CN117487920A - 用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合及应用 - Google Patents
用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合及应用，选自171种甲基化生物标记物中的任意至少两种组合，该甲基化生物标志物组合用于制备检测试剂盒，且检测试剂盒应用于检测前列腺癌的肿瘤负荷诊断。本发明通过利用DNA甲基化分子标记物与前列腺癌高度相关性，通过组合甲基化生物标记物制成检测试剂盒，能够用于对转移性前列腺癌肿瘤负荷的检测，通过非侵入的方式实现转移性前列腺癌肿瘤负荷的检测，提高了对转移性前列腺癌肿瘤负荷检测的灵敏度、特异性和准确性，且相对于现有的检测方法，具有无创诊断和方便快捷的明显进步优势，实用性大大提高，具有很大的临床推广的可行性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物标志物组合应用技术领域，具体涉及用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合及应用。
背景技术
前列腺癌是第二大最常见的癌症，是男性癌症相关死亡的第五大原因。
越来越多的患者不仅对社会和家庭造成了很大的经济负担，同时也给患者带来了更多的痛苦，生活质量下降。
CHAARTED 研究将高肿瘤负荷定义为内脏转移，或者骨转移病灶≥4 个，其中至少有 1处在脊柱或者骨盆以外。低肿瘤负荷定义为无内脏转移，且骨转移病灶≤3 处。转移性前列腺癌患者转移病灶的数目及肿瘤负荷与治疗预后有关。例如以手术为主的原发灶治疗方式有望改低肿瘤负荷患者的预后，且具有较好的安全性，而高肿瘤负荷患者的手术治疗收益很小。不同肿瘤负荷患者的治疗策略有所差异，不同治疗方案的适应症也不同。因此，对于转移前列腺癌患者，指南推荐根据低瘤负荷和高瘤负荷对患者进行分层，临床治疗也需要分层对待。
cfDNA（circulating cell-free DNA）是外周血中游离的小片段DNA，主要源于肿瘤相关的坏死或生理性凋亡，包含体细胞突变和DNA甲基化等遗传信息。检测血液中的cfDNA、循环肿瘤细胞（CTCs）或外泌体等检测方法，称为液体活检（Liquid Biopsy），与传统的组织活检相比，其有着迅速、低风险、低成本、低侵袭性等众多优点。迄今为止多项研究证实，可以从癌症患者的cfDNA中检测出与癌症相关的DNA突变或甲基化修饰变异的信息。2017年Wyatt团队证明所有在前列腺癌转移组织中发现的体细胞突变也在匹配cfDNA样本中出现。临床越来越多的研究表明cfDNA可作为生物标志物应用在前列腺癌患者诊断和预后。
目前前列腺癌肿瘤负荷的检查方法主要骨扫描（ECT）检查和靶向前列腺特异性膜抗原（PSMA） PET/CT。前列腺癌通常首先出现骨转移，当需要进行诊断性检查时，锝-99放射性核素骨扫描目前仍然是评估骨转移的标准方法。虽然骨扫描敏感性较高，但其缺乏特异性。在骨折或损伤或局部炎症或退变中，因为骨的修复存在成骨过程，同样会有信号浓聚，也会造成骨扫描假阳性。因此骨扫描阳性或者不明确的患者通常需要进行进一步检查。近年来，PSMA PET/CT 成像在前列腺癌诊疗中应用逐渐增多。PSMA PET/CT对隐匿性淋巴结和骨转移检测，较常规影像学方法更准确、更全面。常用的68Ga标记 PSMA 类显像剂主要经泌尿系统排泄，容易漏诊膀胱周围小的转移灶或局部复发病灶，同时约10%患者肿瘤病灶PSMA呈现低表达， PSMA PET 显像阴性。PSMA 不仅仅高表达于前列腺癌细胞，许多实体肿瘤如肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、脑肿瘤等的新生血管内皮细胞膜均可一定程度表达PSMA，PSMA PET/CT 显示阳性。此外，支气管扩张伴感染、结节病、佩吉特病等多种良性病变以及神经节等也可见 PSMA PET 显像剂非特异性摄取。PSMA PET/CT价格昂贵，假阳性、假阴性问题困扰成像结果判断，其检出效能尚待更多的研究来探索和证实。
国内外权威指南都按照高肿瘤负荷和低肿瘤负荷对前列腺癌的治疗进行分层，对前列腺癌的检测不仅需要检测是否转移，也需要检测其肿瘤负荷。此前的试剂盒基本不检测前列腺肿瘤负荷，而影像学检测受限假阴性和假阳性问题。因此，发明用于检测转移性前列腺的甲基化生物标志物组合及应用来解决上述问题很有必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合及应用，通过利用DNA甲基化分子标记物与前列腺癌高度相关性，通过组合甲基化生物标记物制成检测试剂盒，能够用于对转移性前列腺癌的检测，通过非侵入的方式实现转移性前列腺癌肿瘤负荷的检测，提高了对转移性前列腺癌的检测的灵敏度、特异性和准确性，以解决技术中的上述不足之处。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合，选自以下甲基化生物标记物中的任意至少两种组合：
