KR20040022705A - 클라미디아 트라코마티스 탐지용 프로브, 이를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 탐지용 키트, 및 이를 이용한 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법 - Google Patents
클라미디아 트라코마티스 탐지용 프로브, 이를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 탐지용 키트, 및 이를 이용한 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 클라미디아 트라코마티스 탐지용 키트, 및 탐지방법, 그리고 이에 이용되는 프로브, 프라이머, 및 DNA 칩에 관한 것이다. 이러한 프로브 또는 DNA 칩을 이용하여 클라미디아 트라코마티스의 탐지용 키트 및 탐지방법은 배양 검사 또는 항원-항체 검사에 비해 더 빠르고, 쉽고, 정확하게 실험 결과를 도출해 낼 수 있다.
Description
[기술분야]
본 발명은 클라미디아 트라코마티스 감염을 검출하기 위한 탐지용 키트 및 탐지방법, 그리고 이에 이용되는 프로브 및 DNA 칩에 관한 것이다. 이러한 DNA 칩을 이용하여, 클라미디아 트라코마티스의 감염을 진단하는 키트 및 방법을 제공한다.
[종래기술]
클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)는 0.2 ~ 1.5 m 의 크기를 가진 구형의 세균이다. 클라미디아 트라코마티스는 곤충을 통해서 감염되기보다는 사람끼리의 접촉 또는 호흡기를 통해서 감염이 된다. 특히, 성병에 있어서임균(Neisseria gonorrhoeae)과 더불어 가장 심각한 문제를 일으키는 세균 중 하나이다.
클라미디아의 감염은 Elementary Body(EB)가 숙주 세포에 침입한 후, EB 가 Reticulate Body(RB)를 형성하게 된다. 그 후, RB는 여러 차례 분열하게 되고, 그 과정 중에서 EB를 재생산하게 된다. 이렇게 재생산된 EB는 숙주 세포가 깨지는 과정에서 다른 세포로 이동할 수 있게 되어, 세포간 감염이 확산이 된다.
클라미디아 속에는 클라미디아 트라코마티스 외에 클라미디아 시터시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 페코룸(Chlamydia pecorum) 등이 있다. 이 중에서 사람에게 영향을 미치는 세균은 클라미디아 트라코마티스와 클라미디아 뉴모니아이고, 이 중에서 클라미디아 트라코마티스는 사람의 성병과 관련이 있는 세균이다.
클라미디아 트라코마티스는 최소한 15개 혈청형(Serotype)으로 나뉘는 데, 그 기준은 클라미디아 트라코마티스의 Major Outer Membrane Protein(MOMP)를 항원-항체 반응으로 구분하는 것이다(Infection and Immunity, 66(8), 1998, 3618 ~ 3625). 또한, 혈청형에 따라서 유발하는 질병이 다른데, 혈청형 A, B, C 타입은 안구 트라코마(ocular trachoma)를 유발하고, 혈청형 D, E, F, G, H, I, J, K 경우에는 요도염(urethritis), 부고환염(epididymitis), 자궁경부염(cervicitis), 난관염(salpingitis) 등을 유발시킨다. 또한 혈청형 L1, L2, L3 경우 성병성 림프육아종을 유발한다. 크게 나누어서, 혈청형 A 형부터 K 형까지는 점막의 표피세포에 감염되고, 혈청형 L1, L2, 그리고 L3 경우 림프 조직에서 증식하거나 전신성감염(Systemic Infection)을 유발시킨다(Journal of Clinical Microbiology, 129(6), 1991, 1132 ~ 1136).
클라미디아 트라코마티스 감염증의 경우 최근 세계적으로 발생률이 높은 성병 중 하나이고, 자각 증세가 없는 불현성 감염이 50 %가 넘어 반드시 확실한 검사가 필요하다. 초기에 발견했을 경우 쉽게 치료가 되지만, 치료가 늦어질 경우에는 골반염, 불임등의 합병증이 유발되기도 한다.
클라미디아 트라코마티스의 검출에 있어서 현재 가장 정확한 방법은 세포배양법에 의해 분리배양하여 확인하는 방법이다. 그러나 이러한 방법은 검사 방법이 까다롭고, 시간과 비용이 과도하게 소요되기 때문에 많은 클라미디아 트라코마티스 샘플을 검사하는 데 있어서 적합한 방법은 아니다.
세포배양을 하지 않고 클라미디아 트라코마티스를 검출하는 방법으로는 김자염색법이 있는데, 이러한 방법은 눈 감염 시에만 적합할 뿐이고 검체가 요도나 자궁경부일 경우 적합하지 않다는 단점을 가지고 있다.
또한 Major Outer Membrane Protein(MOMP)의 항원에 대한 직접형광항체법은 클라미디아 트라코마티스 검출에 있어서 신속하다는 장점이 있지만, 관찰에 많은 경험과 노련함을 필요로 한다(2002년 성병관리지침, 국립보건원).
본 발명의 목적은 클라미디아 트라코마티스에 대한 별도의 특이 항체를 필요로 하지 않으며 염기서열 결정과정을 거치지 않고도 신속하고 용이하게 높은 특이도 및 민감도로 클라미디아 트라코마티스 감염 여부를 더욱 정확하게 검출할 수 있는 클라미디아 트라코마티스 탐지용 프로브를 제공하고자 한다.
