CN113667757B - 用于前列腺癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用 - Google Patents
用于前列腺癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及用于前列腺癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用，用于前列腺癌早期筛查的生物标志物组合，包括与前列腺癌人群早期甲基化位点相关的5对靶标特异引物及对应的内参引物、特异性引物探针。与现有技术相比，本发明利用甲基化敏感内切酶不能切割甲基化位点的特性，降解非肿瘤来源cfDNA，特异扩增肿瘤来源ctDNA极大提升检查灵敏度，可用于早期侵袭性低、无临床症状的隐匿性前列腺癌的早期筛查、早期诊断、疗效评价和追踪以及预后评估。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及用于前列腺癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用。
背景技术
前列腺癌是欧美男性发病率最高的恶性肿瘤，在美国位于男性肿瘤死亡率的第二位，次于肺癌。据统计，美国2012 年有241740 个新诊断的前列腺癌患者，占全部新发肿瘤患者的29%; 有28170 人死千前列腺癌，占全部死于肿瘤的9% 。近年来我国前列腺癌发病率也不断升高。
临床用于前列腺癌诊断及治疗后复发监测的唯一标志物是血清学标志物前列腺特异性抗原(PSA), 但经PSA 为基础的筛查发现的患者中有约1/3 为进展缓慢、侵袭性低、无临床症状的隐匿性前列腺癌，导致部分病例过度诊治，增加了不必要的痛苦和损伤，且筛查对前列腺癌整体致死率并无实质性改善，提示许多隐匿性亚临床肿瘤的被诊断和治疗。这使得研究重点从以往患病风险基因易感性研究转为早期诊断侵袭性前列腺癌和发现致死性前列腺癌分子标签研究。
肿瘤标志物的发现和合理应用是肿瘤早期发现、早期诊断的前提。迄今为止，全球预测早期复发以及预后不佳的前列腺癌的标志物尚不成熟，对于新诊断前列腺癌患者，了解疾病进展风险和指引治疗过程的工具也很有限。因此，检出侵袭性前列腺癌标志物的研究已经成为前列腺癌这种具有高度的分子和临床异质性的肿瘤防治急需解决的的重大科学问题。
发明内容
针对以上述背景技术的不足，本发明提供一种用于前列腺癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用，解决了前列腺癌检测敏感度低，特异性差，避免过度诊治而增加了不必要的痛苦和损伤的问题。
本发明采用的技术方案如下：用于前列腺癌早期筛查的生物标志物组合，关键在于：包括与前列腺癌人群早期甲基化位点相关的5对靶标特异引物及对应的内参引物、特异性引物探针；其中所述5对靶标特异引物的序列如下：
Seq ID NO.1F ACCGAGAAGAAAAGGCCGTACTC，
Seq ID NO.1R TGTGAACCTTTCGCGGCTCGAC；
Seq ID NO.2F AGTTGCTGACGCAGTTCCTTC，
Seq ID NO.2R CCACGCCAGACTGTAGAGCAC；
Seq ID NO.3F GGAATTCTTTTGCTGCGCTG，
Seq ID NO.3R CAAGGCCCGGCACTTTTCA；
Seq ID NO.4F CCGAAGCCCACGTAGCCTG，
Seq ID NO.4R CACCGGACCCTCCTGGACTC；
Seq ID NO.5F CAAAGCCGCCGCTGCCAAAG，
Seq ID NO.5R CTCGGGGTCCAATAGTAGCGGGTAC；
内参引物的序列如下：
Seq ID NO.6F CCTACGAAAACCTCACGGCCAA，
Seq ID NO.6R TCGTCGTCCGCCTTGAGCA。
优选的，所述特异性引物探针序列如下：
Seq ID NO.1P FAM-TCTGCAGCAGGCGGGGACCT-BHQ1，
Seq ID NO.2P FAM-TCACCGAAAGCGCCAGACCCACA-BHQ1，
Seq ID NO.3P FAM-TACGCGGAGCCTGCTTTCCAC-BHQ1，
Seq ID NO.4P FAM-TCCAGCCCAGCCAGTACTTGCCCTC-BHQ1，
Seq ID NO.5P FAM-CTGCCGCCACTAGCCGGGCAT-BHQ1。
内参引物探针序列如下：
Seq ID NO.6P VIC-ACGAGCACGTGGCCTTCGAG-BHQ1。
用于前列腺癌早期筛查的试剂盒，关键在于：包括用于前列腺癌早期筛查的生物标志物组合及甲基化敏感内切酶体系。
优选的，所述甲基化敏感内切酶体系包含HinP1I、HpaII、AciI、HpyCH4IV。
以上试剂盒在制备前列腺癌早期筛查试剂中的应用，关键在于所述筛查方法包括以下步骤：
S1.提取尿液中游离的cfDNA；
S2.将cfDNA与甲基化敏感内切酶体系在37℃下孵育；
S3.将孵育产物作为模板，加入5对靶标特异引物及内参引物，进行多重PCR扩增；
S4.将扩增产物作为模板，加入5对靶标特异引物、5个特异性引物探针及内参引物，进行qPCR检测反应；
S5.根据5对靶标特异引物与内参引物的Ct值之差ΔCt，评估前列腺癌风险。
优选的，所述S1具体为：采用Qiagen尿液游离DNA提取试剂盒提取尿液中的cfDNA。
优选的，所述S3的扩增程序为：98℃/45 s，1个循环；98℃/15 s，55℃/30 s，72℃/30 s，12个循环； 72℃/1 min，1cycles；4℃/hold。
优选的，所述S4的qPCR检测反应程序为：95℃/3min，1个循环；98℃/15 s， 60℃/60 s，45个循环。
优选的，所述S5的评估方式为：
ΔCt=5对引物特异扩增Ct值-内参引物扩增Ct值；
ΔCt>4.8 前列腺癌低风险；
