KR100619189B1

KR100619189B1 - 성교전파성질환 원인균 탐지용 프로브 및 이를 이용한성교전파성질환 원인균 유전자형 분석용 ｄｎａ 칩,분석키트 및 유전형 분석방법

Info

Publication number: KR100619189B1
Application number: KR1020040080429A
Authority: KR
Inventors: 문우철; 오명열; 고정은; 박민구; 이진선; 장은주
Original assignee: 굿젠 주식회사
Priority date: 2004-10-08
Filing date: 2004-10-08
Publication date: 2006-08-31
Also published as: WO2006038752A1; KR20060031410A; JP2008515423A

Abstract

본 발명은 성교전파성질환 (sexually transmitted diseases; STD)의 원인균 가운데 가장 발병율이 높은 네 가지 세균인 임균 (Neisseria gonorrhoeae)과 클라마이디아 트라코마티스 (Chlamydiae trachomatis), 유레아플라즈마 유레아라이티쿰 (Ureaplasma urealyticum), 마이코플라스마 제니탈룸 (Mycoplasma genitalium)의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 DNA 칩 및 유전형 분석키트와 이에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프로브, 및 상기 분석키트를 사용하여 상기 네가지 세균의 감염여부를 탐지하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유전형 분석키트 및 분석방법은 STD의 진단에 있어 민감도와 특이도, 재현성이 모두 뛰어 나며, 다수의 검체에서 4가지 세균을 신속하게 자동 분석할 수 있는 효과가 있다.

성교전파성질환(STD), 중합효소연쇄반응, 임균, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 클라마이디아 트라코마티스, 마이코플라스마 제니탈룸, DNA 칩

Description

성교전파성질환 원인균 탐지용 프로브 및 이를 이용한 성교전파성질환 원인균 유전자형 분석용 ＤＮＡ 칩, 분석키트 및 유전형 분석방법{Probe of Bacteria Causing Sexually Transmitted Diseases, DNA chip, Genotyping Kit and Genotyping Method Using The Same}

도 1은 임균의 16S 리보좀 RNA(16s rRNA) 유전자에 대한 특정 염기서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 증폭을 한 후에 그 산물(products)을 2% 아가로즈 겔에서 전기영동한 결과이다(레인 1과 9: 100bp DNA 사이즈마커, 레인 2: 음성대조군, 레인 3: 양성대조군, 임균의 16s rRNA의 플라스미드 클론을 10개 카피(copy)만큼 정상인의 소변에 혼합하여 만든 인공 검체, 레인 4: 양성대조군, 임균의 16s rRNA의 플라스미드 클론을 100개 카피만큼 정상인의 소변에 혼합하여 만든 인공 검체, 레인 5: 임균이 감염된 남성의 요도분비물, 레인 6: 임균이 감염된 남성의 요도를 면봉으로 긁어 얻은 검체, 레인 7: 임균이 감염된 여성의 자궁경부를 솔로 긁어 얻은 검체, 레인 8: 임균이 감염된 남성의 소변).

도 2는 클라마이디아 트라코마티스의 크립틱 플라스미드(Cryptic plasmid) DNA에 대한 특정 염기서열의 플라이머세트를 이용하여 PCR로 증폭을 한 후에 그 산물을 2% 아가로즈 겔에 전기영동한 결과이다(레인 1과 9: 100bp DNA 사이즈마커, 레인 2: 음성대조군, 레인 3: 양성대조군, 클라마이디아 트라코마티스의 크립틱 플라스미드 클론을 삽입한 플라스미드를 10개 카피(copy)만큼 정상인의 소변에 혼합하여 만든 인공 검체, 레인 4: 양성대조군, 클라마이디아 트라코마티스의 크립틱 플라스미드 클론을 삽입한 플라스미드를 100개 카피만큼 정상인의 소변에 혼합하여 만든 인공 검체, 레인 5: 클라마이디아 트라코마티스이 감염된 남성의 요도분비물, 레인 6: 클라마이디아 트라코마티스이 감염된 남성의 요도를 면봉으로 긁어 얻은 검체, 레인 7: 클라마이디아 트라코마티스이 감염된 여성의 자궁경부를 솔로 긁어 얻은 검체, 레인 8: 클라마이디아 트라코마티스이 감염된 남성의 소변).

도 3은 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 16S 리보솜 RNA와 23S 리보솜 RNA의 경계부위(16S-23S RNA intergenic space region)에 대한 특정 염기서열의 프라이머세트를 이용하여 PCR로 증폭을 한 후, 1.5% 아가로즈 젤에 전기영동한 결과이다(레인 1과 9: 100bp&1kb DNA 사이즈마커, 레인 2: 음성대조군, 레인 3: 양성대조군, 유레아프라스마 유레아라이티쿰의 16S-23S 리보좀 RNA 경계부위의 플라스미드를 10개 카피(copy)만큼 정상인의 소변에 혼합하여 만든 인공 검체, 레인 4: 양성대조군, 유레아프라스마 유레아라이티쿰의 16S-23S 리보좀 RNA 경계부위의 플라스미드를 100개 카피만큼 정상인의 소변에 혼합하여 만든 인공 검체, 레인 5: 유레아프라스마 유레아라이티쿰이 감염된 남성의 요도분비물, 레인 6: 유레아프라스마 유레아라이티쿰이 감염된 남성의 요도를 면봉으로 긁어 얻은 검체, 레인 7: 유레아프라스마 유레아라이티쿰이 감염된 여성의 자궁경부를 솔로 긁어 얻은 검체, 레인 8: 유레아프라스마 유레아라이티쿰이 감염된 남성의 소변).

도 4는 마이코플라스마 제니탈리움 (Mycoplasma genitalium)의 16S 리보좀 RNA(16s rRNA) 유전자에 대한 특정 염기서열의 프라이머세트(primer set)를 이용하여 PCR로 증폭을 한 후, 2% 아가로즈 젤에 전기영동한 결과이다(레인 1과 9: 100bp DNA 사이즈마커, 레인 2: 음성대조군, 레인 3: 양성대조군, 마이코플라스마 제니탈리움의 16s rRNA의 플라스미드 클론을 10개 카피(copy)만큼 정상인의 소변에 혼합하여 만든 인공 검체, 레인 4: 양성대조군, 마이코플라스마 제니탈리움의 16s rRNA의 플라스미드 클론을 100개 카피만큼 정상인의 소변에 혼합하여 만든 인공 검체, 레인 5: 마이코플라스마 제니탈리움이 감염된 남성의 요도분비물, 레인 6: 마이코플라스마 제니탈리움이 감염된 남성의 요도를 면봉으로 긁어 얻은 검체, 레인 7: 마이코플라스마 제니탈리움이 감염된 여성의 자궁경부를 솔로 긁어 얻은 검체, 레인 8: 마이코플라스마 제니탈리움이 감염된 남성의 소변).

도 5는 인체 검체에서의 DNA 분리과정과 PCR 증폭과정의 적정성 여부를 점검 (quality control, QC) 하기 위하여 STD감염이 없는 정상인과 STD 감염 환자의 소변검체로부터 DNA를 분리하여 하우스키핑 유전자 (housekeepeeping gene)인 인체베타그로불린 (human β-globulin, HBB) 유전자를 58℃도에서 PCR로 증폭하여, 그 산물을 1.8% 아가로즈 젤 전기영동에서 분석한 결과이다(레인 1: 100bp DNA 사이즈 마커, 레인 2: 정상인의 소변 검체, 레인 3 & 4: STD의 감염 환자의 소변 검체).

도 6은 임상 검체에서 임균과 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움 유전자를 본 발명의 멀티플렉스(multiplex) PCR방법을 이용하여 증폭한 후 자동염기서열 분석기 (automated sequencer)로 확인한 결과 중 임균의 16S rRNA유전자의 시퀀싱 결과이다.

도 7은 임상 검체에서 임균과 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움 유전자를 본 발명의 멀티플렉스(multiplex) PCR방법을 이용하여 증폭한 후 자동염기서열 분석기 (automated sequencer)로 확인한 결과 중 클라마이디아 트라코마티스의 크립틱 플라스미드의 시퀀싱 결과이다.

도 8은 임균과 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움 유전자를 본 발명의 멀티플렉스(multiplex) PCR방법을 이용하여 증폭한 후 자동염기서열 분석기 (automated sequencer)로 확인한 결과 중 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 16S-23S rRNA 경계부위(intergenic space region)의 시퀀싱 결과이다.

도 9는 임균과 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움 유전자를 본 발명의 멀티플렉스(multiplex) PCR방법을 이용하여 증폭한 후 자동염기서열 분석기 (automated sequencer)로 확인한 결과 중 마이코플라스마 제니탈리움의 16S rRNA의 시퀀싱 결과이다.

도 10은 임균, 마이코플라스마 제니탈룸, 유레아플라스마 유레아라이티쿰 및 클라마이디아 트라코마티스의 각 표적유전자의 DNA 및 인체형 베타글로빈 유전자의 DNA가 각각 삽입되어 있는 플라스미드 클론을 10개 카피 및 100개 카피(copy)씩 검체 보관시약과 혼합하고 상기 DNA들과 특이하게 결합하는 프라이머세트를 함께 하나의 튜브에 넣은 후 56℃에서 멀티플렉스 PCR을 수행한 후 1.8% 아가로즈 젤에 전기영동하여 관찰한 결과이다(레인 1 & 6: 100bp & 1Kb DNA ladder, 레인 2: 음성대조군(베타글로빈), 레인 3: 프라이머세트 농도를 모두 10pmole/μl로 동일한 양을 넣은 경우. 레인 4: 프라이머세트의 농도를 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 경우 10pmole/μl, 임균, 클라마이디아 트라코마티스, 마이코플라스마 제니탈리움은 모두 5pmole/μl로 한 경우, 레인 5: 프라이머의 농도를 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 경우에는 20pmole/μl으로 하고, 나머지는 모두 10pmole/μl로 한 경우). (a)는 10개 카피를 넣은 것이고 (b)는 100개 카피를 넣은 경우이다.

도 11은 STD의 감염 여부와 그 원인균이 기왕에 확인된 임상 검체로부터 추출한 DNA 시료 4μl 를 58℃에서 본 발명의 STD 멀티플렉스 PCR을 수행한 후 1.8% 아가로즈 젤에 전기영동을 하여 감염 여부를 확인한 결과를 도시한 것이다(레인 1 & 8: 100bp & 1kb DNA ladder, 레인 2: 음성대조군(인체 베타글로빈, 레인 3: 양성대조군(4개 원인균의 표적유전자의 DNA 및 인체 베타글로빈 유전자의 DNA가 각각 삽입되어 있는 플라스미드 클론을 각각 100개 카피(copy)씩 검체 보관시약과 혼합한 인공 검체), 레인 4: 마이코플라스마 제니탈리움 감염이 확인된 남성의 소변 검체, 레인 5: 클라마이디아 트라코마티스 감염이 확인된 남성의 소변 검체, 레인 6: 임균 감염이 확인된 남성의 소변 검체, 레인 7: 유레아플라스마 유레아라이티쿰 감염이 확인된 남성의 소변 검체).