chr1：1137001-1137301、chr1：145573620-145573920、chr1：155620501-155620801、chr1：184006347-184006405、chr1：205631898-205632198、chr1：230208001-230208301、chr1：29564367-29564667、chr1：58234801-58235101、chr1：87767701-87768001、chr1：91089001-91089301、chr1：147487202-147487501、chr1：147532802-147533101、chr1：181059009-181059309、chr1：181059309-181059609、chr1：94146733-94146927、chr10：133506601-133506901、chr10：2095501-2095801、chr10：482262-482562、chr10：77158920-77159220、chr10：91330501-91330801、chr10：17270986-17271286、chr10：73156539-73156552、chr10：79397203-79397502、chr11：2867401-2867701、chr11：45672001-45672301、chr11：64875601-64875901、chr11：836101-836401、chr11：86900101-86900401、chr11：17373393-17373693、chr12：125076301-125076601、chr12：125139301-125139601、chr12：133353801-133354101、chr12：87835801-87836101、chr12：104851940-104852240、chr12：49393272-49393353、chr14：90849279-90849579、chr14：91579987-91580287、chr15：102303001-102303301、chr15：39872388-39872688、chr15：102286047-102286347、chr15：45479869-45480127、chr15：72667882-72668182、chr16：1730317-1730617、chr16：5337901-5338201、chr16：83691601-83691901、chr17：80072101-80072401、chr17：31619207-31619225、chr18：150901-151201、chr18：76273801-76274101、chr19：16680412-16680712、chr19：29613901-29614201、chr19：38978952-38979252、chr19：38996401-38996701、chr19：49703623-49703923、chr19：49703923-49704223、chr19：50944201-50944501、chr19：51303278-51303578、chr19：39282525-39282825、chr2：170552044-170552344、chr2：170552344-170552375、chr2：177023775-177024075、chr2：20068960-20069094、chr2：2275801-2276101、chr2：240033301-240033601、chr2：240033601-240033901、chr2：47703601-47703901、chr2：88690201-88690501、chr2：99796148-99796448、chr20：29804820-29805120、chr20：56247772-56248072、chr20：4803590-4803717、chr21：11169301-11169601、chr21：27041008-27041308、chr21：45078301-45078601、chr21：28219250-28219313、chr22：39855601-39855901、chr22：46969801-46970101、chr22：51177001-51177301、chr22：24199607-24199629、chr3：145173301-145173601、chr3：184243114-184243414、chr3：193119901-193120201、chr3：197113944-197114244、chr3：79606801-79607101、chr3：93744201-93744501、chr3：98381701-98382001、chr3：50274237-50274536、chr4：1039501-1039801、chr4：151726801-151727101、chr4：44450164-44450464、chr4：9241061-9241361、chr4：9245629-9245929、chr4：185937927-185937986、chr5：111409501-111409801、chr5：149985301-149985601、chr5：171576901-171577201、chr5：175119901-175120201、chr5：178398013-178398313、chr5：178408306-178408606、chr5：63373501-63373801、chr5：79331327-79331526、chr5：94956093-94956392、chr6：131404801-131405101、chr6：161273487-161273787、chr6：105584593-105584757、chr6：107810663-107810821、chr6：131383975-131383979、chr6：26189401-26189431、chr7：144835801-144836101、chr7：154592101-154592401、chr7：155135101-155135401、chr7：157485729-157486029、chr7：20823318-20823618、chr7：56230801-56231101、chr7：56357341-56357641、chr7：7605460-7605760、chr7：7606060-7606112、chr7：7612688-7612988、chr7：7612988-7613288、chr7：7613288-7613588、chr7：134144180-134144289、chr7：23513704-23514004、chr7：23514004-23514120、chr8：110882401-