CN103849682A - 用于人类耳聋多基因突变筛查的引物、探针及其使用方法 - Google Patents

用于人类耳聋多基因突变筛查的引物、探针及其使用方法 Download PDF

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CN103849682A CN201410027023.1A CN201410027023A CN103849682A CN 103849682 A CN103849682 A CN 103849682A CN 201410027023 A CN201410027023 A CN 201410027023A CN 103849682 A CN103849682 A CN 103849682A
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Abstract

本发明公开了用于人类耳聋多基因突变筛查的引物、探针及其使用方法,属于基因检测技术领域。本发明公开了用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1、GJB2-M2或GJB2-M3、GJB2-M4和GJB2-M5筛查的引物和探针及其使用方法,用于人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M1或GJB3-M2筛查的引物和探针及其使用方法,用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1和SLC26A4-M2筛查的引物和探针及其使用方法。本发明提供的引物和探针及其使用方法,可以在同一次PCR反应中检测多个样本,相比传统的检测方法具有准确率高、步骤少,耗时少的优点。

Description

用于人类耳聋多基因突变筛查的引物、探针及其使用方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域,特别涉及用于人类耳聋多基因突变筛查的引物、探针及其使用方法。
背景技术
耳聋是严重影响人类健康的一种常见疾病,也是临床上最常见的遗传性疾病之一,因其病因复杂、发生率高且治疗困难,从而极大的影响着患者的人际交往与生活质量。据统计,耳聋在新生儿中的发病率约为1‰~3‰,全世界约有7000万人罹患不同程度的听力缺损,而我国是世界上听力障碍人口最多的国家,在全国各类残疾人中,听力残疾约占总数的24%,累及全国数千万个家庭。
耳聋的致病因素有很多,包括遗传因素和环境因素等,其中约50%-60%由遗传因素导致,即遗传性耳聋。在大量迟发性听力下降的患者中,许多也是由于自身基因缺陷或由于基因缺陷和多态性造成对环境因素的易感性增加而致病。根据是否伴有耳外组织的异常或病变,遗传性耳聋分为综合征性耳聋(SHL)和非综合征性耳聋(NSHL),其中NSHL占70%甚至更多。而根据遗传方式的不同又可将遗传性耳聋分为常染色体显性遗传(DFNA)、常染色体隐性遗传(DFNB)、X连锁遗传、Y连锁遗传及线粒体遗传五类,其中以DFNB最为常见,约占60%~75%;其次为DFNA,约占20%~30%。一般情况下,DFNB多表现为语前聋或先天性耳聋,DFNA多表现为语后聋或渐进性听力下降。
随着基因组学以及分子生物学技术的迅猛发展,对于遗传性耳聋相关基因及发病机制的研究已经取得了很大的进展。研究发现,在70%~80%的遗传性耳聋患者中可发现致聋基因突变,已知有数百个基因与遗传性耳聋有关,且绝大多数的遗传性耳聋为单基因病,而耳聋相关的遗传基因突变在正常群体中也并不少见,在我国现有人口中,携带遗传性致聋基因的比例约为6%。研究结果还表明,遗传性耳聋的致病基因及同一基因的突变位点在不同种族,甚至在同一种族的不同地区的人群中都不完全相同。目前,欧美发达国家列入耳聋致病基因临床检测的项目包括EYA1、TIMM8A、GJB2、GJB6、SLC26A4、USH2A、USH3A、POU3F4、WFS1、COCH、OTOF、TECTA以及线粒体DNA(mtDNA)等,但最普遍也是最基本的检测项目是GJB2、GJB6、SLC26A4、COCH和mtDNA基因的突变检测。而国内进行的耳聋分子流行病学调查结果显示,我国大部分的遗传性耳聋主要由GJB2、GJB3、SLC26A4以及mtDNA等为数不多的几个基因突变引起,对这几个基因进行遗传学检测可以明确耳聋人群中40%的遗传学病因,结合家族史分析和查体可以诊断95%以上的遗传性耳聋,这为我国耳聋致病基因筛查以及临床基因诊断工作的大规模开展提供了理论依据。
GJB2基因定位于13ql12q12上,含2个外显子,是NSHL最常见的致病基因,已被证实与常染色体隐性遗传性耳聋(DFNB1)和显性遗传性耳聋(DFNA3)有关,其编码的连接蛋白26(connexin26)表达于耳蜗,参与细胞间信号介导和离子传递。突变的GJB2基因可导致连接蛋白异常,进而影响细胞间隙的连接功能,引起内耳钾离子回收障碍而致耳聋。GJB2基因突变是中国人散发性先天性耳聋的主要病因,且有26%-33%的语前聋患儿为GJB2基因突变所致。目前在NSHL病人中已经发现了100多种GJB2基因突变类型,其主要突变类型包括35delG、167delT、235delC、V37I、299-300delAT、R143W、W24X等,这些突变类型在不同种族人群中的发生频率和分布情况差异很大,其中35delG为高加索人的致病热点突变,而我国的致病热点突变则为235delC。
GJB3基因于1998年由夏家辉等研究中国两个常染色体显性遗传非综合征性耳聋的家系时定位并克隆,该基因定位于人类染色体1p33-p35,编码由270个氨基酸组成的连接蛋白31(connexin31)。GJB3突变既可导致DFNA,又可导致DFNB,其错义突变E183K和无义突变R180X被认为与高频听力下降有关,复合杂合突变423-425delATT和423A-G能导致隐性非综合征性耳聋。多项研究结果表明,GJB3基因突变在中国耳聋人群中的携带率约为3%。
SLC26A4基因定位于7q31,亦称PDS基因,含21个外显子,是Pendred综合征和大前庭水管综合征的致病基因。SLC26A4基因编码的Pendred蛋白主要由疏水性氨基酸组成,其功能主要是参与碘/氯离子的转运。SLC26A4的突变导致Pendred蛋白发生异常,既可影响细胞内外阴离子的转运,从而影响声音传递而导致听力损失。在中国大陆,大前庭水管综合征患者SLC26A4基因突变检出率为97.9%,高于韩国(78%)、日本(92%)和欧洲(40%)。全国分子流行病学研究结果表明,中国人群的SLC26A4基因具有独特的突变谱,其IVS7-2A>G突变是大前庭水管综合征中的高发突变,在聋人群体中的检出率达到14.3%,占所有SLC26A4突变的45-60%,其次为第19外显子上的2168A>G突变。而在欧美国家耳聋患者中最常见的T416P、IVS8+1G>A、L236P等SLC26A4基因突变,在中国大前庭水管综合征患者中却鲜有发现。
综上所述,对遗传性耳聋致病基因GJB2、GJB3和SLC26A4的热点突变进行筛查,明确患者耳聋病因,依据基因检测结果指导临床医生及患者的疾病治疗情况以规避耳聋风险,对夫妻双方均为遗传性耳聋致病基因携带者的胎儿进行产前诊断,对于我国防治遗传性耳聋、推进优生优育、提高人口素质具有重要意义。目前,对遗传性耳聋致病基因进行检测的方法包括限制性片段长度多态性分析(RFLP),变性高效液相色谱分析(DHPLC),直接测序法等,这些方法或者不能定性,或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵,更重要的是这些方法难以同时对不同基因或同一基因的多个突变位点进行检测。由于遗传性耳聋具有遗传异质性强、突变位点多以及人群患病率及携带致病基因比例高等特点,因此有必要建立一种高通量、高效率的基因突变检测方法,以实现临床快速检测或大规模的人群筛查。基因芯片技术用于遗传性耳聋致病基因检测,具有通量高、自动化程度高等优点,但存在重复性差、易产生交叉污染从而造成假阳性结果等缺点。Real-Time PCR法在实时荧光定量PCR平台上进行闭管检测,能够有效克服PCR产物遗留污染的问题,且操作简便、快捷,根据引物和探针的优化设计,可同时检测多个样品不同基因或同一基因的多个突变位点,能够有效的应用于遗传性耳聋致病基因检测,是一种极具潜力的耳聋基因检测工具。
发明内容
为解决上述问题,本发明提出了一种用于人类耳聋多基因突变筛查的引物、探针及其使用方法。
一种用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1筛查的引物和探针,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示的DNA序列,Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1和Probe-2,其中Probe-1为序列表中SEQ ID NO.38或SEQ IDNO.40所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.41所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第30-35位碱基G的缺失。
上述用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1筛查的引物和探针的使用方法,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