도 12는 2가지 이상의 세균에 의한 중복 감염이 기왕에 확인된 환자의 검체의 DNA 4μl 을 대상으로 하여 본 발명의 멀티플렉스 STD PCR을 수행한 후 그 산물을 1.8% 아가로즈 젤에서 전기영동을 하여 확인한 결과이다(레인 1, 10: 100bp DNA ladder, 레인 9: 1kb DNA ladder, 레인 2: 음성대조군(HBB), 레인 3: 양성대조군(4개 원인균의 표적유전자의 DNA 및 인체 베타글로빈 유전자의 DNA가 각각 삽입되어 있는 플라스미드 클론을 각각 100개 카피(copy)씩 검체 보관시약과 혼합한 인공 검체), 레인 4: 클라마이디아 트라코마티스와 유레아플라스마 유레아라이티쿰 의 복합 감염이 확인된 여성의 자궁경부의 스왑 검체, 레인 5: 유레아플라스마 유레아라이티쿰와 임균의 복합감염이 확인된 남성의 소변 검체, 레인 6: 유레아플라스마 유레아라이티쿰와 마이코플라스마 제니탈리움의 복합 감염이 확인된 남성의 소변 검체, 레인 7: 마이코플라스마 제니탈리움과 클라마이디아 트라코마티스의 복합 감염이 확인된 남성의 소변 검체, 레인 8: 임균, 클라마이디아 트라코마티스 및 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 복합 감염이 확인된 남성의 소변 검체).

도 13은 멀티플렉스 PCR후 그 산물을 올려놓고 히브라다이제이션 반응을 수행하여 확인하는 DNA 칩(STD genotyping oligonucleotide microarray)의 모식도이다.

도 14는 본 발명의 STD DNA 칩의 일종으로 그리드가 8개인 DNA칩의 사진이다.

도 15는 임균 감염된 임상검체를 본 발명의 STD유전자형 진단 DNA칩 으로 분석한 형광 스캐너 이미지이다.

도 16은 트라마이디아 트라코마티스 감염된 임상검체를 본 발명의 STD유전자형 진단 DNA칩 으로 분석한 형광 스캐너 이미지이다.

도 17은 유레아플라스마 유레아라이티쿰 감염된 임상검체를 본 발명의 STD유 전자형 진단 DNA칩 으로 분석한 형광 스캐너 이미지이다.

도 18은 마이코플라스마 마이코제니탈리움 감염된 임상검체를 본 발명의 STD유전자형 진단 DNA칩 으로 분석한 형광 스캐너 이미지이다.

도 19는 임균과 클라마이디아 트라코마티스가 복합 감염된 임상검체를 본 발명의 STD유전자형 진단 DNA칩 으로 분석한 형광 스캐너 이미지이다.

도 20은 임균과 유레아플라스마 유레아라이티쿰이 복합 감염된 임상검체를 본 발명의 STD유전자형 진단 DNA칩 으로 분석한 형광 스캐너 이미지이다.

도 21은 임균과 마이코플라스마 제니탈리움이 복합 감염된 임상검체를 본 발명의 STD유전자형 진단 DNA칩 으로 분석한 형광 스캐너 이미지이다.

도 22는 클라마이디아 트라코마티스과 유레아플라스마 유레아라이티쿰이 복합 감염된 임상검체를 본 발명의 STD유전자형 진단 DNA칩 으로 분석한 형광 스캐너 이미지이다.

도 23은 STD가 감염되지않은 음성 대조군을 본 발명의 STD유전자형 진단 DNA칩으로 분석한 것으로 인체 베타글로빈 유전자의 신호만이 나타난 형광 스캐너 이미지이다.

본 발명은 성교전파성질환 (sexually transmitted diseases; STD)의 원인균 가운데 가장 발병율이 높은 네 가지 세균인 임균 (Neisseria gonorrhoeae)과 클라마이디아 트라코마티스 (Chlamydiae trachomatis), 유레아플라즈마 유레아라이티쿰 (Ureaplasma urealyticum), 마이코플라스마 제니탈룸 (Mycoplasma genitalium)의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 DNA 칩, 유전형 분석키트 및 분석방법, 그리고 이에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프로브에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 DNA 칩을 이용하여 시료내에서 상기 4개 균의 존재여부 뿐 아니라 그 유전형을 분석할 수 있는 유전형 분석키트 및 분석방법에 관한 것이다.

성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD)이란 성행위로 인해 전파되는 질병을 통틀어 이르는 말이다.

STD의 역학 (epidemiology)을 원인 별로 보면 (1) 임질과 (2) 클라마이디아 감염, (3) 비임균성 요도염 (nongonorrheal urethritis, NGU)이 95%이상으로 절대 다수를 차지한다. 여기에서 비임균성 요도염이란 남성에서 요도염이 발생하였으나 임균 (Neissetia gonorrhoeae)이 확인되지 않는 경우를 가리킨다. 비임균성 요도염의 가장 흔한 원인균은 클라마이디아 트라코마티스이며, 그 외에 유레아플라스마 유레아라이티쿰(Ureaplasma urealyticum)과 마이코플라스마 제니탈리움 (Mycoplasma genitalium)도 중요 원인균으로 지적되고 있다. 즉 임균과 클라마이디아 트라코 마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움의 4가지 종류의 세균이 STD의 원인의 절대 다수를 차지한다. 이들 세균은 모두 공통적으로 남성에서 전부요도염 (anterior urethritis)의 중요 원인이 되며 부고환염 및 전립선염을 합병할 수 있으며, 불임의 중요한 원인이 된다. 또한 여성에서는 자 궁경부염 (cervicitis)과 골반염증성질환 (pelvic inflammatory diseases)의 주 원인이 되며, 나팔관 폐쇄 (fallopian tube occlusion)를 일으킴으로써 불임과 이소성 임신 (ectopic pregnancy) 등의 합병증을 유발할 수 있다.

구미의 경우 오늘날 클라마이디아 감염이 가장 흔하며, 국내에서도 최근에는 임질은 줄어드는 대신 클라마이디아 감염과 비임균성 요도염이 늘어나는 추세이다.

STD는 다른 질환과 달리 무증상으로 잠복되어 증세가 악화되는 경우가 많고, 재감염이 용이하므로 상기 STD의 원인균을 조기에 검출하여 무증상의 보균자도 효과적으로 진단할 수 있는 방법의 개발이 중요하다.

만약 어떤 환자에서 일단 요도염이 발견되면 그것이 임균성인지 비임균성인지를 먼저 감별해야 하는데 그 이유는 치료 방법과 경과가 서로 다르기 때문이다. 그러나 근래에는 항균제의 오남용에 따른 세균의 변이와 혼합감염의 증가로 인해 양자간의 구별이 애매한 경향이 많고, 정확한 진단을 위해서는 본 발명에서와 같은 분자유전자적 검사법이 필요하다.

임균성 요도염을 일으키는 임균(N, gonorrhoeae)은 나이세리아(Neisseria)속에 속한다.

임균의 진단은 일차적으로 그람염색 (Gram stain)에 의한다. 그람염색으로 특징적인 세포내 그람음성 쌍구균의 존재를 확인하는 것은 간편하고 정확도가 비교적 높아서 널리 사용되는 방법이다. 그러나 무증상이거나 증상이 미미한 임균성 요도염에서는 그람염색으로 판단이 애매하거나 위음성 (false negative)으로 나오는 경우가 많다.

그람염색법을 보완하기 위해서는 임균배양을 시도한다. 임균의 배양은 여러모로 유용하고 정확한 검사 방법이지만 검사결과를 알기까지 많은 시간과 비용이 소모되는 단점이 있다.

이외 효소면역 검사법 (enzyme immunoassay: EIA)과 면역형광검사법 (immunofluorescence technique)은 임균 감염질환 진단에 있어 새로운 항원 확인방법으로 이용되고 있는데 배양검사에 비해 더 신속하게 결과를 얻을 수 있으며, 민감도 (sensitivity)와 특이도 (specificity)가 더 높은 것으로 보고되고 있으나 고비용의 단점이 있다.

비임균성 요도염은 최근 임균성요도염이 감소하는데 대해 역으로 발병율이 증가하고 있다. 비임균성요도염은 단일 질환이 아니라, 여러 가지 미생물에 의해 일어날 수 있는 일종의 증후군 (syndrome)이다. 비임균성 요도염의 원인 미생물로서 가장 중요한 것이 클라마이디아 트라코마티스(Chlamydia, trachomatis)이다. 클라마이디아 트라코마티스는 세포내 기생성 (intracellular parasitism)의 생존 주기(life cycle)를 가지는 미생물로 지놈에 DNA와 RNA를 모두 갖고 있으며 모두 15가지의 혈청형이 있는데 비임균성 요도염을 일으키는 것은 D-K형이다. 이에 의해 발병할 수 있는 인체 질환으로는 트라코마와 호흡기감염, 요도염과 자궁경부염, 부고환염, 골반염증성질환을 포함한 STD 가 있다. 최근에는 클라마이디아가 심근염을 일으킨다는 보고도 있다.

클라마이디아 트라코마티스의 확인 방법으로는 (1) 감염부위에서 채취된 가검물을 배양, 분리 확인하는 방법, (2) 감염부위의 상피세포를 직접 도말 염색하여 균을 확인하는 방법, (3) 환자의 혈청에서 항체를 분리, 확인하는 방법이 사용되어 왔으며, 최근에는 (4) 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)과 하이브리다이제이션 (hybridization) 등의 분자유전학적 기법을 이용하는 방법이 선호된다.

상기 검체를 배양, 분리하는 방법은 장시간이 소요된다는 점, 진단 민감도가 낮다는 점 등으로 인해 임상 진단 목적으로는 적합치 못하며 감염부위의 상피세포를 직접 도말 염색하여 균을 확인하는 간편성은 좋으나, 진단 민감도가 낮다. 또한 단클론항체에 형광물질인 FITC (fluorescein isothiocynate)가 부착된 시약을 이용하는 형광항체법은 민감도는 비교적 높으나 고비용과 전용 장비를 요한다는 단점이 있어서 제한적으로 사용되고 있다.

인간과 각종 포유류 동물에 광범위하게 존재하는 마이코플라스마와 유레아플라스마속에 속하며 비뇨생식기에 감염을 유발할 수 있는 유레아플라스마 유레아라이티쿰과 마이코플라스마 제니탈리움은 배양하기가 기술적으로 매우 어렵고, 염색이나 면역학적 방법으로도 발견하기가 어렵다. 이에 따라 PCR에 의거한 분자유전학적 검사법으로 진단하려는 것이 최근의 추세이다. 이 경우 각 균의 종에 특이한 유전자의 DNA의 염기서열을 PCR로 증폭한 후 이를 시퀀싱 반응이나 하이브리다이제이션 등으로 확인하는 방법이 주로 이용된다. 현재까지 확인된 13종의 마이코플라스마와 2종의 유레아플라스마는 16S 리보솜 RNA(16S rRNA)의 V3의 5'방향 측 인접 부위(flanking region)와 V6의 3'방향측 인접부위의 염기 서열이 서로 일치한다. 이에 대해 V4와 V5 부위의 약 250개의 염기 서열이나 16S-23S 리보솜 RNA 사이부위의 염기서열은 각 종 별로 차이가 있다. 따라서 이를 검사하는 방법이 유효하며, 혹은 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 경우 이에 특유한 urease subunit의 염기서열을 분석하는 방법도 사용가능 하다 (Jensen JS et al. J Clin Microbiol 2003;41:261-6; Yoshida T et al. J Clin Microbiol 2002;40:105-110 ).

