KR20070047269A

KR20070047269A - 다중-중합효소연쇄반응과 자동화전기영동 시스템을 통한성전파질환 원인균 고감도 검출 방법

Info

Publication number: KR20070047269A
Application number: KR1020070037147A
Authority: KR
Inventors: 김연수
Original assignee: 김연수
Priority date: 2007-04-16
Filing date: 2007-04-16
Publication date: 2007-05-04

Abstract

본 발명은 다양한 성 전파질환 원인균 특이적(typespecific) 염기서열의 DNA 단편과 결합하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통하여 원인균 DNA를 특이적으로 증폭함과 동시에 객관적 대규모 검사가 가능한 자동화 전기영동 시스템을 이용하여 샘플 내에 존재하는 미량의 성전파 질환 원인균 DNA 까지도 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 합성된 성 전파질환 원인균 특이적 프라이머를 동시에 사용하면 1회의 PCR 증폭 과정을 통하여 그 증폭 산물의 크기를 확인함과 동시에 상대적인 정량분석까지 가능하여 샘플 내에 존재하는 다양한 성 전파 질환 원인균을 신속 정확하게 검출함은 물론 치료에 따른 예후예측을 가능하게 해 준다.

성전파질환(Sexual Transmitted Diseases), 균주 특이적 프라이머(Strain Specific Primer), 다중-중합효소연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction), 자동화 전기영동 시스템(Automatic Electrophoresis System)

Description

다중-중합효소연쇄반응과 자동화전기영동 시스템을 통한 성전파질환 원인균 고감도 검출 방법{High Sensitivity Method for Detection of Sexual Transmitted Diseases by Multiplex PCR and Automatic Electrophoresis System}

도 1은 본 발명에서 합성한 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭 후 결과 분석에 있어서 기존 시스템과 본 발명의 시스템을 이용한 분석 방법 모식도

도 2는 본 발명에서 합성된 다양한 균주 특이적 프라이머가 동시에 사용된 총 1조의 병용 프라이머 세트(1조의 하우스키핑 유전자 프라이머 혼용)를 사용하여 총 7종의 성 전파 질환 원인균 DNA를 다양하게 혼합한 후 PCR 증폭을 실시한 후 자동화 전기영동 시스템을 이용하여 분석한 결과 사진이다.

도 3a 내지 도 3g는 각각 본 발명에서 합성된 프라이머를 병용한 1조의 병용 프라이머 세트를 사용하여 본 발명에서 확보한 표준물질을 다양하게 혼합한 후 PCR 증폭 후 이들 증폭 산물의 밴드 양상에 따른 peak 결과를 보여주는 사진이다.

본 발명은 성 전파성 질환(sexually transmitted diseases, “STD”라 한다)의 원인균을 검출할 수 있는 진단 키트 및 그 키트의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 성 전파성 질환과 밀접한 관련이 있는 성 전파성 질환(sexually transmitted diseases; STD) 원인균 (Neisseria gonorrhea, Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis), 질염 원인균(Trichomonas vaginalis), 성기궤양 원인균(Herpes simplex virus type 2)을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 올리고 뉴클레오티드 프라이머와 상기 프라이머를 이용하여 STD 원인균을 신속 정확하게 검출, 진단할 수 있는 다중-중합효소 연쇄반응 기술과 대규모 객관적 분석이 가능한 자동화 전기영동 시스템을 이용한 STD 원인균 진단 키트 및 키트 제조 방법에 관한 것이다.

성교전파성질환(sexually transmitted disease, STD)이란 성행위로 인해 전파되는 질병을 통틀어 이르는 말로서 원인 별로 살펴 보면 (1) 성전파질환, (2) 질염, (3) 성기궤양 및 (4) 비 임균성 요도염 (nongonorrheal urethritis, NGU) 원인균 가운데 몇몇 원인균들이 95% 이상으로 절대 다수를 차지하고 있다. 여기에서 비임균성 요도염이란 남성에서 요도염이 발생하였으나 임균 (Neissetia gonorrhoeae)이 확인되지 않는 경우를 가리키며 비임균성 요도염의 가장 흔한 원인균은 클라마이디아 트라코마티스이며, 그 외에 유레아플라스마 유레아라이티쿰(Ureaplasma urealyticum)과 마이코플라스마 제니탈리움 (Mycoplasma genitalium)도 중요 원인균으로 지적되고 있다. 즉 임균과 클라마이디아 트라코 마티스, 유레아플라스마 유 레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움 4가지 종류 세균이 STD 원인의 절대 다수를 차지하며, 이들 세균은 모두 공통적으로 남성에서 요도염 (anterior urethritis)의 중요 원인이 되며 부고환염 및 전립선염을 합병할 수 있으며, 불임의 중요한 원인이 된다. 또한 여성에서는 자궁경부염 (cervicitis)과 골반염증성질환 (pelvic inflammatory diseases)의 주 원인이 되며, 나팔관 폐쇄 (fallopian tube occlusion)를 일으킴으로써 불임과 이소성 임신 (ectopic pregnancy) 등 의 합병증을 유발할 수 있다.

최근 발생 양상은 클라마이디아 감염이 가장 흔할 것으로 생각되었으나, 이 보다는 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis)와 유레아플라스마 유레아라이티쿰(Ureaplasma urealyticum)의 비임균성 요도염이 매우 흔하며, 국내에서도 최근에는 임질은 줄어드는 대신 이들 비임균성 요도염이 늘어나는 추세이다.

STD는 다른 질환과 달리 무증상으로 잠복되어 증세가 악화되는 경우가 많고, 재감염이 용이하므로 상기 STD의 원인균을 조기에 검출하여 무증상의 보균자도 효과적으로 진단할 수 있는 방법의 개발이 중요하다. 만약 어떤 환자에서 일단 요도염이 발견되면 그것이 임균성인지 비임균성인지를 먼저 감별해야 하는데 그 이유는 치료 방법과 경과가 서로 다르기 때문이다. 그러나 근래에는 항균제의 오남용에 따른 세균의 변이와 혼합감염의 증가로 인해 양자간의 구별이 애매한 경향이 많고, 정확한 진단을 위해서는 본 발명에서와 같은 분자유전자적 검사법이 필요하다.

임균성 요도염을 일으키는 임균(N, gonorrhoeae)은 나이세리아(Neisseria)속에 속한다. 임균의 진단은 일차적으로 그람염색 (Gram stain)에 의한다. 그러나 무증상이거나 증상이 미미한 임균성 요도염에서는 그람염색으로 판단이 애매하거나 위음성 (false negative)으로 나오는 경우가 많다. 이를 보완하기 위해 임균배양을 시도하지만 여러모로 유용하고 정확한 검사 방법이지만 검사결과를 알기까지 많은 시간과 비용이 소모되는 단점이 있다.

이 밖에 효소면역 검사법 (enzyme immunoassay: EIA)과 면역형광검사법 (immuno- fluorescence technique)은 임균 감염질환 진단에 있어 새로운 항원 확인방법으로 이용되고 있는데 배양검사에 비해 더 신속하게 결과를 얻을 수 있으며, 민감도 (sensitivity)와 특이도 (specificity)가 더 높은 것으로 보고되고 있으나 고비용의 단점이 있다.

클라마이디아 트라코마티스의 확인 방법으로는 (1) 가검물을 배양 및 분리법, (2) 도말 염색법, (3) 항원 항체 반응법, 최근에는 (4) 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)과 하브리다이제이션 (hybridization) 등의 분자유전학적 기법을 이용하는 방법이 선호되고 있다. 그러나 검체를 배양, 분리하는 방법은 장시간이 소요된다는 점, 진단 민감도가 낮다는 점 등으로 인해 임상 진단 목적으로는 적합하지 못하며 감염부위의 상피세포를 직접 도말 염색하여 균을 확인하는 간편성 은 좋으나, 진단 민감도가 낮다.

또한, 마이코플라스마와 유레아플라스마속에 속하며 비뇨생식기에 감염을 유발할 수 있는 유레아플라스마 유레아라이티쿰과 마이코플라스마 제니탈리움은 배양하기가 기술적으로 매우 어렵고, 염색이나 면역학적 방법으로도 발견하기가 어렵다. 이에 따라 PCR에 의거한 분자유전학적 검사법으로 진단하려는 것이 최근의 추세이다. 이 경우 각 균의 종에 특이한 유전자의 DNA의 염기서열을 PCR로 증폭한 후 이를 시퀀싱 반응이나 히브리다이제이션 등으로 확인하는 방법이 주로 이용된다.

그러나 상기한 모든 방법들을 이용할 지라도 분자 진단의 목적은 세균감염이 있을 때 그 원인균을 정확하게 파악하는 것으로 정확한 진단 뿐 아니라 감염의 근원을 파악하며, 병태를 파악하고, 경과와 예후를 예측하며, 치료방침을 결정하고, 백신의 개발을 하는 데 필수적이다. 이 때의 원인균 진단은 단순한 균의 속과 종 뿐 아니라 아종 (subspecies) 내지 균주 (strain)까지 파악할 수 있도록 하는 것이 중요하다. 세균감염의 원인균을 정확하게 파악하기 위해서는 검사방법은 민감도(sensitivity), 특이도 및 재현성이 100%에 가까워야 한다.

배양검사나 면역검사 등 기존의 세균 체형 검사법으로는 이와 같은 조건을 만족시키기 힘들다. 이에 대해 세균 지놈의 유전자형, 즉 DNA 및 RNA의 염기서열을 분석하는 유전자 검사는 이론적으로 상기한 3가지 조건을 모두 만족시킬 수 있으며, PCR기법을 이용하여 임균감염과 클라마이디아 감염 만을 검사하는 진단키트는 이미 상업화되어 사용되고 있다. 그러나 세균파악을 위한 유전자 검사법이 임상 진료나 기타 검사실에서 활발하게 사용되고 임상 진료에 실제 도움이 되기 위해서는 상기한 조건 외에도 추가로 갖추어야 할 조건이 많다. 즉 검사의 방법이 용이하고 해석하기도 쉽고 간편해야 하며, 신속하게 결과를 얻을 수 있어야 하고, 특별한 고가의 장비가 필요 없이 검사할 수 있어야 하며, 검사가 자동화되어 있어서 다수의 검체를 신속하게 검사할 수 있어야 하고, 검사 비용도 저렴해야 한다. 이를 위해 PCR은 가급적 대상 세균 모두를 하나의 튜브 내에서 한번의 PCR반응으로 검사하는 멀티플렉스형의 PCR일 필요가 있으며 PCR시 각 대상 세균이 균주 수준에 까지 정확히 식별이 될 수 있도록 검사하는 유전자와 염기서열 부위가 적절하게 선택되어야 하고, 이에 맞추어 최적의 PCR조건이 수립되어야 한다.

나아가 PCR 후 증폭된 산물이 정확하게 원하는 세균의 DNA인지를 정확하게 확인하는 검사도 중요하다. 아울러 세균의 유전자형을 정확하게 판독하여 항균제 내성이나 생물학적 침해도 등을 정확하게 예측할 수 있는 유전자검사법도 필요하다. 이를 위해 각종의 STD 원인균을 동시에 분석하고 나아가 항균제 내성 등의 정보도 함께 알 수 있는 다중-중합효소 연쇄반응 기술의 개발 필요성이 대두되었다.

이에 본 발명은 다중-중합효소연쇄반응과 더불어 접목이 용이한 자동화 전기영동시스템을 구축하였는데 있으며 이를 위해 사용된 자동화 전기영동 시스템은 12채널 모세관 전기영동 카트리지와 형광측정장치를 이용하여 DNA를 신속 정확하게 분석하는 시스템으로 사용자가 카트리지와 96점의 시료를 넣을 수 있는 샘플 플레이트를 설치하고 버튼만 누르면 자동으로 분석을 실시하며 96점 분석에 소요되는 시간으로는 1시간이면 가능하다.

본 장비는 다른 종류의 전기영동 장치에 비해 유지 보수가 저렴하며, 전통적인 전기영동 분석법에 비해 시간이 많이 단축되고 노동력이 들어가는 현 전기영동 시스템에 비해 컴퓨터가 전 과정을 제어하므로 사람에 의한 오차를 줄일 수 있다.

또한, 민감도(0.1ng/ul)가 전통적인 전기영동 장치의 감도(10ng/ul)에 비해 100배 이상 좋으며 100-500bp 크기의 절편 분석에서 5bp이하의 해상도를 가지고 있어 다중 PCR 분석을 통한 유전자 프로파일링, 유전자 발현 패턴 분석, 박테리아 및 바아러스 동정, GMO 등의 검사에 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 상기한 7종의 STD 원인균에 대한 PCR 방법 및 상기 7종의 원인균의 존재여부를 분석할 수 있는 다중-중합효소연쇄반응과 자동화 전기영동 시스템의 접목을 통한 객관적 대규모 검사를 가능하게 하였다.

본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 성전파질환과 밀접한 관련이 있는 다양한 세균들을 신속하고 간단하게 검출할 수 있는 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 프라이머를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머를 이용하여 성전파질환 원인균을 선택적으로 검출할 수 있는 다중-중합효소연쇄반응법 및 상기 기술을 포함하는 성전파질환 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 성전파질환 원인균의 존재유무 분석을 위한 키트를 제조하는 방법은 물론 객관적 대규모 검사가 가능할 뿐만 아니라 치료를 통한 예후 예측이 가능하도록 정량 분석 시스템을 활용할 수 있는 자동화 전기영동 시스템을 접목하였다는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 관점에 따르면, 각각 균주 특이적 STD DNA 단편을 증폭시킬 수 있는 총 7조의 올리고 뉴클레오티드와 DNA 추출 여부를 즉시 확안할 수 있는 1조의 하우스키핑 유전자로 구성되는 프라이머를 제공한다.

상기 프라이머는 첨부하는 서열번호 3 내지 서열번호 16의 염기 서열을 갖는 것으로서, 성전파질환과 관련된 7종의 성 전파 질환 원인균 DNA 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고 뉴클레오티드와 서열번호 1내지 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것으로서, DNA 추출 여부를 확인할 수 있는 1종의 하우스키핑 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고 뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 관점에 따르면, 서열번호 3 내지 서열번호 16의 염기서열과 서열번호 1내지 서열번호 3의 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 프라이머를 사용하여 샘플 내의 특정 성 전파질환 원인균 DNA를 증폭시키고 DNA 증폭 여부 및 DNA 추출 여부에 따라 특정 균주 DNA 존재 여부를 확인하는 방법이 제공된다.

한편, 본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 상기한 서열번호 3 내지 서열번호 16과 서열번호 1내지 서열번호 2의 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 적어도 어느 한 조의 프라이머, dNTP, 내열성 중합효소 및 PCR 완충용액을 포함하는 성 전파 질환 원인균 특이적 DNA를 증폭시킬 수 있는 PCR용 프라이머와 DNA 추출 여부를 확인할 수 있는 프라이머 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상기에서 설명한 바와 같이, 성전파질환과 밀접한 관련이 있는 세균으로는 현재까지 약 20여종이 보고되고 있으며 이들을 질환별로 세분화하여 살펴보면 성 전파성 질환(sexually transmitted diseases; STD) 원인균 (Neisseria gonorrhea, Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis), 질염 원인균(Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans), 성기궤양 원인균(Herpes simplex virus type 1 & 2, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi) 등이 있다.

우선, 본 발명에서는 성전파질환과 밀접한 관련이 있는 다양한 원인균을 탐지할 수 있는 프라이머를 설계하고, 상기 프라이머를 이용하여 다양한 샘플내에 존재하고 있는 다수의 성전파질환 원인균을 검출할 수 있도록 하였다. 이를 위하여 본 발명에서는 총 100여가지 성전파질환 원인균의 전 서열 중 질환에 직접적으로 많은 영향을 미치고 있는 7종의 STD 원인균 DNA 서열을 기준으로 컴퓨터 프로그램을 이용하여 특이적 프라이머를 설계하였다. 상기 설계된 프라이머는 다른 컴퓨터 프로그램을 사용하여 다양한 STD 원인균에 대한 결합능을 확인한 후 최종적으로 7조의 프라이머를 선별하였다.

