CN115786496A - 预测或检测角膜营养不良的生物标志物组合及检测剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了预测或检测角膜营养不良的生物标志物组合及检测剂和应用。所述生物标志物组合包括以下SNP位点：rs541270955、rs121909211、rs121909210、rs80358223、rs121909212、rs118020901、rs185919705、rs34224785、rs532728316、rs121909208、rs1420975530和rs771397083。所述生物标志物组合在预测或检测角膜营养不良发病方面具有高准确性、特异性和灵敏度，尤其适合对东亚人人群进行预测或检测。所述检测剂具有良好的扩增和检测能力，能够精确地在样本中检测出所述生物标志物。
Description
技术领域
本发明属于疾病检测领域，具体涉及一种预测或检测角膜营养不良的生物标志物组合及检测剂和应用。
背景技术
角膜营养不良(Corneal Dystrophy，CD)是一组与遗传有关的原发性、具有病理学组织特性的疾病，以双眼对称性缓慢进行的角膜透明度丧失为典型临床表现，常导致复发性角膜糜烂和视觉损伤。随着分子遗传学研究技术的发展，越来越多类型的角膜营养不良的致病基因及相关突变已经被确定。常染色体显性遗传是角膜营养不良的主要遗传方式。但是我国现仅仅只针对角膜营养不良或TGFβI基因的部分位点进行了引物设计并进行检测，并没有用于预测或检测角膜营养不良相关多基因的热点设计。
发明内容
针对现有技术中尚未有预测或检测角膜营养不良的生物标志物组合的技术缺陷，本发明利用OMIM、HGMD和gnomAD数据库根据致病性和东亚人群频率筛选出了一种预测或检测角膜营养不良的生物标志物组合及检测剂，以及所述标志物组合或检测剂在制备预测或检测角膜营养不良的试剂盒中的应用。所述生物标志物组合在预测或检测角膜营养不良发病方面具有高准确性、特异性和灵敏度，尤其适合对东亚人人群进行预测或检测。所述检测剂具有良好的扩增和检测能力，能够精确地在样本中检测出所述生物标志物。
为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种预测或检测角膜营养不良的生物标志物组合，所述生物标志物组合包括以下SNP位点：rs541270955、rs121909211、rs121909210、rs80358223、rs121909212、rs118020901、rs185919705、rs34224785、rs532728316、rs121909208、rs1420975530和rs771397083。
在本发明一具体实施例中，所述生物标志物组合由以下SNP位点组成：rs541270955、rs121909211、rs121909210、rs80358223、rs121909212、rs118020901、rs185919705、rs34224785、rs532728316、rs121909208、rs1420975530和rs771397083。
为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种用于检测如本文所述的生物标志物组合的检测剂，所述检测剂包括分别或同时特异性识别所述生物标志物或与所述生物标志物特异性杂交的生物分子，所述生物分子例如引物、探针和/或抗体；或，所述检测剂包括用于检测如本文所述的生物标志物组合的基因组、转录组和/或蛋白质组测序的试剂。
较佳地，所述生物分子包括以下一组或多组引物对：
(1)用于检测rs541270955、rs121909211和rs121909210的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
(2)用于检测rs80358223的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
(3)用于检测rs121909212的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
(4)用于检测rs118020901的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；
(5)用于检测rs185919705的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
(6)用于检测rs34224785的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；
(7)用于检测rs532728316的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示
(8)用于检测rs121909208的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；
(9)用于检测rs1420975530的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；
(10)用于检测rs771397083的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示。
更佳地，各所述特异扩增引物对的份数为1-20份，例如1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、15份和20份。进一步更佳地，各所述特异扩增引物对的份数满足以下一种或多种：
(1)用于检测rs541270955、rs121909211和rs121909210的特异扩增引物对的份数为5份；
(2)用于检测rs80358223的特异扩增引物对的份数为5份；
(3)用于检测rs121909212的特异扩增引物对的份数为6份；
(4)用于检测rs118020901的特异扩增引物对的份数为4份；
(5)用于检测rs185919705的特异扩增引物对的份数为5份；
(6)用于检测rs34224785的特异扩增引物对的份数为8份；
(7)用于检测rs532728316的特异扩增引物对的份数为5份；
(8)用于检测rs121909208的特异扩增引物对的份数为5份；
(9)用于检测rs1420975530的特异扩增引物对的份数为6份；
(10)用于检测rs771397083的特异扩增引物对的份数为5份。
在本发明一具体实施方案中，所述各所述特异扩增引物对的份数满足：
(1)用于检测rs541270955、rs121909211和rs121909210的特异扩增引物对的份数为5份；
(2)用于检测rs80358223的特异扩增引物对的份数为5份；
(3)用于检测rs121909212的特异扩增引物对的份数为6份；
(4)用于检测rs118020901的特异扩增引物对的份数为4份；
(5)用于检测rs185919705的特异扩增引物对的份数为5份；
(6)用于检测rs34224785的特异扩增引物对的份数为8份；
(7)用于检测rs532728316的特异扩增引物对的份数为5份；
(8)用于检测rs121909208的特异扩增引物对的份数为5份；
(9)用于检测rs1420975530的特异扩增引物对的份数为6份；
(10)用于检测rs771397083的特异扩增引物对的份数为5份。
进一步更佳地，各所述特异扩增引物被用于PCR体系中时，各所述特异扩增引物对的工作浓度为0.01μM-0.2μM，例如0.074μM、0.093μM、0.111μM和0.148μM，优选为以下工作浓度中的一种或多种：