세균감염이 있을 때 그 원인균을 정확하게 파악하는 것은 정확한 진단 뿐 아니라 감염의 근원을 파악하며, 병태를 파악하고, 경과와 예후를 예측하며, 치료방침을 결정하고, 백신의 개발을 하는 데 필수적이다. 이 때의 원인균 진단은 단순한 균의 속과 종 뿐 아니라 아종 (subspecies) 내지 균주 (strain)까지 파악할 수 있도록 하는 것이 중요하다.

세균감염의 원인균을 정확하게 파악하기 위해서는 검사방법은 민감도(sensitivity), 특이도 및 재현성이 100%에 가까워야 한다.

배양검사나 면역검사 등 기존의 세균 체형 검사법으로는 이와 같은 조건을 만족시키기 힘들다. 이에 대해 세균 지놈의 유전자형, 즉 DNA 및 RNA의 염기서열을 분석하는 유전자 검사는 이론적으로 상기한 3가지 조건을 모두 만족시킬 수 있으며(Olive DM et al. Journal of Clinical Microbiology. 1999:37:1661-9), PCR기법을 이용하여 임균감염과 클라마이디아 감염 만을 검사하는 진단키트는 이미 상업화되어 사용되고 있다(Shafer M et al, J Clin Microbiol 2003;41:4395-9).

그러나 세균파악을 위한 유전자 검사법이 임상 진료나 기타 검사실에서 활발하게 사용되고 임상 진료에 실제 도움이 되기 위해서는 상기한 조건 외에도 추가로 갖추어야 할 조건이 많다. 즉 검사의 방법이 용이하고 해석하기도 쉽고 간편해야 하며, 신속하게 결과를 얻을 수 있어야 하고, 특별한 고가의 장비가 필요 없이 검사할 수 있어야 하며, 검사가 자동화되어 있어서 다수의 검체를 신속하게 검사할 수 있어야 하고, 검사 비용도 저렴해야 한다. 이를 위해 PCR은 가급적 대상 세균 모두를 하나의 튜브 내에서 한번의 PCR반응으로 검사하는 멀티플렉스형의 PCR일 필요가 있으며 PCR시 각 대상 세균이 균주 수준에 까지 정확히 식별이 될 수 있도록 검사하는 유전자와 염기서열 부위가 적절하게 선택되어야 하고, 이에 맞추어 최적의 PCR조건이 수립되어야 한다. 그러나 지금까지 요도염과 자궁경부염의 4대 원인균인 임균과 클라마이디아 트라코마티스나 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움을 동시에 검색하는 멀티플렉스형의 PCR에 대한 보고는 없으며 이러한 PCR 키트는 아직 상업화되어 있지 않다.

나아가 PCR 후 증폭된 산물이 정확하게 원하는 세균의 DNA인지를 정확하게 확인하는 검사도 필요하다. 아울러 세균의 유전자형을 정확하게 판독하여 항균제 내성이나 생물학적 침해도 등을 정확하게 예측할 수 있는 유전자검사법도 필요하다. 이를 위해 각종의 STD 원인균을 동시에 분석하고 나아가 항균제 내성 등의 정보도 함께 알 수 있는 DNA 칩(또는 DNA 마이크로어레이)의 개발이 시급하다. 이에 따라 본 발명에서는 상기한 STD의 4대 원인균의 멀티플렉스 PCR 방법 및 상기 4대 원인균을 탐지 및 유전자형을 분석할 수 있는 DNA 칩을 연구하게 되었다.

본 발명의 목적은 STD의 원인 중 90% 이상으로 절대 다수를 차지하며, 요도염과 자궁경부염 및 골반염증성질환의 4대 원인균인 임균과 클라마이디아 트라코마 티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움의 유전자와 대조 인체유전자의 DNA를 하나의 튜브 내에서 한번의 PCR반응으로 동시에 증폭하여 분석할 수 있는 멀티플렉스 형 PCR의 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 4대 원인균 및 인체베타글로빈의 PCR 증폭하기 위한 효과적인 프라이머를 고안하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 상기한 네가지 세균 별로 특유한 염기서열의 유전자와 대조 유전자 및 항균제내성 유전자를 더욱 정확하게 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 상기 프로브가 집적되어 있는 상기 4대 원인균의 탐지 및 유전자형 분석용 DNA 칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 다섯 번째 목적은 상기 프로브를 포함하는 상기 4대 원인균의 탐지 및 유전자형 분석용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 여섯 번째 목적은 상기 프로브를 이용한 상기 4대 원인균의 탐지 및 유전자형 분석방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 임균의 핵산 증폭용 프라이머, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 클라마이디아 트라코마티스의 핵산 증폭용 프라이머, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열을 갖는 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 핵산 증폭용 프라이머, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열을 갖는 마이코플라스마 제니탈리움의 핵산 증폭용 프라이머, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 염기서열을 갖는 인체베타글로빈의 핵산 증폭용 프라이머를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 프라이머 중 어느 하나 이상을 이용하는 것을 특징으로 하는 단일 또는 멀티플렉스 PCR증폭방법을 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호 11 내지 서열번호 39의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 이들 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되며, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 임균, 클라마이디아 트라코마티스, 또는 마이코플라스마 제니탈리움, 테트라사이클린 내성 유전자의 핵산과 상보적으로 결합하는 프로브를 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호 11 내지 서열번호 39의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 이들 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는 STD원인균 탐지용 DNA칩을 제공한다.

본 발명은 또한 STD 원인균 시료 DNA를 PCR 증폭시키기 위한 프라이머 세트, 상기 STD 원인균 탐지용 DNA칩, 상기 DNA 칩과 하이브리드 되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD)의 원인균 탐지용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 (a) STD 원인균 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 STD 원인균 시료 DNA를 증폭하는 단계; (b) 서열번호 11 내지 서열번호 33의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 이들 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는 DNA칩에 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및 (c) 상기 프로브와 하이브리드화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD)의 원인균 탐지방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 검사하려는 4개 세균 및 인체형 베타글루불린의 검사할 유전자와 그 부위를 결정하고 이를 증폭하는 데 필요한 PCR 프라이머를 고안하고(실시예 1), 대조 균주와 각 균주의 표적 유전자의 DNA 클론을 확보하고 (실시예 2), 검체 채취 및 저장법을 수립하였으며(실시예 3), 검체로부터의 DNA 분리 방법을 수립하고(실시예 4), 세균의 표적유전자에 대한 단일 PCR의 조건을 수립하고(실시예 5), 임상 검체에서 단일 PCR 및 시퀀싱의 수행하고 그 결과를 데이터베이스화하고 (실시예 6과 7), 4개 균과 인체베타글로빈 유전자에 대한 멀티플렉스 PCR의 조건을 수립하고 (실시예 8), 인체 검체에서 상기 멀티플렉스 분석을 수행함으로써 그 분석방법의 적정성을 판단하였다 (실시예 9). 또한, 상기 4개 세균과 인체 베타글로빈유전자의 하이브리다이제이션 분석을 위한 프로브의 디자인과 이를 이용한 DNA칩을 제작하고 (실시예 10과 11), 인공검체를 상기 DNA 칩을 이용하여 분석하여 분석조건을 수립하고 (실시예 12), 상기 DNA 칩을 이용하여 임상검체를 분석하여 (실시예 13) 상기 4개 균들의 감염여부 진단 뿐 아니라 감염된 균들의 유전형을 판별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

이하에서 본 발명을 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 임균과 마이코플라스마 제니탈룸의 16S rRNA와 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 16S-23S intergenic region, 또는 클라마이디아 트라코마티스의 크립틱 플라스미드 유전자의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 STD 원인균 탐지를 위한 프로브에 관한 것이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 11 내지 서열번호 33의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 및 이들 올리고 뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된다.

서열번호 11 내지 16은 유레아플라스마 유레아라이티쿰을 탐지하기 위한 프로브이고, 서열번호 17 내지 21은 임균, 서열번호 11 내지 28은 클라마이디아 트라코마티스, 서열번호 29 내지 33은 마이코플라스마 제니탈룸을 탐지하기 위한 프로브이다. 서열번호 34 내지 39는 테틀라사이클린 내성유전자(TetC)를 탐지하기 위한 프로브이고 서열번호 40은 기준 마커인 인체 베타글로빈 탐지용 프로브이다.

본 발명의 일례의 DNA칩은 서열번호 11 내지 서열번호 33에 나타난 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 및 이들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의프로브를 포함하는 STD 원인균 탐지용 DNA칩이다.

본 발명의 또 다른 일례의 STD 원인균 탐지용 DNA칩은 표적 세균의 유전자 별로 5 내지 7개의 프로브를 사용하여 표적 유전자 별로 하나만의 프로브를 사용하여 검색할 때 초래될 수 있는 가음성과 가양성을 피하며, 진단 민감도와 특이도를 극대화할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일례의 STD 원인균 탐지용 DNA칩은 베타글로빈, 액틴 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 유전자를 기준마커로 추가 포함할 수 있으며, 상기 기준마커가 베타 글로빈인 경우에는 바람직하게는 서열 40에 나타난 염기서열을 가지며 이의 증폭을 위한 프라이머로는 서열번호 9의 염기서열 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 베타글로빈 DNA 증폭용 프라이머일 수 있다. 기준 마커를 사용함으로써 DNA 칩에서의 하이브리드화반응, 이전 과정인 DNA 분리과정 및 PCR 증폭과정이 적합했는지를 검증하고 가음성을 파악할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일례의 STD 원인균 탐지용 DNA 칩은 테트라사이클린 항균제 내성 유전자를 함께 분석하여 STD의 치료에 가장 널리 사용되는 항균제인 테트라사이클린 항균제에 대한 내성을 미리 정확하게 파악하여 치료 방침 결정과 치유에 도움을 줄 수 있다. 상기 테트라 사이클린 항균제 유전자의 프로브는 바람직하게는 서열번호 34 내지 39의 염기서열을 갖는다.

본 발명의 DNA칩의 제조방법은 STD원인균의 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의 5'말단에 아민이 결합된 DNA프로브를 제조하는 공정; 제조된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시키는 공정 및 전기 DNA 프로브가 결합된 고체 표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시키는 공정을 포함한다.

상기 고체의 표면에서 프로브 DNA와 알데히드의 결합은 아민과 알데히드의 시프염기반응을 통해 수행될 수 있으며, 상기 고체는 유리, 실리콘 이산화물, 플라스틱 또는 세라믹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 STD 원인균 탐지용 DNA 칩을 포함하는 STD 원인균 탐지용 분석키트 및 분석방법을 제공하며, 이들은 프라이머 및 표지수단을 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 STD 원인균의 증폭용 프라이머일 수 있으며, 서열번호 9 및 10의 염기서열로 구성된 베타글로빈 프라이머를 포함할 수 있다.

상기 표지수단은 공지된 여러가지 표지물을 사용할 수 있으며, 예를 들면, Cy5, Cy3, 바이오틴 결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 또는 텍사스 레드를 사용할 수 있다. Cy5를 이용하여 표지할 경우, 표지된 반응물을 검출할 때 추가적인 반응없이 직접 콘포칼 레이저 스캐너와 같은 분석기를 이용하여 형광신호를 분석 할 수 있어 효율적이며 민감한 결과를 얻을 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예일 뿐 발명이 하기 실시예에 한정된 것은 아니다.