ΔCt≤4.8 前列腺癌高风险。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.通过深入挖掘CGAC项目与公共数据库资源，对比前列腺癌与癌旁DNA甲基化组特征，筛选中国人群前列腺癌早期基因组超甲基化区域，并与正常前列腺组织对应区域进行比对，选取在正常组织中低甲基化，且区域内含有CCGC, CCGG, GCGC,ACGT,GCGG中至少两个位点的区域作为靶点，设计100余对引物。筛选PCR效率高，特异性强，稳定性好的引物，最终得到5对可用于判别早期前列腺癌风险的引物及对应探针序列；
2. 利用甲基化敏感内切酶不能切割甲基化位点的特性，降解非肿瘤来源cfDNA，特异扩增肿瘤来源ctDNA极大提升检查灵敏度；
3.可用于早期侵袭性低、无临床症状的隐匿性前列腺癌的早期筛查、早期诊断、疗效评价和追踪以及预后评估。
附图说明
图1为基于本发明的分类性能AUC曲线图；
图2为基于本发明的风险判定图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。
实施例1 用于前列腺癌早期筛查的试剂盒
包括Qiagen尿液游离DNA提取试剂盒、HinP1I、HpaII、AciI、HpyCH4IV甲基化敏感内切酶体系、5对靶标特异引物及内参引物、5对特异性引物探针及内参引物探针；
其中其中所述5对靶标特异引物的序列如下：
Seq ID NO.1F ACCGAGAAGAAAAGGCCGTACTC，
Seq ID NO.1R TGTGAACCTTTCGCGGCTCGAC；
Seq ID NO.2F AGTTGCTGACGCAGTTCCTTC，
Seq ID NO.2R CCACGCCAGACTGTAGAGCAC；
Seq ID NO.3F GGAATTCTTTTGCTGCGCTG，
Seq ID NO.3R CAAGGCCCGGCACTTTTCA；
Seq ID NO.4F CCGAAGCCCACGTAGCCTG，
Seq ID NO.4R CACCGGACCCTCCTGGACTC；
Seq ID NO.5F CAAAGCCGCCGCTGCCAAAG，
Seq ID NO.5R CTCGGGGTCCAATAGTAGCGGGTAC；
内参引物的序列如下：
Seq ID NO.6F CCTACGAAAACCTCACGGCCAA，
Seq ID NO.6R TCGTCGTCCGCCTTGAGCA。
所述特异性引物探针序列如下：
Seq ID NO.1P FAM-TCTGCAGCAGGCGGGGACCT-BHQ1，
Seq ID NO.2P FAM-TCACCGAAAGCGCCAGACCCACA-BHQ1，
Seq ID NO.3P FAM-TACGCGGAGCCTGCTTTCCAC-BHQ1，
Seq ID NO.4P FAM-TCCAGCCCAGCCAGTACTTGCCCTC-BHQ1，
Seq ID NO.5P FAM-CTGCCGCCACTAGCCGGGCAT-BHQ1。
内参引物探针序列如下：
Seq ID NO.6P VIC-ACGAGCACGTGGCCTTCGAG-BHQ1。
实施例2 检测ctDNA甲基化水平变化的方法
1. 取10 mL尿液，采用Qiagen尿液游离DNA提取试剂盒（Cat: 954154）提取游离cfDNA；
2. 取20 ng cfDNA与20μL HinP1I、HpaII、AciI、HpyCH4IV四种甲基化敏感内切酶体系（终浓度10 U/μL），于37℃ 孵育16 h，80℃酶失活 20 min；
3.将孵育完成的全部产物作为模板，5对靶标特异引物（每种50 nM）加1个内参引物（10 nM）配置体系，设置以下表1设定程序在普通PCR仪中进行扩增程序；
表1
4. 取上步扩增产物1μL做为模板，加入5对靶标特异引物（每种0.25μM），5个特异性引物探针（每种0.1μM）加1个内参引物（0.05 μM）及内参引物探针（0.02 μM），设置以下表2设定程序在ABI 7500荧光PCR仪中进行qPCR反应，每轮循环结束前采集FAM及VIC通道信号；
表2
5. 根据4对靶标特异引物与内参引物的Ct值之差ΔCt，如图2所示，评估前列腺癌风险，ΔCt=5对引物特异扩增Ct值-内参引物扩增Ct值；
ΔCt>4.8 前列腺癌低风险；
ΔCt≤4.8 前列腺癌高风险。
对60例健康者和40例前列腺癌患者（Gleasonscore≥7）的尿液样本同时采用本发明评估前列腺癌风险性能，样本信息和测试结果如下表3所示：
表3
将表4中的数据导入到Graphpadprism 6.0软件中，自动生成ROC曲线，并统计曲线下面积AUC值（图1），横坐标为1-特异度，纵坐标为敏感度，软件统计结果以ΔCt<4.8为阈值，分类器敏感度91.53%，特异度92.31%。
最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 求臻医学科技（北京）有限公司
<120> 用于前列腺癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
accgagaaga aaaggccgta ctc 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
tgtgaacctt tcgcggctcg ac 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
agttgctgac gcagttcctt c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
ccacgccaga ctgtagagca c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
ggaattcttt tgctgcgctg 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
caaggcccgg cacttttca 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
ccgaagccca cgtagcctg 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