(1)用于检测rs541270955、rs121909211和rs121909210的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(2)用于检测rs80358223的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(3)用于检测rs121909212的特异扩增引物对的工作浓度为0.111μM；
(4)用于检测rs118020901的特异扩增引物对的工作浓度为0.074μM；
(5)用于检测rs185919705的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(6)用于检测rs34224785的特异扩增引物对的工作浓度为0.148μM；
(7)用于检测rs532728316的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(8)用于检测rs121909208的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(9)用于检测rs1420975530的特异扩增引物对的工作浓度为0.111μM；
(10)用于检测rs771397083的特异扩增引物的工作浓度为0.093μM。
在本发明一具体实施方案中，各所述特异扩增引物被用于多重PCR体系中时，各所述特异扩增引物对的工作浓度为：
(1)用于检测rs541270955、rs121909211和rs121909210的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(2)用于检测rs80358223的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(3)用于检测rs121909212的特异扩增引物对的工作浓度为0.111μM；
(4)用于检测rs118020901的特异扩增引物对的工作浓度为0.074μM；
(5)用于检测rs185919705的特异扩增引物对的工作浓度为0093μM
(6)用于检测rs34224785的特异扩增引物对的工作浓度为0.148μM；
(7)用于检测rs532728316的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(8)用于检测rs121909208的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(9)用于检测rs1420975530的特异扩增引物对的工作浓度为0.111μM；
(10)用于检测rs771397083的特异扩增引物的工作浓度为0.093μM；
此时，各所述引物能够使各标志物位点的扩增效率保持基本一致，提高结果的可靠性和易读性。
较佳地，所述生物分子包括探针，所述探针优选为SNP单碱基延伸引物，更优选包括以下一种或多种SNP单碱基延伸引物：
(1)用于检测rs121909211的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
(2)用于检测rs121909210的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；
(3)用于检测rs541270955的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；
(4)用于检测rs80358223的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；
(5)用于检测rs121909212的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；
(6)用于检测rs118020901的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；
(7)用于检测rs185919705的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；
(8)用于检测rs34224785的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；
(9)用于检测rs532728316的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示
(10)用于检测rs121909208的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；
(11)用于检测rs1420975530的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示；
(12)用于检测rs771397083的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示。
更佳地，各所述SNP单碱基延伸引物应用于SNP检测体系中时，各所述SNP单碱基延伸引物的份数为1-20份，例如1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、15份和20份。进一步更佳地，各所述SNP单碱基延伸引物的份数满足以下一种或多种：
(1)用于检测rs121909211的SNP单碱基延伸引物的份数为5份；
(2)用于检测rs121909210的SNP单碱基延伸引物的份数为4份；
(3)用于检测rs541270955的SNP单碱基延伸引物的份数为3份；
(4)用于检测rs80358223的SNP单碱基延伸引物的份数为3份；
(5)用于检测rs121909212的SNP单碱基延伸引物的份数为4份；
(6)用于检测rs118020901的SNP单碱基延伸引物的份数为3份；
(7)用于检测rs185919705的SNP单碱基延伸引物的份数为4份；
(8)用于检测rs34224785的SNP单碱基延伸引物的份数为4份；
(9)用于检测rs532728316的SNP单碱基延伸引物的份数为3份；
(10)用于检测rs121909208的SNP单碱基延伸引物的份数为3份；
(11)用于检测rs1420975530的SNP单碱基延伸引物的份数为4份；
(12)用于检测rs771397083的SNP单碱基延伸引物的份数为4份。
进一步更佳地，各所述SNP单碱基延伸引物应用于SNaPshot单碱基延伸体系中时，各所述SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.01μM-1μM，例如0.136μM、0.182μM和0.227μM，优选为以下工作浓度中的一种或多种：
(1)用于检测rs121909211的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0227μM；