110882701、chr8：126445404-126445704、chr8：131455029-131455329、chr8：55002982-55003282、chr8：65711134-65711434、chr8：7830601-7830901、chr8：86566135-86566435、chr8：95182801-95183101、chr8：99954843-99955143、chr8：144853418-144853717、chr9：130529101-130529401、chr9：137378101-137378401、chr9：44868901-44869201、chr9：97317483-97317783、chr9：102585769-102586068、chr9：27529891-27530023、chr9：37036916-37037215、chr9：93955005-93955305、chrX：100672978-100673278、chrX：114468337-114468637、chrX：115005001-115005301、chrX：32723401-32723701、chrY：13489201-13489501以及另外35种源自中国专利申请号202211120273.0的甲基化标志物。
作为本发明的优选方案，所述甲基化生物标志物组合用于制备检测试剂盒。
作为本发明的优选方案，所述检测试剂盒应用于检测前列腺癌肿瘤负荷。
甲基化生物标志物组合的检测方法，包括上述甲基化生物标志物组合及其制成的检测试剂盒，检测步骤如下：
步骤一：提取待测血液样本的cfDNA；所述血液样本是血浆、血清或血液；
步骤二：将提取的cfDNA进行亚硫酸氢盐处理、得到转化后的cfDNA样本；
步骤三：对转化后cfDNA样本进行甲基化DNA建库；
步骤四：构建前列腺癌的靶向杂交捕获甲基化与文库；
步骤五：高通量测序，获得探针捕获的数据。所述测序可通过任何测序方法进行，包括但不限于双脱氧链终止法，优选高通量测序方法包括但不限于第二代测序技术或者是单分子测序技术；
步骤六：甲基化数据分析，根据甲基化标记物和算法模型确认最终转移性前列腺癌分值和转移性肿瘤负荷分值。
作为本发明的优选方案，步骤六中甲基化数据分析时，针对测序仪的下机原始数据，进行常规的生物信息学分析处理。
检测DNA甲基化的方法本领域周知，采用的检测方法是采用焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、荧光定量qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合所使用的试剂。在一个或多个实施方案中，检测包括检测基因或位点处的任一条链。
在上述技术方案中，本发明提供的技术效果和优点：
通过利用DNA甲基化分子标记物与前列腺癌高度相关性，通过组合甲基化生物标记物制成检测试剂盒，能够用于对转移性前列腺癌肿瘤负荷的检测，通过非侵入的方式实现转移性前列腺癌肿瘤负荷的检测，提高了对转移性前列腺癌的检测的灵敏度、特异性和准确性，且相对于现有的检测方法，具有无创诊断和方便快捷的明显进步优势，实用性大大提高，具有很大的临床推广的可行性高。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中cfDNA甲基化应用于转移性前列腺癌诊断的ROC图；
图2为本发明实施例2中转移性前列腺癌的预测分值图；
图3为本发明实施例2中高肿瘤负荷与低肿瘤负荷对比生成的ROC曲线；
图4为本发明实施例1中转移性前列腺癌症分值及前列腺癌症转移负荷分值算法模型。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行, 如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989）中所述的条件。下述实施例中所用的材料、试剂、 仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
在一个方面，本文公开了基于来自血液样品的测序数据（例如，核酸）进行疾病诊断的方法。cfDNA在整个申请中用作主要实例，但它不应以任何方式限制本发明的范围。
本发明提供了用于检测转移性前列腺癌的甲基化生物标志物组合，选自以下甲基化生物标记物中的任意至少两种组合：
chr1：1137001-1137301、chr1：145573620-145573920、chr1：155620501-155620801、chr1：184006347-184006405、chr1：205631898-205632198、chr1：230208001-230208301、chr1：29564367-29564667、chr1：58234801-58235101、chr1：87767701-87768001、chr1：91089001-91089301、chr1：147487202-147487501、chr1：147532802-147533101、chr1：181059009-181059309、chr1：181059309-181059609、chr1：94146733-94146927、chr10：133506601-133506901、chr10：2095501-2095801、chr10：482262-482562、chr10：77158920-77159220、chr10：91330501-91330801、chr10：17270986-17271286、chr10：73156539-73156552、chr10：79397203-79397502、chr11：2867401-2867701、chr11：45672001-45672301、chr11：64875601-64875901、chr11：836101-836401、chr11：86900101-86900401、chr11：17373393-17373693