본 발명의 또다른 목적은 클라미디아 트라코마티스의 감염 여부를 더욱 정확하게 검출할 수 있도록, 클라미디아 트라코마티스 증폭용 프라이머를 제공하고자 한다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 클라미디아 트라코마티스 탐지용 프로브를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 탐지용 DNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 클라미디아 트라코마티스 탐지용 프로브를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 탐지용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 클라미디아 트라코마티스 탐지용 프로브를 이용한 클라미디아 트라코마티스 탐지방법를 제공하는 것이다.
도 1은 프라이머 CT1과 CT2-1, 및 프라이머 CT1과 CT2-2을 이용하여 클라미디아 트라코마티스 DNA를 PCR 증폭한 사진이다.
도 2는 프라이머 BGI 과 BGII 를 이용하여 β-글로빈을 PCR 증폭한 결과이다.
도 3는 본 발명의 일례에 따른 DNA 칩에 위치한 프로브의 종류와 위치를 나타내는 모식도이다.
도 4은 프라이머 CT1 과 CT2-1을 이용하여 클라미디아 트라코마티스 양성 표준균주의 DNA를 PCR 증폭한 후, 그것을 DNA 칩에 하이브리디제이션 반응시킨 결과이다.
도 5은 프라이머 CT1 과 CT2-2을 이용하여 클라미디아 트라코마티스 양성 표준균주의 DNA를 PCR 증폭한 후, 그것을 DNA 칩에 하이브리디제이션 반응시킨 결과이다.
도 6은 클라미디아 트라코마티스, 임균(Neisseria gonorrhoeae),매독균(Treponema pallidum), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 인유두종 바이러스(Human Papillomavirus), 단순 포진 바이러스(Herpes Simplex virus)등을 검출할 수 있는 DNA 프로브를 모두 포함하는 DNA칩 포맷의 일례를 도시하고 있다.
도 7은 프라이머 CT1 과 CT2-1을 이용하여 클라미디아 트라코마티스 임상시료의 DNA를 PCR 증폭한 후, 그것을 DNA 칩에 하이브리디제이션 반응시킨 결과이다.
도 8은 프라이머 CT1 과 CT2-2을 이용하여 클라미디아 트라코마티스 임상시료의 DAN를 PCR 증폭한 후, 그것을 DNA 칩에 하이브리디제이션 반응시킨 결과이다.
본 발명은 SEQ ID. NO: 1의 염기서열 내지 SEQ ID NO:11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되며, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 DNA와 상보적으로 결합하는 프로브에 관한 것이다.
본 발명은 또한 SEQ ID. NO: 1의 염기서열 내지 SEQ ID NO:11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는, 클라미디아 트라코마티스 탐지용 DNA 칩에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 상기 클라미디아 트라코마티스의 탐지용 DNA 칩, (b) 클라미디아 트라코마티스의 시료 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 프라이머, 및 (c) 상기 DNA 칩과 하이브리드되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 클라미디아 트라코마티스의 탐지용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 클라미디아 트라코마티스의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 클라미디아 트라코마티스 시료 DNA를 증폭하는 단계;
(b) SEQ ID NO: 1의 염기서열 내지 SEQ ID NO. 12의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트를 포함하는 DNA 칩에 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계;
(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 클라미디아 트라코마티스의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 클라미디아 트라코마티스의 시료 DNA를 증폭하는 단계;
(b) SEQ ID NO: 1의 염기서열 내지 SEQ ID NO: 12의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트와 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및
(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 14의 염기서열 내지 SEQ ID NO: 16의 염기서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 증폭용 프라이머에 관한 것이다.
본 발명자들은 간단한 방법으로 환자의 시료을 분석하여 클라미디아 트라코마티스를 분석할 수 있는 방법을 확립하고자 연구 노력한 결과, 클라미디아 트라코마티스의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브, 및 이를 포함하는 DNA 칩을 개발하였다. 또한, 클라미디아 트라코마티스의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하는 DNA 칩, 시료로부터 채취한 DNA를 PCR방법으로 증폭시키기 위한 프라이머 및 상기 DNA 칩과 하이브리디제이션되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 클라미디아 트라코마티스 분석키트를 제작하였고, 상기 분석키트를 사용하여 환자의 시료에서 채취한 DNA의 분석함으로써, 클라미디아 트라코마티스의 감염여부를 신속하고 정확하게 분석할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 클라미디아 트라코마티스 탐지방법은 배양 검사 또는 항원-항체 검사에 비해 더 빠르고, 쉽고, 정확하게 실험 결과를 도출해 낼 수 있는 장점을 가지고 있다.
이하에서 본 발명을 자세히 설명하고자 한다.
본 발명은 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 DNA와 상보적으로 결합하는 프로브에 관한 것이며, 바람직하게는 SEQ ID. NO: 1의 염기서열 내지 SEQ ID NO:11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것이다. 상기 프로브는 클라미디아 트라코마티스의 DNA 또는 RNA와 하이브리드가능하다.
