KR100532666B1 - 매독 트레포네마 탐지용 프로브, 이를 포함하는 매독트레포네마 탐지용 키트, 및 이를 이용한 매독트레포네마의 탐지방법 - Google Patents
매독 트레포네마 탐지용 프로브, 이를 포함하는 매독트레포네마 탐지용 키트, 및 이를 이용한 매독트레포네마의 탐지방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 매독 트레포네마의 핵산과 상보적으로 결합하는 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩을 사용하여 매독 트레포네마의 탐지 또는 treponema pallidum repeat (tpr) gene의 subfamily 분석용 키트, 및 상기 프로브 또는 분석키트를 사용하여 매독 트레포네마의 감염여부를 탐지하고 트레포네마 tpr subfamily를 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 매독 분석방법은 종래의 현미경을 이용한 검사나 혈청학적 검사에 비해 더욱 특이적이고 민감하게 실험 결과를 도출해 낼 수 있는 장점을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 한번의 실험으로 트레포네마 tpr subfamily까지 구분해 낼 수 있다.
Description
[기술분야]
본 발명은 매독 트레포네마 탐지 또는 tpr subfamily 분석키트 및 분석방법, 및 이에 사용되는 프로브 및 DNA 칩에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 매독 트레포네마 특이적 프로브를 이용하여 매독 트레포네마의 tpr 유전자의 서브패밀리를 분석하는 분석키트 및 전기 분석키트를 사용하여 매독 트레포네마의 감염여부를 판별하는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
매독은 나선충인 매독 트레포네마 (Treponema pallidum)라는 병원체(病原體)의 감염으로 인해 생기는 만성전염병으로 주로 매독 환자와의 성교 또는 입맞춤 등으로 감염되거나, 간혹 모체로부터 태아에게 전염되기도 한다. 또한 감염 초기에 치료를 하지 못하게 되면 뼈, 심장, 신경 조직 등의 손상을 가져오게 된다. 현대에 이르러, 성병에 있어서 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 임균 (Neisseria gonorrhoeae)처럼 심각한 문제를 일으키는 세균으로 꼽히지는 않지만 태아 감염등의 문제를 일으키는 면에 있어서 중요시되고 있는 질병이며, 연간 100,000명 이상의 성인 환자 발생을 보이고 있고, 3000건 이상의 신생아에게 전염되고 있다 (Curr Opin Ophthalmol 2001; 12:433-441).
매독의 병증을 나누는 단계는 모두 다섯 단계로 나눌 수 있다 : primary, secondary, latent, neurosyphilis, tertiary(late). 매독에 감염된 사람은 처음 두 단계에 있는 동안 다른 사람을 전염시킬 수 있게 된다. 매독 트레포네마는 성교나 입맞춤 등의 과정뿐만 아니라, 몸의 전체에 있어서 피부의 상처를 통해서도 전염될 수 있다. tertiary syphilis와 neurosyphilis의 경우에는 전염성은 없지만, 체내 감염 장기에서 다른 장기나 조직, 뇌로의 전이가 일어나고 이는 심각한 심혈관의 손상이나 신경계통의 이상을 초래한다.
Primary syphilis의 증상은 종기나 하감(下疳)등의 증상이 십 일에서 삼 개월 이내에 접촉이 있었던 부위에 나타난다. 이러한 증상은 몇 주 내에 사라지고, 통증이 거의 없거나 내부에서 있기 때문에 발견하지 못하는 경우가 많다.
Secondary syphilis는 종종 발진(發疹)의 증상으로 나타나며, 균 자체가 매우 활동적인 시기이므로 꼭 성적 행위를 통해서 만이 아니라도 상처난 피부를 통해서 전염이 되기 쉬운 시기이다. 미열과 피로, 두통, 인후통, 탈모 등의 증상이 나타난다.
Latent syphilis는 기타의 임상적 증후가 없고 cerebrospinal fluid (CSF)를 이용한 혈청학적 검사에만 양성 반응을 보인다. 감염 후 1년 이내에 속하는 early latent syphilis는 다른 이에게 전염시킬 가능성을 가지며 재발이 일어날 수 있지만, late latent syphilis의 경우에는 재발에 대해서 면역성을 갖는다.
매독 트레포네마에 감염된 후 치료를 받지 않은 latent syphilis 환자의 삼분의 일 정도는 late, tertiary syphilis로의 발전이 된다. Tertiary syphilis의 경우, 세균이 심장, 안구, 뇌, 신경 시스템, 뼈, 관절 등 몸의 대부분의 부분에 손상을 입히게 된다. 이 경우는 수년 동안 지속이 될 수 있다. Late syphilis는 흔히 심혈관계의 질환과 정신질환, 실명, 심지어 사망에 이를 수도 있다 (Clin. Microbiol. rev. 1995; 8: 1-21).
매독의 진단은 직접 균을 확인하는 방법과 혈청학적으로 확인하는 방법으로 나뉜다. 매독 트레포네마는 시험관에서 배양이 불가능하므로 직접 토끼에 접종시키거나 (rabbit infectivity test, RIT) 종기나 하감의 표피에서 시료를 채취해서 특별히 제작된 "dark-field" 현미경에서 관찰을 함으로서 매독 트레포네마가 있는지를 직접 확인할 수 있다. 이 방법은 상당히 숙달된 전문성이 요구되어 오진이 발생될 수 있으며 시간이 많이 소요되어 latent 또는 tertiary syphilis 환자의 진단에는 적당하지 않은 방법이다 (Clin. Microbiol. rev. 1995; 8: 1-21).
위와 같은 이유 때문에, 매독의 대부분의 경우에는 혈청학적 방법을 이용하는 non-treponemal assays를 이용하여 진단을 먼저 내린다. Non-treponemal test는 cardiolipin 항원을 써서 regin을 검사하는 방법이다. 매독 트레포네마의 감염에 의해 생성되는 anti-lipoidal 항체를 검출하는 Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) 방법과 rapid plasma reagin (RPR) 방법 등이 이러한 non-treponemal assay에 속한다. 하지만 이러한 non-treponemal assays는 비특이 기질의 항원을 사용하므로 specificity에 있어서 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제점은 neurosyphilis를 진단하는데 있어서 많이 발생을 하게 된다 (J. Clin. Microbiol. 1997; 35;1348-1352).
이러한 문제점 때문에 treponemal-based 혈청학적 방법을 이용한 확인과정이 요구되어지고 있다. Treponemal-based 혈청학적 방법은 균체 자체 또는 균체 성분을 항원으로 사용하여 특이 항체를 검출하는 방법으로, Fluorescent treponemal antibody-absorption (FTA-ABS) 방법과 TPHA (TP hemagglutination test), T. pallidum immobilization test (TPI) 방법 등이 있다. Treponemal-based 혈청학적 방법은 높은 specificity로 인해 non-treponemal assays 양성 결과의 확인용으로 주로 쓰인다. 그러나 매독이 치료되어 균이 모두 소멸 된 후에도 항체를 가지고 있을 수 있으므로 위양성 결과를 도출해 낼 가능성이 커 치료 경과 관찰에는 쓸 수 없다. 또한 진단을 수행하는데 있어서 너무 가격이 비싸고, 복잡하고, 시간이 오래 걸리며, 다양하고 복잡한 기계들의 사용이 요구되어지고, 취급자의 숙련된 기술이 요구되어지는 등의 여러 가지 단점들도 가지고 있다 (J. Clin. Microbiol. 1997; 35;1348-1352).
매독균을 검출하는데 있어서 다양한 방법들이 개발되어 사용되어지고 있기는 하지만, 여러 가지 문제점들이 존재하고 이러한 문제점들을 해결한 새로운 방법의 개발이 요구되고 있는 상황이다. 따라서, 정확하고 저렴하며 간단하게 매독균을 검출하는 방법의 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 매독 트레포네마 (트레포네마 팔리덤, Treponama pallidum, T. pallidum)에 대한 별도의 특이 항체를 필요로 하지 않으며 염기서열 결정과정을 거치지 않고도 신속하고 용이하게 높은 특이도 및 민감도로 매독 트레포네마 감염 여부를 더욱 정확하게 검출할 수 있는 매독 트레포네마 탐지용 프로브를 제공하고자 한다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 매독 트레포네마 탐지용 프로브를 포함하는 매독 트레포네마 탐지용 DNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 매독 트레포네마 탐지용 프로브를 포함하는 매독 트레포네마 탐지용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 매독 트레포네마 탐지용 프로브를 이용한 매독 트레포네마 탐지방법를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 매독 트레포네마 탐지용 프로브를 포함하는 성인성 질환(sexually transmitted disease)의 원인균 탐지용 DNA칩 또는 분석키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되며, 매독 트레포네마의 핵산과 상보적으로 결합하는 프로브에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는, 매독 트레포네마의 탐지 또는 서브패밀리 분석용 DNA 칩에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 상기 매독 트레포네마의 탐지용 DNA 칩, (b) 매독 트레포네마의 시료 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 프라이머, 및 (c) 상기 DNA 칩과 하이브리드되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 매독 트레포네마의 탐지 또는 tpr 서브패밀리 분석용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 매독 트레포네마의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 시료 DNA를 증폭하는 단계;
(b) 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트를 포함하는 DNA 칩에 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및
(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 매독 트레포네마의 탐지 또는 서브패밀리 분석방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 매독 트레포네마의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 매독 트레포네마의 시료 DNA를 증폭하는 단계;
(b) 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트와 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및
(c) 상기 프로브와 하이브리화 된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 매독 트레포네마의 탐지 또는 tpr 서브패밀리 분석방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 7의 염기서열 내지 서열번호 11의 염기서열을 갖는 매독 트레포네마 DNA 증폭용 프라이머에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는 매독 트레포네마 탐지용 프로브 및,
클라미디아 트라코마스(Chlamydia trachomatis), 나이세리아속 균(Neisseria), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 인유두종 바이러스(Human Papillomavirus), 및 단순 포진 바이러스(Herpes Simplex virus) 검출용 DNA 프로브로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 성인성 질환(Sexually transmitted disease)의 원인균 탐지용 DNA 칩에 관한 것이다.
본 발명자들은 간단한 방법으로 환자의 유전형을 분석하여 매독 트레포네마의 감염여부를 진단하고, 감염된 매독 트레포네마의 tpr 서브패밀리를 정확하게 판별할 수 있는 방법을 확립하고자 연구 노력한 결과, 매독 트레포네마의 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브 및 이를 포함하는 DNA 칩을 개발하였다. 또한, 매독 트레포네마의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하는 DNA 칩, 시료로부터 채취한 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 프라이머 및 상기 DNA 칩과 하이브리디제이션되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 매독 트레포네마의 tpr 서브패밀리 분석키트를 제작하였고, 상기 분석키트를 사용하여 환자의 시료에서 채취한 DNA에서 매독 트레포네마의 감염여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 감염된 매독 트레포네마의 tpr 서브패밀리를 판별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에서 사용되는 매독 트레포네마 탐지 방법은 종래 기술의 문제점을 해결할 수 있을 뿐만 아니라, 이러한 문제들을 충족시킬 뿐 아니라, 본 발명의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였을 경우 3마리 이하의 매독 트레포네마를 진단할 수 있으며 (도 2a 내지 도 2b), 본 발명의 마이크로 어레이를 사용할 경우 민감도는 더욱 좋아지는 결과를 나타냄으로써(도 4, 5) 높은 민감도로 인해 매독의 진단에 있어서 "gold standard" 방법이라 여겨지고 있는 RIT (10마리 이하) (Br. J. Vener. Dis. 1969; 45:183-196)에 비해 더 나은 민감도 (sensitivity)를 갖는 장점이 있다.
본 발명의 PCR 대상이 되는 매독 트레포네마의 DNA는 트레포네마 필리둠 리피트 (treponema pallidum repeat, tpr) 유전자이다. 이 유전자를 대상으로 해서 PCR 증폭을 실행한 후 DNA 증폭 여부에 따라 매독 트레포네마의 존재 유무를 관찰할 수 있다. 특히 Tpr 단백질은 표면 단백질로서 숙주와의 면역반응에 직접적으로 관련된 단백질이며 총 DNA 양인 1.1 Mb 의 2% 라는 큰 부분을 차지하는 사실로 미루어보아 균의 생존과 독성에 중요한 유전자이므로 (J. Exp. Med. 1999; 189:647-656) tpr 유전자를 검사하는 것은 매독 트레포네마의 검출에 있어서 타당한 방법이다. 본 발명에서 표준균주로 사용한 Nichols strain은 tpr A에서 L까지 12 개를 포함하며 아미노산의 상동성(homology)에 따라 서브패밀리 I (tpr CDFI), II (tpr EGJ), III (tpr ABHKL)로 나눌 수 있다 (Infect. Immun. 2000; 68:6482-6486, J. Exp. Med. 1999; 189:647-656,). 매독 트레포네마의 전체서열은 GenBank Accession No. NC_000919에 기재되어 있다. 본 DNA 칩은 한번의 PCR로 tpr 서브패밀리 I 또는 II를 구분할 수 있는 장점이 있으며 tpr 서브패밀리에 따른 매독 트레포네마의 subtyping은 역학 조사에 도움을 줄 것이다.
이하에서 본 발명을 자세히 설명하고자 한다.
본 발명은 매독 트레포네마의 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합하는 프로브에 관한 것이며, 바람직하게는 tpr 유전자의 일부, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것이다. 상기 프로브는 매독 트레포네마의 DNA 또는 RNA와도 하이브리드 가능하다.
본 발명은 매독 트레포네마의 핵산, 바람직하게는 매독 트레포네마의 tpr DNA와 상보적으로 결합하는 염기서열을 프로브로 제공한다. 본 발명의 바람직한 프로브의 예로서 서열목록 서열번호 1 내지 5에 기재된 염기서열을 포함한다. 서열번호 1 내지 3에 나타낸 프로브는 tpr 서브패밀리 I을 탐지하기 위한 프로브이고, 서열번호 4 내지 5에 나타낸 프로브는 tpr 서브패밀리 II를 탐지하기 위한 프로브이다.
| SEQ ID NO. | 명칭 | 서열 |
| 1 | 1-I-a | 5'-AACGAAAACAAAACAGCACTCCTCGTT-3’ |
| 2 | 1-II-a | 5'-TCGGTGCACAGAAGGACGCAAACAA-3’ |
| 3 | 1-II-b | 5'-TCAGAACAAGGATAAACTGCTGTGGAAT-3’ |
| 4 | 2-a | 5'-GGCCGACTCACCCTCGAACCAGGC-3’ |
| 5 | 2-b | 5'-GGCTTCCGCTTCTCCTTCGCCCTCG -3’ |
| 6 | β-글로빈 | 5'-TGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCG -3’ |
또한 본 발명은 매독 트레포네마의 DNA증폭용 프라이머를 제공하고자 한다. 본 발명은 서열번호 7 및 11에 나타난 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 매독 트레포네마 DNA의 증폭을 위한 프라이머를 제공한다. 이하 표 2에서 본 발명의 프라이머를 나타내었다. 본 발명의 매독 트레포네마 증폭용 프라이머는 tpr I(tpir CDFI) 및 tpr II(EGJ)에 모두 공통적으로 존재하는 서열에 기초하여 고안되었으며, 예로서 본 발명에 따른 서열번호 7 내지 11에 나타낸 프라이머를 tpr C 유전자 서열에 표시한 것을 도 1에 도시하였다. tpr C 유전자는 매독 트레포네마의 134901bp 내지 136697에 위치하며, 도 1에서 밑줄 그어 표시한 부분은 tpr C의 577 bp 내지 596 bp에 위치하는 것이 서열번호 7의 정방향 프라이머이고, 774 bp 내지 793 bp 위치에 나타난 핵산의 역방향(즉 3' -> 5') 서열이 서열번호 8의 역방향 프라이머이고, 824 bp 내지 843 bp 위치에 나타난 핵산의 역방향이 서열번호 9의 역방향 프라이머이다. 또한, 박스로 표시한 부분으로서, 358 bp 내지 377 bp위치에 나타낸 것이 서열번호 10의 정방향 프라이머이고, 578 bp 내지 597 bp에 위치에 나타난 핵산의 역방향 서열이 서열번호 11의 프라이머 서열이다.
| SEQ ID NO. | 명칭 | 서열 |
| 7 | 1-F (정방향) | 5'-GGTGCCTGGGATAGTACTGA-3’’ |
| 8 | 1-R (역방향) | 5'-CTGGTTCGAGGGTGAGTCGG-3’ |
| 9 | 2-R (역방향) | 5'-CTGGTGTTGGTTACCGGCGT-3’ |
| 10 | 3-F (정방향) | 5'-CACTGTTATGGGGCCTACCT-3’ |
| 11 | 3-R (역방향) | 5'-GTCAGTACTATCCCAGGCAC-3’ |
| 12 | BG-F (정방향) | 5'-ATACAAGTCAGGGCAGAG-3' |
| 13 | BG-R (역방향) | 5'-CTTAAACCTGTCTTGTAACC-3' |
본 발명은 매독 트레포네마 DNA를 증폭하기 위한 프라이머로서 서열번호 7 및 10의 프라이머중에서 선택된 1종의 정방향 프라이머와, 서열번호 8, 9, 및 11의 프라이머중에서 선택된 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍, 바람직하게는 서열번호 7 및 8에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍, 서열번호 7 및 9에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍, 또는 서열번호 10 및 11에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍을 제공한다. 본 발명의 바람직한 일례에서, 매독 트레포네마 유형에 따른 프라이머 및 프로브의 선택 및 조합을 하기 표 3에 정리하여 표시하였다.
| 프라이머 서열번호 | 프로브 서열번호 | 구분할 수 있는 tpr 유형 |
| 7 및 8 | 1 | 1 |
| 7 및 8 | 2 및 3 | 2 |
| 7 및 9 | 1 | 1 |
| 7 및 9 | 2 및 3 | 2 |
| 7 및 9 | 4 및 5 | 1과 2 공통 |
바람직하게는 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머쌍을 사용하여 매독 트레포네마 DNA를 증폭한 후 서열번호 1,2,3으로 이루어진 프로브가 고정된 칩에 하이브리드 시키거나 또는 서열번호 7 및 9로 이루어진 프라이머쌍을 사용하여 매독 트레포네마 DNA를 증폭한 후 서열번호 1,2,3,4,5로 이루어진 프로브가 고정된 칩에 하이브리드 시키는 것이다. 매독 트레포네마의 tpr 서브패밀리 분석용인 경우에, 상기 표 1에 나타난 서열번호 1, 4 또는 5에 나타난 염기서열을 갖는 프로브는 tpr 서브패밀리 I형을 나타내며 서열번호 2, 4 또는 5에 나타난 염기서열을 갖는 프로브는 tpr 서브패밀리 II형임을 나타낸다.
또한 본 발명은 상기 매독 트레포네마의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 마이크로어레이, 바람직하게는 DNA칩이다. 본 발명의 일례에서, 상기 DNA칩은 본 발명의 기술분야 전문가가 용이하게 조합가능한 모든 프로브 서열 세트를 포함하는 DNA 칩도 포함한다. 본 발명에 따른 DNA 칩은 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함한다.
또한, 본 발명의 DNA칩은 상기 매독 트레포네마에 대한 프로브 외에도 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 수막염균(Neisseria meningitidis), 트리코모나스 바지날리스 (Trichomonas vaginalis), 인유두종 바이러스 (Human Papillomavirus), 및/또는 인체포진 바이러스 (Human herpesvirus) 등을 검출할 수 있는 DNA 프로브를 동시에 하나의 슬라이드에 고정시켜 하나의 DNA 칩을 제조할 수 있다. 이러한 다양한 DNA칩 포맷의 일례를 도 7에 나타내고 있다. 하나의 기질상에 여러 가지 박테리아 또는 바이러스의 DNA 프로브를 고정화시켰을 경우, 한번의 실험으로 어떤 박테리아 또는 바이러스가 시료에 존재하는 지를 쉽게 검출할 수 있게 된다. 또한, 위에서 언급한 박테리아 또는 바이러스 외에 다른 여러 가지 박테리아, 바이러스의 DNA 프로브를 하나의 슬라이드에 올려놓게 될 경우, 마찬가지로 한번의 실험으로 시료를 정확히 분석할 수 있다는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 DNA칩 또는 유전형 분석키트에 성인성 질환(sexually-transmitted disease, STD)에 관련된 다양한 원인균에 특이적인 프로브를 추가로 포함하여 한번에 다양한 질병의 원인균을 동시에 탐지할 수 있다.
본 발명의 구체적 일예에서, 본 발명에 따른 매독 트레포네마 탐지용 프로브, 예컨대 tpr 유전자의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 매독 트레포네마 탐지를 위한 프로브, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는 매독 트레포네마 탐지용 프로브 및,
클라미디아 트라코마스(Chlamydia trachomatis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 수막염균(Neisseria meningitidis), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 인유두종 바이러스(Human Papillomavirus), 및 단순 포진 바이러스(Herpes Simplex virus)을 검출할 수 있는 DNA 프로브로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 성인성 질환(Sexually transmitted disease)의 원인균 탐지용 DNA 칩을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 성인성 질환의 원인균 탐지용 DNA 칩을 포함하는 성인성 질환의 원인균 탐지용 분석키트 및 분석방법을 제공하며, 상기 매독 트레포네마의 증폭수단 및 표지수단을 사용할 수 있다.
상기 성인성 질환의 탐지를 위한 DNA칩 또는 분석키트에 포함가능한 프로브 및 이의 증폭을 위한 프라이머는 본 기술분야에서 성인성 질환의 원인균 프로브는 모두 포함할 수 있으며, 바람직한 예를 아래의 표 4에 나열하였으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 프로브는 다양한 방법으로 마이크로어레이에 고정할 수 있으며, 예컨대, 하기 프로브는 5-말단에 아민기를 도입하여 마이크로어레이 기판에 고정할 수 있다.
| 박테리아 및 바이러스 | Seq ID NO. | 서열 (Sequence) | 특징 |
| Chlamydia trachomatis | 14 | 5'-TTAGGAGCTTCTTTCCAATA-3' | 프라이머(정방향) |
| 15 | 5'-TAAACTTGCTTGCCAYTCAT-3' | 프라이머(역방향) | |
| 16 | 5'-CCTCCTGATCTTACAGCAGGAACAGA-3' | 프로브 | |
| 17 | 5'-GACRGGVACTAARGATGCCTCTATTGA-3' | 프로브 | |
| HumanHerpesvirus | 18 | 5'-GTCGTCCAGACGCCCACGG-3' | 프라이머(정방향) |
| 19 | 5'-ATCACGCACCTGCACAACGC-3' | 프라이머(역방향) | |
| 20 | 5'-GTCGTCCGCTCTGACGCGG-3' | 프라이머(정방향) | |
| 21 | 5'-ATCTTTGAACAGTTAATCGCCGG-3' | 프라이머(역방향) | |
| 22 | 5'-TGTACCTACCTGGGGATCTCAACAG-3' | 프로브 | |
| 23 | 5'-GTACCCGACCCGGAGTCCGTAGCAG-3' | 프로브 | |
| 24 | 5'-CAGAATTGCTCCACGCGCTGCACCT-3' | 프로브 | |
| Neisseria meningitides Neisseria gonorrhoeae | 25 | 5'-TACCAAAACAGCGGCTTCTT-3' | 프라이머(정방향) |
| 26 | 5'-TACGAAAATGCCGGTTTCTT-3' | 프라이머(정방향) | |
| 27 | 5'-GTAACCGCCTACCAAACGGT-3' | 프라이머(역방향) | |
| 28 | 5'-GTAACCGGCAACTACGCGGT-3' | 프라이머(역방향) | |
| 29 | 5'-AAGGAAAGACATAATTACACGACTGAGAAACCTT-3' | 프로브 | |
| 30 | 5'-TTATAGTATSCCCAGYYGTTTGTTG-3' | 프로브 | |
| 31 | 5'-TCTTTTGCCAAATATGCTGATTTGAAM-3' | 프로브 | |
| 32 | 5'-GTGCAAGAGGGCGTGAATATTGAGAA-3' | 프로브 | |
| Human Papillomavirus | 33 | 5'-TTTKTTACHGTKGTDGATACYAC-3' | 프라이머(정방향) |
| 34 | 5'-GAAAHATAAAYTGYAADTCATAYTC-3' | 프라이머(역방향) | |
| 35 | 5'-TATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATA-3' | 프로브 | |
| 36 | 5'-TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA-3' | 프로브 |
상기 표에서 R(A,G): Y(C,T): M(A,C): K(G,T): S(G,C): W(A,T), V(A,C,G): H(A,T,C): B(G,T,C): D(G,A,T): N(A,G,C,T)을 의미하며, 이는 본 기술 분야의 전문가에게 널리 알려져 있다.
또한, 상기 DNA칩은 전체적인 위치 마커 및 하이브리드화 반응에 대한 대조군으로서 기준마커를 추가로 포함할 수 있다. 기준마커의 예로는 β-글로빈, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 또는 액틴 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 기준마커가 β-글로빈인 경우에는 바람직하게는 서열번호 6에 나타난 염기서열을 가지며, 이의 증폭을 위한 프라이머로는 서열번호 12의 염기서열 및 서열번호 13의 염기서열을 갖는 β-글로빈 DNA 증폭용 프라이머일 수 있다.
한편, 상기 매독 트레포네마 분석키트에 포함된 DNA 칩의 제조방법은 매독 트레포네마의 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의 5’말단에 아민이 결합된 DNA 프로브를 제조하는 공정; 제조된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시키는 공정; 및, 전기 DNA 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시키는 공정을 포함한다.
상기 고체의 표면에서 프로브 DNA와 알데히드의 결합은 이 분야에서 알려진 방법 즉, 37℃의 온도 및 70%의 습도 조건하에서 아민과 알데히드의 시프염기반응 (Schiffs base reaction)을 통해 수행될 수 있다. 상기 알데히드의 환원은 NaBH4와 같은 환원제를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 고체의 표면에 존재하는 알데히드와 반응하는 프로브 DNA의 농도는 100 ~ 300 pmol/L이 바람직하다. 이 외 범위로 사용하는 경우 상기 프로브 DNA가 고체 표면에 알데히드와의 결합이 이루어지지 않을 수 있다. 상기 고체는 유리, 실리콘 이산화물, 플라스틱 또는 세라믹으로부터 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 DNA 칩 및 그의 제조방법을 공정별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
제 1공정: 프로브의 제조
매독 트레포네마의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의 5’말단에 아민이 결합된 DNA 프로브를 제조한다. 이때, 프로브는 매독 트레포네마 DNA의 염기서열, 바람직하게는 매독 트레포네마의 tpr DNA와 상보적으로 결합하는 염기서열을 갖도록 설계 및 합성되고, 합성된 염기서열이 고체의 표면에 결합될 수 있도록 염기서열의 5’말단에 아민기를 결합시켜서 프로브를 제조한다.
제 2공정: 프로브의 고정화
상기 제조된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시킨다: 이때, 고체는 특별히 제한되는 것은 아니나, 유리인 것이 바람직하고, 고체 표면의 알데히드는 이 분야에서 알려진 방법, 즉 프로브의 5’말단에 결합된 아민과 30 내지 40℃, 70 내지 100%의 습도조건에서 시프염기반응 (Schiffs base reaction)을 수행하여 고체 표면에 프로브를 결합시킨다. 이때, 프로브의 농도는 100 내지 300 pmole/l가 바람직하고, 가장 바람직하게는 200 pmole/l이다. 또한 상기 고체의 표면에 전체적인 위치 마커 및 하이브리디제이션 반응에 대한 대조군 역할을 하는 β-글로빈 프로브을 부착한다.
제 3공정: DNA 칩의 제조
상기 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시켜서, DNA 칩을 제조한다. 이때, 알데히드의 환원조건이 특별히 제한되는 것은 아니나, NaBH4 등의 환원제를 사용함이 바람직하다.
본 발명은 매독 트레포네마의 탐지용 키트에 관한 것이며, 바람직하게는 상기 서열번호 1 내지 5의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는 DNA 칩을 포함하는 것이다. 본 발명의 구체적인 일례에서,
(a) 상기 매독 트레포네마의 탐지용 DNA 칩, (b) 매독 트레포네마의 시료 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 프라이머, 및 (c) 상기 DNA 칩과 하이브리드되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 매독 트레포네마의 탐지용 키트를 제공한다.
상기 표지수단은 이 기술분야의 숙련된 자에게 알려져 있는 여러 가지 표지물들이 본 발명에 사용될 수 있으며, 그 예로는 Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS (5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민 (TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트 (TMRITC), x-로다민 또는 텍사스 레드를 사용할 수 있다. 상기 표지수단은 매독 트레포네마에 대한 표지 유전자를 첨가하여 PCR 반응을 이용하여 증폭 및 표지증폭과정에서 유전자를 표지할 수 있다. 또한, 일반적인 표지수단인 비오틴-결합물질을 이용하여 표지할 수 있다. 상기 비오틴-결합물질은 예를 들어, 스트렙타비딘-R-피코에리스린 (streptavidine-R-phycoerythrin)을 포함한다. Cy5를 이용하여 표지할 경우, 표지된 반응물을 검출할 때 추가적인 반응 없이 직접 콘포칼 레이저 스캐너와 같은 분석기를 이용하여 형광신호를 분석할 수 있어 효율적이며 비오틴-결합물질을 이용하여 표지하는 경우에 비해 더 민감한 결과를 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 상기 매독 트레포네마의 프로브 및 증폭용 프라이머를 이용하여 매독 트레포네마를 탐지 또는 trp 서브패밀리 분석방법에 관한 것이다. 본 발명은 상기 매독 트레포네마의 프로브를 이용하여 통상의 핵산 증폭 및 하이브리디제이션방법을 이용하여 시료에 포함된 매독 트레포네마의 탐지 또는 서브패밀리 분석도 가능하다. 통상의 핵산 증폭 반응으로는 PCR, LCR, 등을 사용할 수 있으며, 하이브리디제이션 방법으로는 고체표면상에서 프로브와 직접 시료 DNA의 하이브리디제이션, line blot assay, 또는 마이크로 어레이 등을 이용한 방법을 들 수 있다.
본 발명의 일례에서, (a) 매독 트레포네마의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 매독 트레포네마의 시료 DNA를 증폭하는 단계;
(b) 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트와 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및
(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 매독 트레포네마의 탐지 또는 trp 서브패밀리 분석방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 일례에서,
(a) 매독 트레포네마의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 매독 트레포네마 시료 DNA를 증폭하는 단계;
(b) 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트를 포함하는 DNA 칩에 상기 증폭된 DNA를 하이브리드 시키는 단계; 및
(c) 상기 프로브와 하이브리드화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 매독 트레포네마의 탐지 또는 trp 서브패밀리 분석방법을 제공한다.
상기 프라이머는 서열번호 7 내지 서열번호 11의 염기서열을 갖는 매독 트레포네마 증폭용 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 그 예는 상기 표 2에 표시하였다.
또한 본 발명은 상기 매독 트레포네마의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 마이크로어레이, 바람직하게는 DNA칩을 사용할 수 있으며, 상기 DNA칩은 β-글로빈, 액틴, 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 유전자를 위치 마커로 추가로 포함할 수 있으며, 위치마커는 상기 DNA 칩에서 사용한 것을 사용할 수 있다. 상기 검출은 표지수단을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기에 열거한 표지수단을 사용할 수 있다.
본 발명의 일례에서, 시료 DNA의 증폭은 통상의 PCR 반응으로 수행할 수 있다. 즉, 전변성, 변성, 프라이머 결합, 및 사슬연장단계로 이루어진 PCR 반응으로 시료 DNA를 증폭할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일예에서, 상기 매독 트레포네마 프라이머 및 β-글로빈 프라이머, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 표지물질, 그리고 Taq 폴리머라제를 포함하고, 경우에 따라 첨가물로 BSA 및 DMSO등을 사용하여 PCR 서머싸이클러에 넣고, 94℃에서 5분간 변성 (denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성 (denaturation), 45 ~ 60 ℃에서 45초 ~ 1분간 프라이머 결합 (primer annealing), 72℃에서 20 ~ 45초간 연장 (extension)과정을 30 ~ 35회 반복 후 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, 표지분자가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득한다.
이하, 본 발명의 매독 트레포네마의 분석키트를 이용한 매독 트레포네마 검출방법을 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
제 1공정: 시료의 수득 및 증폭: 검사할 시료를 증폭시켜서 Cy5 (Cyanine 5)을 포함하는 증폭시료를 수득한다: 이때, 증폭된 시료가 Cy를 함유하기 위하여 Cy5-dUTP를 사용한 PCR을 통하여 증폭시료를 수득한다.
제 2공정: 하이브리디제이션 반응: 전기 증폭시료를 DNA 칩에 적용하여, 프로브와 하이브리디제이션 반응을 수행한다.
제 3공정: 검출: 프로브와 하이브리디제이션된 DNA를 표지수단으로 표지하고, 이를 검출하여, 매독 트레포네마의 감염여부를 판단한다. 검출방법은 상기 각각의 표시수단의 검출방법에 따라 수행하며, 예컨대 검출수단으로 콘포칼 레이저 스캐너 (confocal laser scanner)로 스캐닝하여 읽을 수 있다.
본 발명의 DNA 칩을 이용한 매독 트레포네마의 서브패밀리 분석키트 및 분석방법을 사용하여, 매독 트레포네마의 감염여부를 진단할 경우, 신속하고 간단하며 정확하게 매독 트레포네마 감염여부 및 tpr 서브패밀리를 분석할 수 있으므로, STD를 일으키는 매독 트레포네마의 정확한 진단, 이로 인한 매독의 합병증 예방 및 치료에 기여할 수 있을 것이다.
하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명할 것이나, 하기 실시예를 본 발명을 예시하고자 하는 것일 뿐 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다. 프로브의 종류 및 개수가 특별히 제한되는 것은 아니므로, 매독 트레포네마로부터 유도된 염기서열을 갖는 프로브를 이용한 DNA 칩 및 전기 DNA 칩을 이용한 각종 분석키트 또한 본 발명의 범주에 속한다.
실시예 1: 프로브의 제조
매독 트레포네마의 검출을 위하여 사용된 각 매독 트레포네마 tpr에 특이적인 프로브와 β-글로빈에 특이적인 프로브는 5’말단에 아민 (amine)기가 포함되도록 (주)바이오니아에서 상업적으로 합성하였다. 각 프로브의 염기서열은 상기 표 1의 서열번호 1 내지 5에 나타냈다.
실시예 2: DNA 칩의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 각각의 프로브를 3X SSC (0.05 M 소디움 시트레이트, 0.45 M NaCl (pH 7.0)에 200 pmol/l가 되도록 용해시키고, 알데히드기가 결합된 슬라이드 (aldehyde coated slide, ALCS-100, NURICELL, Korea) 표면에 어레이어 (GMS 417 Arrayer, TaKaRa, Japan)를 이용하여 크기 150 m, 간격 300 m으로 스파팅 (spotting)한 다음 37℃, 습도 70% 이상의 조건에서 4시간 이상 시프염기반응 (Schiff base reaction)을 수행하였다. 이어서, 0.2% (w/v) 소디움 도디실 설페이트 (sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액으로 슬라이드를 세척하고, 3차 증류수로 세척한 다음, NaBH4용액 (2 g NaBH4, 150 ml phosphate buffered saline (PBS), 50 ml ethanol)에 40분 동안 침지시켜 아민이 결합되지 않은 알데히드를 환원시킨 후, 3차 증류수로 세척하고, 건조시켜서 DNA 칩을 제조하였다.
또한 상기 고체의 표면에 전체적인 위치마커 및 하이브리디제이션 반응에 대한 대조군 역할을 하는 β-글로빈을 부착하였다.
본 발명의 일례에 따른 DNA 칩의 배치도를 도 3에 나타냈다. 도 3은 DNA 칩에 위치한 프로브의 종류와 위치를 나타내는 모식도로서, BG는 반응이 일어난 것인지를 확인하기 위한 배경마커이며 동시에 프로브의 위치를 나타내기 위한 기준마커를 나타낸다.
실시예 3: 시료의 수득
사람의 혈청 등이 매독 트레포네마에 감염되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 먼저 상기 혈청에서 DNA를 추출하고, 정제하였다. 전기 정제된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 12 및 13을 갖는 β-글로빈 프라이머 (β-globin primer)를 이용하여 PCR을 수행하며, β-글로빈 유전자가 증폭된 DNA를 선별하여 검색시료로서 사용하였다. 임상시료는 대한민국 서울시 서대문구 신촌동에 소재하는 연세대학교 의과대학 세브란스 병원 피부과에서 제공받았다.
또한 검색시료의 매독 트레포네마 양성 대조군으로, 역시 세브란스병원 피부과에서 제공받은 표준균주 (Nichols strain)의 DNA를 추출 및 정제하여 사용하였다.
3-1: β-글로빈 시료의 수득
β-글로빈의 최적 PCR 확립을 위한 구성과 조건은 다음과 같다. 2X PCR 완충용액 (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3), 0.1 ㎍의 DNA, 2 mM MgCl2, 서열번호 12와 서열번호 13의 25 pmol의 β-글로빈 프라이머, 각 50 μM의 dNTP mixture (TaKaRa), 0.05 nM의 Cy5-dUTP (NEN, USA) 및 2 유니트 Taq 폴리머라제 (2 unit Taq polymerase, TaKaRa, Japan)를 포함하고 경우에 따라 첨가물로 BSA 및 DMSO등을 사용하여 50 ㎕의 반응혼합물을 PCR 서머싸이클러 (thermocycler, Perkin-Elmer Cetus, CA, USA)에 넣고, 94℃에서 5분간 변성 (denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성 (denaturation), 50℃에서 2분간 프라이머 결합 (primer annealing), 72℃에서 30초간 연장 (extension)과정을 5회 반복한 뒤 94℃에서 1분간 변성, 50℃에서 2분간 프라이머 결합, 72℃에서 15초간 연장과정을 35회 반복한다. 그 후 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.
3-2: 매독 트레포네마 표준균주 시료의 수득
매독 트레포네마의 최적 PCR 증폭 반응을 위해서, 서열번호 7, 8 또는 서열번호 7 및 9 및 서열번호 10, 11을 프라이머로 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다: 1 x PCR 완충용액 (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3), 1 ng의 DNA, 1.5 mM MgCl2, 각 25 pmol의 프라이머, 50 μM의 각 dATP, dCTP, dGTP, dTTP (TaKaRa), 0.05 nM의 Cy5-dUTP (NEN, USA) 및 2 유니트 Taq 폴리머라제 (TaKaRa, Japan)를 포함하는 50 ㎕의 반응혼합물을 PCR 서머싸이클러 (thermocycler, Perkin-Elmer Cetus, CA, USA)에 넣고, 94℃에서 5분간 변성 (denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성 (denaturation), 55℃에서 45초간 프라이머 결합 (primer annealing), 72℃에서 30초간 연장 (extension)과정을 35회 반복 후 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다. 이에 대한 결과는 도 2a 내지 도 2c에 나타내었다.
3-3: 임상시료의 수득
전기 수득한 혈청의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 7, 서열번호 9를 갖는 염기서열을 프라이머로 사용하며, 실시예 3-2과 동일한 방법으로 Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.
실시예 4: DNA 칩을 사용한 감염여부의 확인
상기 실시예 2에서 제조한 DNA 칩에 실시예 3에서 수득한 증폭된 시료를 적용하여, 하이브리디제이션 반응을 다음과 같이 수행하였다. 이때, 하이브리디제이션 반응실 (Hybridization reaction chamber)로 100 ㎕ 용량의 커버슬립 (cover slip, GRACE Bio-Labs, USA, PC4L-1.0)을 사용하였다.
표준 DNA 또는 임상시료 DNA의 경우의 매독 트레포네마 증폭산물 15 ㎕와 β-글로빈 증폭산물 5 ㎕의 혼합물을 반응시료로서 사용하였다. 전기 반응시료에 3 N 수산화나트륨 (NaOH) 수용액을 10% (v/v) 첨가하여 실온에서 5분간 변성시키고, 1 M Tris-HCl (pH 7.4)을 5% (v/v) 첨가하여 중화시켰다. 그런 후에, 상기 결과물에 3 N 염산을 10% (v/v) 첨가한 후, 얼음에서 5분간 방치하였다. 이어서, 하이브리디제이션 용액 (6X 식염수-소디움 포스페이트-EDTA 완충액 (SSPE, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)과 0.05% 소디움 도데실 설페이트 (SDS)를 사용하여 40℃에서 슬라이드에 고정된 프로브와 2시간 동안 반응시키고, 3X SSPE로 2분, 1X SSPE로 2분간 DNA 칩을 세척하여 실온에서 공기 건조하거나 스핀 건조기 (spin dryer)를 사용하여 건조하였다. 이를 콘포칼 레이저 스캐너 (confocal laser scanner, GSI Lumonics, Germany)를 이용하여 형광신호를 분석하였다 (excitation 650 nm, emission 668 nm).
상기 3-2 실시예에서 서열번호 7과 8의 프라이머를 사용하여 얻은 매독 트레포네마 표준균주의 시료를 이용하여 분석한 결과를 도 4a 내지 4d에, 서열번호 7및 9의 프라이머를 사용하여 얻은 매독 트레포네마 표준균주의 시료를 이용하여 분석한 결과를 도 5a 내지 도 5d에 나타내었다. 도 4a는 300 마리, 도 4b는 30 마리, 도 4c는 3 마리, 도 4d는 0 마리에 해당하는 매독 트레포네마 표준균주 DNA를 PCR 증폭한 후, 그것을 DNA 칩에 하이브리드 시킨 결과이다. 도 5a는 300 마리, 도 5b는 30 마리, 도 5c는 3 마리, 도 5d는 0 마리에 해당하는 매독 트레포네마 표준균주 DNA를 PCR 증폭한 후, 그것을 DNA 칩에 하이브리드 시킨 결과이다.
상기 실시예 3-3에서 수득한 임상시료에 대하여 상기 표준균주와 실질적으로 동일한 방법으로 매독 트레포네마의 감염 분석 실험을 수행하였다. 서열번호 7과 8의 프라이머로 PCR 한 후 분석한 결과를 도 5a에 나타내었다. 그 결과 도 6a는 매독 트레포네마에 감염된 샘플이며 이때의 매독 트레포네마는 tpr I과 II형을 가지고 있는 것으로 분석되었다. 서열번호 7과 9의 프라이머로 PCR 한 후 분석한 결과는 도 6b에 나타내었으며, 매독 트레포네마에 감염된 샘플이며 이때의 매독 트레포네마는 tpr I과 II형을 가지고 있는 것으로 분석되었다.
분석실험 결과, 발명의 분석키트는 손쉽게 매독 트레포네마를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 감염된 매독 트레포네마의 tpr 서브패밀리를 판별할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 DNA 칩을 사용하여 매독 트레포네마 감염의 정확한 진단과 감염된 매독 트레포네마의 tpr 서브패밀리에 따른 정확한 분석으로 인한 치료 및 역학 조사에 기여할 수 있을 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 DNA 칩을 이용한 매독 트레포네마의 감염을 검출하기 위한 탐지용 키트 및 탐지방법, 그리고 이에 이용되는 프로브 및 DNA 칩을 제공하여 현미경을 통한 직접 검사 혹은 혈청학적 검사에 비해 더욱 정확하게 검출할 수 있는 매독 트레포네마의 탐지방법을 제공한다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일례에 따른 프라이머 서열을 도시한 tpr C 유전자 서열을 나타낸다.
도 2a 내지 2c는 본 발명의 일례에 따른 프라이머쌍을 이용하여 매독 트레포네마 표준균주 DNA를 PCR 증폭한 사진으로서, 도 2a는 서열번호 7과 8의 프라이머쌍, 도 2b는 서열번호 7과 9의 프라이머쌍 및 도 2c는 서열번호 10과 11의 프라이머쌍을 이용한 증폭결과이다.
도 3는 본 발명의 일례에 따른 DNA 칩에 위치한 프로브의 종류와 위치를 나타내는 모식도이다.
도 4a 내지 도 4d는 서열번호 7과 8의 프라이머를 이용하여 매독 트레포네마 표준균주 시료를 PCR 증폭한 후, 그것을 본 발명의 일례에 따른 DNA 칩에 하이브리드 시킨 결과로서, 도 4a는 300 마리, 도 4b는 30 마리, 도 4c는 3 마리, 및 도 4d는 0 마리에 해당하는 매독 트레포네마 표준균주를 이용한 것이다.
도 5a 내지 도 5d는 서열번호 7과 9의 프라이머를 이용하여 매독 트레포네마 표준균주 시료를 PCR 증폭한 후, 그것을 본 발명의 일례에 따른 DNA 칩에 하이브리드 시킨 결과로서, 도 5a는 300 마리, 도 5b는 30 마리, 도 5c는 3 마리, 및 도 5d는 0 마리에 해당하는 매독 트레포네마 표준균주를 이용한 것이다.
도 6a 내지 6b는 본 발명의 일례에 따른 프라이머쌍을 이용하여 매독 트레포네마 임상시료를 PCR 증폭한 후, 그것을 본 발명의 일례에 따른 DNA 칩에 하이브리드 시킨 결과로서, 도 6a는 서열번호 7과 8의 프라이머쌍을, 도 6b는 서열번호 7과 9의 프라이머쌍을 이용한 것이다.
도 7은 매독 트레포네마, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 수막염균(Neisseria meningitidis), 인유두종 바이러스(Human Papillomavirus), 및 단순 포진 바이러스(Herpes Simplex virus)등을 검출할 수 있는 DNA 프로브를 모두 포함하는 DNA칩 포맷의 일례를 도시한 것이다.