、chr12：125076301-125076601、chr12：125139301-125139601、chr12：133353801-133354101、chr12：87835801-87836101、chr12：104851940-104852240、chr12：49393272-49393353、chr14：90849279-90849579、chr14：91579987-91580287、chr15：102303001-102303301、chr15：39872388-39872688、chr15：102286047-102286347、chr15：45479869-45480127、chr15：72667882-72668182、chr16：1730317-1730617、chr16：5337901-5338201、chr16：83691601-83691901、chr17：80072101-80072401、chr17：31619207-31619225、chr18：150901-151201、chr18：76273801-76274101、chr19：16680412-16680712、chr19：29613901-29614201、chr19：38978952-38979252、chr19：38996401-38996701、chr19：49703623-49703923、chr19：49703923-49704223、chr19：50944201-50944501、chr19：51303278-51303578、chr19：39282525-39282825、chr2：170552044-170552344、chr2：170552344-170552375、chr2：177023775-177024075、chr2：20068960-20069094、chr2：2275801-2276101、chr2：240033301-240033601、chr2：240033601-240033901、chr2：47703601-47703901、chr2：88690201-88690501、chr2：99796148-99796448、chr20：29804820-29805120、chr20：56247772-56248072、chr20：4803590-4803717、chr21：11169301-11169601、chr21：27041008-27041308、chr21：45078301-45078601、chr21：28219250-28219313、chr22：39855601-39855901、chr22：46969801-46970101、chr22：51177001-51177301、chr22：24199607-24199629、chr3：145173301-145173601、chr3：184243114-184243414、chr3：193119901-193120201、chr3：197113944-197114244、chr3：79606801-79607101、chr3：93744201-93744501、chr3：98381701-98382001、chr3：50274237-50274536、chr4：1039501-1039801、chr4：151726801-151727101、chr4：44450164-44450464、chr4：9241061-9241361、chr4：9245629-9245929、chr4：185937927-185937986、chr5：111409501-111409801、chr5：149985301-149985601、chr5：171576901-171577201、chr5：175119901-175120201、chr5：178398013-178398313、chr5：178408306-178408606、chr5：63373501-63373801、chr5：79331327-79331526、chr5：94956093-94956392、chr6：131404801-131405101、chr6：161273487-161273787、chr6：105584593-105584757、chr6：107810663-107810821、chr6：131383975-131383979、chr6：26189401-26189431、chr7：144835801-144836101、chr7：154592101-154592401、chr7：155135101-155135401、chr7：157485729-157486029、chr7：20823318-20823618、chr7：56230801-56231101、chr7：56357341-56357641、chr7：7605460-7605760、chr7：7606060-7606112、chr7：7612688-7612988、chr7：7612988-7613288、chr7：7613288-7613588、chr7：134144180-134144289、chr7：23513704-23514004、chr7：23514004-23514120、chr8：110882401-110882701、chr8：126445404-126445704、chr8：131455029-131455329、chr8：55002982-55003282、chr8：65711134-65711434、chr8：7830601-7830901、chr8：86566135-86566435、chr8：95182801-95183101、chr8：99954843-99955143、chr8：144853418-144853717、chr9：130529101-130529401、chr9：137378101-137378401、chr9：44868901-44869201、chr9：97317483-97317783、chr9：102585769-102586068、chr9：27529891-27530023、chr9：37036916-37037215、chr9：93955005-93955305、chrX：100672978-100673278、chrX：114468337-114468637、chrX：115005001-115005301、chrX：32723401-32723701、chrY：13489201-13489501。