PCR의 타겟이 되는 클라미디아 트라코마티스 DNA 는 Major Outer Membrane Protein(MOMP)를 발현시키는omp1유전자이다. 이 유전자를 대상으로 해서 PCR 증폭을 실행한 후, DNA 의 증폭 여부에 따라서 클라미디아 트라코마티스의 존재 유무를 관찰할 수 있다. 특히, Major Outer Membrane Protein 의 경우 클라미디아 트라코마티스의 세포와 숙주 세포 사이에서 직접적인 상관관계를 형성하는 단백질이기 때문에, 클라미디아 트라코마티스의 검출 여부를 판단함에 있어서 결정적인 증거가 될 수 있는 단백질이다. 따라서 MOMP 를 발현하는omp1유전자를 검사하는 것은 클라미디아 트라코마티스의 검출에 있어서 타당한 방법이다.
본 발명은 클라미디아 트라코마티스 DNA의 염기서열, 바람직하게는 클라미디아 트라코마티스의omp1DNA와 상보적으로 결합하는 염기서열을 프로브로 제공한다. 본 발명의 프로브는 서열목록 서열번호 1 내지 11에 기재된 염기서열을 포함한다. 하기 표 1중 서열번호 5, 6, 10, 11에서 서열중 진하게 밑줄 그은 부분은 프로브 기능을 위해 적합한 형태를 제공하기 위해서 부가된 서열이다.
| Seq ID No. | 명칭 | 서열 (Sequence) | 길이 |
| 1 | CT II 1-1 | 5'-CCT CTT GAT CTT ACA GCA GGA ACA GA-3' | 26 mer |
| 2 | CT II 1-2 | 5'-CTT GAT CTT ACA GCA GGA ACA GAT G-3' | 25 mer |
| 3 | CT II 1-3 | 5'-CCT CTT GAT CTT ACA GCA GGA ACA GAT G-3' | 28 mer |
| 4 | CT II 2-1 | 5'-CTT GAT ATT ACC GCA GGA ACA GAA G-3' | 25 mer |
| 5 | CT II 2-2 | 5'- CTT CT T TGA TAT TAC CGC AGG AAC AGA AG-3' | 29 mer |
| 6 | CT II 2-3 | 5'- CTT CTT GAT ATT ACC GCA GGA ACA GAA G-3' | 28 mer |
| 7 | CT II 3-1 | 5'-CCT CTT GCA CTC AYA GCA GGA ACT GAT G-3' | 28 mer |
| 8 | CT II 3-2 | 5'-CTT GCA CTC AYA GCA GGA ACT GAT G-3' | 25 mer |
| 9 | CT III 1 | 5'-GAC RGG VAC TAA RGA TGC CTC TAT TGA-3' | 27 mer |
| 10 | CT III 2 | 5'-GAC RGG VAC TAA RGA TGC CTC TAT TGA TGT C -3' | 31 mer |
| 11 | CT III 3 | 5'-GAC RGG VAC TAA RGA TGC CTC TAT TGA GTC -3' | 30 mer |
| 12 | BG 프로브 | 5'-TGC ACC TGA CTC CTG AGG AGA AGT CTG CCG-3' | 30 mer |
| 13 | Negative | 5'-GGT AAA AAT CGA AGG ATA WNR TCA ACC-3' | 27 mer |
상기 표에서 R(A,G): Y(C,T): M(A,C): K(G,T): S(G,C): W(A,T), V(A,C,G): H(A,T,C): B(G,T,C): D(G,A,T): N(A,G,C,T)을 의미하며, 이는 본 기술분야의 전문가에게 널리 알려져 있다.
본 발명의 프로브를 이용하여 높은 특이도와 민감도로 클라미디아 트라코마티스의 존재여부를 분석할 수 있으며, 신속하게 클라미디아 트라코마티스를 검사할 수 있다.
지금까지 발명된 클라미디아 트라코마티스 분석 키트는 실험시간이 오래 걸리고, 실험하는 데 있어서 비용이 많이 들고 또는 실험방법이 까다롭다는 단점이 있었지만, 이번 실험에서는 PCR 을 기본으로 DNA Chip 을 이용하기 때문에 간편하면서도 빠르고 정확한 실험 결과를 도출해 낼 수 있다.
또한 본 발명은 상기 클라미디아 트라코마스의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 마이크로어레이, 바람직하게는 DNA칩이다. 본 발명의 일례에서, 상기 DNA칩은 본 발명의 기술분야 전문가가 용이하게 조합가능한 모든 프로브 서열 세트를 포함하는 DNA 칩도 포함한다. 본 발명에 따른 DNA 칩은 SEQ ID. NO: 1의 염기서열 내지 SEQ ID NO:11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함한다.
또한, 본 발명의 DNA칩은 상기 클라미디아 트라코마스에 대한 프로브 외에도 임균(Neisseria gonorrhoeae), 매독균(Treponema pallidum), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 인유두종 바이러스(Human Papillomavirus), 단순 포진 바이러스(Herpes Simplex virus)등을 검출할 수 있는 DNA 프로브를 동시에 하나의 슬라이드에 고정시켜 하나의 DNA 칩을 제조할 수 있다. 이러한 다양한 DNA칩 포맷의 일례를 도 6에 나타내고 있다.
