> 149
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 149
tatttcagtg ttacttacct gtcttgtctt 30
<210> 150
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 150
ggaccatagg tacatcttca gagtccttaa 30
<210> 151
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 151
caaatacaca aagaaagccc tccccagtcc 30
<210> 152
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 152
atcctgagaa gggagaaaca cagtctggat 30
<210> 153
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 153
aaagaatggt cctgcaccag taatatgcat 30
<210> 154
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 154
attcagtcat tttcagcagg ccttataata 30
<210> 155
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 155
aggggagcct cacgttggtc cacatcctgc 30
<210> 156
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 156
gagagccacg cacactctac ccgtcagacc 30
<210> 157
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 157
cccactttgg aacaggacca acttggaggc 30
<210> 158
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 158
gagaagatca gtgagctggg ggctggcaat 30
<210> 159
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 159
gtagggccag gaaggggctg aggtcactca 30
<210> 160
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 160
aacagaggag ggggagaagt aagtatatac 30
<210> 161
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 161
caccgcttct tgtcctgctt gcttacctcg 30
<210> 162
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 162
ccactactca ggataggaaa agagaagcaa 30
<210> 163
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 163
gtggcaagtg gctcctgacc tggagtcttc 30
<210> 164
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 164
aggagataac acaggcccaa gatgaggcca 30
<210> 165
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 165
cagagacccc agttgcaaac cagacctcag 30
<210> 166
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 166
cagtgaggaa tcagaggcct ggggaccctg 30
<210> 167
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 167
ggaccctggg caaccagccc tgtcgtctct 30
<210> 168
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 168
gaatcaaccc acagctgcac agggcaggtc 30
<210> 169
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 169
tcaacccaca gctgcacagg gcaggtcttg 30
<210> 170
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 170
ggaagacggc agcaaagaaa caaacatgcg 30
<210> 171
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 171
caagtcacag acttggctgt cccagaatgc 30
<210> 172
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 172
gtaggagctg ctggtgcagg ggccacgggg 30
<210> 173
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 173
gcctgccctt ccaatggatc cactcacagt 30
<210> 174
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 174
tgcaagagga aaagtgggga tccagcatga 30
<210> 175
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 175
aatgtgaaaa ttccagtggc catcaaagtg 30
<210> 176
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 176
caggtctggg ctctggtctc tcttcattgg 30
<210> 177
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 177
taccctctca gcgtaccctt gtccccagga 30
<210> 178
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 178
cctcttagac catgtccggg aaaaccgcgg 30
<210> 179
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 179
caggggatga gctacctgga ggatgtgcgg 30
<210> 180
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 180
gcagatgggg gcaaggttag gtgaaggacc 30
<210> 181
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 181
cctcatgtga tctatgcccg tctctggagg 30
<210> 182
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 182
acgaacgagt tgtatcacct ggaattggta 30
<210> 183
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 183
gattaatgtt tcatttgttt tcccctttaa 30
<210> 184
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 184
attagtttgt gtgagcggca ggcagtaaca 30
<210> 185
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 185
agtatgatgg tgaaggatga atatgtgcat 30
<210> 186
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 186
agctctgtta gccccatctg agtctaatgc 30
<210> 187
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 187
gccatagtga aggactgttg cagatagcat 30
<210> 188
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 188
aagcaaatta acccatgtgg gccttaattt 30
<210> 189
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 189
ttctttaggg cctgttcaca atgagcttgc 30
<210> 190
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 190
tagtggtgat tgaaacgcac aaacacaggc 30
<210> 191
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 191
gagtattggt gttccattgc ttactttgaa 30
<210> 192
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 192
ttgtttgggt caactctcca atgtccacag 30
<210> 193
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 193
atttcttttt tcttcctaag gttgcacata 30
<210> 194
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 194
ttagacagag aagctgggcg tgcacctgga 30
<210> 195