以及另外35种源自中国专利申请号202211120273.0的甲基化标志物（chr1：205532103-205532401、chr10：2565003-2565301、chr11：134253603-134253901、chr11：46316648-46316946、chr11：830025-830323、chr12：113779503-113779801、chr12：131174103-131174401、chr12：124955703-124956001、chr12：77272466-77272764、chr15：96906603-96906901、chr15：45406119-45406417、chr15：33219303-33219601、chr16：74440716-74441014、chr17：79652103-79652401、chr19：55994103-55994401、chr19：49636737-49637035、chr2：163323603-163323901、chr2：103445403-103445701、chr2：111875389-111875687、chr20：21493409-21493707、chr20：21497940-21498238、chr22：50623397-50623695、chr22：50988003-50988301、chr22：42307184-42307431、chr4：95579714-95580012、chr5：148252503-148252801、chr5：170744972-170745270、chr5：172070703-172071001、chr6：26189103-26189401、chr7：2376603-2376901、chr7：5006703-5007001、chr7：21765303-21765601、chr8：10586552-10586850、chr8：23583988-23584286、chr9：26547903-26548201）。
其中，甲基化标记物为受试者血液样本的检测包血浆、血清或血液。组合标志物的检测试剂可包括用于检测组合标志物中各个基因甲基化水平的引物和/或探针。
受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，简称ROC线）：是根据一系列不同的二分类方式（分界值或决定阈），以敏感性（真阳性率） 为纵坐标，1-特异性（假阳性率）为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下面积是重要的 试验准确度指标，ROC曲线下面积越大，试验的诊断价值越大。
实施例1
针对检测转移性前列腺癌ctDNA差异性甲基化标记物的检测方法，本实施例给出具体的检测步骤：
1、血浆cfDNA的提取；
具体为：血浆cfDNA提取时，其具体的操作步骤按照QIAGEN公司的QIAampCirculating Nucleic Acid Kit的操作说明书进行操作。
2、亚硫酸氢盐转化；
具体为：投入20ng cfDNA进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA，且上述转化过程具体操作按照Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit说明书进行操作。
3、甲基化建库；
具体包括如下步骤：
3.1、变性；
3.1.1、将转化后15ul的样本置于PCR仪中，按以下程序进行：
95℃ 时间2min
热盖 105℃
3.1.2、PCR反应结束后立即将样本取出，直接插入冰中，放置2min以上再进行下一步操作。
3.2、T7接头连接；
3.2.1、按以下体系配置反应液；
| 组分 | 体积（ul） |
| Low EDTA TE | 11.5 |
| Buffer G1 | 4 |
| Reagent G2 | 4 |
| Reagent G3 | 2.5 |
| Enzyme G4 | 1 |
| Enzyme G5 | 1 |
| Enzyme G6 | 1 |
| 转化后的样本 | 15 |
| 总体积 | 40 |
3.2.2、置于PCR仪中按以下程序进行反应：
37℃ 15min
95℃ 2min
4℃ hold
热盖 105℃
3.3、第二链合成；
3.3.1、按以下体系配置反应液
| 组分 | 体积（ul） |
| Reagent Y1 | 2 |
| Enzyme Y2 | 42 |
| 上一步反应产物 | 40 |
| 总体积 | 84 |
3.3.2、置于PCR仪中按以下程序进行反应：
98℃ 1min
62℃ 2min
65℃ 5min
4℃ hold
热盖 105℃
3.4、第一次纯化；
3.4.1、将上一步反应产物离心后，每个样本加入101ul Agencourt AMPure Beads（已经提前静置平衡至室温），吹打混匀；
3.4.2、室温静置5min，转移至磁力架上静置5min，小心弃除上清；
3.4.3将PCR管保持在磁力架上，加入200ul 80%乙醇，静置30s，吸走乙醇；
3.4.4、重复步骤3.4.3一次；
3.4.5、开盖干燥磁珠2-3min，酒精完全挥发后，将PCR管置于磁力架上，加入15ul的Low EDTA TE，吹打混匀，室温静置5min；
3.4.6、将PCR管放到磁力架上，室温静置5min，吸取15ul上清于新的PCR管中。