Figure BDA0000459597710000031
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ IDNO.38或SEQ ID NO.40所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.41所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB2基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M1纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M1野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M1杂合突变。
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第30-35位碱基G的缺失。
一种用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M2或GJB2-M3筛查的引物和探针,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1、Probe-2、Probe-3和Probe-4,Probe-1为序列表中SEQ ID NO.42所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.43所示的DNA序列;Probe-3为序列表中SEQ ID NO.44所示的DNA序列;Probe-4为序列表中SEQ ID NO.45所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M2为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第167位碱基T的缺失;所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M3为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第176-191位16个碱基的缺失。
上述用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M2或GJB2-M3筛查的引物和探针的使用方法,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ IDNO.42所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.43所示的DNA序列;Probe-3为序列表中SEQ ID NO.44所示的DNA序列;Probe-4为序列表中SEQ ID NO.45所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB2基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M2或GJB2-M3纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M2或GJB2-M3野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M2或GJB2-M3杂合突变。
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M2为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第167位碱基T的缺失;所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M3为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第176-191位16个碱基的缺失。
一种用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M4筛查的引物和探针,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1和Probe-2,其中Probe-1为序列表中SEQ ID NO.46或SEQ IDNO.48所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.47或SEQ ID NO.49所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M4为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第233-235位碱基C的缺失。
上述用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M4筛查的引物和探针的使用方法,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
Figure BDA0000459597710000061
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ IDNO.46或SEQ ID NO.48所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.47或SEQ ID NO.49所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB2基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M4纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M4野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M4杂合突变。
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M4为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第233-235位碱基C的缺失。
一种用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M5筛查的引物和探针,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1和Probe-2,其中Probe-1为序列表中SEQ ID NO.50或SEQ IDNO.52所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.51或SEQ ID NO.53所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M5为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第299-300位碱基AT的缺失。
上述用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M5筛查的引物和探针的使用方法,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
Figure BDA0000459597710000071
Figure BDA0000459597710000081
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ IDNO.50或SEQ ID NO.52所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.51或SEQ ID NO.53所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB2基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M5纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M5野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M5杂合突变。
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M5为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第299-300位碱基AT的缺失。