(2)用于检测rs121909210的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(3)用于检测rs541270955的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(4)用于检测rs80358223的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(5)用于检测rs121909212的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(6)用于检测rs118020901的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(7)用于检测rs185919705的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(8)用于检测rs34224785的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(9)用于检测rs532728316的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(10)用于检测rs121909208的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(11)用于检测rs1420975530的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(12)用于检测rs771397083的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM。
在本发明一具体实施方案中，各所述SNP单碱基延伸引物的工作浓度为：
(1)用于检测rs121909211的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.227μM；
(2)用于检测rs121909210的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(3)用于检测rs541270955的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(4)用于检测rs80358223的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(5)用于检测rs121909212的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(6)用于检测rs118020901的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(7)用于检测rs185919705的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(8)用于检测rs34224785的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(9)用于检测rs532728316的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(10)用于检测rs121909208的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(11)用于检测rs1420975530的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(12)用于检测rs771397083的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
此时，各所述SNP单碱基延伸引物能够使各标志物位点的扩增产物量基本一致。
在本发明一具体实例中，所述生物分子包括以下一种或多种引物和探针组合：
(1)用于检测rs121909211的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于检测rs121909211的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
(2)用于检测rs121909210的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于检测rs121909210的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；
(3)用于检测rs541270955的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于检测rs541270955的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；
(4)用于检测rs80358223的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；用于检测rs80358223的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；
(5)用于检测rs121909212的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；用于检测rs121909212的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；
(6)用于检测rs118020901的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；用于检测rs118020901的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；
(7)用于检测rs185919705的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；用于检测rs185919705的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；
(8)用于检测rs34224785的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；用于检测rs34224785的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；
(9)用于检测rs532728316的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；用于检测rs532728316的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；
(10)用于检测rs121909208的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；用于检测rs121909208的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；
(11)用于检测rs1420975530的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；用于检测rs1420975530的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示；
(12)用于检测rs771397083的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；用于检测rs771397083的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示。