하나의 슬라이드에 여러 가지 박테리아 또는 바이러스의 DNA 프로브를 고정화시켰을 경우, 한번의 실험으로 어떤 박테리아 또는 바이러스가 시료에 존재하는 지를 쉽게 검출할 수 있게 된다. 또한, 위에서 언급한 박테리아 또는 바이러스 외에 다른 여러 가지 박테리아, 바이러스의 DNA 프로브를 하나의 슬라이드에 올려놓게 될 경우, 마찬가지로 한번의 실험으로 시료를 정확히 분석할 수 있다는 장점이 있다.
상기 DNA 칩은 음성 대조군 프로브를 추가로 포함할 수 있으며, 이의 바람직한 예는 서열목록중 SEQ ID NO: 13에 나타냈다.
또한, 상기 DNA칩은 전체적인 위치 마커 및 하이브리드화반응에 대한 대조군으로서 기준마커를 추가로 포함할 수 있다. 기준마커의 예로는 β-글로빈, 액틴, 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 기준마커로 추가로 포함할 수 있다. 상기 기준마커가 β-글로빈인 경우에는 바람직하게는 SEQ ID NO:12에 나타난 염기서열을 가지며, 이의 증폭을 위한 프라이머로는 SEQ ID NO: 17의 염기서열 및 SEQ ID NO: 18의 염기서열을 갖는 β-글로빈 DNA 증폭용 프라이머일 수 있다.
한편, 상기 클라미디아 트라코마티스의 탐지용 키트에 포함된 DNA 칩의 제조방법은 클라미디아 트라코마티스의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의5'말단에 아민이 결합된 DNA 프로브를 제조하는 공정; 제조된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시키는 공정; 및, 상기 DNA 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시키는 공정을 포함한다.
상기 고체의 표면에서 프로브 DNA와 알데히드의 결합은 이 분야에서 알려진 방법 즉, 30-40℃의 온도 및 70-100%의 습도 조건하에서 아민과 알데히드의 시프염기반응(Schiffs base reaction)을 통해 수행될 수 있다. 상기 알데히드의 환원은 NaBH4와 같은 환원제를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 고체의 표면에 존재하는 알데히드와 반응하는 프로브 DNA의 농도는 100-300 pmole/l이 바람직하다. 이 외 범위로 사용하는 경우 상기 프로브 DNA가 고체 표면에 알데히드와의 결합이 이루어지지 않을 수 있다.
상기 고체는 유리, 실리콘 이산화물, 플라스틱 또는 세라믹으로부터 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 DNA 칩 및 그의 제조방법을 공정별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
제 1공정: 프로브의 제조
클라미디아 트라코마티스의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의 5말단에 아민이 결합된 DNA 프로브를 제조한다. 이때, 프로브는 클라미디아 트라코마티스의 DNA의 염기서열, 바람직하게는 클라미디아 트라코마티스의omp1DNA와 상보적으로 결합하는 염기서열을 갖도록 설계 및 합성되고, 합성된 염기서열이 고체의 표면에 결합될 수 있도록 염기서열의 5'말단에 아민기를 결합시켜서 프로브를 제조한다.
제 2공정: 프로브의 고정화
상기 제조된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시킨다: 이때, 고체는 특별히 제한되는 것은 아니나, 유리인 것이 바람직하고, 고체 표면의 알데히드는 이 분야에서 알려진 방법, 즉 프로브의 5’말단에 결합된 아민과 30 내지 40℃, 70 내지 100%의 습도조건에서 시프염기반응(Schiffs base reaction)을 수행하여 고체표면에 프로브를 결합시킨다. 이때, 프로브의 농도는 100 내지 300 pmole/l가 바람직하고, 가장 바람직하게는 200 pmole/l이다. 또한 상기 고체의 표면에 전체적인 위치 마커 및 하이브리디제이션 반응에 대한 대조군 역할을 하는 β-글로빈을 부착한다.
제 3공정: DNA 칩의 제조
상기 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시켜서, DNA 칩을 제조한다. 이때, 알데히드의 환원조건이 특별히 제한되는 것은 아니나, NaBH4등의 환원제를 사용함이 바람직하다.
본 발명은 클라미디아 트라코마티스의 탐지용 키트에 관한 것이며, 바람직하게는 상기 SEQ ID NO:1 내지 11의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는 DNA 칩을 포함하는 것이다. 본 발명의 구체적인 일례에서,
(a) 상기 클라미디아 트라코마티스의 탐지용 DNA 칩, (b) 클라미디아 트라코마티스의 시료 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 프라이머, 및 (c) 상기 DNA 칩과 하이브리드되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 클라미디아 트라코마티스의 탐지용 키트를 제공한다.
상기 표지수단은 이 기술분야의 숙련된 자에게 알려져 있는 여러 가지 표지물들이 본 발명에 사용될 수 있으며, 그 예로는 Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 또는 텍사스 레드를 사용할 수 있다. 상기 표지수단은 클라미디아 트라코마티스에 대한 표지 유전자를 첨가하여 PCR 반응을 이용하여 증폭 및 표지증폭과정에서 유전자를 표지할 수 있다. 또한, 일반적인 표지수단인 비오틴틴-결합물질을 이용하여 표지할 수 있다. 상기 비오틴-결합물질은 예를 들어, 스트레타비딘-R-피코에리스린(streptavidine-R-phycoerythrin)을 포함한다. Cy5를 이용하여 표지할 경우, 표지된 반응물을 검출할 때 추가적인 반응 없이 직접 콘포칼 레이저 스캐너와 같은 분석기를 이용하여 형광신호를 분석할 수 있어 효율적이며 비오틴-결합물질을 이용하여 표지하는 경우에 비해 더 민감한 결과를 얻을 수 있다.