<110> BIOMEDLAB
<120> PROBE FOR DETECTING Treponema pallidum, DETECTION KIT AND
DETECTION METHOD FOR Treponema pallidum USING THE SAME
<130> DPP2002-3839
<160> 36
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe 1-I-a
<400> 1
aacgaaaaca aaacagcact cctcgtt 27
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe 1-II-a
<400> 2
tcggtgcaca gaaggacgca aacaa 25
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe 1-II-b
<400> 3
tcagaacaag gataaactgc tgtggaat 28
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe 2-a
<400> 4
ggccgactca ccctcgaacc aggc 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe 2-b
<400> 5
ggcttccgct tctccttcgc cctcg 25
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe for beta-globin
<400> 6
tgcacctgac tcctgaggag aagtctgccg 30
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer 1-F
<400> 7
ggtgcctggg atagtactga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer I-R
<400> 8
ctggttcgag ggtgagtcgg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer 2-R
<400> 9
ctggtgttgg ttaccggcgt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer 3-F
<400> 10
cactgttatg gggcctacct 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer 3-R
<400> 11
gtcagtacta tcccaggcac 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer BG-F
<400> 12
atacaagtca gggcagag 18
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer BG-R
<400> 13
cttaaacctg tcttgtaacc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer (Chlamydia trachomatis)
<400> 14
ttaggagctt ctttccaata 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer (Chlamydia trachomatis)
<400> 15
taaacttgct tgccaytcat 20
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Chlamydia trachomatis
<400> 16
cctcctgatc ttacagcagg aacaga 26
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Chlamydia trachomatis
<400> 17
gacrggvact aargatgcct ctattga 27
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer (Human Herpes virus)
<400> 18
gtcgtccaga cgcccacgg 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer (Human Herpes virus)
<400> 19
atcacgcacc tgcacaacgc 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer(Human Herpes Virus)
<400> 20
gtcgtccgct ctgacgcgg 19
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer (Human Herpes Virus)
<400> 21
atctttgaac agttaatcgc cgg 23
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Human Herpes Virus
<400> 22
tgtacctacc tggggatctc aacag 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Human Herpes Virus
<400> 23
gtacccgacc cggagtccgt agcag 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Human Herpes Virus
<400> 24
cagaattgct ccacgcgctg cacct 25
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer (Neisseria)
<400> 25
taccaaaaca gcggcttctt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer (Neisseria)
<400> 26
tacgaaaatg ccggtttctt 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer (Neisseria)
<400> 27
gtaaccgcct accaaacggt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer (Neisseria)
<400> 28
gtaaccggca actacgcggt 20
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Neisseria
<400> 29
aaggaaagac ataattacac gactgagaaa cctt 34
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Neisseria
<400> 30
ttatagtats cccagyygtt tgttg 25
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Neisseria
<400> 31
tcttttgcca aatatgctga tttgaam 27
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Neisseria
<400> 32
gtgcaagagg gcgtgaatat tgagaa 26
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer (Human Papillomavirus)
<400> 33
tttkttachg tkgtdgatac yac 23
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Backward primer (Human Papillomavirus)
<400> 34
gaaahataaa ytgyaadtca taytc 25
<210> 35
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Human Papillomavirus
<400> 35
tatgtgctgc catatctact tcagaaacta cata 34
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Human Papillomavirus
<400> 36
tgcttctaca cagtctcctg tacctgggca 30
Claims (18)
- 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되며, 매독 트레포네마 (Treponema pallidum)의 핵산과 상보적으로 결합하는 프로브.
- 삭제
- 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는, 매독 트레포네마 탐지용 DNA 칩.
- 제 3 항에 있어서, 상기 DNA칩은 β-글로빈, 액틴, 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 기준마커 프로브를 추가로 포함하는 매독 트레포네마 탐지용 DNA 칩.
- 제 4 항에 있어서, 상기 β-글로빈 프로브는 서열번호 6에 나타난 염기서열을 갖는 것인 매독 트레포네마 탐지용 DNA 칩.
- 제 3 항에 있어서, 상기 프로브 DNA의 5' 말단 아민기가 칩의 고체표면의 알데히드기와 시프염기반응으로 고정화되는 것인 매독 트레포네마 탐지용 DNA칩.
- (a) 제 3항 내지 6항중 어느 한항에 따른 매독 트레포네마의 탐지용 DNA 칩;(b) 매독 트레포네마의 시료 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 프라이머; 및(c) 상기 DNA 칩과 하이브리드되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 매독 트레포네마의 탐지용 키트.
- 제 7 항에 있어서, 상기 표지수단은 Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS (5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민 (TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트 (TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 매독 트레포네마의 탐지용 키트.
- 제 7 항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호 7의 염기서열 내지 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 매독 트레포네마 증폭용 프라이머인, 매독 트레포네마의 탐지용 키트.
- 제 9 항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍, 서열번호 7 및 9의 프라이머쌍, 또는 서열번호 10 및 11의 프라이머쌍인 매독 트레포네마의 탐지용 키트.
- 제 7 항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호 12의 염기서열 내지 서열번호 13의 염기서열을 갖는 β-글로빈 DNA 증폭용 프라이머를 추가로 포함하는 매독 트레포네마의 탐지용 키트.
- (a) 매독 트레포네마의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 매독 트레포네마 시료 DNA를 증폭하는 단계;(b) 제 3항 내지 6항중 어느 한항에 따른 DNA 칩에 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 매독 트레포네마의 탐지방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 7 내지 서열번호 11의 염기서열을 갖는 매독 트레포네마 증폭용 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 것인 매독 트레포네마의 탐지방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 검출은 유전자가 Cy5로 표지된 경우 콘포칼 레이저 스캐너를 이용하여 형광신호를 분석함을 특징으로 하는 매독 트레포네마의 탐지방법.
- (a) 매독 트레포네마의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 매독 트레포네마의 시료 DNA를 증폭하는 단계; 및(b) 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트와 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계;(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 매독 트레포네마의 탐지방법.
- 서열번호 7의 염기서열 내지 서열번호 11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 매독 트레포네마 증폭용 프라이머.
- 서열번호 1 내지 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는 매독 트레포네마 탐지용 프로브 및,클라미디아 트라코마스(Chlamydia trachomatis), 나이세리아속 균(Neisseria), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 인유두종 바이러스(Human Papillomavirus), 및 단순 포진 바이러스(Herpes Simplex virus) 검출용 DNA 프로브로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는 성인성 질환(Sexually transmitted disease)의 원인균 탐지용 DNA 칩.
- 제 17 항에 있어서, 상기 클라미디아 트라코마스 탐지용 프로브는 서열번호 16 내지 17의 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브이고, 단순 포진 바이러스 탐지용 프로브는 서열번호 22 내지 24의 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브이고, 나이세리아속균 탐지용 프로브는 서열번호 29 내지 32의 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브이고, 인유두종 바이러스 탐지용 프로브는 서열번호 35 내지 36의 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브인 DNA 칩.
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