一种用于人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M1或GJB3-M2筛查的引物和探针,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID NO.17或SEQ IDNO.18所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23中的任一个所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1、Probe-2、Probe-3和Probe-4,其中Probe-1为序列表中SEQ IDNO.54所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.55所示的DNA序列;Probe-3为序列表中SEQ ID NO.56或SEQ ID NO.58所示的DNA序列;Probe-4为序列表中SEQ IDNO.57或SEQ ID NO.59所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M1为人类耳聋GJB3基因的第二外显子的第538碱基由G变成T;所述的人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M2为人类耳聋GJB3基因的第二外显子的的第547碱基由G变成A。
上述用于人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M1或GJB3-M2筛查的引物和探针的使用方法,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23中的任一个所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ ID NO.54所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.55所示的DNA序列;Probe-3为序列表中SEQ ID NO.56或SEQ IDNO.58所示的DNA序列;Probe-4为序列表中SEQ ID NO.57或SEQ ID NO.59所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到GJB3基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的GJB3基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB3基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的GJB3基因为GJB3-M1或GJB3-M2纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的GJB3基因为GJB3-M1或GJB3-M2野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的GJB3基因为GJB3-M1或GJB3-M2杂合突变。
其中,所述的人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M1为人类耳聋GJB3基因的第二外显子的第538碱基由G变成T;所述的人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M2为人类耳聋GJB3基因的第二外显子的第547碱基由G变成>A。
一种用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1筛查的引物和探针,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID NO.24或SEQ IDNO.25所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29中的任一个所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1和Probe-2,其中Probe-1为序列表中SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62中的任一个所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.63所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1为人类耳聋SLC26A4基因的IVS7-2A>G。
上述用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1筛查的引物和探针的使用方法,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
Figure BDA0000459597710000101
Figure BDA0000459597710000111
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29中的任一个所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62中的任一个所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.63所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到SLC26A4基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的SLC26A4基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB3基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M1纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M1野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M1杂合突变。
其中,所述的人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1为人类耳聋SLC26A4基因的IVS7-2A>G。
一种用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M2筛查的引物和探针,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.31和SEQ ID NO.32中的任一个所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37中的任一个所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1和Probe-2,其中Probe-1为序列表中SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66和SEQ ID NO.67中的任一个所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ IDNO.68所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M2为人类耳聋SLC26A4基因的第十九外显子的第2168碱基由A变成G。
上述用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M2筛查的引物和探针的使用方法,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
Figure BDA0000459597710000121
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32中的任一个所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQID NO.36和SEQ ID NO.37中的任一个所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66和SEQ ID NO.67中的任一个所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.68所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到SLC26A4基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的SLC26A4基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB3基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M2纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M2野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M2杂合突变。
其中,所述的人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M2为人类耳聋SLC26A4基因的第十九外显子的第2168碱基由A变成G。
表1:用于人类耳聋多基因突变筛查的引物和探针序列
引物名称 序列 序列编号
GJB2-M1-F1 5’-TAGTGATTCCTGTGTTGTGTG-3’ SEQ ID NO.1
GJB2-M1-F2 5’-TCTGTCCTAGCTAGTGATTCCT-3’ SEQ ID NO.2
GJB2-M1-R1 5’-AGAGGACGGTGAGCCAGA-3’ SEQ ID NO.3
GJB2-M1-R2 5’-AAGAGGACGGTGAGCCA-3’ SEQ ID NO.4
GJB2-M1-P1 FAM-5’-ACGATCCTGGGGGTGT-3’-MGB SEQ ID NO.38
GJB2-M1-P1’ HEX-5’-CGATCCTGGGGGTGTGA-3’-MGB SEQ ID NO.39
GJB2-M1-P2 FAM-5’-CGATCCTGGGGGGTGT-3’-MGB SEQ ID NO.40
GJB2-M1-P2’ HEX-5’-ATCCTGGGGGGTGTGA-3’-MGB SEQ ID NO.41
GJB2-M2\3-F1 5’-TATGATCCTCGTTGTGGCT-3’ SEQ ID NO.5
GJB2-M2\3-F2 5’-TTCGCATTATGATCCTCGTTGT-3’ SEQ ID NO.6
GJB2-M2\3-R1 5’-ACACGAAGATCAGCTGC-3’ SEQ ID NO.7
GJB2-M2\3-R2 5’-CATAGCCGGATGTGGGAG-3’ SEQ ID NO.8
GJB2-M2-P1 FAM-5’-TCTGCAACACCCGCA-3’-MGB SEQ ID NO.42
GJB2-M2-P1’ HEX-5’-TCTGCAACACCCTGCA-3’-MGB SEQ ID NO.43
GJB2-M3-P1 FAM-5’-CAGCCAGCTACGATCA-3’-MGB SEQ ID NO.44
GJB2-M3-P1’ HEX-5’-CCAGGCTGCAAGAACGTGTGCT-3’-TAMRA SEQ ID NO.45
GJB2-M4-F1 5’-TGTGCTACGATCACTACTTCC-3’ SEQ ID NO.9
GJB2-M4-F2 5’-AAGAACGTGTGCTACGATCA-3’ SEQ ID NO.10
GJB2-M4-R1 5’-CCCCCTTGATGAACTTCCTC-3’ SEQ ID NO.11
GJB2-M4-R2 5’-CTTCTTCTCATGTCTCCGGT-3’ SEQ ID NO.12
GJB2-M4-P1 FAM-5’-CGGCTATGGGCCTGCA-3’-MGB SEQ ID NO.46
GJB2-M4-P1’ HEX-5’-CGGCTATGGGCCCTGCA-3’-MGB SEQ ID NO.47
GJB2-M4-P2 FAM-5’-ATCCGGCTATGGGCCTG-3’-MGB SEQ ID NO.48
GJB2-M4-P2’ HEX-5’-ATCCGGCTATGGGCCCTG-3’-MGB SEQ ID NO.49
GJB2-M5-F1 5’-TGATCTTCGTGTCCACGC-3’ SEQ ID NO.13
GJB2-M5-F2 5’-CTGATCTTCGTGTCCACG-3’ SEQ ID NO.14
GJB2-M5-R1 5’-GGAGCCTTCGATGCGG-3’ SEQ ID NO.15
GJB2-M5-R2 5’-CTTCGATGCGGACCTTCTG-3’ SEQ ID NO.16
GJB2-M5-P1 FAM-5’-TGGCCTACCGGAGACGAG-3’-MGB SEQ ID NO.50
GJB2-M5-P1’ HEX-5’-CCTACCGGAGACATGAG-3’-MGB SEQ ID NO.51
GJB2-M5-P2 FAM-5’-TGGCCTACCGGAGACGAG-3’-MGB SEQ ID NO.52
GJB2-M5-P2’ HEX-5’-CCTACCGGAGACATGAGA-3’-MGB SEQ ID NO.53
GJB3-M-F1 5’-TCTCTGGCATGGCTTCAATATG-3’ SEQ ID NO.17
GJB3-M-F2 5’-CTCTCTGGCATGGCTTCAATATG-3’ SEQ ID NO.18
GJB3-M-R1 5’-CACCATGAAGTAGGTGAAGATTTTCTT-3’ SEQ ID NO.19
GJB3-M-R2 5’-CCACCATGAAGTAGGTGAAGATTTT-3’ SEQ ID NO.20
GJB3-M-R3 5’-CCCACCATGAAGTAGGTGAAGAT-3’ SEQ ID NO.21
GJB3-M-R4 5’-GGCGCCCACCATGAAGTA-3’ SEQ ID NO.22
GJB3-M-R5 5’-GAGGCGCCCACCATGA-3’ SEQ ID NO.23
GJB3-M1-P1 FAM-5’-GCCCCCTGCCCCAACA-3’-MGB SEQ ID NO.54
GJB3-M1-P1’ HEX-5’-GTGGCCCCCTGCCCTAACA-3’-MGB SEQ ID NO.55
GJB3-M2-P1 FAM-5’-CCCAACATCGTAGAC-3’-MGB SEQ ID NO.56
GJB3-M2-P1’ HEX-5’-CCCCAACATCGTGGAC-3’-MGB SEQ ID NO.57
GJB3-M2-P2 FAM-5’-CCCAACATCGTAGACT-3’-MGB SEQ ID NO.58
GJB3-M2-P2’ HEX-5’-AACATCGTGGACTGCT-3’-MGB SEQ ID NO.59
SLC26A4-M1-F1 5’-AAAGTTCAGCATTATTTGGTTGACAA-3’ SEQ ID NO.24
SLC26A4-M1-F2 5’-GAAAGTTCAGCATTATTTGGTTGACA-3’ SEQ ID NO.25
SLC26A4-M1-R1 5’-AGGTTGGCTCCATATGAAATGG-3’ SEQ ID NO.26
SLC26A4-M1-R2 5’-CCAGGTTGGCTCCATATGAAA-3’ SEQ ID NO.27
SLC26A4-M1-R3 5’-TTTTTTCCAGGTTGGCTCCATA-3’ SEQ ID NO.28
SLC26A4-M1-R4 5’-TTTTTCCAGGTTGGCTCCAT-3’ SEQ ID NO.29
SLC26A4-M1-P1 FAM-5’-ATCTTTTGTTTTATTTCGGACGA-3’-MGB SEQ ID NO.60
SLC26A4-M1-P2 FAM-5’-TCTTTTGTTTTATTTCGGACGA-3’-MGB SEQ ID NO.61
SLC26A4-M1-P3 FAM-5’-CTTTTGTTTTATTTCGGACGAT-3’-MGB SEQ ID NO.62
SLC26A4-M1-P’ HEX-5’-CATCTTTTGTTTTATTTCAGACG-3’-MGB SEQ ID NO.63
SLC26A4-M2-F1 5’-TGACGACAACATTAGAAAGGACACA-3’ SEQ ID NO.30
SLC26A4-M2-F2 5’-GGAGCAATGCGGGTTCTTT-3’ SEQ ID NO.31
SLC26A4-M2-F3 5’-TGGAGCAATGCGGGTTCT-3’ SEQ ID NO.32
SLC26A4-M2-R1 5’-TGAGATTTCACTTGGTTCTGTAGATAGAG-3’ SEQ ID NO.33
SLC26A4-M2-R2 5’-TTGACCCTCTTGAGATTTCACTTG-3’ SEQ ID NO.34
SLC26A4-M2-R3 5’-CTTGACCCTCTTGAGATTTCACTTG-3’ SEQ ID NO.35
SLC26A4-M2-R4 5’-CCTTGACCCTCTTGAGATTTCACTT-3’ SEQ ID NO.36
SLC26A4-M2-R5 5’-ATGGAACCTTGACCCTCTTGAGA-3’ SEQ ID NO.37
SLC26A4-M2-P1 FAM-5’-CGGTCCGTGATGC-3’-MGB SEQ ID NO.64
SLC26A4-M2-P2 FAM-5’-TTGACGGTCCGTGATG-3’-MGB SEQ ID NO.65
SLC26A4-M2-P3 FAM-5’-TGACGGTCCGTGATG-3’-MGB SEQ ID NO.66
SLC26A4-M2-P4 FAM-5’-ACGGTCCGTGATGC-3’-MGB SEQ ID NO.67
SLC26A4-M2-P’ HEX-5’-TGACGGTCCATGATG-3’-MGB SEQ ID NO.68
表2:GJB2、GJB3和SLC26A4的9种突变
突变名称 突变 外显子/内含子 碱基变化
GJB2-M1 35delG Exon-2 第30-35位碱基G的缺失
GJB2-M2 167delT Exon-2 第167位碱基T的缺失
GJB2-M3 176_191del16 Exon-2 第176-191位16个碱基的缺失
GJB2-M4 235delC Exon-2 第233-235位碱基C的缺失
GJB2-M5 299_300delAT Exon-2 第299-300位碱基AT的缺失
GJB3-M1 R180X Exon-2 第538碱基由G变成T
GJB3-M2 E183K Exon-2 第547碱基由G变成A
SLC26A4-M1 Intron-7 IVS7-2A>G
SLC26A4-M2 H723R Exon-19 第2168碱基由A变成G
本发明的有益效果是:
使用本发明提供的用于人类耳聋多基因突变筛查的引物和探针序列检测人类耳聋多基因突变的多重实时荧光PCR,可以在同一次PCR反应中检测多个样本,准确率高、步骤少,耗时少。
附图说明
图1是本发明实施例1中GJB2-M1基因野生型扩增曲线图;
图2是本发明实施例1中GJB2-M1基因纯合突变扩增曲线图;
图3是本发明实施例1中GJB2-M1基因杂合突变扩增曲线图。
图4是本发明实施例2中GJB3-M1基因野生型扩增曲线图;
图5是本发明实施例2中GJB3-M1基因纯合突变扩增曲线图;
图6是本发明实施例2中GJB3-M1基因杂合突变扩增曲线图。
图7是本发明实施例3中SLC26A4-M1基因野生型扩增曲线图;
图8是本发明实施例3中SLC26A4-M1基因纯合突变扩增曲线图;
图9是本发明实施例3中SLC26A4-M1基因杂合突变扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步说明:
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的全血样品均为非肝素抗凝全血;使用的10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶均购自中国大连宝生物公司。
实施例1:
本实施例以GJB2基因检测为例来说明单管荧光PCR检测待检样品的方法。
实验用样品为某聋哑人学校学员及家属共计1200例样本,其中聋哑人400例,家属800例。
利用上述荧光PCR的方法来鉴定1200人中GJB2基因突变的方法如下:
(1)样品的DNA提取:
每人抽取400μL全血样品,采用RBC公司MagCore Genomic DNA Whole Blood Kit试剂盒(Cat.No.:MGB400-04),按试剂盒的操作说明提取DNA。经紫外分光光度计检测提取的DNA质量后,将提取的DNA用Tris-HCl溶液(10mmol/L,pH8.0)调整到10ng/μL作为PCR扩增的模板;
(2)荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
Figure BDA0000459597710000161
Figure BDA0000459597710000171
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环。
当用上述PCR体系检测GJB2-M1突变时,上述PCR体系中的Primer-F为序列表中SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ ID NO.38或SEQ ID NO.40所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.41所示的DNA序列;无Probe-3和Probe-4;
当用上述PCR体系检测GJB2-M2或GJB2-M3突变时,上述PCR体系中的Primer-F为序列表中SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ ID NO.42所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.43所示的DNA序列;Probe-3为序列表中SEQ ID NO.44所示的DNA序列;Probe-4为序列表中SEQ ID NO.45所示的DNA序列;
当用上述PCR体系检测GJB2-M4突变时,上述PCR体系中的Primer-F为序列表中SEQID NO.9或SEQ ID NO.10所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.11或SEQ IDNO.12所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ ID NO.46或SEQ ID NO.48所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.47或SEQ ID NO.49所示的DNA序列;无Probe-3和Probe-4;
当用上述PCR体系检测GJB2-M5突变时,上述PCR体系中的Primer-F为序列表中SEQID NO.13或SEQ ID NO.14所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.15或SEQ IDNO.16所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ ID NO.50或SEQ ID NO.52所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.51或SEQ ID NO.53所示的DNA序列;无Probe-3和Probe-4;
(3)检测:
采用Mx3000P实时PCR扩增仪(StrataGene公司)于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到GJB2基因扩增曲线。一次可检测96份样品。
(4)结果判定:
根据步骤3得到的GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB2基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的GJB2基因为纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为杂合突变。
结果显示,前述样本中,400例聋哑人中共计检出GJB2基因突变85例,其中78例为GJB2-M4(即235delC)突变;7例为GJB2-M5(即299_300delAT突变);800例家属中共检出GJB2基因突变118例,其中2例为GJB2-M1(即35delG)突变,1例为GJB2-M2或GJB2-M3(即167delT或176_191del16)突变,109例为GJB2-M4(即235delC)突变,10例为GJB2-M5(即299_300delAT)突变。
同时采用测序法将上述所有DNA样品送上海生工进行测序验证。经测序得到的结果和使用本发明提供的方法得到的结果对比如表4所示:
表4
Figure BDA0000459597710000181
由表4可知,使用本实施例提供的方法与使用测序方法得到的结果完全一致,说明本实施例提供的方法准确率很高;但是,与测序相比,本方法单个PCR反应即可判断检体为野生型、纯合突变和杂合突变,检测时间仅需100分钟,步骤少,耗时少,可满足产前诊断的快速筛查。
实施例2:
本实施例以GJB3基因检测为例来说明单管荧光PCR检测待检样品的方法。
实验用样品为某聋哑人学校学员及家属共计1200例样本,其中聋哑人400例,家属800例。
利用上述荧光PCR的方法来鉴定1200人中GJB3基因突变的方法如下:
(1)样品的DNA提取:
每人抽取400μL全血样品,采用RBC公司MagCore Genomic DNA Whole Blood Kit试剂盒(Cat.No.:MGB400-04),按试剂盒的操作说明提取DNA。经紫外分光光度计检测提取的DNA质量后,将提取的DNA用Tris-HCl溶液(10mmol/L,pH8.0)调整到10ng/μL作为PCR扩增的模板;
(2)荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环。
当用上述PCR体系检测GJB3-M1或GJB3-M2突变时,上述PCR体系中的Primer-F为序列表中SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23中的任一个所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ ID NO.54所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ IDNO.55所示的DNA序列;Probe-3为序列表中SEQ ID NO.56或SEQ ID NO.58所示的DNA序列;Probe-4为序列表中SEQ ID NO.57或SEQ ID NO.59所示的DNA序列;
(3)检测:
采用Mx3000P实时PCR扩增仪(StrataGene公司)于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到GJB3基因扩增曲线。一次可检测96份样品。
(4)结果判定:
根据步骤3得到的GJB3基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB3基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的GJB3基因为纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的GJB3基因为野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的GJB3基因为杂合突变。
结果显示,前述样本中,400例聋哑人中共计检出GJB3基因突变10例,其中6例为GJB3-M2(即547G>A)突变;4例为GJB3-M1(即538C>T)突变;800例家属中共检出GJB3基因突变17例,其中10例为GJB3-M2(即547G>A)突变,7例为GJB3-M1(即538C>T)突变。
同时采用测序法将上述所有DNA样品送上海生工进行测序验证。经测序得到的结果和使用本发明提供的方法得到的结果对比如表5所示:
表5
Figure BDA0000459597710000201
由表5可知,使用本实施例提供的方法与使用测序方法得到的结果完全一致,说明本实施例提供的方法准确率很高;但是,与测序验证法相比,本方法单个PCR反应即可判断检体为野生型、纯合突变和杂合突变,检测时间仅需100分钟,步骤少,耗时少,可满足产前诊断的快速筛查。
实施例3:
本实施例以SLC26A4基因检测为例来说明单管荧光PCR检测待检样品的方法。
实验用样品为某聋哑人学校学员及家属共计1200例样本,其中聋哑人400例,家属800例。
利用上述荧光PCR的方法来鉴定1200人中SLC26A4基因突变的方法如下:
(1)样品的DNA提取:
每人抽取400μL全血样品,采用RBC公司MagCore Genomic DNA Whole Blood Kit试剂盒(Cat.No.:MGB400-04),按试剂盒的操作说明提取DNA。经紫外分光光度计检测提取的DNA量后,将提取的DNA用Tris-HCl溶液(10mmol/L,pH8.0)调整到10ng/μL作为PCR扩增模板;
(2)荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
Figure BDA0000459597710000202
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环。
当用上述PCR体系检测SLC26A4-M1突变时,上述PCR体系中的Primer-F为序列表中SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.26、SEQID NO.27、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29中的任一个所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62中的任一个所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.63所示的DNA序列;
当用上述PCR体系检测SLC26A4-M2突变时,上述PCR体系中的Primer-F为序列表中SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32中的任一个所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37中的任一个所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ IDNO.66和SEQ ID NO.67中的任一个所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.68所示的DNA序列;
(3)检测:
采用Mx3000P实时PCR扩增仪(StrataGene公司)于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到SLC26A4基因扩增曲线。一次可检测96份样品。
(4)结果判定:
根据步骤3得到的SLC26A4基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的SLC26A4基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为杂合突变。
结果显示,前述样本中,400例聋哑人中共计检出SLC26A4基因突变56例,其中41例为SLC26A4-M2(即IVS7-2A>G)突变;15例为SLC26A4-M1(即2168A>G)突变;800例家属中共检出SLC26A4基因突变103例,其中72例为SLC26A4-M2(即IVS7-2A>G)突变,31例为SLC26A4-M1(即2168A>G)突变。
同时采用测序法将上述所有DNA样品送上海生工进行测序验证。经测序得到的结果和使用本发明提供的方法得到的结果对比如表6所示:
表6
Figure BDA0000459597710000211
由表6可知,使用本实施例提供的方法与使用测序方法得到的结果完全一致,说明本实施例提供的方法准确率很高;但是,与测序验证法相比,本方法单个PCR反应即可判断检体为野生型、纯合突变和杂合突变,检测时间仅需100分钟,步骤少,耗时少,可满足产前诊断的快速筛查。
Figure IDA0000459597800000011
Figure IDA0000459597800000021
Figure IDA0000459597800000031
Figure IDA0000459597800000041
Figure IDA0000459597800000051
Figure IDA0000459597800000061
Figure IDA0000459597800000071
Figure IDA0000459597800000081
Figure IDA0000459597800000091
Figure IDA0000459597800000101
Figure IDA0000459597800000111
Figure IDA0000459597800000121
Figure IDA0000459597800000131
Figure IDA0000459597800000141
Figure IDA0000459597800000161

Claims (14)

1.一种用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1筛查的引物和探针,其特征在于,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示的DNA序列,Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1和Probe-2,其中Probe-1为序列表中SEQ ID NO.38或SEQ IDNO.40所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.41所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第30-35位碱基G的缺失。
2.权利要求1所述的用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1筛查的引物和探针的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ IDNO.38或SEQ ID NO.40所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.41所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB2基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M1纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M1野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M1杂合突变;
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第30-35位碱基G的缺失。
3.一种用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M2或GJB2-M3筛查的引物和探针,其特征在于,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1、Probe-2、Probe-3和Probe-4,Probe-1为序列表中SEQ ID NO.42所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.43所示的DNA序列;Probe-3为序列表中SEQ ID NO.44所示的DNA序列;Probe-4为序列表中SEQ ID NO.45所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M2为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第167位碱基T的缺失;所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M3为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第176-191位16个碱基的缺失。
4.权利要求3所述的用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M2或GJB2-M3筛查的引物和探针的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
Figure FDA0000459597700000021
Figure FDA0000459597700000031
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ IDNO.42所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.43所示的DNA序列;Probe-3为序列表中SEQ ID NO.44所示的DNA序列;Probe-4为序列表中SEQ ID NO.45所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB2基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M2或GJB2-M3纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M2或GJB2-M3野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M2或GJB2-M3杂合突变;
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M2为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第167位碱基T的缺失;所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M3为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第176-191位16个碱基的缺失。
5.一种用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M4筛查的引物和探针,其特征在于,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1和Probe-2,其中Probe-1为序列表中SEQ ID NO.46或SEQ IDNO.48所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.47或SEQ ID NO.49所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M4为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第233-235位碱基C的缺失。
6.权利要求5所述的用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M4筛查的引物和探针的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
Figure FDA0000459597700000041
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ IDNO.46或SEQ ID NO.48所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.47或SEQ ID NO.49所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB2基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M4纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M4野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M4杂合突变;
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M4为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第233-235位碱基C的缺失。
7.一种用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M5筛查的引物和探针,其特征在于,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1和Probe-2,其中Probe-1为序列表中SEQ ID NO.50或SEQ IDNO.52所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.51或SEQ ID NO.53所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M5为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第299-300位碱基AT的缺失。
8.权利要求7所述的用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M5筛查的引物和探针的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
Figure FDA0000459597700000051
Figure FDA0000459597700000061
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ IDNO.50或SEQ ID NO.52所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.51或SEQ ID NO.53所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB2基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M5纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M5野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M5杂合突变;
其中,所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M5为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第299-300位碱基AT的缺失。
9.一种用于人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M1或GJB3-M2筛查的引物和探针,其特征在于,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID NO.17或SEQ IDNO.18所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23中的任一个所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1、Probe-2、Probe-3和Probe-4,其中Probe-1为序列表中SEQ IDNO.54所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.55所示的DNA序列;Probe-3为序列表中SEQ ID NO.56或SEQ ID NO.58所示的DNA序列;Probe-4为序列表中SEQ IDNO.57或SEQ ID NO.59所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M1为人类耳聋GJB3基因的第二外显子的第538碱基由G变成T;所述的人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M2为人类耳聋GJB3基因的第二外显子的的第547碱基由G变成A。
10.权利要求9所述的用于人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M1或GJB3-M2筛查的引物和探针的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
Figure FDA0000459597700000071
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23中的任一个所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ ID NO.54所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.55所示的DNA序列;Probe-3为序列表中SEQ ID NO.56或SEQ IDNO.58所示的DNA序列;Probe-4为序列表中SEQ ID NO.57或SEQ ID NO.59所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到GJB3基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的GJB3基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB3基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的GJB3基因为GJB3-M1或GJB3-M2纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的GJB3基因为GJB3-M1或GJB3-M2野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的GJB3基因为GJB3-M1或GJB3-M2杂合突变;