상기 프라이머는 SEQ ID NO: 14의 염기서열 내지 SEQ ID NO: 16의 염기서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 증폭용 프라이머일 수 있다. 프라이머의 서열은 하기 표 2에 나타냈다.
| Seq ID No. | 명칭 | 서열 (Sequence) | 길이 |
| 14 | CT 1 | 5'-TTA GGA GCT TCT TTC CAA TA-3' | 20 mer |
| 15 | CT 2-1 | 5'-TAA ACT TGC TTG CCA YTC AT-3' | 20 mer |
| 16 | CT 2-2 | 5'-GGA GTG AAC ATA TTY ART CT-3' | 20 mer |
| 17 | BG I | 5'-ATA CAA GTC AGG GCA GAG-3' | 18 mer |
| 18 | BG II | 5'-CTT AAA CCT GTC TTG TAA CC-3' | 20 mer |
상기 표에서 R(A,g): Y(C,T): M(A,C): K(g,T): S(g,C): W(A,T), V(A,C,g): H(A,T,C): B(g,T,C): D(g,A,T): N(A,g,C,T)을 의미하며, 이는 본 기술분야의 전문가에게 널리 알려져 있다.
본 발명은 또한 상기 클라미디아 트라코마티스의 프로브 및 증폭용 프라이머를 이용하여 클라미디아 트라코마티스를 탐지하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일례에서, (a) 클라미디아 트라코마티스의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 클라미디아 트라코마티스의 시료 DNA를 증폭하는 단계;
(b) SEQ ID NO: 1의 염기서열 내지 SEQ ID NO: 12의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트와 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및
(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 일례에서,
(a) 클라미디아 트라코마티스의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 클라미디아 트라코마티스 시료 DNA를 증폭하는 단계;
(b) SEQ ID NO: 1의 염기서열 내지 SEQ ID NO. 12의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트를 포함하는 DNA 칩에 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및
(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법을 제공한다.
상기 프라이머는 SEQ ID NO: 14 내지 SEQ ID NO: 16의 염기서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 증폭용 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 그 예는 상기 표 2에 표시하였다.
또한 본 발명은 상기 클라미디아 트라코마스의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 마이크로어레이, 바람직하게는 DNA칩을 사용할 수 있으며, 상기 DNA칩은 β-글로빈, 액틴, 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 위치 마커로 추가로 포함할 수 있으며, 위치마커는 상기 DNA 칩에서 사용한 것을 사용할 수 있다.
상기 검출은 표지수단을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기에 열거한 표지수단을 사용할 수 있다.
본 발명의 일례에서, 시료 DNA의 증폭은 통상의 PCR 반응으로 수행할 수 있다. 즉, 전변성, 변성, 프라이머 결합, 및 사슬연장단계로 이루어진 PCR 반응으로 시료 DNA를 증폭할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일예에서, 상기 클라미디아 트라코마티스 프라이머 및β-글로빈 프라이머, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 표지물질, 그리고 Taq 폴리머라제를 포함하고, 경우에 따라 첨가물로 BSA 및 DMSO등을 사용하여 PCR 서머싸이클러에 넣고, 94℃에서 5분간 변성(denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 45 ~ 60 ℃에서 1분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 20 ~ 45초간 연장(extension)과정을 30 ~ 35회 반복 후 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, 표지분자가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득한다.
이하, 본 발명의 클라미디아 트라코마티스의 분석키트를 이용한 클라미디아 트라코마티스 검출방법을 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
제 1공정: 시료의 수득 및 증폭
검사할 시료를 증폭시켜서 CY5(Cyanine 5)을 포함하는 증폭시료를 수득한다: 이때, 증폭된 시료가 CY5을 함유하기 위하여 CY5-dUTP를 사용한 PCR을 통하여 증폭시료를 수득한다.
제 2공정: 하이브리디제이션 반응
상기 증폭시료를 DNA 칩에 적용하여, 프로브와 하이브리디제이션 반응을 수행한다.
제 3공정: 검출
프로브와 하이브리디제이션된 DNA를 표지수단으로 표지하고, 이를 검출하여, 클라미디아 트라코마티스의 감염여부를 판단한다. 검출방법은 상기 각각의 표시수단의 검출방법에 따라 수행하며, 예컨대 검출수단으로 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner)로 스캔닝하여 읽을 수 있다.
따라서, 본 발명의 DNA 칩을 이용한 클라미디아 트라코마티스의 분석키트를 사용하여, 시료내에 클라미디아 트라코마티스의 존재여부를 신속하고 간단하며 정확하게 검출할 수 있으므로 클라미디아 트라코마티스로 인해 발생되는 요도염, 자궁경부염 등의 성병 감염이 확산되는 것을 억제할 수 있다.
이하에서 예시적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 특히, 프로브의 종류 및 개수가 특별히 제한되는 것은 아니므로, 클라미디아 트라코마티스로부터 유도된 염기서열을 갖는 프로브를 이용한 DNA 칩 및 상기 DNA 칩을 이용한 각종 분석키트 또한 본 발명의 범주에 속한다.
실시예 1 : 프로브의 제조
클라미디아 트라코마티스를 검출하기 위해 사용된 각각의 프로브와 β-글로빈에 특이적인 프로브는 5' 말단에 아민(Amine)기가 포함되도록 제조하였다. 각 프로브의 염기서열은 서열목록중 SEQ ID NO:1 내지 11에 나타내었다.
실시예 2: DNA 칩의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 각각의 프로브를 3X SSC(0.05 M 소디움 시트레이트, 0.45 M NaCl, pH 7.0)에 200 pmole/l가 되도록 용해시키고, 알데히드기가 결합된 슬라이드(silylated slide, CSS-100, CEL, Houston, TX, USA) 표면에 어레이어(GMS 417 Arrayer, TaKaRa, Japan)를 이용하여 크기 150m, 간격 300m으로 스파팅(spotting)한 다음 37℃, 습도 70%이상의 조건에서 4시간 동안 시프염기반응(Schiff base reaction)을 수행하였다. 이어, 0.2%(w/v) 소디움 도디실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액으로 슬라이드를 세척하고, 3차 증류수로 세척한 다음, NaBH4용액(0.1 g NaBH4, 30 ml phosphate buffered saline(PBS), 10 ml ethanol)에 5 분 동안 침지하여 아민(Amine)이 결합되지 않은 알데히드를 환원시킨 후, 3차 증류수로 세척하고, 건조시켜서 DNA 칩을 제조하였다.
또한 상기 고체의 표면에 전체적인 위치 마커 및 하이브리디제이션 반응에 대한 대조군 역할을 하는 β-글로빈을 부착하였다.
실시예 3: 최적 PCR 증폭반응(클라미디아 트라코마티스 증폭)
방법 1)
94℃에서 5분간 변성(denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 45 ~ 60℃에서 1분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 30초간 연장(extension)과정을 30 ~ 35 회 반복 후, 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다. 이에 대한 결과는 도 1에 자세하게 나타나 있다.
방법 2)
45 ~ 60℃에서 1분간 프라이머 결합(primer annealing)을 수행하는 것을 제외하고는 상기 방법1과 동일하게 실험하여 Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.
실시예 4 : 최적 PCR 증폭반응 (β-글로빈 증폭)
방법 1)
94℃에서 5분간 변성(denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 50℃ 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 30초간 연장(extension)과정을 5회 반복 후 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 50℃에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 15초간 연장(extension)과정을 35회 반복한 뒤 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다. 이에 대한 결과는 도 2에 자세하게 나타나 있다.
방법 2)
50℃에서 30초간 프라이머 결합(primer annealing)을 수행하는 것을 제외하고는 상기 방법1과 동일하게 실험하여 Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.
실시예 5 : 시료의 수득
사람의 자궁경부조직(Human cervical swabs)이 클라미디아 트라코마티스에 감염되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 먼저 상기 조직에서 DNA를 추출하고, 정제하였다. 상기 정제된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 17 및 18에 나타난 염기서열을 갖는 β-글로빈 프라이머(β-globin primer)를 이용하여 PCR을 수행하며, β-글로빈 유전자가 증폭된 DNA를 선별하여 검색시료로서 사용하였다. 증폭된 β-글로빈 DNA는 도 2에 나타내었다. 클라미디아 트라코마티스 양성 표준균주 시료 및 임상시료는 국립보건원에서 수령하였으며, 이로부터 얻어진 DNA 시료를 이용해서 PCR 및 DNA 칩 실험에 사용하였다. 추출한 클라미디아 트라코마티스 DNA를 서열번호 14 내지 16에 나타난 프라이머를 이용하여 PCR 증폭실험을 수행하였다.
증폭된 클라미디아 트라코마티스 DNA는 도 1에 나타내었다. 도 1은 프라이머 CT1 과 CT2-1, 및 프라이머 CT1 과 CT2-2을 이용하여 클라미디아 트라코마티스 DNA를 PCR 증폭한 사진이며, 각 레인은 다음과 같다. 1: 클라미디아 트라코마티스 임상시료 DNA 증폭사진(CT1~CT2-1), 2: 클라미디아 트라코마티스 임상시료 DNA 증폭사진(CT1~CT2-2), 3:클라미디아 트라코마티스 임상샘플 DNA 증폭사진(CT1~CT2-1), 4: 클라미디아 트라코마티스 임상샘플 DNA 증폭사진(CT1~CT2-2), 5: 클라미디아 트라코마티스 양성 표준균주 DNA 증폭사진(CT1~CT2-1), 6: 클라미디아 트라코마티스 양성 표준균주 DNA 증폭사진(CT1~CT2-2).
5-1: 클라미디아 트라코마티스 양성 표준균주 시료의 수득
상기 정제된 클라미디아 트라코마티스 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 14 내지 서열번호 16의 프라이머를 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다: 1 x PCR 완충용액(50mM KCl, 10mM Tris-HCl, pH 8.3), 0.1 ㎍의 DNA, 3 mM MgCl2, 각 10 pmol의 프라이머, 50℃M의 각 dATP, dCTP, dGTP, dTTP(Pharmacia), 0.05 nM의 Cy5-dUTP(NEN, USA) 및 2 유니트 Taq 폴리머라제(TaKaRa, Japan)를 포함하는 50 ㎕의 반응혼합물을 PCR 서머싸이클러(thermocycler, Perkin-Elmer Cetus, CA, USA)에 넣고, 94℃에서 5분간 변성(denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 50℃에서 1분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 30초간 연장(extension)과정을 30회 반복 후 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.