실시예 1: PCR 프라이머의 고안

검사하려는 4개 세균 별로 검사할 유전자와 그 부위를 결정하고 이를 PCR로 증폭하는 데 필요한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합을 고안하였다. 아울러 DNA의 분리와 PCR 반응의 적정 여부를 파악하기 위해서 내부참고 유전자 및 대조유전자의 역할을 할 하우스키핑 유전자로 인체베타글로빈 유전자를 선택하여 이의 PCR 증폭을 위한 프라이머도 고안하였다. 그 방법은 다음과 같으며, 각각의 프라이머의 특성은 표 1에 정리하였다.

검사할 유전자 부위는 세균의 계통 (phylogeny) 파악에 가장 널리 사용되는 16S rRNA나 23S rRNA, 혹은 양자의 중간 및 경계부위에서 1차적으로 선택하였다 (Olsen GJ et al. Ribosomal RNA: a key to phylogeny. FASEB 1993;7:113-123; Lane DJB et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1985;92:6955-9).

이 때 PCR 증폭부위의 기준으로는 한 방향으로는 모든 세균 및 동일 속의 세균에 동일한 염기서열의, 소위 보존적 부위 (highly conserved region)를 두고 다른 한 방향은 표적 세균의 종 (genus)에 특유한 염기서열을 가지는, 소위 고도 변형 부위 (highly variable region)를 두었다. 혹은 양측으로 보존적 부위를 두고 그 사이에 변형 부위를 두게 하였다. 만약 16S rRNA나 23S rRNA, 16S-23S 사이 부위에 적절한 염기 서열이 없을 경우에는 여타 부위에서 표적 세균에 특유한 고유의 유전자와 고유의 염기서열을 선택하여 분석할 수 있다. 예컨대 임균의 경우 16S rRNA 대신에 사이토신 메틸트란스퍼라제(cytosine methyltransferase) 유전자를 분석하고, 클라마이디아의 경우 주외막단백질(MOMP)의 omp1 유전자를 분석하기도 한다. 그 외의 방법으로 클라마이디아 트라코마티스의 경우 이 균주 내에 잠재하는 크립틱 플라스미드(cryptic plasmid)의 염기서열을 검색할 수도 있다 (Yoshida T et al. J Clin Microbiol 2002;40:105-110).

표 1. PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머

표적세균 (표적유전자)	PCR증폭 부위 (염기 번호)	SEQ.ID. No.	염기서열 (5'-3'로 기술)	길이
N. gonorrhoeae (16s r RNA)	NGF(454-471)* 정방향	1	AAGGCCGTTGCCAATATCG	19mer
N. gonorrhoeae (16s r RNA)	NGR(839-819)* 역방향	2	GCCCAACAGCTAATTGACATC	21mer
C.trachomatis (Criptic plasmid DNA)	CTF(2947-2970)** 정방향	3	AGTGGCAACTAGAACTCGATGGAC	24mer
C.trachomatis (Criptic plasmid DNA)	CTR(3260-3237)** 역방향	4	CTGTAATCACCCAGTCGATAAATG	24mer
U.urealyticum (16s-23s rRNA intergenic space region)	UUF(789-811)*** 정방향	5	CATTAAATGTCGGCTCGAACGAG	23mer
U.urealyticum (16s-23s rRNA intergenic space region)	UUR(1600-1577)*** 역방향	6	AGAGTCCGACCATATGAACTTTTG	24mer
M.genitalium (16s rRNA)	MGF(622-645)**** 정방향	7	GCATTGGAAACTATCAGTCTAGAG	24mer
M.genitalium (16s rRNA)	MGR(828-806)**** 역방향	8	GCTCCGACAGCTAGTATCTATCG	23mer
HBB	HBBF(14-33)***** 정방향	9	ACACAACTGTGTTCACTAGC	21mer
HBB	HBBR(123-104)*****역방향	10	CAAACTTCATCCACGTTCACC	22mer
* Genebank accession number : X07714 Genebank accession number : X07547 * Genebank accession number : AF073455 & X58561 ** Genebank accession number : X77334 *** Genebank accesion number: NG-000007 NG( Neisseria gonorrhoea), CT( Chlamydia trachomatis) UU( Ureaplasma urealyticum), MG( Mycoplasma genitalium) HBB( human beta-globulin), F(정방향), R(역방향)

실시예 2: 대조군 균주와 검체 및 그 클론의 확보

검사하려는 4가지 세균별로 표준적인 양성 대조군 균주를 미국의 ATCC 사(Manassas, VA20108, USA.)로 부터 구입하였으며, 이와 함께 기왕에 각 세균의 감염이 확인된 검체를 얻었다. 이들로부터 DNA를 분리한 후 각각 세균 별로 검사하고자 하는 표적 유전자 부위를 PCR로 증폭한 후 크로닝과 시퀀싱반응을 거쳐 확인하여 각각에 대해 플라스미드 클론을 확보하였다.

클로닝 실험 방법은 공지의 방법을 이용하여 다음과 같이 하였으며, 양성 대조군 세균 균주와 확보한 플라스미드 클론의 특징은 표 3에 정리하였다. PCR의 방 법은 이후의 실시예와 중복되므로 여기에서는 기술을 생략한다.

1) PCR로 증폭된 임균과 마이코플라스마 제니탈룸의 16S rRNA와 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 16S-23S 경계부위(intergenic region), 클라마이디아 트라코마티스의 크립틱 플라스미드(cryptic plasmid)와 인체 베타글로빈 유전자의 PCR 산물을 아가로스 젤에서 Gel recovery kit (Zymo Research, USA)를 이용하여 분리한 후, 그 농도를 분광광도계나 아가로스 젤의 밀도측정(densitometry) 분석으로 측정하였다.

2) 냉동 보관되어 있던 pGEM^?-T Easy Vector (Promega, A1360, USA)와 2x Rapid Ligation Buffer는 녹여 손끝으로 튜브를 살짝 흔들어 섞어준 후, 가볍게 원심분리를 하여 클로닝 하고자 하는 삽입DNA와 함께 표 2의 비율로 라이게이션 반응(ligation reaction)을 0.5ml 튜브에서 준비하였다.

표 2. 라이게이션 반응 조성

성분	표준반응용액	양성대조군	배경대조군
2x Rapid Ligation Buffer, T4 DNA 리가아제	5μl	5μl	5μl
pGEM?-T Easy Vector (50ng/㎕)	1μl	1μl	1μl
PCR 산물	Xμl*	-	-
삽입 DNA	-	2μl	-
T4 DNA 리가아제(3 Wess units/)	1μl	1μl	1μl
최종부피(탈이온수 첨가하여 조절)	10μl	10μl	10μl
* PCR 산물과 벡터가 3:1의 비율이 되도록 조절한다. 즉 3.0kb 크기의 벡터 50ng에 0.25kb와 0.45kb의 삽입DNA를 라이게이션 할 경우 12.4ng과 22.5ng씩 반응시킨다.

3) 각 반응액을 피펫으로 잘 섞어 준 후, 실온에서 한 시간 정도 라이게이션 반응을 한다. 다수의 형질전환 산물(transformants)이 필요할 경우에는 4℃에서 하 룻밤 동안 반응을 할 수도 있다)

4) 라이게이션된 샘플은 영하 70℃에 보관된 JM109 competent cell(=1x10⁸ cfu/㎍ DNA) 50㎕를 이용하여 형질전환(transformation)을 하였다.

5) 우선 1.5ml 튜브에 앞에서 얻은 라이게이션 반응 산물(ligate) 2㎕를 넣고, 직전에 해동한 competent cell 50㎕를 다시 넣어, 잘 섞어 준 후, 얼음조(ice bath)에서 20분간 반응을 시킨다.

6) 세포를 42℃ 항온수조에 넣어 45-50초 간 열충격(heat shock)을 주고, 즉시 다시 얼음 속에 넣어 2 분간 방치를 한다

7) 여기에 실온으로 맞춰진 SOC 배지 950㎕를 넣어, 37℃ 진탕기(shaking incubator) 내에서 약 1시간 반 동안 배양을 한다.

8) 배양액 중 약 100㎕를 LB/ampicillin/IPTG/X-Gal 플레이트에 깔아 준 다음, 플레이트를 뒤집어서 37℃로 맞춘 배양기 내에서 16-24 시간동안 배양을 한 후, 콜로니수를 측정 (colony counting)하고, 백색의 콜로니 (white colony)만을 선택해서 3ml LB/ampicillin 배양액에서 배양한 후 미니프렙 (mini prep) 방법으로 플라스미드 DNA를 분리 정제하였다. 이후 PCR 및 제한효소 (restriction enzyme) 절단반응을 이용하여 삽입 DNA가 제대로 들어갔는지를 확인하였고, 이렇게 얻어진 클론의 염기서열을 자동염기서열 분석기를 이용하여 분석하였다.

표 3. 본 발명의 기초 실험을 위한 대조군 균주 및 그 클론

표적 세균	양성 대조군 (ATCC No.)	클론의 종류
N. gonorrhoeae	53420	16S rRNA
C. trachomatis	-	크립틱 플라스미드
U. urealyticum	700970	16S-3s rRNA intergenic space region
M. genitalium	33530	16S rRNA

실시예 3: 임상 검체의 채취

인체에서 요도나 자궁경부, 구강의 분비물 (discharge) 및 세포를 면봉이나 세포솔로 채취하여 얻은 스왑 검체, 소변, 요도 세척액, 전립선액 등의 다양한 검체를 채취한 후 운반하고 검사할 때 까지 저장하는 적정 방법을 수립하였다. 여기에서 남성 소변의 채취는 전통적인 3배 검사 (3-glass test)에 따라 VB (voided bladder)1과 VB2, VB3 및 전립선분비 액(expressed prostatic secretion, EPS)으로 나누어서 채취하였다. VB1은 배뇨할 때 맨 처음에 나오는 10-20ml의 소변, 즉 첫줄기 소변 (early stream urine)을 가리킨다. VB2는 배뇨의 중간에 나오는 중간줄기 소변 (mid-stream urine)을 가리킨다. 전립선분비액은 전립선마사지를 한 후에 요도로 나오는 분비액을 가리킨다. VB3는 전립선마사지를 한 후 배뇨하게 하여 가장 처음에 나오는 소변 10-20ml을 가리킨다. 여기에서 VB1은 요도의 검체, VB2는 방광의 검체, VB3는 전립선의 검체를 대변한다.

검체 채취방법과 여기에 사용되는 도구, 그리고 검체의 운반 및 보관 방법은 다음과 같다,

본 STD검사에 있어서 표준 검체는 남성의 경우 요도 스왑 검체와 첫줄기 소변(VB1) 검체로 하였고, 필요에 따라 요도분비물이나 전립선마사지 후 소변(VB3)를 추가하였다. 이에 대해 여성의 경우에는 자궁경부의 스왑 내지 스크레이프 (scrape) 검체를 표준검체로 하였으며, 여기에 필요에 따라 질(vagina)의 스왑이나 분비물, 소변을 추가하였다. 여기에 동성연애자나 직업 여성의 경우에는 추가로 직장 및 홍문과 구강에서도 검체를 얻을 수 있다.

남성에서 요도의 스왑 검체를 얻을 때는 끝에 면이나 솔이 붙은 멸균된 면봉을 요도구의 2-3cm 안쪽으로 삽입해서 좌우로 돌려서 요도 내 분비물 및 세포가 잘 집적 (collect)되게 하여 채취하였다. 아울러 여성에서 자궁경부의 스왑 검체를 얻을 때는 끝에 솔이 붙은 멸균된 면봉을 자궁경부 내부에 삽입해서 좌우로 돌려서 분비물 및 세포가 잘 집적되게 하여 채취하였다. 여기에서 스왑 채취용 도구로는 COPAN사(COPAN innovation, USA)의 면봉이나 상아메디칼(서울, 대한민국)의 Pap-brush, 혹은 이에 준하는 제품을 사용한다. 이후 멸균된 검체보관용액이 들어있고, 톱니 형 뚜껑(screw cap)이 있는 튜브 내에 면봉의 면부분이나 솔부분을 넣어서 이동 및 보관시켰다.

소변이나 스왑 검체 등 채취된 검체는 가급적 채취 후 48시간 이내에 분석실로 운반되어야 하며, 운송 중에는 가급적 냉장 온도를 유지해야 한다. 이렇게 해야 유전자증폭이 까다로운 세균의 분리가 용이하며, 성장이 빠른 세균의 경우, 과성장을 억제할 수 있기 때문이다.

검체 채취용기 내에는 멸균 상태의 검체 보관용액을 미리 채워 놓게 된다. 그 조성은 37내지 40% 포름알데히드 100ml에 메탄올 15ml, Na₂HPO₄ 6.5g, NaH₂PO₄ 4.0g를 혼합한 후 3차 멸균 증류수를 첨가하여 최종 용적 1리터로 하였다.

소변 검체의 경우, 멸균된 톱니 형 뚜껑이 있는 용적 30ml의 튜브에 상기한 방법대로 채취한 신선 소변 10~20ml을 넣고 이동하여 4℃에 보관해 두었다가 검사한다. 혹은 원심분리 하여 세포 침전층을 얻어서 -70℃에 보관시켜 두었다가 나중에 DNA를 분리하도록 하였다.

실시예 4: DNA 분리

상기 실시예 3의 다양한 인체 검체로 부터 DNA를 분리하기 위해 상업화된 키트를 이용하는 방법과 실험실에서 자가 (manual) 준비한 시약을 이용하는 방법을 사용하여 DNA를 분리 및 정제하였다.

상업화된 키트로는 QIA amp DNA blood mini kit (Cat No. 51106, Qiagen, Valencia, CA, USA.)를 사용하여 다음과 같이 하였다.

소변이나 스왑 검체를 30분 동안 3000rpm에서 원심분리기(swing rotor centrifuge)를 이용하여 원심분리 한다. 상층액을 따라 버리고, 펠렛(pellet) 을 PBS 500㎕를 이용하여 다시 녹인(resuspend) 후, 1.5 ml 미세원심분리튜브에 옮긴다. 2 분간 원심분리를 하여 다시 상층액을 따라 버리고, 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4) 200μl와 프로티나아제 K 20㎕를 넣은 후, 펠렛이 완전히 풀어질 때까지 약 2분 정도 진탕 혼합(vortex mixing)을 한다. AL 버퍼 200㎕를 넣고 2분 간 더 진탕 혼합을 한 후 56℃ 항온수조 에서 20분 간 반응시키고, 그 다음 무수에탄올 200㎕를 넣고 피펫으로 잘 섞어 준다. 이렇게 처리한 반응액을 2ml 수집튜브에 장착해 놓은 스핀 컬럼에 옮긴 후, 8000rpm에서 1-2분간 원심분리를 한다. 이 후 새로운 2ml 수집튜브를 장착 시키고, AW1 버퍼 500㎕ 를 넣어 8000rpm에서 1분간 원심분리를 한다. 다시 새 2ml 수집튜브를 장착 시키고, Buffer AW2 500μl를 넣어 12000rpm에서 3-5분간 원심분리를 한다. 1.5ml 미세원심분리튜브를 장착시키고, Buffer AE 또는 멸균증류수 60㎕를 넣어 준 후, 실온에서 3-5분 간 반응시킨다. 이후 12000rpm에서 3분간 원심분리를 하여 DNA를 분리하고, 그 농도를 분광광도계나 아가로스 젤에서 측정한다. DNA농도를 20ng/㎕ 정도로 얻었을 경우 그 중 3㎕를 PCR반응에 이용하고, 1.5% 아가로즈 겔 상에서 DNA 밴드가 보이지 않을 경우에는 6㎕를 이용한다

본 발명자가 준비한 자가 준비 시약을 이용하는 방법은 다음과 같다. 약 1ml의 소변 검체나 스왑 검체를 30분 동안 15,000 rpm으로 원심분리한 후 상층액은 버리고 PBS(pH 7.4)으로 세척하였다. 이후 여기에 10mM Tris HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 0.5% 트윈 50, 0.5% Nonidet P-40, 프로티나아제 K(200㎍/ml)로 조성한 세포용해 완충액(lysis buffer) 100㎕를 넣고 55℃에서 30분간 반응시킨다. 혹은 용해 완충액을 10mM Tris HCl(pH 8.0), 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.5% 소디움 도데실 설페이트(SDS), 0.5% 트윈 50, 0.5% Nonidet P-40, 프로티나아제 K(700㎍/ml)으로 조성하여, 이 용해완충액 500㎕로 처리할 수도 있다. 세포용해과정 이후에는 94℃로 15분간 가열하여 프로티나아제 K를 비활성화시키고 다시 원심분리하여 농축된 침전물을 얻었다. 이후 페놀-클로로포름으로 처리하여 DNA를 얻고 에탄올로 침전시킨 후 원 심분리하여 멸균된 3차 증류수나 혹은 TE 완충액(10mM Tris-HCl[pH 8.0], 1mM EDTA) 50㎕에 녹였다. 이 중 3 내지 6㎕를 PCR에 사용하였다.

실시예 5: 단일 PCR의 조건 수립을 위한 PCR 수행

멸균된 3차 증류수, 실시예 3의 검체 보관용액, 그리고 감염의 증후가 없는 정상 성인 남성의 신선 소변(VB1)에 실시예 2에서 확보한 각 세균 별로 검사할 표적 유전자의 플라스미드 클론을 10개, 100개, 1,000개, 10,000개 씩의 다양한 수의 카피(copy)로 혼합하여 인공적 검체를 만든 후 각각의 균 별로 표적 유전자에 대해 단일(single) PCR을 여러 차례 반복해서 수행하여 단일 PCR의 적정 조건을 수립하였다. PCR시에는 반드시 내부참조 유전자인 인체 베타글로빈 유전자의 PCR도 함께 수행하였다. 아울러 나중의 멀티플렉스 PCR을 감안하여 각 PCR 산물의 크기가 서로 뚜렷하게 차이가 나도록 고안하였으며, 이에 대해 결합온도(annealing temperature)는 서로 크게 차이가 나지 않도록 고려하였다.

본 PCR의 방법에서 반응액의 조성과 조건은 표 4에서 8까지에 정리하였다. 본 발명에서 고안한 프라이머를 사용하여 본 방법으로 할 경우 검체 용액 1ml당 10개 내지 100개 이상의 카피(copy) 수의 플라스미드 클론이 포함되어 있으면 항상 검색이 가능하다. 본 방법대로 PCR을 한 후 그 산물을 1.5-2.0% 아가로즈 젤에서 전기영동을 하여 확인한 결과를 도 1에서 5까지에 예시하였다.

표 4. 임균 (Neisseria Gonorrhoeae)의 단일 PCR 조건

PCR 성분
ddH2O		19.2㎕
10 ×PCR 버퍼		3㎕
2.5mM dNTPs		2.5㎕
NG 프라이머(10pmole/㎕), NGF/NGR 각각		1㎕/1㎕
Taq DNA 중합효소(5Unit/㎕)		0.3㎕(1.5Unit)
주형 DNA(최소 20ng)		3㎕
최종부피		30㎕
PCR 조건
예비변성 (Predenaturation)	95℃/5min	1 Cycle
변성(Denaturation)	95℃/30sec	35 Cycle
결합(Annealing)	56℃/40sec
연장(Extention)	72℃/45sec
최종연장 (Final Extention)	72℃/10min	1 Cycle

표 5. 클라마이디아 트라코마티스의 단일 PCR 조건

PCR 성분
ddH2O		19.2㎕
10 ×PCR 버퍼		3㎕
2.5mM dNTPs		2.5㎕
CT 프라이머(10pmole/㎕), CTF/CTR 각각		1㎕/1㎕
Taq DNA 중합효소(5Unit/㎕)		0.3㎕(1.5Unit)
주형 DNA(최소 20ng)		3㎕
최종부피		30㎕
PCR 조건
예비변성 (Predenaturation)	95℃/5min	1 Cycle
변성(Denaturation)	95℃/30sec	35 Cycle
결합(Annealing)	56℃/40sec
연장(Extention)	72℃/45sec
최종연장 (Final Extention)	72℃/10min	1 Cycle

표 6. 유레아플라즈마 유레아라이티쿰의 단일 PCR 조건

PCR 성분
ddH2O		19.2㎕
10 ×PCR 버퍼		3㎕
2.5mM dNTPs		2.5㎕
UU 프라이머(10pmole/㎕), UUF/UUR 각각		1㎕/1㎕
Taq DNA 중합효소(5Unit/㎕)		0.3㎕(1.5Unit)
주형 DNA(최소 20ng)		3㎕
최종부피		30㎕
PCR 조건
예비변성 (Predenaturation)	95℃/5min	1 Cycle
변성(Denaturation)	95℃/30sec	35 Cycle
결합(Annealing)	56℃/40sec
연장(Extention)	72℃/45sec
최종연장 (Final Extention)	72℃/10min	1 Cycle

표 7. 마이코플라스마 제니탈룸의 단일 PCR 조건

PCR 성분
ddH2O		19.2㎕
10 ×PCR 버퍼		3㎕
2.5mM dNTPs		2.5㎕
MG 프라이머(10pmole/㎕), MGF/MGR 각각		1㎕/1㎕
Taq DNA 중합효소(5Unit/㎕)		0.3㎕(1.5Unit)
주형 DNA(최소 20ng)		3㎕
최종부피		30㎕
PCR 조건
예비변성 (Predenaturation)	95℃/5min	1 Cycle
변성(Denaturation)	95℃/30sec	35 Cycle
결합(Annealing)	56℃/40sec
연장(Extention)	72℃/45sec
최종연장 (Final Extention)	72℃/10min	1 Cycle

표 8. 인체 베타글로빈 유전자 HBB의 단일 PCR 조건

PCR 성분
ddH2O		19.2㎕
10 ×PCR 버퍼		3㎕
2.5mM dNTPs		2.5㎕
HBB 프라이머(10pmole/㎕), HBBF/HBBR 각각		1㎕/1㎕
Taq DNA 중합효소(5Unit/㎕)		0.3㎕(1.5Unit)
주형 DNA(최소 20ng)		3㎕
최종부피		30㎕
PCR 조건
예비변성 (Predenaturation)	95℃/5min	1 Cycle
변성(Denaturation)	95℃/30sec	35 Cycle
결합(Annealing)	58℃/40sec
연장(Extention)	72℃/45sec
최종연장 (Final Extention)	72℃/10min	1 Cycle

실시예 6: 임상 검체에서 단일 PCR 수행

STD의 이환이 의심되어 국내 병원의 비뇨기과 및 산부인과 외래로 내원한 541명의 성인 남녀 환자들과 성감염의 증후가 없는 성인 남녀 103명에서 실시예 3의 방법으로 첫줄기 소변 (VB1)이나 요도, 자궁경부의 스왑 등으로 얻은 다양한 검체를 채취하여 실시예 4의 방법으로 DNA를 분리하고 실시예 5의 방법에 따라 단일 PCR을 수행하였다.

실시예 7: 임상검체의 PCR 산물의 시퀀싱의 수행

상기 실시예 6의 PCR 산물은 ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Perkin Elmer Biosystems, USA)를 이용하여 시퀀싱반응을 수행한 후 ABI Prism 377 자동염기서열분석기 (Perkin Elmer, USA)로 염기서열을 분석하였다. 이는 다음의 순서로 이루어 졌다.

(1) 각 검체로부터 얻은 PCR 산물을 시퀀싱반응의 주물로 이용하기 위해, 가장 적합한 농도로 맞춘다. 예컨대 100-200bp 길이라면, 1-3ng/㎕가 필요하고, 200-500bp길이라면, 3-10ng/㎕정도가 필요하다.

(2) 두께가 얇은(thin wall) 미세원심분리튜브에 각 PCR 산물과 프라이머 3.2 pmol, terminator ready reaction mix 8㎕를 넣고 최종 20㎕가 되게 멸균 증류수를 넣어 가볍게 잘 혼합한다.

(3) (2)의 혼합물을 섭씨 96℃에서 10 초, 50℃도에서 5초, 그리고 60℃에서 6분간씩, 도합 25 주기 만큼 진앰프2700 (PE Biosystems, USA)을 사용하여 사이클 시퀀싱 (cycle sequencing) 반응을 수행하였다.

(4) 얻어진 반응물을 에탄올로 침전시키고 원심분리 하여 유리 프라이머 (free primer)와 반응혼합물(terminator ready reaction mixture) 안의 형광 부착 디데옥시뉴클레오티드(형광 표지ddNTPs)를 제거 한 후 건조시켰다.

(5) (4)에서 얻어진 DNA를 포름아마이드: 25mM EDTA (pH 8.0):블루 덱스트란 혼합체와 로딩 버퍼(loading buffer) 10㎕에 혼합하여, 끓는 물 속에서 5분 간 변성(denaturation)시킨 후, 검체를 냉각 보관한다.

(6) 미리 5.5% 롱 레인저 겔(BMA, Cat No. 50611, USA)로 캐스팅 한 플레이트의 각 웰에 (5)의 변성 DNA검체를 넣고, 2-4시간 동안 전기영동을 수행한 후 서열분석기(sequencer)로 염기서열을 분석하였다.

본 시퀀싱 분석으로 STD의 4가지 원인균의 검색을 위한 단일 PCR과 인체 베타글로빈 유전자의 단일 PCR의 적정성 여부를 확인하였으며 이들 검사결과에서 한국인에서 STD의 4대 세균의 분자역학과 유전자형에 대한 데이터베이스를 수립하였다. 이렇게 하여 PCR과 시퀀싱으로 STD 감염의 유무와 원인균이 확인된 검체는 이후 멀티플렉스 PCR과 DNA칩의 가치 분석에 사용하였다.

PCR과 시퀀싱 반응의 분석 결과는 표 9에 정리하였다. STD가 의심되어 내원한 476 명 중 387명에서 임균이나 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈룸 중 하나 이상의 균이 발견되었고, 이에 대해 정상 대조군 중에서는 103명 중 4명에서만 클라마이디아 트라코마티스나 유레아플라스마 유레아라이티쿰이 발견되었다. 발견된 세균은 빈도 상 클라마이디아가 45.2%로 가장 흔하였다. 105례(27.2%)에서는 2가지 이상의 세균의 복합감염으로 나타났으며, 특히 임균감염의 경우 복합감염이 52.2%로 더 흔하게 나타났다.

표 9. STD의 4대 원인균에 대한 PCR 및 시퀀싱 분석의 결과

	Case No (%)
전체	387
단일감염 Chlamydia trachomatis(CT) Neisseria gonorrhoeae(NG) Mycoplasma genitalium(MG) Ureaplasma urealyticum(UU)	282(72.8%) 175(45.2%) 113(29.2%) 105(27.1%) 99(25.6%)
복합 감염 NG + CT +/- (UU or MG) NG + UU or MG CT + UU or MG	105(27.2%) 34 25 46

실시예 8: 멀티플렉스 PCR의 조건 수립을 위한 실험

멸균된 3차 증류수, 실시예 3의 검체보관용액, 그리고 STD의 증후가 없는 정상 성인 남성의 신선 소변에 실시예 2에서 확보한 각 세균 별 특이 유전자의 플라스미드 클론을 한 종류에서 네 종류까지 10개, 100개, 1,000개, 10,000개의 다양한 카피수로 혼합하여 인공적 검체를 만든 후 여기에 4종의 세균별 표적 유전자의 프라이머를 함께 하나의 튜브 내에 넣고 한꺼번에 PCR을 시행하는 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 또한 상기한 멀티플렉스 PCR 시에는 대조 유전자로 하우스키핑유전자(housekeeping gene)인 인체 베타글로빈 유전자도 함께 증폭하였다.

멀티플렉스 PCR에서 반응액의 조성과 반응조건은 표 10에 정리하였다. 본 멀티플렉스 PCR 후 그 산물은 1.5-2.0% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인한다(도 6-9). PCR산물의 전기영동 이미지를 보면 위에서 부터 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 산물이 812bp, 임균의 산물이 386bp, 클라마이디아 트라코마티스의 산물이 314bp, 마이코플라스마 제니탈룸의 산물이 207bp, 인체 베타글로빈 유전자의 증폭 산물이 110bp로 각각 나타난다. 본 방법으로 할 경우 임균과 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움, 인체 베타글로빈 유전자의 DNA가 다양하게 한가지에서 5가지까지 다양하게 혼합된 모든 경우에 한번의 멀티플렉스 PCR로 정확하게 검색이 가능하였다. 이 때 검체 1ml당 10개 내지 100개 이상의 카피의 서로 다른 세균 유전자의 플라스미드 클론이 포함되어 있으면 항상 식별이 가능하였다 (도 10).

표 10. 멀티플렉스 PCR 조건

PCR 성분
증류수		2㎕
10 ×PCR 버퍼		3㎕
NG 프라이머(5pmole/㎕), 정방향/역방향 혼합물		2㎕
UU 프라이머(5pmole/㎕), 정방향/역방향 혼합물		2㎕
CT 프라이머(5pmole/㎕), 정방향/역방향 혼합물		2㎕
MG 프라이머(5pmole/㎕), 정방향/역방향 혼합물		2㎕
HBB 프라이머(10pmole/㎕), 정방향/역방향 혼합물		2㎕
STD PCR Premix*		15㎕
주형 DNA(> 20ng)		3㎕
최종부피		30㎕
PCR 조건
예비변성 (Predenaturation)	95℃/5min	1 Cycle
변성(Denaturation)	95℃/30sec	35 Cycle
결합(Annealing)	56-58℃/40sec
연장Extention)	72℃/45sec
최종연장 (Final Extention)	72℃/10min	1 Cycle
* STD PCR Premix의 조성은 열에 안정한 DNA 중합효소 1unit에 dNTPs 200μM, MgCl₂ 1.5mM 으로 하고 여기에 증류수를 가해 전체 용적을 15ml으로 하였다. .

실시예 9: 임상 검체에서 멀티플렉스 PCR의 수행

상기 실시예 7에서 단일 PCR 및 시퀀싱 분석으로 STD감염의 유무와 원인 균이 미리 확인된 바 있는 인체 검체의 DNA를 대상으로 상기 실시예 8에서 수립된 방법대로 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.

검사 대상에 포함시킨 DNA검체로는 임균 감염 검체 50례, 클라마이디아 감염 검체 50례, 유레아플라스마 감염 검체 50례, 마이코플라스마 감염 검체 50례, 감염이 없는 검체 50례를 포함하였다. 감염 검체 200례 중에는 복합감염 검체도 40례 포함시켰다. 본 멀티플렉스 PCR의 검사결과를 시퀀싱의 그것과 비교 분석하여 STD원인균 진단의 민감도와 특이도를 조사하였다. 이로서 본 멀티플렉스 PCR이 임상에서 STD의 4대 원인균을 선별하고 1차 검색하는 데 사용할 수 있을 지를 분석하였다.

단일 PCR 및 시퀀싱 분석의 결과와 비교한 멀티플렉스 PCR 분석의 결과는 표 11에 정리하였고, 그 실례를 도 11과 12에 나타내었다. 단일 PCR후 시퀀싱 분석의 결과를 기준으로 할 때 멀티플렉스 PCR의 민감도는 94-96%, 평균 95%이었으며, 특이도는 96%로 나타났다. 복합감염의 진단 민감도가 87.5%로 단일 감염보다 낮게 나타났다.

표 11. 임상검체에서 STD의 4대 원인균에 대한 멀티플렉스 PCR후 그 결과를 시퀀싱 분석 결과와 비교 분석한 결과.

Group	진단 정확도, No(%)
STD 환자군(N = 200)
Neissera. gonorrhea(N = 50) Chlamydia trachomatis(N=50) Ureaplsma urealyticum(N=50) Mycoplasma genitalum(N=50) 단일감염(N=160) 복합감염(N=40) 전체	48(96) 48(96) 47(94) 48(96) 156(97.5) 35(87.5) 191(95.5)
정상 대조군(N=50)	48(96)

도 6 내지 9는 임상 검체에서 임균과 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움 유전자를 본 발명의 멀티플렉스(multiplex) PCR방법을 이용하여 증폭한 후 자동염기서열 분석기 (automated sequencer)로 확인한 시퀀싱 결과이다. 본 발명에서 고안한 상기 4개 균과 인체베타글로빈 유전자의 프라이머 및 PCR방법을 이용하여 매우 선택도가 높은 PCR산물을 생산함을 알 수 있다.

실시예 10: 하이브리다이제이션 분석을 위한 프로브의 디자인

앞의 STD의 4대 원인균의 유전자와 대조유전자의 PCR산물을 하나의 칩위에서 하이브리다이제이션 반응으로 동시에 분석하기 위한 DNA칩을 제작하기 위해 우선 적정한 염기서열의 올리고 뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probe)의 조합을 고안하였다.

이는 본 DNA칩 개발의 가장 근간이 되는 과정으로 , DNA칩 위에 올려 놓을 올리고뉴클레오티드 프로브를 고안 및 제작하는 과정이다. 미국의 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 유전자은행의 데이터베이스와 앞의 실시예 7에서 얻은 한국인에서 발견된 STD의 4가지 원인균의 유전자와 인체 베타글로빈유전자의 데이터베이스를 분석하여 각각의 유전자형의 염기서열을 확보하였다. 확보한 DNA 서열을 컴퓨터 프로그램 DNASTAR(MegAlign^TM 5, DNASTAR Inc.)를 활용하여 ClustalW 방법으로 쌍정렬(pairwise alignment) 및 다중서열정렬(multiple sequence alignment)을 실행한 후 분류계통도(Phylogenetic tree)를 작성하고 각 그룹별 유형 특이적 염기서열을 선별한 다음, 다시 컴퓨터 프로그램 프라이머 프리미어 5(primer premier 5, PREMIER Biosoft International Co.)를 활용하여 유형 특이적 프로브를 설계하였다. 이때 프로브의 길이는 20±2 및 18±2 bp의 올리고 뉴클레오티드로 설정하여 총 30가지 유형의 유전자형 특이적 프로브(genotype-specific probe)를 설계하였다. 이들 프로브의 명칭과 서열번호 및 유전자형은 표 12에 정리하였다.