在本发明一具体实例中，所述生物分子包括以下一种或多种引物和探针组合：
(1)用于检测rs121909211的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于检测rs121909211的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；用于检测rs121909211的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(2)用于检测rs121909210的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于检测rs121909210的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；用于检测rs121909210的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(3)用于检测rs541270955的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于检测rs541270955的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；用于检测rs541270955的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(4)用于检测rs80358223的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；用于检测rs80358223的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；用于检测rs80358223的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(5)用于检测rs121909212的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；用于检测rs121909212的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；用于检测rs121909212的特异扩增引物对的工作浓度为0.111μM；
(6)用于检测rs118020901的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；用于检测rs118020901的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；用于检测rs118020901的特异扩增引物对的工作浓度为0.074μM；
(7)用于检测rs185919705的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；用于检测rs185919705的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；用于检测rs185919705的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(8)用于检测rs34224785的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；用于检测rs34224785的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；用于检测rs34224785的特异扩增引物对的工作浓度为0.148μM；
(9)用于检测rs532728316的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；用于检测rs532728316的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；用于检测rs532728316的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(10)用于检测rs121909208的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；用于检测rs121909208的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；用于检测rs121909208的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(11)用于检测rs1420975530的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；用于检测rs1420975530的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示；用于检测rs1420975530的特异扩增引物对的工作浓度为0.111μM；
(12)用于检测rs771397083的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；用于检测rs771397083的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示；用于检测rs771397083的特异扩增引物的工作浓度为0.093μM。
为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种试剂盒，包括如本文所述的生物标志物组合和/或如本文所述的检测剂。
较佳地，所述试剂盒包含PCR反应体系和SNP检测体系，所述PCR体系包含如本文所述的生物标志物组合的特异性扩增引物，所述SNP检测体系包括特异性识别如本文所述的生物标志物组合或与如本文所述的生物标志物组合特异性结合的探针。
较佳地，所述特异性扩增引物为如前文所述的特异性扩增引物。
较佳地，所述探针为如前文所述的探针。
较佳地，所述PCR反应体系为多重PCR扩增体系。
较佳地，所述SNP检测体系为SNaPshot单碱基延伸体系。
一种套装药盒，所述套装药盒包括药盒A，所述药盒A包括如本文所述的检测剂和/或如本文所述的试剂盒；
较佳地，所述套装药盒还包括药盒B，所述药盒B包括基因组取样试剂、角膜营养不良的诊断剂和角膜营养不良的治疗剂中的一中或多种。
为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：如本文所述的生物标志物组合、如本文所述的检测剂或如本文所述的试剂盒在制备预测或检测角膜营养不良的制剂中的应用。
较佳地，所述制剂为诊断产品。
为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种非诊断目的的检测如本文所述的生物标志物组合的方法，包括以下步骤：将待测样品和如本文所述的检测剂混合，或利用如本文所述的试剂盒检测所述待测样品。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明提供的预测或检测角膜营养不良的生物标志物组合可以准确、高特异性和灵敏地预测或检测角膜营养不良的发生，尤其适合在东亚人群中预测或检测角膜营养不良。而本发明提供的用于检测所述生物标志物组合的检测剂具有良好的扩增和检测能力，能够精确地在样本中检测出所述生物标志物。