3.5、T5接头连接；
3.5.1、按以下体系配置反应液
| 组分 | 体积（ul） |
| Buffer B1 | 3 |
| Reagent B2 | 10 |
| Enzyme B3 | 2 |
| 上一步反应产物 | 15 |
| 总体积 | 30 |
3.5.2、置于PCR仪中按以下程序进行反应：
25℃ 15min
4℃ hold
3.6、第二次纯化；
3.6.1、将上一步反应产物离心后，每个样本加入36ul Agencourt AMPure Beads（已经提前静置平衡至室温），吹打混匀；
3.6.2、室温静置5min，转移至磁力架上静置5min，小心弃除上清；
3.6.3、将PCR管保持在磁力架上，加入200ul 80%乙醇，静置30s，吸走乙醇；
3.6.4、重复步骤3.6.3一次；
3.6.5、开盖干燥磁珠2-3min，酒精完全挥发后，将PCR管置于磁力架上，加入20ul的Low EDTA TE，吹打混匀，室温静置5min；
3.6.6、将PCR管放到磁力架上，室温静置5min，吸取20ul上清于新的PCR管中。
3.7、Indexing PCR；
3.7.1、按以下体系配置反应液
| 组分 | 体积（ul） |
| Low EDTA TE | 10 |
| Buffer R1 | 10 |
| Reagent R2 | 4 |
| Enzyme R3 | 1 |
| PCR Index Primer | 5 |
| 上一步反应产物 | 20 |
| 总体积 | 50 |
3.7.2、置于PCR仪中按以下程序进行反应：
3.8、第三次纯化；
3.8.1、将上一步反应产物离心后，每个样本加入40ul Agencourt AMPure Beads（已经提前静置平衡至室温），吹打混匀；
3.8.2、室温静置5min，转移至磁力架上静置5min，小心弃除上清；
3.8.3、将PCR管保持在磁力架上，加入200ul 80%乙醇，静置30s，吸走乙醇；
3.8.4、重复步骤3.8.3一次；
3.8.5、开盖干燥磁珠2-3min，酒精完全挥发后，将PCR管置于磁力架上，加入20ul的Low EDTA TE，吹打混匀，室温静置5min。
3.8.6、将PCR管放到磁力架上，室温静置5min，吸取20ul上清于新的PCR管中。
4、甲基化快速杂交实验；
具体包括如下步骤：
4.1、计算好不同DNA文库用量，在离心管中混合均匀，每个文库的用量不超过500ng，总用量不超过4ug；
4.2、在混合好的样本中分别加入以下预杂交试剂，混匀，表格如下
| 组分 | 体积（ul） |
| 探针 Panel | 4 |
| 通用封闭剂 | 8 |
| 封闭剂溶液 | 5 |
4.3、将以上混合好的预杂交试剂在真空浓缩仪中常温烘干；
4.4、向烘干的样本中加入20ul Fast Hybridization Mix，指尖轻弹混匀；
4.5、加入 30ul Hybridization Enhancer 至以上试剂表面；
4.6、置于PCR仪中按以下程序进行反应：
95℃ 5 min
75℃ 2h
60℃ 14h
热盖 85℃
4.7、将链霉亲和素磁珠提前平衡至室温，取100ul磁珠至 1.5ml 离心管中。
4.8、加入200ul结合缓冲液并用枪头吹打混匀，将离心管置于磁力架上 1min 或至溶液澄清，弃去上清。
4.9、重复步骤4.8两次，一共洗涤三次。
4.10、最后一次清洗后，加入200ul结合缓冲液，充分混匀，将PCR仪中的杂交液全部转移至平衡好的磁珠中。
4.11、将加入了杂交液的磁珠在混匀仪上室温充分混匀30min。
4.12、将离心管从混匀仪上取下，快速离心后在磁力架上放置 1min、去上清。
4.13、加入200ul预热的洗液1，混匀，65℃孵育5min，转移至磁力架上静置1min，小心弃除上清。
4.14、重复步骤4.13一次。
4.15、加入200ul预热过的洗液2、混匀，48℃孵育5min，转移至磁力架上静置1min，小心弃除上清。
4.16、重复步骤4.15两次，一共三次。
4.17、加入 45ul 水，混匀，冰上孵育该溶液。
4.18、按以下体系配置反应液
| 组分 | 体积（ul） |
| 扩增引物 | 2.5 |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | 25 |
| Enzyme B3 | 2 |
| 上一步反应产物 | 22.5 |
| 总体积 | 50 |
4.19、置于PCR仪中按以下程序进行反应：
4.20、在扩增产物中加入90ulDNA纯化磁珠（提前静置平衡至室温）、混匀。
4.21、室温静置5min，转移至磁力架上静置5min，小心弃除上清。
4.22、将PCR管保持在磁力架上，加入200ul 80%乙醇，静置30s，吸走乙醇。
4.23、重复步骤4.22一次。
4.24、开盖干燥磁珠2-3min，酒精完全挥发后，将PCR管置于磁力架上，加入32ul的水，吹打混匀，室温静置5min。
4.25、将PCR管放到磁力架上，室温静置5min，吸取30ul上清于新的PCR管中。
5、采用Illumina公司的测序仪对杂交捕获后的样本进行测序，得到测序结果。
6、对测序仪的下机原始数据，进行常规的生物信息学分析处理，得到目标区域的甲基化数据，得到甲基化差异区域信号和特异甲基化片段，通过已构建算法模型（附图4），计算转移性前列腺癌症分值及前列腺癌症转移负荷分值。算法计算过程如下：
6.1、根据本专利中设计的靶向甲基化区域，分别得到区域的甲基化比例值和区域的甲基化片段信息。其中甲基化比例水平由Bismark软件计算CpG位点后，根据修正的区域甲基化位点计算方法对区域内所有片段的所有CpG甲基化位点进行加权平均计算。甲基化片段信息由靶向甲基化区域的所有测序片段，去除低质量区域（测序读长5’端25bp）后对序列ATCG及甲基化C的所有片段的碱基信息进行汇总构建。