caccggaccc tcctggactc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
caaagccgcc gctgccaaag 20
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
ctcggggtcc aatagtagcg ggtac 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
cctacgaaaa cctcacggcc aa 22
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
tcgtcgtccg ccttgagca 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 13
tctgcagcag gcggggacct 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 14
tcaccgaaag cgccagaccc aca 23
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 15
tacgcggagc ctgctttcca c 21
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 16
tccagcccag ccagtacttg ccctc 25
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 17
ctgccgccac tagccgggca t 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 18
acgagcacgt ggccttcgag 20
Claims (8)
1.用于前列腺癌早期筛查的生物标志物组合物，其特征在于：包括与前列腺癌人群早期甲基化位点相关的5对靶标特异引物及对应的内参引物、特异性引物探针；其中所述5对靶标特异引物的序列如下：
Seq ID NO.1F ACCGAGAAGAAAAGGCCGTACTC，
Seq ID NO.1R TGTGAACCTTTCGCGGCTCGAC；
Seq ID NO.2F AGTTGCTGACGCAGTTCCTTC，
Seq ID NO.2R CCACGCCAGACTGTAGAGCAC；
Seq ID NO.3F GGAATTCTTTTGCTGCGCTG，
Seq ID NO.3R CAAGGCCCGGCACTTTTCA；
Seq ID NO.4F CCGAAGCCCACGTAGCCTG，
Seq ID NO.4R CACCGGACCCTCCTGGACTC；
Seq ID NO.5F CAAAGCCGCCGCTGCCAAAG，
Seq ID NO.5R CTCGGGGTCCAATAGTAGCGGGTAC；
内参引物的序列如下：
Seq ID NO.6F CCTACGAAAACCTCACGGCCAA，
Seq ID NO.6R TCGTCGTCCGCCTTGAGCA；
所述特异性引物探针序列如下：
Seq ID NO.1PFAM-TCTGCAGCAGGCGGGGACCT-BHQ1，
Seq ID NO.2PFAM-TCACCGAAAGCGCCAGACCCACA-BHQ1，
Seq ID NO.3PFAM-TACGCGGAGCCTGCTTTCCAC-BHQ1，
Seq ID NO.4PFAM-TCCAGCCCAGCCAGTACTTGCCCTC-BHQ1，
Seq ID NO.5PFAM-CTGCCGCCACTAGCCGGGCAT-BHQ1；
内参引物探针序列如下：
Seq ID NO.6PVIC-ACGAGCACGTGGCCTTCGAG-BHQ1。
2.用于前列腺癌早期筛查的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的用于前列腺癌早期筛查的生物标志物组合物及甲基化敏感内切酶体系。
3.根据权利要求2所述用于前列腺癌早期筛查的试剂盒，其特征在于：所述甲基化敏感内切酶体系包含HinP1I、HpaII、AciI、HpyCH4IV。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒在制备前列腺癌早期筛查试剂中的应用，其特征在于所述筛查方法包括以下步骤：
S1.提取尿液中游离的cfDNA；
S2.将cfDNA与甲基化敏感内切酶体系在37℃下孵育；
S3.将孵育产物作为模板，加入5对靶标特异引物及内参引物，进行多重PCR扩增；
S4.将扩增产物作为模板，加入5对靶标特异引物、5个特异性引物探针及内参引物，进行qPCR检测反应；
S5.根据5对靶标特异引物与内参引物的Ct值之差ΔCt，评估前列腺癌风险。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S1具体为：采用Qiagen尿液游离DNA提取试剂盒提取尿液中的cfDNA。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S3的扩增程序为：98℃/45 s，1个循环；98℃/15 s，55℃/30 s，72℃/30 s，12个循环； 72℃/1 min，1cycles；4℃/hold。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S4的qPCR检测反应程序为：95℃/3min，1个循环；98℃/15 s， 60℃/60 s，45个循环。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S5的评估方式为：
ΔCt=5对引物特异扩增Ct值-内参引物扩增Ct值；
ΔCt>4.8前列腺癌低风险；
ΔCt≤4.8 前列腺癌高风险。
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