附图说明
图1为样本的角膜营养不良基因位点峰图，其中各峰对应相应标出的SNP位点。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明利用OMIM(https://www.omim.org/)数据库找到角膜营养不良特定基因，利用HGMD数据库找对应基因的检测位点，利用gnomAD数据库查看东亚人群的检测位点频率分布，根据频率高低进行排序，最终确定6个基因12个检测位点。因为基因和检测位点比较多，当采用SNaPshot法进行检测时，分型准确并且通量高。
本发明检测的位点信息如下表1。
表1检测位点信息
实施例1基因组DNA抽提
用GENFINE(济凡)FineMag Swab DNA kits(FineMag磁珠法口腔拭子基因组提取试剂盒)(REF：M401)，提取角膜营养不良患者的口腔拭子基因组DNA。本实验经过良培基因生物科技(武汉)有限公司伦理委员会审核通过，所有病人样本和数据采集符合《医疗卫生机构科研用人类生物样本管理暂行办法(征求意见稿)》规定。并且患者签署了对研究的知情同意书。
按照说明书进行操作：
1、在拭子保存管(含500-600μl保存液)中加入20μl Proteinase K，然后分别加入250μl RLB和50μl SA；
2、高速涡旋混匀10sec，65℃水浴或振荡混匀20min；
3、取600μl消化液至新的EP管中，没管加入10μl FineMag Particles G和350μlIP液，颠倒混匀20-30次，温室孵育10min；
4、将EP管置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附后小心去除液体；
5、将EP管取下，加900μl DW1，涡旋15sec；
6、静置30sec后，待磁珠完全吸附后小心去除液体；
7、重复步骤5,6一次；
8、将EP管取下，加900μl MWE2，涡旋15sec；
9、静置30sec后，待磁珠完全吸附后小心去除液体；
10、温室晾干5min，加入50-100μl EB，振荡1min，70℃振荡孵育4min；
11、短暂离心后，将EP管置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附后，小心将DNA溶液转移到新的离心管中，并于适当条件保存；
12、使用前用Nanodrop进行测定DNA浓度，并调整到20ng/μl的终浓度。
实施例2多重PCR扩增目的片段
用的多重PCR扩增试剂(HuHi,REF:NH9350)，按说明书要求进行多重PCR扩增。本发明所有引物由擎科生物合成。
引物信息见下表2：
表2扩增引物信息
注：TGFBI的三个SNP位点rs541270955、rs121909211和rs121909210共用SEQ IDNO:1和2这一对引物。
按下表3配制反应体系：
表3扩增反应体系
| MPX体系 | 8μl |
| MPX扩增酶 | 1U |
| 引物混合物 | 1μl |
| DNA模板 | 40ng |
| 水 | 适量 |
| 总体系 | 20μl |
其中，引物混合物是把每种引物先稀释到20pmol/μl，然后所有引物按下表4中比例进行混合。
表4引物用量
扩增程序如下：
实施例3酶解纯化PCR片段
先配制酶解体系，然后按3μl PCR产物，5μl酶解体系，共8μl进行酶切消化。酶解体系配置见表5(300份为例)。
表5酶解体系
按下列程序进行：
37℃45min
95℃15min
得到酶解后的纯化PCR片段。
实施例4SNaPshot单碱基延伸
用配制好的单碱基延伸体系，进行单碱基延伸反应。SNaPshot单碱基延伸引物信息见下表6。
表6SNP单碱基延伸引物信息
注：各SNP单碱基延伸引物具体序列如下划线部分所示，并且在其5’端还包含一段聚PolydT(多聚脱氧胸苷酸)，本领域技术人员可以常规确定各引物适用的polydT长度。
延伸体系见下表7。
表7延伸体系
| 酶解后PCR产物 | 2μl |
| SNaPshot dye(AB,REF:4323151) | 0.8μl |
| 5×SEQ BUFFER | 1.7μl |
| 引物MIX | 1μl |
| 水 | 4.5μl |
| 10μl |
其中，引物MIX是把每种引物先稀释到20pmol/μl，然后所有引物按下表8中比例混合。
表8延伸引物用量
扩增程序如下：
得到单碱基延伸核酸混合液。
实施例5单碱基延伸产物酶解
纯化操作步骤：步骤四结束后，直接在各反应孔内加入1U SAP酶(Takara,REF:2660A)(酶浓度为1U/μl),上PCR仪进行酶解。
纯化程序如下：
37℃60min
75℃15min
得单碱基延伸产物酶解物。
实施例6SNaPshot检测
酶解结束后，其产物按下体系进行测序(毛细管电泳测序)。检测体系为：PCR酶解产物1μl+Hi-Di(AB,REF:4440753)9.0μl+GeneScan 120LIZ(AB,REF:4324287)0.1μl。混匀，95℃加热5min，使PCR酶解产物变性；待冷却至室温后，放入ABI 3500XL中进行测序。
实施例7SNP碱基分析
测序结果用GeneMarker HID V2.5.0进行分析，根据LIZ120片段大小标准品确定各峰的大小，再根据设计的各位点引物长度，对照确认各峰的片段大小。根据峰型颜色确认相应的碱基，再根据SNP单碱基延伸引物的方向确认是否记录SNP位点为互补序列，如果单碱基延伸使用的为反方向引物，则SNP位点为实际显示碱基的互补碱基。经过上述分析后，得到所有片段的SNP位点的碱基信息，再对照该位点的基因型，判定各位点的基因型。
表9SNP碱基分析结果
SNP分析结果见表9和图1，可见该患者样本的基因组中检测到了上述SNP位点，显示本发明筛选得到的SNP位点组合对角膜营养不良的预测或检测准确度较高。
Claims (10)
1.一种预测或检测角膜营养不良的生物标志物组合，其特征在于，所述生物标志物组合包括以下SNP位点：rs541270955、rs121909211、rs121909210、rs80358223、rs121909212、rs118020901、rs185919705、rs34224785、rs532728316、rs121909208、rs1420975530和rs771397083。
2.一种用于检测如权利要求1所述的生物标志物组合的检测剂，其特征在于，所述检测剂包括分别或同时特异性识别所述生物标志物或与所述生物标志物特异性杂交的生物分子，所述生物分子例如引物、探针和/或抗体；或，所述检测剂包括用于检测如权利要求1所述的生物标志物组合的基因组、转录组和/或蛋白质组测序的试剂。
3.如权利要求2所述的检测剂，其特征在于，所述生物分子包括以下一组或多组引物对：
(1)用于检测rs541270955、rs121909211和rs121909210的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
(2)用于检测rs80358223的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
(3)用于检测rs121909212的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