6.2、对于区域的甲基化片段信息，根据已构建的转移性前列腺癌甲基化片段数据库训练得到的组织LSTM模型和Transformer模型，将甲基化片段进行独热编码后，使用组织模型计算样本的组织甲基化分值。
6.3、对于区域的甲基化比例值，根据已经构建的转移性前列腺癌血液甲基化数据库和已构建模型，包括随机森林模型（Randomforest，RF），XGBoost模型和广义线性模型（Generalized Linear Model, GLM），计算样本的血液甲基化分值。
6.4、根据样本的组织甲基化分值和血液甲基化分值，使用转移性前列腺癌标签和转移肿瘤负荷标签训练的广义线性模型，计算样本的前列腺癌肿瘤转移分值和转移负荷分值。
实施例
本实施例对70例局限性前列腺癌患者、20例转移性前列腺癌低肿瘤负荷患者和23例转移性前列腺癌高肿瘤负荷患者的血浆样本进行检测，具体的检测试剂盒和实验方法以及数据判断处理与实施例1所述内容一致。
利用在不同组别的甲基化水平差异筛选出与转移性前列腺癌相关的生物标记物，最终筛选出共171个甲基化标记物。
结果见附图1所示，在96.1%特异性下，检测转移性前列腺癌和非转移型前列腺癌的整体灵敏度为95.2%，整体的AUC为0.987。转移性前列腺癌患者组与非转移型前列腺癌患者组的判别得分显著分离的散点图（参照图2)。转移性前列腺癌肿瘤负荷的区分结果如图3所示，在90%特异性下，检测高肿瘤负荷和低肿瘤负荷的整体灵敏度为91.3%，整体的AUC为0.972。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
Claims (7)
1.用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合，其特征在于：
选自以下甲基化生物标记物中的任意至少两种组合：
chr1：1137001-1137301、chr1：145573620-145573920、chr1：155620501-155620801、chr1：184006347-184006405、chr1：205631898-205632198、chr1：230208001-230208301、chr1：29564367-29564667、chr1：58234801-58235101、chr1：87767701-87768001、chr1：91089001-91089301、chr1：147487202-147487501、chr1：147532802-147533101、chr1：181059009-181059309、chr1：181059309-181059609、chr1：94146733-94146927、chr10：133506601-133506901、chr10：2095501-2095801、chr10：482262-482562、chr10：77158920-77159220、chr10：91330501-91330801、chr10：17270986-17271286、chr10：73156539-73156552、chr10：79397203-79397502、chr11：2867401-2867701、chr11：45672001-45672301、chr11：64875601-64875901、chr11：836101-836401、chr11：86900101-86900401、chr11：17373393-17373693、chr12：125076301-125076601、chr12：125139301-125139601、chr12：133353801-133354101、chr12：87835801-87836101、chr12：104851940-104852240、chr12：49393272-49393353、chr14：90849279-90849579、chr14：91579987-91580287、chr15：102303001-102303301、chr15：39872388-39872688、chr15：102286047-102286347、chr15：45479869-45480127、chr15：72667882-72668182、chr16：1730317-1730617、chr16：5337901-5338201、chr16：83691601-83691901、chr17：80072101-80072401、chr17：31619207-31619225、chr18：150901-151201、chr18：76273801-76274101、chr19：16680412-16680712、chr19：29613901-29614201、chr19：38978952-38979252、chr19：38996401-38996701、chr19：49703623-49703923、chr19：49703923-49704223、chr19：50944201-50944501、chr19：51303278-51303578、chr19：39282525-39282825、chr2：170552044-170552344、chr2：170552344-170552375、chr2：177023775-177024075、chr2：20068960-20069094、chr2：2275801-2276101、chr2：240033301-240033601、chr2：240033601-240033901、chr2：47703601-47703901、chr2：88690201-88690501、chr2：99796148-99796448、chr20：29804820-29805120、chr20：56247772-56248072、chr20：4803590-4803717、chr21：11169301-11169601、chr21：27041008-27041308、chr21：45078301-45078601、chr21：28219250-28219313、chr22：39855