표 12. STD DNA칩의 제작을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브

균	명칭	SEQ. ID. NO	서열	위치*	길이	Tm	%GC
UU	UU-478	11	TCCAACTTCAAGAGGGCGA	478	19	64.7	52.6
	UU-296	12	CCGCAAGGTAGAGGAAGGTG	296	20	64.7	60
	UU-452	13	TCGCCCTCTTGAAGTTGGA	452	19	64.7	52.6
	UU-284	14	GCGATACTGCTACCGCAAGG	284	20	65.6	60
	UU-424	15	AGTCTCAGTTCGGATAGAGGGC	424	22	63.6	54.5
	UU-290	16	CTGCTACCGCAAGGTAGAGG	290	20	62.6	60
NG	NG-103	17	CGGGCGCAGACGGTTAC	103	17	66.7	70.5
	NG-154	18	GAACTGCGTTCTGAACTGGGT	154	21	64.3	52.3
	NG-281	19	CGTTCATGTCCGAAAGCGT	281	19	64.9	52.6
	NG-283	20	TTCATGTCCGAAAGCGTGG	283	19	66	52.6
	NG-277	21	CTGACGTTCATGTCCGAAAGC	277	21	65.7	52.3
CT	CT-119	22	TCACCATCTACACGGAAACA	119	20	60.4	45
	CT-120	23	CACCATCTACACGGAAACATAAAG	120	24	62.1	41.6
	CT-125	24	TCTACACGGAAACATAAAGG	125	20	55.6	40
	CT-127	25	TACACGGAAACATAAAGGAT	127	20	54.9	35
	CT-147	26	TCGTTGTAGAGCCATGTCCT	147	20	61.1	50
	CT-116	27	AATTCACCATCTACACGGAA	116	20	58.2	40
	CT-118	28	TTCACCATCTACACGGAAACA	118	21	61.7	42.8
MG	MG-25	29	ATGTGGAGCGGTGAAATGC	25	19	64.8	52.6
	MG-27	30	GTGGAGCGGTGAAATGCG	27	18	66.7	61.1
	MG-29	31	GGAGCGGTGAAATGCGTAG	29	19	64.4	57.8
	MG-89	32	CATTACTGACGCTTAGGCTTGAA	89	23	63.1	43.4
	MG-79	33	AAACTTAGGCCATTACTGACGC	79	22	62	42.4
Tet C	TET-244	34	GCCTGTCGCTTGCGGTATTC	244	20	67.8	60
	TET-295	35	TCACTGGTCCCGCCACC	295	17	67.5	70.5
	TET-96	36	GTCAGCTCCTTCCGGTGGG	96	19	64.7	66.6
	TET-98	37	CAGCTCCTTCCGGTGGG	98	17	65.8	7.05
	TET-145	38	TGCAACTCGTAGGACAGGTG	145	20	62.7	55
	TET-265	39	CTCAAGCCTTCGTCACTGGT	265	20	63.2	55
HBB	HBB	40	GAGGAGAAGTCTGCCG	56	16	55.2	62.5
주) 올리고프로브의 salt농도는 50mM로 통일. TetC: tetracycline resistance type C * PCR 산물에서 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 제외한 염기서열의 프로브 서열의 위치를 표시한 것임.

실시예 11: DNA칩의 제작

실시예 10에서 고안된 올리고뉴클레오티드 프로브를 적정 시약에 혼합한 후 어레이어 (arrayer)를 이용하여 현미경용 유리슬라이드 위에 집적하여 STD 원인균의 유전자형을 진단하는 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이, 혹은 올리고 DNA칩을 하기 순서 및 방법으로 제작하였다. 아울러 하나의 칩위에 8개의 그리드(grid)를 두고 각각의 그리드에 서로 다른 검체를 올려 놓고 분석하므로서 한꺼번에 8개의 검체를 분석할 수 있는 개량된 칩도 제작하였다(도 13와 14).

1. DNA칩 위에 올려질 STD 유전자형 별 프로브의 순서 그리드의 작성

본 발명에서는 칩 위에서 하이브리다이제이션 반응 후 STD유전형에 따른 나타난 형광신호 (fluorescence signal)를 보고 해당 세균을 알기 쉽게 파악할 수 있도록 그룹화 하여 그리드 (grid)를 작성하였다. 그리드의 배열 모식도는 도 13과 같다. 가장 좌측에는 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 16S-23S 리보솜 경계 스페이서에 대한 6개의 프로브를 집적시키고, 그 오른쪽에는 임균의 16S rRNA에 대한 5개 프로브를 집적하였고, 중앙에는 클라미디아 트라코마티스의 크립틱 플라스미드에 대한 7개 프로브를 집적시켰으며, 그 우측에는 마이코플라스마 제니탈리움의 16S rRNA에 대한 5개의 프로브를 집적시켰으며, 그리고 가장 우측에는 테트라사이클린 항생제 내성 유전자에 대한 6개 프로브를 집적시켰다. 또한 대조유전자인 인체형 베타글로빈유전자에 특이한 올리고뉴클레오티드 프로브는 코너마커 (corner marker)로 하여 좌우측 상단에 2개씩과 좌우측 하단에 각각 하나씩 위치하도록 집적하였다.

각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 어레이어를 이용하여 스파팅 내지 집적하였다. 이 때 동일한 프로브를 이중(duplicate)으로 집적하여 각각의 균주의 유전자형이 최소 2번, 최대 4번씩 나오도록 고안하였다.

본 발명의 DNA 칩의 중요한 변형 중 하나는 구획 카버를 이용하여 그리드가 하나의 칩 위에 8개 내지 6개의 구획으로 나눠져 똑같이 존재하도록 하는 것이다. 이로서 하나의 칩 위에 6개 내지 8개의 서로 다른 검체를 검색할 수 있고, 이는 시간과 인력 및 비용을 절감하는 데 매우 유용하다(도 13).

2. 올리고뉴클레오티드 프로브를 칩위에 스파팅할 용액의 제조와 마스터플레이트(master plate) 로의 분주

실시예 10에 따라 고안하여 C6부위에 아민을 붙여 합성한 올리고뉴클레오티드 프로브는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 정제한 후 멸균된 3차 증류수에 최종 농도가 200 pM이 되도록 녹였다. 이렇게 준비된 올리고프로브들을 스파팅 용액인 micro spotting solution Plus (Telechem, TC-MSP, USA)와 4.3배 비율로 섞어 최종 농도가 38 pM이 되게 하였다. 예컨대 200pM 농도의 올리고 프로브 7.6㎕에 스파팅 용액 32.4㎕을 혼합하여 40㎕이 되게 한다. 이렇게 준비된 혼합물은 각각 순서대로 96웰(96-well)의 마스터플레이트에 분주를 하였다.

3. 올리고뉴클레오티드 프로브의 고정화

어레이어를 이용하여 상기 마스터 플레이트로부터 올리고프로브 함유 스파팅 용액을 옮겨서 특수 코팅된 유리슬라이드위에 이중 (double hit)으로 집적한다. 하 나의 스팟에는 평균 약 0.005㎕ 정도의 용적의 프로브 용액이 집적된다. 칩의 원료가 되는 유리슬라이드로는 직경이 7.5 x 2.5cm이며, super aldehyde가 코팅되어 있는 BMT aldehyde glass slide (Biometrix technology, Korea)나 이에 준하는 제품이 적합하다. 어레이어로는 GMS 417 arrayer (Affymetrix, USA)나 MGII (Biorobotics Inc, MA01801, USA), 혹은 이에 준하는 장비가 적합하다.

상기한 대로 유리슬라이드에 프로브를 집적하여 제작한 DNA칩을 습도 80%로 유지되는 유리단지 (glass jar) 내에 넣고 15분간 실온에서 반응한다.

4. 후처리 과정

반응이 끝난 후 고정화된 슬라이드를 건조기 (dry oven)에 넣고 섭씨120℃에서 1시간 30분 동안 구운 (baking) 후 슬라이드를 0.2% 소디움 도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액에서 2분간 2회 세척한 후 3차 증류수로 옮겨 2분간 2회 세척한다. 이후 95℃로 가열한 3차 증류수에 3분간 담가 슬라이드에 붙어 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 변성 (denaturation) 시키고 다시 3차 증류수로 옮겨 1분간 세척한다. 세척을 마친 슬라이드는 환원용액 (blocking solution, 1g NaBH₄, 300ml PBS, 100ml ethanol)에서 15분간 환원시켰고 0.2% SDS용액에서 2분간 2회 세척한 후 3차 증류수로 옮겨 2분간 2회 세척하고, 800rpm에서 1분 30초 동안 원심분리기를 이용하여 슬라이드의 물기를 제거하고 슬라이드 상자 (slide box)에 담아 데시케이터에 넣어 실온에 보관한다.

이상의 과정을 거쳐서 제작된 본 발명의 칩은 다음의 실시예 12에 기술된 것과 같은 방법을 이용하여 상태를 파악하고 품질을 관리 (QC)한다.

실시예 12: DNA 칩위에서의 하이브리다이제이션 반응 및 결과분석

상기 실시예 8에서와 같이 각 세균의 플라스미드 클론 및 인체 베타글로빈 유전자의 플라스미드 클론을 다양한 조합과 농도로 혼합하여 인공적 검체를 만들어서 멀티플렉스 PCR을 수행한 후 그 산물을 앞의 실시예 11에서 제작된 STD DNA칩위에 올려놓고 여러 차례 하이브리다이제이션 반응을 수행한 후 형광스캐너로 분석하여 이의 최적 조건을 수립하였다. 그 방법은 다음과 같고 그 실례를 도 15 내지 23에 나타내었다.

1. 멀티플렉스 PCR

임균과 마이코플라스마 제니탈룸의 16S rRNA와 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 16S-23S intergenic region, 클라마이디아 트라코마티스의 크립틱 플라스미드(cryptic plasmid)와 인체 베타글로빈의 대조유전자의 멀티플렉스 PCR은 실시예 8과 9의 방법을 따랐으며, 단 프라이머 조합 중 역방향의 프라이머, 즉 NGR, CTR, UUR, MGR과 HBBR 의 경우 Cy-5 형광을 표지한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다.

2. 하이브리다이제이션 반응

30개 종류의 올리고뉴클레오티드 프로브를 스파팅시킨 슬라이드 칩위에 검체의 DNA를 주물로 하여 임균과 마이코플라스마 제니탈룸의 16S rRNA와 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 16S-23S intergenic region, 클라마이디아 트라코마티스의 크립틱 플라스미드(cryptic plasmid)와 인체 베타글로빈 유전자를 PCR로 증폭시킨 산물을 올려 놓고 하이브리다이제이션 반응을 실시한다. 이 때100㎕ 용량의 8웰 구획 챔버(perfusion 8 wells chamber, Schleicher & Schuell BioScience, Germany)를 하이브리다이제이션 반응실(hybridization reaction chamber)로 이용하였다.