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 195
tttcttaaaa ggtctttgat ttgcgtcagt 30
<210> 196
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 196
tcagtaggtg gaatagctcc agctatcagt 30
<210> 197
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 197
aattggtgtt gatgaccttc gtcgcttatg 30
<210> 198
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 198
cataccatgc cgattgcaga cccacaacct 30
<210> 199
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 199
ggagggcgag ctgatgtcgg tgggtatgga 30
<210> 200
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 200
ggtgaaggag gtgctggact cggagacgct 30
<210> 201
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 201
gctcaccacc ggtggcaccc tcaaaatctc 30
<210> 202
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 202
agggggggcc ctggggcgcc ccctcccggg 30
<210> 203
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 203
tttcttccct cccctcgaaa tgaagctaca 30
<210> 204
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 204
tctctgacct gctgaaaggt gggagcctca 30
<210> 205
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 205
tcctccggct gaagcaccag tgcccatccc 30
<210> 206
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 206
tacactcagg acttcacggt gcccggtgag 30
<210> 207
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 207
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34
<210> 208
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 208
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
Claims (9)
1.一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物，其特征在于，包括103对引物或包含其中部分引物的组合，每对引物的正向引物与反向引物序列均包括扩增引物对，以及与所述扩增引物对5’端连接的其他序列；每对所述引物的正向引物与反向引物中的特异性序列选自SEQ ID NO.1～206所示的序列。
2.根据权利要求1所述一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物，其特征在于，每对所述引物的正向引物与反向引物中的特异性序列为所述序列其中的18-25个碱基序列。
3.如权利要求1所述的肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物，其特征在于，所述扩增引物对的正向引物包括SEQ ID NO.207所示的序列，优选地，为所述序列其中的16-25个碱基序列。
4.如权利要求1所述的肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物，其特征在于，所述扩增引物对的反向引物包括SEQ ID NO.208所示的序列，优选地，为所述序列其中的16-25个碱基序列。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物在检测肺癌或结直肠癌突变基因中的应用。
6.一种用于肺癌或结直肠癌基因检测的试剂，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的引物组合物。
7.如权利要求6所述的试剂，其特征在于，还包括三对接头中的至少一对，所述三对接头分别对应Illumina、Ion Torrent、MGI三种测序平台，所述接头内部含有与权利要求3或4任一项所述的序列配对的DNA片段。
8.如权利要求6或7所述的试剂，其特征在于，所述试剂适用于新鲜或冰冻组织、FFPE、及外周血ctDNA的分子检测。
9.一种如权利要求6或7所述的试剂在基于NGS方法的肺癌或结直肠癌相关基因检测中的应用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2020105760020 | 2020-06-22 | ||
| CN202010576002 | 2020-06-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112029856A true CN112029856A (zh) | 2020-12-04 |
Family
ID=73577088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010802253.6A Pending CN112029856A (zh) | 2020-06-22 | 2020-08-11 | 一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112029856A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113293209A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-08-24 | 上海贞固医学检验实验室有限公司 | 一种脑胶质瘤突变基因检测引物组合物、试剂盒及试剂盒的应用 |
-
2020
- 2020-08-11 CN CN202010802253.6A patent/CN112029856A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113293209A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-08-24 | 上海贞固医学检验实验室有限公司 | 一种脑胶质瘤突变基因检测引物组合物、试剂盒及试剂盒的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108004301B (zh) | 基因目标区域富集方法及建库试剂盒 | |
| CN105442054B (zh) | 对血浆游离dna进行多目标位点扩增建库的方法 | |
| CN108300716A (zh) | 接头元件、其应用和基于不对称多重pcr进行靶向测序文库构建的方法 | |
| WO2023071889A1 (zh) | 用于检测胃癌淋巴结节转移相关的甲基化生物标记物或其组合及应用 | |
| CN114107513B (zh) | 一种用于膀胱尿路上皮癌诊断的检测方法和试剂盒 | |
| CN112176057B (zh) | 利用CpG位点甲基化水平检测胰腺导管腺癌的标志物及其应用 | |
| CN108841953A (zh) | 利用数字pcr技术检测egfr基因22种突变的试剂盒 | |
| WO2023216707A1 (zh) | Nk细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒 | |
| CN106282161B (zh) | 特异捕获并重复复制低频率dna碱基变异的方法及应用 | |
| CN113278611A (zh) | 捕获测序探针及其用途 | |
| CN111424087A (zh) | 基于二代测序的用于泛癌种检测或靶向用药的检测Panel、试剂盒及应用 | |
| CN118591636A (zh) | Dna甲基化文库构建方法及其文库、dna杂交捕获方法和试剂盒 | |
| CN111748628B (zh) | 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒 | |
| CN109385469A (zh) | 一种高灵敏度双链循环肿瘤dna检测方法及试剂盒 | |
| CN115466791A (zh) | 用于检测转移性前列腺癌的甲基化生物标志物组合及应用 | |
| CN109337956B (zh) | 基于ngs技术富集多基因茎环探针设计方法及试剂盒 | |
| WO2021169874A1 (zh) | 一种检测3种管腔性器官肿瘤的探针组合物 | |
| CN112029856A (zh) | 一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物及其应用 | |
| CN117487920A (zh) | 用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合及应用 | |
| CN106048021A (zh) | 用于检测微量组织中p53基因突变的引物组合及其应用 | |
| CN108913774B (zh) | 一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN110144386A (zh) | 用于检测pole基因突变的引物、探针及试剂盒 | |
| CN112251515B (zh) | 一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的引物及试剂盒 | |
| CN113969277A (zh) | 一种用于封闭人类基因组上重复序列的封闭引物、其组合物及应用 | |
| CN113981059B (zh) | 一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物及其试剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |