JP2008515423A - 性交渉感染症を引き起こす細菌のプローブ、dnaチップ及び遺伝子型解析キット - Google Patents
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Abstract
【選択図】
図19
Description
Jensen J.S. et al., J. Clin. Microbiol. 2003; 41: 261−6 Yoshida T. et al., J. Clin. Microbiol. 2002; 40: 105−110 Olive DM et al. Journal of Clinical Microbiology. 1999:37:1661−9 Shafer M. et al., J. Clin. Microbiol. 2003; 41: 4395−9 Olsen G.J. et al., Ribosomal RNA: a key to phylogeny.FASEB 1993; 7:113−123 Lane DJB et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985; 92:6955−9 Yoshida T. et al. J. Clin. Microbiol. 2002; 40:105−110
分析する前記4種の細菌の遺伝子及びその領域を決定し、それらの増幅に必要なPCRプライマーが設計された。その上、ヒトβグロブリン遺伝子は、いくつかの内部基準遺伝子及びコントロール遺伝子であるハウスキーピング遺伝子として選択され、DNA分離及びPCR反応の制御品質を確認した。そしてそのPCR増幅のためのプライマーもまた設計された。
**遺伝子バンク登録番号:X07547
***遺伝子バンク登録番号:AF073455&X58561
****遺伝子バンク登録番号:X77334
*****遺伝子バンク登録番号:NG−000007
NG(淋菌)、CT(クラミジア・トラコマチス)、UU(ウレアプラズマ・ウレアリティカム)、MG(マイコプラズマ・ジェニタリウム)、HBB(ヒトβグロブリン)、F(正方向)、R(逆方向)
分析する4種の細菌のそれぞれに対するスタンダードポジティブコントロール群の系統は、ATCC,USA(米国マナッサス,VA200108)で購入し、そして又、各細菌がすでに感染していると同定されたサンプルを得た。DNAをこれらから分離し、その後、分析する標的遺伝子領域を、各細菌に対してPCR増幅し、クローニング及びシークエンシングにより同定し、それによりそれらのそれぞれに対してプラスミドクローンが確保された。
尿道、頸部又は口からの分泌物、消毒綿またはブラシで集めた細胞によって得られたスワブサンプル、尿、尿道洗浄溶液並びに前立腺溶液のような様々なサンプルを人体から採取する適切な方法を確立し、分析前にそれらを運搬及び保存した。ここで、男性尿の採取は、従来の三杯試験により、VB(排せつされた尿:voided bladder)1,VB2,VB3及び前立腺圧出液(EPS)に分割することにより行った。VB1は、排尿の始め(すなわち、早期尿流)に出される10から20mlを言う。VB2は、排尿の中間に出された中期尿流を言う。前立腺圧出液は、前立腺マッサージに続いて尿道に出てくる分泌物を言う。VB3は、前立腺マッサージの後の排尿で始めに出る10から20mlの尿を言う。ここで、VB1は尿道のサンプルを意味し、VB2は膀胱サンプルを意味し、そしてVB3は前立腺サンプルを意味する。
DNAを、実施例3の様々なヒトサンプルからDNAを分離するための市販キットを用いた方法及び手作業で用意した試薬を用いる方法によって、分離・精製した。
人工サンプルは、10、100、1000及び10000毎の多重コピーである各細菌を検査するための、実施例2で得られた標的遺伝子のプラスミドクローンを、滅菌三重蒸留水、実施例3のサンプル保存溶液及び感染症状の無い正常男性の新鮮な尿に加えることによって作製した。その後、各細菌の標的遺伝子のシングルPCRを繰り返し行い、それによりシングルPCRに適切な条件を確立した。PCRを行っているとき、内部基準遺伝子であるヒトβグロブリンのPCRを、確実に一緒に行った。その上、その後マルチプレックスPCRを考慮して、各PCR産物の大きさがそれぞれ特徴的に異なり、そしてアニーリング温度が大きな違いを有さないように設計された。
STDの羅病の疑いで国内病院の泌尿器科及び産婦人科を訪れた541人の成人男性及び成人女性患者、及び性交感染の症状が無い103人の成人男性および成人女性から、新鮮な尿(VB1)又は尿道炎、子宮頸管炎等のスワブのような様々なサンプルを実施例3の方法によって集めた。その後、DNAをそれらから実施例4の方法により分離し、実施例5によるシングルPCRが行われた。