其中,所述的人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M1为人类耳聋GJB3基因的第二外显子的第538碱基由G变成T;所述的人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M2为人类耳聋GJB3基因的第二外显子的第547碱基由G变成>A。
11.一种用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1筛查的引物和探针,其特征在于,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID NO.24或SEQ IDNO.25所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29中的任一个所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1和Probe-2,其中Probe-1为序列表中SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62中的任一个所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.63所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1为人类耳聋SLC26A4基因的IVS7-2A>G。
12.权利要求11所述的用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1筛查的引物和探针的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
Figure FDA0000459597700000081
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29中的任一个所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62中的任一个所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.63所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到SLC26A4基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的SLC26A4基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB3基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M1纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M1野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M1杂合突变;
其中,所述的人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1为人类耳聋SLC26A4基因的IVS7-2A>G。
13.一种用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M2筛查的引物和探针,其特征在于,所述的引物和探针如下:
所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.31和SEQ ID NO.32中的任一个所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37中的任一个所示的DNA序列;
所述的探针为Probe-1和Probe-2,其中Probe-1为序列表中SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66和SEQ ID NO.67中的任一个所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ IDNO.68所示的DNA序列;
其中,所述的人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M2为人类耳聋SLC26A4基因的第十九外显子的第2168碱基由A变成G。
14.权利要求13所述的用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M2筛查的引物和探针的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:样品的DNA提取;
步骤2:荧光PCR扩增:
PCR体系如下:
Figure FDA0000459597700000101
PCR反应条件如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒,15个循环;93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环;
其中,Primer-F为序列表中SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32中的任一个所示的DNA序列;Primer-R为序列表中SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQID NO.36和SEQ ID NO.37中的任一个所示的DNA序列;Probe-1为序列表中SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66和SEQ ID NO.67中的任一个所示的DNA序列;Probe-2为序列表中SEQ ID NO.68所示的DNA序列;
步骤3:检测:
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号,得到SLC26A4基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线;
步骤4:结果判定:
根据步骤3得到的SLC26A4基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线,判断样品提供者的GJB3基因突变情况:
如果样品孔只有FAM信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M2纯合突变;
如果样品孔只有HEX信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M2野生型;
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号,表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M2杂合突变;
其中,所述的人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M2为人类耳聋SLC26A4基因的第十九外显子的第2168碱基由A变成G。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111979313A (zh) * 2020-09-21 2020-11-24 郑州桑林生物科技有限公司 一种基于多重pcr及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1896284A (zh) * 2006-06-30 2007-01-17 博奥生物有限公司 一种鉴别等位基因类型的方法
CN102864232A (zh) * 2012-09-26 2013-01-09 潮州凯普生物化学有限公司 耳聋易感基因联合检测试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1896284A (zh) * 2006-06-30 2007-01-17 博奥生物有限公司 一种鉴别等位基因类型的方法
CN102864232A (zh) * 2012-09-26 2013-01-09 潮州凯普生物化学有限公司 耳聋易感基因联合检测试剂盒

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111979313A (zh) * 2020-09-21 2020-11-24 郑州桑林生物科技有限公司 一种基于多重pcr及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用
CN111979313B (zh) * 2020-09-21 2023-05-26 郑州桑林生物科技有限公司 一种基于多重pcr及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用

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