(4)用于检测rs118020901的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；
(5)用于检测rs185919705的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
(6)用于检测rs34224785的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；
(7)用于检测rs532728316的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；
(8)用于检测rs121909208的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；
(9)用于检测rs1420975530的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；
(10)用于检测rs771397083的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；
较佳地，各所述特异扩增引物对的份数为1-20份；
更佳地，各所述特异扩增引物对的份数满足以下一种或多种：
(1)用于检测rs541270955、rs121909211和rs121909210的特异扩增引物对的份数为5份；
(2)用于检测rs80358223的特异扩增引物对的份数为5份；
(3)用于检测rs121909212的特异扩增引物对的份数为6份；
(4)用于检测rs118020901的特异扩增引物对的份数为4份；
(5)用于检测rs185919705的特异扩增引物对的份数为5份；
(6)用于检测rs34224785的特异扩增引物对的份数为8份；
(7)用于检测rs532728316的特异扩增引物对的份数为5份；
(8)用于检测rs121909208的特异扩增引物对的份数为5份；
(9)用于检测rs1420975530的特异扩增引物对的份数为6份；
(10)用于检测rs771397083的特异扩增引物对的份数为5份；
进一步更佳地，各所述特异扩增引物被用于PCR体系中时，各所述特异扩增引物对的工作浓度为0.01μM-0.2μM，优选为以下工作浓度中的一种或多种：
(1)用于检测rs541270955、rs121909211和rs121909210的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(2)用于检测rs80358223的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(3)用于检测rs121909212的特异扩增引物对的工作浓度为0.111μM；
(4)用于检测rs118020901的特异扩增引物对的工作浓度为0.074μM；
(5)用于检测rs185919705的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(6)用于检测rs34224785的特异扩增引物对的工作浓度为0.148μM；
(7)用于检测rs532728316的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(8)用于检测rs121909208的特异扩增引物对的工作浓度为0.093μM；
(9)用于检测rs1420975530的特异扩增引物对的工作浓度为0.111μM；
(10)用于检测rs771397083的特异扩增引物的工作浓度为0.093μM。
4.如权利要求2所述的检测剂，其特征在于，所述生物分子包括探针，所述探针优选为SNP单碱基延伸引物，更优选包括以下一种或多种SNP单碱基延伸引物：
(1)用于检测rs121909211的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
(2)用于检测rs121909210的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；
(3)用于检测rs541270955的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；
(4)用于检测rs80358223的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；
(5)用于检测rs121909212的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；
(6)用于检测rs118020901的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；
(7)用于检测rs185919705的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；
(8)用于检测rs34224785的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；
(9)用于检测rs532728316的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；
(10)用于检测rs121909208的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；
(11)用于检测rs1420975530的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示；
(12)用于检测rs771397083的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示；
较佳地，各所述SNP单碱基延伸引物应用于SNP检测体系中时，各所述SNP单碱基延伸引物的份数为1-20份；
进一步更佳地，各所述SNP单碱基延伸引物的份数满足以下一种或多种：
(1)用于检测rs121909211的SNP单碱基延伸引物的份数为5份；
(2)用于检测rs121909210的SNP单碱基延伸引物的份数为4份；
(3)用于检测rs541270955的SNP单碱基延伸引物的份数为3份；
(4)用于检测rs80358223的SNP单碱基延伸引物的份数为3份；
(5)用于检测rs121909212的SNP单碱基延伸引物的份数为4份；
(6)用于检测rs118020901的SNP单碱基延伸引物的份数为3份；
(7)用于检测rs185919705的SNP单碱基延伸引物的份数为4份；
(8)用于检测rs34224785的SNP单碱基延伸引物的份数为4份；
(9)用于检测rs532728316的SNP单碱基延伸引物的份数为3份；
(10)用于检测rs121909208的SNP单碱基延伸引物的份数为3份；
(11)用于检测rs1420975530的SNP单碱基延伸引物的份数为4份；
(12)用于检测rs771397083的SNP单碱基延伸引物的份数为4份；
进一步更佳地，各所述SNP单碱基延伸引物应用于SNaPshot单碱基延伸体系中时，各所述SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.01μM-1μM，优选为以下工作浓度中的一种或多种：
(1)用于检测rs121909211的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.227μM；