5-2: 클라미디아 트라코마티스 임상 시료의 수득
상기 임상시료 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 14 내지 16에 나타난 염기서열을 프라이머로 사용하며, 실시예 5-1과 동일한 방법으로 Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.
5-3:β-글로빈 시료의 수득
상기 임상시료 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 17 및 서열번호 18에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머로 사용하며, 실시예 5-1과 동일한 방법으로 Cy5가 결합된 증폭된 DNA 시료를 수득하였다.
실시예 6: DNA 칩을 사용한 표준균주의 분석
상기 실시예 2에서 제조한 DNA칩에 실시예 5-1에서 수득한 증폭된 시료를 적용하여, 하이브리디제이션 반응을 다음과 같이 수행하였다. 이때, 하이브리디제이션 반응실(Hybridization reaction chamber)로 100 ㎕ 용량의 커버슬립(cover slip, GRACE Bio-Labs, USA, PC4L-1.0)을 사용하였다.
클라미디아 트라코마티스 DNA의 경우는 10 ㎕의 증폭산물과 β-증폭산물 5 ㎕의 혼합물을 반응시료로서 사용하였다. 상기 반응시료에 3N 수산화나트륨(NaOH) 수용액을 10%(v/v) 첨가하여 실온에서 5분간 변성시키고, 1M Tris-HCl(pH 7.2)을 5%(v/v) 첨가하여 중화시켰다. 그런 후에, 상기 결과물에 3N 염산을 10%(v/v) 첨가한 후, 얼음에서 5분간 방치하였다. 이어서, 하이브리디제이션 용액(6X 식염수-소디움 포스페이트-EDTA 완충액(SSPE, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)와 0.2% 소디움 도데실 설페이트(SDS))을 사용하여 40℃에서 실릴화된 슬라이드(silylated slide)에 고정된 프로브와 2시간 동안 반응시키고, 3X SSPE로 2분, 1X SSPE로 2분간 DNA 칩을 세척하여 실온에서 공기 건조하거나 스핀 건조기(spin dryer)를 사용하여 건조하였다.
이를 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner, GSI Lumonics, Germany)를 이용하여 형광신호를 분석하였다(excitation 650 nm, emission 668 nm) 그 결과는 도 4 내지 도 5에 나타내었다.
도 3은 DNA 칩에 위치한 프로브의 종류와 위치를 나타내는 모식도로서, 표시된 번호는 각각의 프로브를 나타내고, (○)는 시료와 결합할 수 있는 프로브가 결합된 부위를 나타내며, (○) 안에 들어있는 글씨는 프로브의 명칭을 나타낸다. 분석한 결과는 도 4와 도 5에 잘 나타나 있다. 도 4는 프라이머 CT1 ~ CT2-1을 이용하여 양성 표준균주 DNA를 증폭한 후, DNA 칩 테스트를 한 결과이고, 도 5의 경우는 프라이머 CT1과 CT2-1을 이용해 양성 표준균주 DNA를 증폭한 후, DNA 칩 테스트를 한 결과이다. 각각의 경우 DNA 칩상에서 클라미디아 트라코마티스를 검출할 수있는 프로브의 성능을 비교해 볼 수 있었다. CTIII-1, CTIII-2, CTIII-3, CTIII1, CTIII2, CTIII3의 여섯 가지 프로브가 뛰어난 검출효과를 보임을 알 수 있었다.
실시예 7: DNA 칩을 사용한 임상시료의 분석
상기 실시예 2에서 제조한 DNA칩에 실시예 5-2에서 수득한 임상시료의 증폭된 DNA를 적용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 6과 실질적으로 동일한 방법으로 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타냈다.
도 7은 프라이머 CT1 ~ CT2-1을 이용하여 임상시료 DNA를 증폭한 후, DNA 칩 테스트를 한 결과이고, 도 8의 경우는 프라이머 CT1과 CT2-1을 이용해 임상시료 DNA를 증폭한 후, DNA 칩 테스트를 한 결과이다. 각각의 경우 DNA 칩상에서 클라미디아 트라코마티스를 검출할 수 있는 프로브의 성능을 비교해 볼 수 있었다.
본 발명은 클라미디아 트라코마티스 감염을 검출하기 위한 탐지용 키트 및 탐지방법, 그리고 이에 이용되는 프로브 및 DNA 칩을 제공하여, 배양 검사 또는 항원-항체 검사에 비해 더 빠르고, 쉽고, 정확하게 실험 결과를 도출해 낼 수 있는 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법을 제공한다는 장점이 있다.
Claims (14)
- SEQ ID. NO: 1의 염기서열 내지 SEQ ID NO:11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되며, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 핵산과 상보적으로 결합하는 프로브.
- SEQ ID. NO: 1의 염기서열 내지 SEQ ID NO:11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는, 클라미디아 트라코마티스 탐지용 DNA 칩.