実施例6のPCR産物は、ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット(米国Perkin Elmer Biosystems社製)を用いてシークエンシング反応にかけて、その後、ABI Prism 377 Automated Base Sequencer(米国Perkin Elmer社製)を用いて塩基配列の分析を行った。これらの手順は、次の順序で行われた。
96℃、5秒間50℃そして6分間60℃であるサイクルシークエンシング反応にかけた。
人工サンプルは、10、100、1000及び10000毎の多重コピーである各細菌を検査するため、実施例2で得られた1〜4つの型からなる特定遺伝子のプラスミドクローンを、滅菌三重蒸留水、実施例3のサンプル保存溶液及びSTDの症状が無い正常成人男性の新鮮な尿(VB1)に加えることによって作製した。その後、一つのチューブに人工サンプルで細菌毎に対しての標的遺伝子の4つの型のプライマーを加えることによって同時にPCRを行うマルチプレックスPCRが行われた。更に、前記マルチプレックスPCRの時に、ハウスキーピング遺伝子であるヒトβグロブリン遺伝子もまたコントロール遺伝子として増幅した。
上記実施例7でシングルPCR及びシークエンシング分析によって、STD感染及び原因となる細菌の存在が直ちに確認されたヒトサンプルのDNAを、上記実施例8で確立された方法であるマルチプレックスPCRにかけた。
STDを引き起こす4種の主な病原菌の遺伝子及び一チップ上でハイブリダイゼーション反応によって同時にコントロール遺伝子のPCR産物を分析するためのDNAチップを製造するために、先ず、適切な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを設計した。
*PCR産物の塩基配列中のプローブ配列の位置(正及び逆方向でのプライマー配列を除く。)
実施例10で設計されたオリゴヌクレオチドプローブは、適切な試薬と混合され、その後、アレイヤー(arrayer)を用いて顕微鏡用スライドガラスに結合させることで、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、又はSTDを引き起こす病原菌の遺伝子型検出用オリゴDNAチップを次の順序、方法によって製造した。更に、チップ上に8つの格子を有し、その上に8種の異なるサンプルを同時分析するために結合させてもよい改良チップもまた製造された(図13及び14)。
本発明において、チップでのハイブリダイゼーション反応後のような群に格子を書き込むことで、特定の細菌を、そのSTD遺伝子型により示される蛍光シグナルによって容易に検出することができる。格子配列の模擬図を図13に示す。最も左側に、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの16S〜23Sリボソームに対する6つのプローブの境界スペーサを結合し、その右側に、マイコプラズマ・ジェニタリウムの16S rRNAに対する5つのプローブを結合させた。更に、最も右側に、テトラサイクリン抗体の耐性遺伝子に対する6つのプローブを結合させた。加えて、コントロール遺伝子であるヒトβグロブリン遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブをコーナーマーカーとして、その2組が、左及び右側上部に位置し、そして各一つが左及び右側下部に位置するように結合させた。
アレイヤーを用いて、オリゴプローブを含むスポッティング溶液を、マスタープレートから、明確にコーティングされたスライドガラスに移し、ダブルヒット(double hit)でそこに結合した。平均約0.005μlの体積が、1スポットで結合される。チップの基板にするスライドガラスとして、BMTアルデヒドスライドガラス(韓国Biometrix technology社製)又は7.5×2.5cmのサイズを有するそれに対応する生成物で、スーパーアルデヒドによるコーティングを有するものが好ましい。アレイヤーとして、GMS 417 アレイヤー(米国Affymetrix社製)、MGII(米国Biorobotics社製、MA01801)又はそれに対応する装置が好ましい。
前記反応終了後、固定されたスライドガラスは、乾燥機で1時間30分、120℃で焼かれた。その後、前記スライドガラスを0.2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で2回、2分間洗浄し、その後、三重蒸留水に移し、2回、2分間洗浄した。それから後、前記スライドガラスを95℃に熱した三重蒸留水に3分間浸し、それによりスライドガラスに結合させたオリゴヌクレオチドプローブを変性させ、その後、三重蒸留水に移し、1分間洗浄した。洗浄後スライドガラスを15分間ブロッキング溶液(1gのNaBH4、300mlのPBS及び100mlのエタノール)中で低減させ、0.2% SDS溶液で2回、2分間洗浄し、その後三重蒸留水に移し、2回、2分間洗浄した。スライドガラス上の水は、1分30秒間800rpmで遠心分離することにより取り除き、その後、室温のデシケーター中のスライドボックスで保存した。
各細菌のプラスミドクローンとヒトβグロブリン遺伝子のプラスミドクローンを様々な組み合わせ及び濃度で混合することにより作製された人工サンプルを、マルチプレックスPCRにかけ、その産物を実施例11で準備したSTD DNAチップ上に結合させ、複数回ハイブリダイゼーション反応させ、その後、前記DNAチップを蛍光スキャナを用いて分析した。その方法は、次の通りであり、その実施形態を図15〜23に示す。
淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの16S rRNA及びウレアプラズマ・ウレアリティカムの16S〜23S遺伝子間領域、クラミジア・トラコマチスのクリプティックプラスミド並びにヒトβグロブリンのコントロール遺伝子のマルチプレックスPCRは、実施例8及び9に従って行われ、逆方向にプライマーを有するプライマーの組み合わせの内、すなわち、NGR、CTR、UUR、MGR及びHBBRの場合、Cy5蛍光で標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
スライドガラスチップ上に、30種の型のオリゴヌクレオチドプローブをスポットし、淋菌及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの16S rRNA、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの16S〜23S遺伝子間領域、クラミジア・トラコマチスのクリプティックプラスミド並びにヒトβグロブリンのコントロール遺伝子がPCRで増幅された産物を、主な材料としてサンプルのDNAを有することによって結合し、ハイブリダイゼーション反応が行われた。この時、100μlの能力を有する灌流8ウェルチャンバー(独国Scheicher & Schuell BioScience社製)をハイブリダイゼーション反応チャンバーに用いた。
前記ハイブリダイゼーション反応終了後、ウェルカバーを前記DNAチップから取り除き、前記スライドガラスを3x SSPE(NaCl(26.195g)、NaH2PO4−1H2O(4.14g)、蒸留水1Lに溶解したNa2EDTA(1.11g)、及び10N NaOHでpHを7.4に調整した。)溶液に浸し、室温で2分間洗浄した。前記スライドガラスを1x SSPE(NaCl(8.765g)、NaH2PO4−1H2O(1.38g)、蒸留水1Lに溶解したNa2EDTA(0.37g)、及び10N NaOHでpHを7.4に調整した。)溶液で更に2分間室温で洗浄し、1分30秒間800rpmで遠心分離することで乾燥させた。
ハイブリダイゼーションし、洗浄により非特異性シグナルを取り除きその後乾燥したスライドガラスを、共焦点レーザー蛍光スキャナを用いて、その蛍光シグナル及び画像を分析した。この時、スキャナとして、Affimetrix 428 Array Scanner(米国Affrymetrix社製)、Scan Array Lite(米国Packard Bioscience社製)又はそれに対応する装置が好ましい。
実施例7でPCR後のシークエンシング反応によりSTD及びその原因となる細菌の存在が確認され、実施例9でマルチプレックスPCRの正確な分析を受けた様々なヒトサンプルのDNAを、再びマルチプレックスPCRにかけ、そのPCR産物を実施例11及び12で製造されたSTD DNAチップ上に結合させ、実施例12で説明されたものと同様の手順でハイブリダイゼーション反応にかけ、その後蛍光スキャナで分析した。試験対象に含まれるDNAサンプルは、淋菌に感染したサンプルの50例、クラミジア・トラコマチスに感染したサンプルの50例、ウレアプラズマ・ウレアリティカムに感染したサンプルの50例、マイコプラズマ・ジェニタリウムに感染したサンプルの50例及び非感染サンプルの50例である。感染サンプルの200例の内には、複合感染の40例も含まれていた。