(2)用于检测rs121909210的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(3)用于检测rs541270955的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(4)用于检测rs80358223的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(5)用于检测rs121909212的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(6)用于检测rs118020901的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(7)用于检测rs185919705的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(8)用于检测rs34224785的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(9)用于检测rs532728316的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(10)用于检测rs121909208的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.136μM；
(11)用于检测rs1420975530的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM；
(12)用于检测rs771397083的SNP单碱基延伸引物的工作浓度为0.182μM。
5.如权利要求2-4任一项所述的检测剂，其特征在于，所述生物分子包括以下一种或多种引物和探针组合：
(1)用于检测rs121909211的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于检测rs121909211的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
(2)用于检测rs121909210的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于检测rs121909210的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；
(3)用于检测rs541270955的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于检测rs541270955的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；
(4)用于检测rs80358223的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；用于检测rs80358223的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；
(5)用于检测rs121909212的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；用于检测rs121909212的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；
(6)用于检测rs118020901的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；用于检测rs118020901的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；
(7)用于检测rs185919705的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；用于检测rs185919705的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；
(8)用于检测rs34224785的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；用于检测rs34224785的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；
(9)用于检测rs532728316的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；用于检测rs532728316的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；
(10)用于检测rs121909208的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；用于检测rs121909208的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；
(11)用于检测rs1420975530的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；用于检测rs1420975530的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示；
(12)用于检测rs771397083的特异扩增引物对，其正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；用于检测rs771397083的SNP单碱基延伸引物，所述SNP单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的生物标志物组合和/或如权利要求2-5任一项所述的检测剂。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含PCR反应体系和SNP检测体系，所述PCR体系包含如权利要求1所述的生物标志物组合的特异性扩增引物，所述SNP检测体系包括特异性识别如权利要求1所述的生物标志物组合或与如权利要求1所述的生物标志物组合特异性结合的探针；
较佳地，所述特异性扩增引物为如权利要求3所述的检测剂中所述的特异性扩增引物；和/或，所述探针为如权利要求3所述的检测剂中所述的探针；和/或，所述PCR反应体系为多重PCR扩增体系；和/或，所述SNP检测体系为SNaPshot单碱基延伸体系。
8.一种套装药盒，其特征在于，所述套装药盒包括药盒A，所述药盒A包括如权利要求2-5任一项所述的检测剂和/或如权利要求6或7所述的试剂盒；
较佳地，所述套装药盒还包括药盒B，所述药盒B包括基因组取样试剂、角膜营养不良的诊断剂和角膜营养不良的治疗剂中的一中或多种。
9.如权利要求1所述的生物标志物组合、如权利要求2-5任一项所述的检测剂或如权利要求6或7所述的试剂盒在制备预测或检测角膜营养不良的制剂中的应用；较佳地，所述制剂为诊断产品。
10.一种非诊断目的的检测如权利要求1所述的生物标志物组合的方法，其特征在于，包括以下步骤：将待测样品和如权利要求2-5任一项所述的检测剂混合，或利用如权利要求6或7所述的试剂盒检测所述待测样品。
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