임균과 마이코플라스마 제니탈룸의 16S rRNA와 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 16S-23S intergenic region, 클라마이디아 트라코마티스의 크립틱 플라스미드(cryptic plasmid)와 인체 베타글로빈 유전자의 PCR 증폭 산물을 각각 10㎕씩 혼합하여 최종 용적 50㎕이 되게 하고, 이를 95℃에서 5분간 변성시킨 후 즉시 얼음에 3분간 방치하였다. 이후 하이브리다이제이션 반응 용액 50㎕를 첨가하여 최종 부피를 100㎕로 조정한 후 45℃에서 슬라이드에 고정된 프로브와 30분간 반응시킨다. 이 때 하이브리다이제이션 반응용액은 20X SSC 2ml와 90% 글리세롤1.7ml, 50mM 인산완충용액 6.3ml을 혼합하여 최종 10ml로 만들어서 조성하였다.

3. 세척 (washing)

하이브리다이제이션 반응 종료 후 DNA 칩에서 구획 카버(well cover)를 제거하고, 슬라이드를 3X SSPE 용액(NaCl (26.295g), NaH₂PO₄-1H₂O(4.14g), Na₂EDTA (1.11g)를 증류수 1liter에 녹여서 10N NaOH로 pH 7.4로 맞춤)에 담근 후 실온에서 2분간 세척하고 다시 1X SSPE(NaCl (8.765g), NaH₂PO₄-1H₂O(1.38g), Na₂EDTA (0.37g)을 증류수 1liter에 녹여서 10N NaOH로pH 7.4로 맞춤) 용액으로 상온에서 2분간 세척한 다음 상온에서 800 rpm 으로 1분30초 동안 원심분리하여 건조시켰다.

4. 스캐닝 분석 (scanning analysis)

하이브리다이제이션 후 세척을 통해 비특이적인 신호(nonspecific signal)는 제거한 후 건조된 슬라이드는 콘포칼 레이저 형광스캐너(confocal laser fluorescence scanner)를 이용하여 그 형광신호와 이미지를 분석한다. 이때의 스캐너로는 Affymetrix 428 Array Scanner(Affymetrix, USA)나 ScanArray Lite(Packard Bioscience, USA), 또는 이에 준하는 장비이면 충분하다.

삭제

실시예 13: 본 발명에 따른 DNA 칩의 검증 실험

상기 실시예 7에서 PCR후 시퀀싱 반응으로 STD의 유무와 원인균이 확인된 바 있고, 실시예 9에서 멀티플렉스 PCR의 정확도 분석에 사용되었던 다양한 인체 검체의 DNA를 대상으로 다시 멀티플렉스 PCR을 수행한 후 그 PCR산물을 상기 실시예 11과 12에서 제작된 STD DNA 칩위에 올려 놓고 실시예 12에 기술한 것과 같은 방법으로 히브라다이제이션 반응을 수행한 후 형광스캐너로 분석하였다. 검사 대상에 포함시킨 DNA검체로는 임균 감염 검체 50례, 클라마이디아 감염 검체 50례, 유레아플라스마 감염 검체 50례, 마이코플라스마 감염 검체 50례, 감염이 없는 검체 50례를 포함하였다. 감염 검체 200례 중에는 복합감염 검체도 40례 포함시켰다.

서로 다른 검사자가 시간 간격을 두고 동일 검사를 2차례 반복 수행하여 본 DNA칩 분석의 민감도와 특이도, 재현성을 조사하였다. 이로서 본 DNA 칩이 임상에서 STD의 4대 원인균을 정확하게 진단할 수 있을 지, 특히 복합감염도 모두 정확하게 진단할 수 있을지를 분석하였다.

단일 PCR 및 시퀀싱 분석의 결과와 비교한 STD DNA칩 분석의 결과는 표 13에 정리하였다.

단일 PCR후 시퀀싱 분석의 결과를 기준으로 할 때 DNA칩의 민감도는 98-100%, 평균 99%이었고, 특이도는 100%이었다. 재현성은 99%이었다. 이상의 결과는 멀티플렉스 PCR과 비교할 때 DNA칩의 특이도가 더 우수하며, 복합감염의 진단 민감도도 더 우수한 것으로 나타났다.

이상에서 본 발명의 실시예를 부분적으로 기술하였으나, 이는 어디까지나 예시일 뿐, 본 발명의 정신을 훼손하지 않는 범위에서 다양한 변형과 변경이 가능하다는 사실은 당업자에게는 자명한 사실이라 할 것이다. 또한 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은 첨부된 청구의 범위를 통하여 보다 명백해질 것이다.

표 13. 임상검체의 DNA칩 분석결과와 시퀀싱결과와 비교한 결과

	진단의 정확도, No(%)
회차	1차	2차
STD 환자군(N = 200) Neissera. gonorrhea(N = 50) Chlamydia trachomatis(N=50) Ureaplsma urealyticum(N=50) Mycoplasma genitalum(N=50) 단일감염(N=160) 복합감염(N=40) 전체	50(100) 49(98) 49(98) 50(100) 159(99.4) 39(97.5) 198(99)	50(100) 50(100) 49(98) 49(98) 40(100) 199(99.5) 198(99)
정상 대조군(N=50)	50(100)	50(100)

본 발명에 따른 멀티플렉스 형 PCR의 방법, DNA 칩은 STD의 원인 중 90% 이상으로 절대 다수를 차지하며, 요도염과 자궁경부염 및 골반염증성질환의 4대 원인균인 임균과 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움을 정확하고 신속하게 동시에 검색할 수 있다. 또한 본 발명의 DNA 칩은 STD 진단의 민감도나 특이도, 재현성이 모두 100%에 가까울 정도로 뛰어나며, 복합감염도 정확히 진단할 수 있으며 검사의 방법이 간편하며, 결과 해석도 용이하고, 짧은 시간 내에 다수의 검체를 신속하고 정확하게 자동 분석할 수 있다는 점에서 기존의 방법보다 우수하며, 경제적이다. 따라서, 본 발명은 STD의 1차 검색이나 확진과 치료방침 결정을 위해 널리 사용될 것으로 판단되며, 기존의 배양이나 염색, 단일 PCR등 기존 DNA검사 키트를 대치할 것으로 기대되는 의학산업상 매우 유용한 발명이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 11 내지 서열번호 33의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 이들 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되며, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 임균, 클라마이디아 트라코마티스 및 마이코플라스마 제니탈리움으로 이루어진 군에서 선택된 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균의 핵산과 상보적으로 결합하는 프로브로서,

서열번호 11 내지 서열번호 16의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 이들 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 핵산과 상보적으로 결합하며, 서열번호 17 내지 서열번호 21의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 이들 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 임균의 핵산과 상보적으로 결합하며, 서열번호 22 내지 서열번호 28의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 이들 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 클라마이디아 트라코마티스의 핵산과 상보적으로 결합하며, 서열번호 29 내지 서열번호 33의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 이들 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 마이코플라스마 제니탈리움의 핵산과 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 프로브.
서열번호 11 내지 서열번호 33의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 이들 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 프로브를 포함하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균의 탐지용 DNA칩.
제 2 항에 있어서, 상기 DNA칩에 집적되는 프로브 용액의 농도는 최소 38pmole/㎕인 것을 특징으로 하는 DNA칩.
제 2 항에 있어서, 상기 프로브 DNA의 5'말단 아민기가 칩의 고체표면의 알데히드기와 시프염기반응으로 고정화되는 DNA 칩.
제 2 항에 있어서, 상기 DNA칩은 각각 하나의 시료를 집적할 수 있는 6개 내지 8개의 구획으로 나뉘어지는 것을 특징으로 하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균의 탐지용 DNA칩.
제 2 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 서열번호 34 내지 서열번호 39의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 이들 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되며, 테트라사이클린 내성 유전자의 핵산과 상보적으로 결합하는 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균의 탐지용 DNA 칩.
제 2 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 서열번호 40의 염기서열을 갖는 인체베타글로빈 유전자의 핵산과 상보적으로 결합하는 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균의 탐지용 DNA 칩.
제 2 항에 따른 STD 원인균 탐지용 DNA 칩, 임균, 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 및 마이코플라스마 제니탈리움으로 이루어진 군에서 선택된 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균 중 하나 이상의 시료 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 및 상기 DNA 칩과 하이브리드 되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD)의 원인균 탐지용 키트.
제 8 항에 있어서, 상기 표지수단은 Cy5인 것을 특징으로 하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD)의 원인균 탐지용 키트.
제 8 항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 임균 DNA를 증폭하기 위한 프라이머세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 클라마이디아 트라코마티스의 DNA를 증폭하기 위한 프라이머세트, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열을 갖는 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 DNA를 증폭하기 위한 프라이머세트, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열을 갖는 마이코플라스마 제니탈리움의 DNA를 증폭하기 위한 프라이머세트 중 어느 하나 이상을 포함하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD)의 원인균 탐지용 키트.
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 베타글로빈 DNA 증폭용 프라이머 세트를 추가로 포함하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD)의 원인균 탐지용 키트.
(a) 성교전파성 질환 원인균의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 시료의 DNA를 PCR 증폭하는 단계;

(b) 제 2 항에 따른 DNA 칩에 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및

(c) 상기 프로브와 하이브리드화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균의 탐지방법.
제 12 항에 있어서, 서열번호 1 내지 서열번호 10에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 갖는 프라이머를 상기 다중 PCR 증폭에 사용하는 것을 특징으로 하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균의 탐지방법.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 검출은 유전자가 Cy5로 표지된 경우 콘포칼 레이저 스캐너를 이용하여 형광신호를 분석함을 특징으로 하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균의 탐지방법.
제 14 항에 있어서, 상기 Cy5 형광물질이 역방향 프라이머에 포함되는 것을 특징으로 하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균의 탐지방법.
제 12 항에 있어서, 단계 (a)의 PCR 증폭방법은

(a)서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 임균 증폭용 프라이머세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 증폭용 프라이머세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 유레아플라스마 유레아라이티쿰 증폭용 프라이머세트, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 마이코플라즈마 제니탈룸 증폭용 프라이머세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프라이머세트를 주형 DNA, Taq DNA 중합효소, dNTP, 증류수, PCR버퍼와 혼합하는 단계;

(b) 상기 혼합물을 반응기에 넣고 95℃에서 5분간 예비변성시키는 단계;

(c) 95℃에서 30초간 변성시키고 56℃에서 40초간 프라이머 결합시키고 72℃에서 45초간 연장시키는 것을 35회 반복하는 단계; 및

(d) 72℃에서 최종 연장 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균의 탐지방법.
제 16 항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 베타글로빈 DNA 증폭용 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균의 탐지방법.
제 17 항에 있어서, 서열번호 1과 서열번호 2, 서열번호 3과 서열번호 4, 서열번호 5와 서열번호 6, 및 서열번호 7과 서열번호 8의 염기서열을 갖는 STD 원인균 증폭용 프라이머세트, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 인체베타글로빈 증폭용 프라이머세트의 비가 1:1:1:1:2인 것을 특징으로 하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균의 탐지방법.
제 16 항에 있어서, 유레아플라스마 유레아라이티쿰의 PCR 산물이 812bp, 임균의 PCR 산물이 386bp, 클라마이디아 트라코마티스의 PCR 산물이 314bp, 마이코플라스마 제니탈룸의 PCR 산물이 110bp 의 크기로 되는 것을 특징으로 하는 성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD) 원인균의 탐지방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제