601-39855901、chr22：46969801-46970101、chr22：51177001-51177301、chr22：24199607-24199629、chr3：145173301-145173601、chr3：184243114-184243414、chr3：193119901-193120201、chr3：197113944-197114244、chr3：79606801-79607101、chr3：93744201-93744501、chr3：98381701-98382001、chr3：50274237-50274536、chr4：1039501-1039801、chr4：151726801-151727101、chr4：44450164-44450464、chr4：9241061-9241361、chr4：9245629-9245929、chr4：185937927-185937986、chr5：111409501-111409801、chr5：149985301-149985601、chr5：171576901-171577201、chr5：175119901-175120201、chr5：178398013-178398313、chr5：178408306-178408606、chr5：63373501-63373801、chr5：79331327-79331526、chr5：94956093-94956392、chr6：131404801-131405101、chr6：161273487-161273787、chr6：105584593-105584757、chr6：107810663-107810821、chr6：131383975-131383979、chr6：26189401-26189431、chr7：144835801-144836101、chr7：154592101-154592401、chr7：155135101-155135401、chr7：157485729-157486029、chr7：20823318-20823618、chr7：56230801-56231101、chr7：56357341-56357641、chr7：7605460-7605760、chr7：7606060-7606112、chr7：7612688-7612988、chr7：7612988-7613288、chr7：7613288-7613588、chr7：134144180-134144289、chr7：23513704-23514004、chr7：23514004-23514120、chr8：110882401-110882701、chr8：126445404-126445704、chr8：131455029-131455329、chr8：55002982-55003282、chr8：65711134-65711434、chr8：7830601-7830901、chr8：86566135-86566435、chr8：95182801-95183101、chr8：99954843-99955143、chr8：144853418-144853717、chr9：130529101-130529401、chr9：137378101-137378401、chr9：44868901-44869201、chr9：97317483-97317783、chr9：102585769-102586068、chr9：27529891-27530023、chr9：37036916-37037215、chr9：93955005-93955305、chrX：100672978-100673278、chrX：114468337-114468637、chrX：115005001-115005301、chrX：32723401-32723701、chrY：13489201-13489501；
以及另外35种源自中国专利申请号202211120273.0的甲基化标志物。
2.根据权利要求1所述的用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合，其特征在于，所述甲基化生物标志物组合用于制备检测试剂盒。
3.根据权利要求2所述的用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合，其特征在于，所述检测试剂盒应用于检测前列腺癌肿瘤负荷。
4.根据权利要求1-3任一所述的用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合，其特征在于，所述甲基化生物标志物组合的检测方法，检测步骤如下：
步骤一：提取待测血液样本的cfDNA；
步骤二：将提取的cfDNA进行亚硫酸氢盐处理、得到转化后的cfDNA样本；
步骤三：对转化后cfDNA样本进行甲基化DNA建库；
步骤四：构建前列腺癌的靶向杂交捕获甲基化与文库；
步骤五：高通量测序，获得探针捕获的数据；
步骤六：甲基化数据分析，根据甲基化标记物和算法模型确认最终转移性前列腺癌信号和转移性肿瘤负荷信号。
5.根据权利要求4所述的用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合，其特征在于：步骤六中甲基化数据分析时，针对测序仪的下机原始数据，进行常规的生物信息学分析处理。
6.根据权利要求4所述的用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合，其特征在于：步骤一中所述的待测血液样是血浆、血清或血液。
7.根据权利要求4所述的用于检测转移性前列腺癌肿瘤负荷的甲基化生物标志物组合，其特征在于：其中骤五中，使用所述测序文库进行高通量测序，所述测序可通过任何测序方法进行，包括第二代测序技术或者是单分子测序技术。
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