本発明により、マルチプレックス型PCR法及びDNAチップは、STD原因の90%以上の絶対多数であり、尿道炎、子宮頸管炎、及び骨盤内炎症疾患の4種の主な病原菌として存在する、淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、及びマイコプラズマ・ジェニタリウムを、正確に素早く同時に検出できるかもしれない。更に本発明のDNAチップは、STD診断において、ほぼ100%の感度、特異性、及び再現性を示す点で優れている。前記DNAチップは、正確に複合感染を検出し、試験方法が使いやすく、そして結果の分析が容易であるかもしれない。素早く正確に短時間で様々なサンプルの自動分析を考慮する観点から、前記DNAチップは、従来の方法と比較して、より優れており、経済的である。その為、本発明は、STDの最初の検出及び診断のため、そして治療方針の決定のために広く用いられてもよい。その上、本発明は、培養又は染色、及びシングルPCRのような従来のDNA試験キットを置き換え、医薬産業上の観点から非常に効果的である。
[配列表のテキスト]
Claims (28)
- 配列番号1〜配列番号8のいずれか一つから選択された塩基配列を有する性交渉感染症(STD)病原菌の核酸増幅用プライマー。
- 配列番号9又は配列番号10の塩基配列を有するヒトβグロブリンの核酸増幅用プライマー。
- PCR増幅のための方法において、請求項1又は請求項2記載のプライマーの少なくとも一つを用いることを特徴とする方法。
- (a)配列番号1及び配列番号2の塩基配列を有する淋菌増幅用プライマーセット、配列番号3及び配列番号4の塩基配列を有するクラミジア・トラコマチス増幅用プライマーセット、配列番号5及び配列番号6の塩基配列を有するウレアプラズマ・ウレアリティカム増幅用プライマーセット、配列番号7及び配列番号8の塩基配列を有するマイコプラズマ・ジェニタリウム増幅用プライマーセットからなる群から選択されたプライマーセットと、Taq DNA ポリメラーゼ、dNTP(デオキシヌクレオチド三リン酸)、蒸留水、及びPCRバッファーとを混合する工程;
(b)95℃で15分間、反応器中で該混合物を前変性させる工程;
(c)95℃で30秒間変性させ、56℃で40秒間プライマーと結合させ、72℃で45秒間伸張させる手順を35サイクル繰り返す工程;
(d)72℃で最終延長反応を行う工程;を含む請求項3記載のPCR増幅のための方法。 - (a)配列番号1及び配列番号2と、配列番号3及び配列番号4と、配列番号5及び配列番号6と、配列番号7及び配列番号8とを有するSTD病原菌増幅用プライマーセット、並びに配列番号9及び配列番号10を有するヒトβグロブリン増幅用プライマーセットと、鋳型DNA、Taq DNA ポリメラーゼ、dNTP、蒸留水、及びPCRバッファーとを混合する工程;
(b)95℃で5分間、反応器中で該混合物を前変性させる工程;
(c)95℃で30秒間変性させ、56〜58℃で40秒間プライマーと結合させ、72℃で45秒間伸長(extending)させる手順を35サイクル繰り返す工程;
(d)72℃で最終伸長反応を行う工程;を含むマルチプレックスPCR増幅のための方法。 - 前記マルチプレックスPCR増幅のための方法において、配列番号1及び配列番号2の塩基配列を有するSTD病原菌増幅用プライマーセット、配列番号3及び配列番号4の塩基配列を有するSTD病原菌増幅用プライマーセット、配列番号5及び配列番号6の塩基配列を有するSTD病原菌増幅用プライマーセット、配列番号7及び配列番号8の塩基配列を有するSTD病原菌増幅用プライマーセット、並びに配列番号9及び配列番号10を有するヒトβグロブリン増幅用プライマーセットの割合が、1:1:1:1:2であることを特徴とする請求項5記載の方法。
- 前記マルチプレックスPCR増幅のための方法において、ウレアプラズマ・ウレアリティカムのPCR産物の大きさは、812bpであり、淋菌のPCR産物の大きさは、386bpであり、クラミジア・トラコマチスのPCR産物の大きさは、314bpであり、そして、マイコプラズマ・ジェニタリウムのPCR産物の大きさは110bpであることを特徴とする請求項5又は6記載の方法。
- 配列番号11〜配列番号16の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びウレアプラズマ・ウレアリティカムの核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
- 配列番号17〜配列番号21の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び淋菌の核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
- 配列番号22〜配列番号28の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びクラミジア・トラコマチスの核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