상기와 같이 합성된 STD 원인균 특이적 프라이머와 다중 중합효소연쇄반응 기술을 이용하여 STD 감염 여부를 신속 정확하게 검출할 수 있도록 상기와 같이 구성되는 다중 중합효소연쇄반응 기술을 이용한 진단 키트를 이용하여 7종의 세균을 표적 DNA로 하여 본 발명에서 합성한 프라이머를 이용하여 single PCR을 실시하여 결과를 판독한 후 본 발명에서 확인한 7조의 STD 원인균 특이적 병용 프라이머 세트를 이용한 다중 중합효소연쇄반응 실험을 실시한 결과 모두 이에 상응하는 특정 원인균의 STD DNA가 선택적으로 증폭된다는 사실을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 자세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예 일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

(1) PCR 프라이머의 설계

본 발명의 목적인 성 전파질환 원인균 특이적 DNA와 상보적으로 결합하여 균주 특이적 DNA를 선택적으로 증폭시킬수 있는 PCR 프라이머로 사용될 수 있는 올리고 뉴클레오티드를 설계하였다.

우선, 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스로부터 7종의 성전파질환 원인균(Neisseria gonorrhea, Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, Herpes simplex virus type 2, Mycoplasma hominis)의 DNA 염기서열을 확보하였다. 확보한 DNA 서열을 컴퓨터 프로그램 'DNASTAR(MegAlignTM 5, DNASTAR Inc.)'를 활용하여 ClustalW 방법으로 쌍정렬(pairwise alignment) 및 다중서열정렬(multiple sequence alignment)을 실행한 후 계통도(Phylogenetic tree)를 작성하고 각 원인균별 특이적 염기서열을 선별한 다음, 다시 컴퓨터 프로그램 프라이머 프리미어 5(primer premier 5, PREMIER Biosoft International Co.)를 활용하여 원인균 특이 프라이머를 설계하였다. 이때 프라이머의 길이는 30+3 및 35+2의 올리고 뉴클레오 티드로 설정하여 7조의 STD 원인균 특이적 프라이머를 설계하였다.

이와 같이 균주 특이적 7조의 프라이머를 예상 증폭산물이 다른 증폭 산물과 구분될 수 있도록 구분하여 프라이머 세트를 설계하였다. 이와 관련하여 본 발명의 명세서에서는 이 프라이머 세트를 M-AES로 명명하기로 하고, 상기 7조의 프라이머는 첨부된 서열목록에 기재된 순서대로 각각 STDTSP1 내지 STDTSP7로 명명하기로 한다.

(2) 설계한 프라이머의 가상 증폭 확인

상기 과정에서 설계한 총 7조의 프라이머를 대상으로 다른 컴퓨터 프로그램(Amplify 1. 2, University of Wisconsin)을 사용하여 각각 증폭도를 확인하였다. 설계 과정에서 기 확보된 총 30여가지의 다른 성 전파질환 원인균을 대상으로 가상 증폭 실험을 수행하였다. 본 발명에서 병용 프라이머 세트를 통하여 사용될 수 있도록 설계된 상기 7조의 프라이머의 서열번호, 증폭되는 STD 유형, 증폭산물의 크기, 증폭위치는 병용되어 사용된 프라이머 세트를 기준으로 하기 표 1 내지 표 4에 상세히 나타내었다. 하기 표 1 내지 표 4에 표시되어 있는 서열번호 중 홀수의 서열번호는 정방향 프라이머(forward primer)로 사용되며, 짝수의 서열번호는 역방향 프라이머(reverse primer)로 사용된다.

또한, 본 실시예에서 명명한 총 7조의 프라이머는 모두 생식기에 감염하여 조산 등 여타 질환의 발생과 관련이 있는 특정 유형의 성 전파질환 원인균 DNA와 상보적으 로 결합하여 각 유형에 특이적인 증폭 산물을 얻을 수 있을 것으로 예상되었다.

특히, 하기 표 1의 예측 결과에서 알 수 있는 것처럼, 본 발명에서 사용된 프라이머 세트 는 모두 7종의 성 전파질환 원인균 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머로 구성되어 있음을 알 수 있다.

표 1. 선별된 프라이머 가상 증폭 특성

프라이머 세트	프라이머	서열번호	프라이머 염기 특성	증폭되는 STD 유형	증폭산물 크기(bp)
M-AES	STD-IC	서열번호 1 서열번호 2	unwobble	Beta-2 macroglobulin (internal control)	120bp
	STD-UU	서열번호 3 서열번호 4	unwobble	Ureaplasma urealyticum	221bp
	STD-MH	서열번호 5 서열번호 6	unwobble	Mycoplasma hominis	300bp
	STD-HSV2	서열번호 7 서열번호 8	unwobble	Herpes simplex virus II	180bp
	STD-NG	서열번호 9 서열번호 10	unwobble	Neisseria gonorrhea	620bp
	STD-MG	서열번호 11 서열번호 12	unwobble	Mycoplasma genitalium	370bp
	STD-TV	서열번호 13 서열번호 14	unwobble	Trichomonas vaginalis	420bp
	STD-CT	서열번호 15 서열번호 16	unwobble	Chlamydiae trachomatis	523bp

(3) 선별된 프라이머의 합성

상기 과정을 통하여 선별된 총 8조의 프라이머를 합성한 후 이들 프라이머를 상기 표 1에 기재되어 있는 것과 같이 1조의 병용 프라이머 세트를 완성하였다.

본 실시예서의 총 14개의 프라이머는 올리고 뉴클레오티드 포스포르아미다이트 합 성화학에 근거한 고체상 합성기법을 탑재하고 있는 Expedite™ 8909 핵산 합성기(ABI사)를 이용하여 합성되었다. 우선, 합성반응은 올리고 뉴클레오티드 3' 말단에 위치한 뉴클레오시드를 고정시킨 CPG 컬럼에서 수행되었으며, 기본적으로 디트리틸레이션(detritylation), 커플링(coupling), 캡핑(caping), 산화(oxidation) 반응을 반복주기로 하여 선별된 PCR 프라이머의 올리고 뉴클레오티드 중합반응이 수행되었다. 합성 종료후 30% 암모니아를 CPG 컬럼에 가하여 상기 올리고머를 격리시킨 다음 55℃에서 12시간 이상 탈보호(deprotection)시켜 고속진공(Speed Vac.)으로 농축 건조되었다. 이어서 역상액체크로마토그래피 및 음이온교환 크로마토그래피를 행하여 총 24개의 올리고 뉴클레오티드가 순수 정제되었다. 최종 정제된 올리고머는 260㎚에서 흡광도를 측정하여 정량되었다.

(4) 합성된 프라이머에 의한 STD 플라스미드를 대상으로 한 PCR 증폭

상기 합성과정을 통하여 합성된 총 7조의 프라이머를 상기 표 1에 기재된 것과 같이 병용한 병용 프라이머 세트를 사용하여 다양한 STD DNA를 함유하고 있는 E.coli 균주(ATCC 구입)를 대상으로 PCR 증폭 실험을 수행하였다.

본 실시예에서 사용된 균주는 다음과 같다.

Ureaplasma urealyticum (ATCC 27618)

Mycoplasma hominis (ATCC 23114D)

Neisseria gonorrhoeae (ATCC 700825D)

Mycoplasma genitalium (ATCC 33530D)

Herpes simplex virus type 1&2 (ATCC VR540)

Trichomonas vaginalis (ATCC 30001D)

Chlamydiae trachomatis (ATCC VR1500)

상기와 같은 유형의 STD 플라스미드 DNA를 함유하는 각 E.coli 균주는 37℃ LB 액체 배지에서 16시간 동안 진탕 배양한 다음 'Qiafilter Plasmid Maxi Kit(Cat. No. 12263, QIAGEN 사)'로 분리 정제하여 10 ng/㎕로 농도 조정되어 주형 DNA로 활용하였고 클론들은 다음의 방법을 토대로 획득하였다. 즉, Salt solution : 1㎕, Vector : 0.5㎕, Template DNA : 4.5㎕를 넣은 후 혼합하여 22℃에서 30분간 방치한 다음 Competent cell을 17 ㎕넣고 섞은 후 30분간 ice에 방치하였다. 이 후 42℃ heat block에서 30초간 heat shock한 후, Ice에 5분간 방치한 후 SOC용액 200㎕을 즉시 넣어서 37 ℃ incubator에서 200rpm으로 1시간 배양한 다음 Ampicillin(50㎍/ml), X-Gal(40mg/ml), 100mM IPTG가 포함된 LB배지에 spreading한 후,Overnight 배양(Invitrogen TOPO TA cloning vector 사용)한 다음 'Qiafilter Plasmid Maxi Kit(Cat. No. 12263, QIAGEN 사)'로 분리 정제하여 10 ng/㎕로 농도 조정되어 주형 DNA로 활용하였다.

PCR 증폭은 상기 실시예 1과 동일한 반응물과 절차에 따라 각 주형 DNA에 대하여 사용된 병용 프라이머 세트에 따라 독립적으로 수행되었다. 겔의 각 경로 상에서 출현된 밴드의 유효 여부는 본 실시예에서 사용된 STD 유형 DNA에 대한 가상 증폭 실험에서 얻어진 PCR 산물의 크기(하기 표 2 참조)와 비교하여 판정하였다.

도 1은 종래 전기영동 시스템과 본 발명에서 사용한 자동화 전기영동 시스템의 분석 모식도를 나타내고 있다.

도 2는 다양한 STD 플라스미드 DNA를 혼합한 후 본 발명에서 합성하여 조합한 STDMP1 병용 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행하고 이 후 자동화 전기영동 시스템을 이용하여 전기영동한 사진이다. 도면에서 왼쪽의 M은 사용된 포지티브 마커(positive marker)이고, 측면의 숫자는 사용된 마커의 크기를 나타낸다.

사진에서 제일 윗 부분과 아래에 있는 calibration marker는 장비의 초기화가 제대로 되었는지, 완충용액이 제대로 작동하고 있는지 등의 여부를 확인하는 것으로 화면상에 보이지 않을 경우 샘플 및 완충용액 등을 새로 준비하고 시스템을 재 시동한다.

도 2에서 레인 1은 NG, CT, TV, MH 및 HSV2 DNA를 혼합한 양성 대조군, 레인 2는 TV, MH 및 HSV2 DNA를 혼합한 양성 대조군, 레인 3은 NG, TV, MH 및 UU DNA를 혼합한 양성 대조군, 레인 4는 CT, MG 및 MH DNA를 혼합한 양성 대조군, 레인 5는 NG, MG, UU 및 HSV2 DNA를 혼합한 양성 대조군, 레인 6은 CT, MG, MH, UU 및 HSV2 DNA를 혼합한 양성대조군으로 이들을 PCR 증폭 후 자동화 전기영동 시스템을 이용하여 분석한 전기영동상이다.

도 3a에서 3g는 도 2의 전기영동상을 peak화 하여 분석한 사진으로 전기영동상과 동일한 패턴을 보이고 있으며 덧붙여 증폭 사이즈 까지 한눈에 확인할 수 있을 뿐만 아니라 이번에 사용하진 않았지만 정량 까지도 바로 확인할 수 있음을 보여주고 있다.

표 2. 플라스미드에 삽입된 STD DNA 및 프라이머 증폭산물의 예상 크기

유 형	증폭산물 크기(bp)
Internal control; IC	120bp
Ureaplasma urealyticum; UU	221bp
Mycoplasma hominis; MH	300bp
Neisseria gonorrhea; NG	620bp
Mycoplasma genitalium; MG	370bp
Herpes simplex virus type 2, HSV2	180bp
Trichomonas vaginalis; TV	420bp
Chlamydiae trachomatis; CT	523bp

이와 같은 결과로 볼 때, M-AES 병용 프라이머 세트는 상기 표 1에서 제시된 것과 같이 특정 유형의 STD DNA에 대해서 상보적으로 결합하여 유형 특이적인 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있으며 비선택적 증폭이 없음을 확인하였다.

실시예 2

본 비교예에서는 인체 유래 샘플(요도나 자궁경부, 구강 분비물 및 세포)을 면봉이나 세포솔로 채취하여 얻은 다양한 검체를 대상으로 성전파질환 원인균 존재여부를 확인하였다. 검체 채취방법과 사용되는 도구 및 보관방법은 다음과 같다.

STD 검사에 필요한 표준 검체는 남성의 경우 요도 스왑 검체, 아침 첫 소변(VB1) 및 전립선마사지 후 소변(VB3)을 추가하였으며 여성의 경우 자궁경부내의 스왑 검체를 표준검체로 하였으며, 여기에 필요에 따라 질(vagina) 분비물이나 소변을 추가하였다.

샘플의 채취 과정에서 남성의 경우 멸균된 면봉을 요도구(2-3cm) 안쪽으로 삽입해서 좌우로 돌려 요도 내 분비물 및 세포가 잘 집적 (collect)되게 하여 채취하였고 여성의 경우 자궁경부의 스왑 검체를 얻을 때는 멸균된 면봉을 자궁경부 내부에 삽입해서 좌우로 돌려 분비물 및 세포가 잘 집적되게 하여 채취하였으며 이후 멸균된 검체보관 용액이 들어있는 튜브 내에 면봉을 넣어서 이동 및 보관시켰다.

실시예 3: DNA 분리

상기 실시예 2의 다양한 검체로 부터 DNA를 분리하기 위해 본 연구자가 개발한 방법 및 시약을 이용하여 DNA를 분리 및 정제하였다. 즉, 소변이나 스왑 검체를 5분 동안 13,000rpm에서 원심분리 한 후 상층액은 버리고, 획득한 펠렛(pellet)에 완충용액(lysis buffer, pH 6.8) 400μl와 프로티나아제 K 20㎕를 넣은 후, 펠렛이 완전히 풀어질 때까지 혼합한 후 95℃에서 5분간 반응시키고, 여기에 6M 소디움 클로라이드 150㎕를 넣고 진탕 혼합한 후 13,000rpm에서 3분간 원심분리 한다. 이 후 새로운 2ml 튜브에 상층액을 옮기 고 여기에 2배의 에탄올을 첨가하고 혼합한 후 12,000rpm에서 3분간 원심분리한다. 이후 상층액을 버리고 실온에서 건조시킨 후 멸균된 3차 증류수나 혹은 TE 완충액(10mM Tris-HCl[pH 8.0], 1mM EDTA) 50㎕에 녹였다. 이 중 3 내지 5㎕를 PCR에 사용하였다.

실시예 4: 단일 PCR 조건 수립

실시예 2의 검체 보관용액, 그리고 감염의 증후가 없는 정상인 시료와 실시예 1에서 확보한 각 세균 별로 검사할 표적 유전자의 플라스미드 클론을 이용하여 각각의 균 별로 표적 유전자에 대해 단일(single) PCR을 반복 수행하여 적정 조건을 수립하였으며, 이때 PCR시에는 반드시 내부참조 유전자인 베타글로빈 유전자의 PCR도 함께 수행하였다. 더불어 멀티플렉스 PCR을 감안하여 각 PCR 산물의 크기가 서로 뚜렷하게 차이가 나도록 고안하였으며, 이에 대해 결합온도(annealing temperature)는 동일한 조건에서 증폭될 수 있도록 고려하였다.

실시예 5: 멀티플렉스 PCR의 조건 수립

실시예 2의 검체 보관용액, 그리고 감염의 증후가 없는 정상인의 시료와 실시예 1에서 확보한 각 세균 별로 검사할 표적 유전자의 플라스미드 클론을 이용하여 각각의 균 별로 표적 유전자에 대해 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 또한 상기한 멀티플렉스 PCR 시에는 대조 유전자로 하우스키핑유전자(housekeeping gene)인 베타 2-마크로글로블린 유전자도 함께 증폭하였으며, 멀티플렉스 PCR 증폭 완료 후 그 산물은 2.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다.

도2a의 PCR 산물의 전기영동 이미지를 보면 STDMP1 병용 프라이머 세트에서 다양하게 조합된 플라스미드 DNA라 할지라도 균주 특이적 프라이머들은 각각 Ureaplasma urealyticum; UU의 산물이 221bp, Mycoplasma hominis; MH의 산물이 300bp, Herpes simplex virus 2; HSV2의 산물이 180bp, Neisseria gonorrhea; NG의 산물이 620bp, Mycoplasma genitalium; MG의 산물이 370bp, Trichomonas vaginalis; TV의 산물이 420bp 및 Chlamydiae trachomatis; CT의 산물이 523bp로 각각 나타났다. 더불어 본 방법으로 분석을 수행할 경우 각각의 균주들이 한 튜브에서 정확하게 반응하여 검색이 가능하였다.