- 제 2 항에 있어서, 상기 DNA칩은 β-글로빈, 액틴, 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 기준마커 프로브를 추가로 포함하는 클라미디아 트라코마티스 탐지용 DNA 칩.
- 제 3 항에 있어서, 상기 β-글로빈 프로브는 SEQ ID NO:12에 나타난 염기서열을 갖는 β-글로빈 프로브인 DNA칩.
- 제 2 항에 있어서, 상기 프로브 DNA의 5'말단 아민기가 칩의 고체표면의 알레히드기와 시프염기반응으로 고정화되는 것인 DNA칩.
- (a) 제 2항 내지 5항중 어느 한항에 따른 클라미디아 트라코마티스의 탐지용 DNA 칩, (b) 클라미디아 트라코마티스의 시료 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 프라이머, 및 (c) 상기 DNA 칩과 하이브리드되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 클라미디아 트라코마티스의 탐지용 키트.
- 제 6 항에 있어서, 상기 표지수단은 Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 클라미디아 트라코마티스의 탐지용 키트.
- 제 6 항에 있어서, 상기 프라이머가 SEQ ID NO: 14의 염기서열 내지 SEQ ID NO: 16의 염기서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 증폭용 프라이머인, 클라미디아 트라코마티스의 탐지용 키트.
- 제 6 항에 있어서, 상기 프라이머가 SEQ ID NO: 17의 염기서열 내지 SEQ ID NO: 18의 염기서열을 갖는 β-글로빈 DNA 증폭용 프라이머를 포함하는 클라미디아 트라코마티스의 탐지용 키트.
- (a) 클라미디아 트라코마티스의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 클라미디아 트라코마티스 시료 DNA를 증폭하는 단계;(b) SEQ ID NO: 1의 염기서열 내지 SEQ ID NO: 11의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트를 포함하는 DNA 칩에 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 프라이머는 SEQ ID NO: 14 내지 SEQ ID NO: 16의 염기서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 증폭용 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 것인 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 검출은 유전자가 Cy5로 표지된 경우 콘포칼 레이저 스캐너를 이용하여 형광신호를 분석함을 특징으로 하는 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법.
- (a) 클라미디아 트라코마티스의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 클라미디아 트라코마티스의 시료 DNA를 증폭하는 단계; 및(b) SEQ ID NO: 1의 염기서열 내지 SEQ ID NO: 12의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트와 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계;(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법.
- SEQ ID NO: 14의 염기서열 내지 SEQ ID NO: 16의 염기서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 증폭용 프라이머.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006038752A1 (en) * | 2004-10-08 | 2006-04-13 | Goodgene Inc. | Probe of bacteria causing sexually transmitted diseases, dna chip and genotyping kit |
| WO2010062001A1 (en) * | 2008-11-25 | 2010-06-03 | Goodgene Inc. | Dna chip, kit for detecting or genotyping bacteria causing sexually transmitted diseases, genotyping antibacterial drug resistance and detecting or genotyping method using the same |
| KR101272017B1 (ko) * | 2011-09-23 | 2013-06-07 | 주식회사 랩 지노믹스 | 비뇨생식기 감염 질환 진단용 ｄｎａ칩 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| US5601978A (en) * | 1993-09-03 | 1997-02-11 | Abbott Laboratories | Oligonucleotides and methods for the detection of chlamydia trachomatis |
| US6169169B1 (en) * | 1994-05-19 | 2001-01-02 | Dako A/S | PNA probes for detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis |
| JP3609164B2 (ja) * | 1995-08-14 | 2005-01-12 | 日立建機株式会社 | 建設機械の領域制限掘削制御の掘削領域設定装置 |
| US20020086289A1 (en) * | 1999-06-15 | 2002-07-04 | Don Straus | Genomic profiling: a rapid method for testing a complex biological sample for the presence of many types of organisms |
| WO2002052043A1 (fr) * | 2000-12-26 | 2002-07-04 | Takara Bio Inc. | Procede de detection d'un micro-organisme pathogene |
-
2002
- 2002-09-09 KR KR10-2002-0054329A patent/KR100532664B1/ko not_active IP Right Cessation
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006038752A1 (en) * | 2004-10-08 | 2006-04-13 | Goodgene Inc. | Probe of bacteria causing sexually transmitted diseases, dna chip and genotyping kit |
| KR100619189B1 (ko) * | 2004-10-08 | 2006-08-31 | 굿젠 주식회사 | 성교전파성질환 원인균 탐지용 프로브 및 이를 이용한성교전파성질환 원인균 유전자형 분석용 ｄｎａ 칩,분석키트 및 유전형 분석방법 |
| WO2010062001A1 (en) * | 2008-11-25 | 2010-06-03 | Goodgene Inc. | Dna chip, kit for detecting or genotyping bacteria causing sexually transmitted diseases, genotyping antibacterial drug resistance and detecting or genotyping method using the same |
| KR101272017B1 (ko) * | 2011-09-23 | 2013-06-07 | 주식회사 랩 지노믹스 | 비뇨생식기 감염 질환 진단용 ｄｎａ칩 |
| US9434998B2 (en) | 2011-09-23 | 2016-09-06 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | DNA chip for diagnosis of genitourinary infections |
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