- 配列番号29〜配列番号33の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
- 配列番号34〜配列番号39の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びテトラサイクリン耐性遺伝子の核酸と相補的に結合する前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブ。
- 配列番号40の塩基配列を有するヒトβグロブリン遺伝子と相補的に結合するプローブ。
- 請求項8〜11のいずれか一項に記載のプローブを含む性交渉感染症(STD)病原菌検出用DNAチップ。
- 前記DNAチップにおいて、前記DNAチップ上に結合されるプローブ溶液の濃度は、少なくとも38pmol/μlであることを特徴とする請求項14記載のDNAチップ。
- 前記DNAチップにおいて、DNAプローブの5’末端のアミン基は、シッフ塩基反応を介して前記チップの固体表面上のアルデヒド基と固定されることを特徴とする請求項14記載のDNAチップ。
- 性交渉感染症(STD)病原菌検出用DNAチップにおいて、前記DNAチップは、各々一つの試薬と結合するために6〜8区画に分割されることを特徴とするDNAチップ。
- 請求項8〜11のいずれか一項から選択されるプローブの少なくとも一つ、ヒトβグロブリン遺伝子検出用プローブ、ヒトβグロブリン遺伝子検出用プローブ、及びテトラサイクリン耐性遺伝子検出用プローブ又はそれらのうちいずれか少なくとも一つのプローブからなることを特徴とする性交渉感染症(STD)病原菌検出用DNAキット。
- 前記性交渉感染症(STD)病原菌検出用DNAチップにおいて、ヒトβグロブリン遺伝子検出用プローブは、配列番号40の塩基配列を有することを特徴とする請求項18記載のDNAキット。
- 配列番号11〜配列番号40で示される塩基配列を有するプローブを含む性交渉感染症(STD)病原菌検出用DNAチップ。
- 請求項14記載のSTD病原菌検出用DANチップ、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、クラミジア・トラコマチス及びマイコプラズマ・ジェニタリウムからなる群から選択される一つ以上のDNAサンプル増幅用プライマーセット、並びに前記DNAチップとハイブリダイゼーションされた増幅されたDNA検出用マーカーを含む性交渉感染症(STD)病原菌検出用キット。
- 前記性交渉感染症(STD)病原菌検出用キットにおいて、前記マーカーはCy5であることを特徴とする請求項21記載のキット。
- 配列番号1及び配列番号2の塩基配列を有する淋菌DNA増幅用プライマーセット、配列番号3および配列番号4の塩基配列を有するクラミジア・トラコマチスDNA増幅用プライマーセット、配列番号5又は配列番号6の塩基配列を有するウレアプラズマ・ウレアリティカムDNA増幅用プライマーセット、配列番号7又は配列番号8の塩基配列を有するマイコプラズマ・ジェニタリウム増幅用プライマーセットからなる群から選択されたプライマーセットを含む請求項21記載の性交渉感染症(STD)病原菌検出用キット。
- 前記性交渉感染症(STD)病原菌検出用キットにおいて、前記プライマーセットは、配列番号9及び配列番号10の塩基配列を有するβグロブリンDNA増幅用プライマーペアを更に含むことを特徴とする請求項21〜23のいずれか一項に記載のキット。
- (a)性交渉感染症病原菌のDNA増幅用プライマーを用いてDNAサンプルをPCR増幅する工程;
(b)請求項14記載のDNAチップ上に、上述した増幅したDNAをハイブリダイゼーションさせる工程;
(c)プローブを用いて、ハイブリダイゼーション反応産物を検出する工程;を含む性交渉感染症(STD)病原菌検出のための方法。 - 前記性交渉感染症(STD)病原菌検出のための方法において、配列番号1〜配列番号10から選択される一つ以上の塩基配列を有するプライマーは、前記マルチプレックスPCR増幅に用いられることを特徴とする請求項25記載の方法。
- 前記性交渉感染症(STD)病原菌検出のための方法において、前記検出は、遺伝子がCy5で標識されている場合、共焦点レーザースキャナを用いて蛍光シグナルを分析することによって行われることを特徴とする請求項25又は26記載の方法。
- 前記性交渉感染症(STD)病原菌検出のための方法において、前記Cy5蛍光物質は、逆方向プライマーに含まれることを特徴とする請求項27記載の方法。
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