표 3. 멀티플렉스 PCR 조건

PCR 조성		PCR 조건
pathogens	프라이머 농도
NG	20pmol	예비 변성(Pre-denaturation) : 94℃/15min,
CT	20pmol	변성(Denaturation) : 94℃/1.0min
TV	20pmol	결합(Annealing) : 65℃/1.0min
MG	30pmol	연장(Extension) 72℃/1.0min
MH	40pmol	35 cycles
UU	20pmol	최종 연장(Final extension) : 72℃/5min
HSV2	20pmol
Internal control	30pmol
프라이머 혼합액	3.0ul
주형 DNA(>10ng)	4.0ul	전기영동
PCR Master mix	10.0ul	2.5% agarose gel : 5ul/20ul loading
최종 부피	20ul(DW 3ul 첨가)

실시예 6: 자동화 전기영동 시스템을 이용한 증폭 능 확인 분석

1) 자동화 전기영동 시스템 장비 초기화

(1) 장비 내부의 WI와 WP위치에 겔 카트리지 키트에 들어 있는 세척 용액 9ml을 용액 운반용 상자에 첨가하고, BUF 위치에 겔 카트리지 키트에 들어 있는 완충용액 20ml을 용액 운반용 상자에 첨가한 후 그 상층부에 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일을 각각 3ml과 6ml을 첨가하며 96well plate 1번 위치의 용액 운반 상자안의 12 vial strip 각각에 40ul의 calibration marker를 첨가하고 미네랄 오일을 한방을 첨가하였다.

(2) 카트리지 문을 열고 카트리지를 삽입한 후 연결단자에 제공된 smart Key를 삽입한 후 카트리지 문을 닫고 컴퓨터 프로그램에서 자동화 전기영동 시스템을 구동시킬 구동용 아이콘을 클릭하여 소프트웨어를 작동시켜 Instrument Control을 구동시키고 화면상의 우측 아래 “NOCOM"이 ”COM"으로 변환되도록 하였다(기기와 컴퓨터 상호 의사교환이 이루어진다는 것을 의미한다).

(3) 분석하기 전에 겔 카트리지내에 있는 용액을 교환하고 표준 DNA 사이즈 마커를 이용하여 cartridge가 정확하게 Calibration 되도록 염기서열 폴더를 열어 GC-calibration sequence 파일을 작동 시키며 Calibration이 완료되면 성공적으로 완료되었다는 메시지가 뜬 후 Cartridge ID에 (cal) 이라는 명칭이 나타남을 확인하였고 마지막으로 질소 가스를 연결시킴으로서 장비의 초기화를 완료하였다.

2) 자동화 전기영동 시스템을 이용한 증폭 능 분석

(1) 시스템의 우측에 있는 스위치를 on 하여 앞면 좌측에 있는 LED가 Green 색으로 표시가 되며, 더불어 컴퓨터의 전원을 함께 켜고 BioCalculator 소프트웨어 작동를 작동시켜 컴퓨터 원도우 화면상의 HDA-GT12 구동용 아이콘을 클릭하여 소프트웨어를 작동시키고 Instrument Control을 구동시켜 화면상의 우측 아래 “NOCOM"이 ”COM"으로 변환되면 프로그램을 통한 샘플 분석을 진행하였다

(2) 샘플을 분석하기 전에 표준 DNA 사이즈 마커를 이용하여 겔 카트리지가 정확하게 Calibration 되도록 Sequence folder를 열어 GC-XX.seq를 작동 시켜 Calibration을 완료하고 Cartridge ID에 (cal) 이라는 명칭이 나타남을 확인한 후 샘플 운반용 홀더에 PCR 증폭 플레이트를 장착하고 Instrument control의 분석법 디렉토리를 클릭하여 분석법을 선택(OM500)후 샘플명칭, 위치 및 분석횟수를 선택하고 사용자 ID, plate ID를 기입하였다.

(3) 재차, 장비상태를 확인(Pres1; OK, Pres2 ; OK, SD; Closed, CD; Closed)하고 이상이 없으면 channel이 다 표시되었는지 체크 한 후 분석을 수행하였으며 분석이 시작되면 실시간으로 Electrophergram 또는 겔 이미지 상태로 분석 과정이 표시되며 분석이 완료되면 분석되는 겔l 이미지상의 맨 위에 있는 레인별 색상이 없어짐으로서 완료됨을 확인하였다.

도2 PCR 산물의 전기영동 이미지를 보면 M-AES 병용 프라이머 세트에서 다양하게 조합된 플라즈미드 DNA에서도 각각의 균주 특이적 프라이머들은 각각 Ureaplasma urealyticum; UU의 산물이 221bp, Mycoplasma hominis; MH의 산물이 300bp, Herpes simplex virus 2; HSV2의 산물이 180bp, Neisseria gonorrhea; NG의 산물이 620bp, Mycoplasma genitalium; MG의 산물이 370bp, Trichomonas vaginalis; TV의 산물이 420bp 및 Chlamydiae trachomatis; CT의 산물이 523bp로 각각 나타났고 이외의 비특이적 반응은 일어나지 않았다. 이를 토대로 본 방법으로 분석을 수행할 경우 각 각의 균주들이 한 튜브에서 정확하게 반응하여 검색이 가능함을 확인하였다.

또한, 3a에서 3g는 본 자동화 전기영동에서 사용한 사이즈 마커로 Gel image와 peak 및 수치화가 가능함으로 보여주고 있으며, 이 사이즈 마커 이외의 정량을 목적으로 한 사이즈 마커를 사용한다면 정성 및 정량적인 부분도 한 번에 판독 가능할 것으로 생각되며 이는 3a에서 3g의 결과에서 보여주듯이 도 2의 전기영동 이미지외에 추가적으로 peak화, 사이즈 마커 대비 증폭산물의 크기 정보 그리고 정량적인 부분까지도 한 눈에 볼 수 있어 성전파질환 원인균의 조기 검출은 물론 치료에 따른 예후 예측 및 객관적 평가가 가능함을 의미하며 이는 현재 상업화 되어 있는 제품들 가운데 단연 으뜸이라 할 수 있다.

따라서, 총 60개의 검체를 대상으로 상업적 분석 키트의 결과와 비교한 본 발명의 멀티플렉스 PCR 분석의 결과는 표 4에 정리하였다. 상업적 분석 키트의 PCR 분석 결과를 기준으로 할 때 본 멀티플렉스 PCR의 정확도는 95%로 타사의 76.7%~90%에 비해 높게 나타났으며 단일 감염 및 복합감염에 있어서도 각각 95%로 타사의 70~85% 및 80~92.5%에 비해 높은 수치를 나타내었다.

표 4. 임상검체의 상업적 분석키트와 비교한 결과

	진단의 정확도
	M사	S사	G사	본 발명
STD 환자군(N=60)
Ureaplasma urealyticum; UU	5	5	5	5
Mycoplasma hominis; MH	-	5	-	5
Neisseria gonorrhea; NG	5	5	5	5
Mycoplasma genitalium; MG	-	5	5	5
Herpes simplex virus 2	-	5	-	5
Trichomonas vaginalis; TV	-	5	-	5
Chlamydiae trachomatis; CT	5	5	5	5
단일 감염(N=20)	14(70)	17(85)	13(65)	19(95)
복합 감염(N=40)	32(80)	37(92.5)	34(85)	38(95)
전체	46(76.7)	54(90)	47(78.3)	57(95)
정상대조군(N=20)	20(100)	20(100)	20(100)	20(100)

이러한 결과는 상기 실시예 1에 제시된 표 1의 결과와 일치하는 것임을 확인할 수 있었으며, 본 실시예에서 확인하지 못한 다른 많은 성전파질환 원인균에 대해서도 표 1에서와 동일한 결과가 도출될 수 있을 것으로 기대되었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 기술하였으나, 본 발명의 정신을 훼손하지 않는 범위 내에서 다양한 변형과 변경이 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게는 자명한 사실이라 할 것이다. 또한 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은 첨부된 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.

본 발명에서는 성전파질환과 밀접한 관련이 있는 다수의 원인균 DNA 단편과 상보적으로 결합하여 유형 특이적 PCR 증폭 산물을 생성시킬 수 있는 총 7조의 올리고 뉴 클레오티드 염기서열로 이루어진 PCR 프라이머를 합성하였다.

이와 같은 신규한 PCR 프라이머의 사용은 성전파질환의 발병과 관련도가 높은 특정 원인균 DNA에 감염된 샘플을 신속하고 용이하게 검출할 수 있기 때문에 성전파질환의 조기 진단 및 예후에 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에서 합성된 프라이머는 성전파질환 원인균별 게놈과 상보적으로 결합할 수 있기 때문에 직접적으로 특정 유형의 원인균을 검출할 수 있는 프로브(probe)로 활용될 수 있다.

더욱이 본 발명에서 합성된 다수의 올리고뉴클레오티드를 동시에 프라이머로 사용하면 샘플 시료가 극미량으로 존재하더라도 1회의 PCR 과정만으로 신속하게 성전파질환 관련 원인균 DNA의 감염여부를 확인할 수 있다.

더불어, 본 발명에서 확인된 다중중합효소연쇄반응과 자동화 전기영동 시스템의 접목은 개관적 대규모 검사가 가능할 뿐만 아니라 감염성 질환의 나아가야할 방향성과도 일치하는 것으로 치료를 통한 예후 예측을 가능하게 해 줄 수 있다.

나아가 발생빈도가 높은 성전파질환을 조기에 진단함과 더불어 치료를 통한 예후 예측이 가능하여, 국민건강 증진에 일익을 담당할 수 있을 것으로 사료된다.

<110> YEON SOO, kim <120> High Sensitivity Method for Detection of Sexual Transmitted Diseases by Multiplex PCR and Automatic Electrophoresis System <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG <400> 1 ttacagactg gcggcggttt cgttttgggc g 31 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-2 <400> 2 cgcaaacgtc gactgcacac ccgaacagct tg 32 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-1 <400> 3 gcgcatctaa aggagctagc tcgcaacaat gc 32 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-2 <400> 4 tcaagccaag accgcaagtg aataatgcgg atac 34 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TV-1 <400> 5 cgaatccatc ctcgatgtca tccgtaagga agctgaatc 39 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TV-2 <400> 6 gcgagcttac gaaggtcgga gttgagctga cctgggaagc g 41 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG-1 <400> 7 aggattggca atttttatgc ctggttgcat cttactttc 39 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG-2 <400> 8 ccatctatca gatgtaaatt ggtggcaata taagc 35 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH-1 <400> 9 cgctgtaagg cgccactaaa agatgagggt gcggaac 37 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH-2 <400> 10 cgctttctga caaggtaccg tcagtctgca atc 33 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU-1 <400> 11 cactaggggt aactttagtg ggagcagggg tagttgctg 39 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU-2 <400> 12 tcagctgatg taattgcaac attgaattca gcttcgt 37 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV2-1 <400> 13 caggaggacg gccagtacga tgtggctgct g 31 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV2-2 <400> 14 ccgtcagggt tacctggcgg gtcaggtgat ag 32 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC-1 <400> 15 ggctaatgcc ctggcccaca agtatcacta agctc 35 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC-2 <400> 16 caaggccctt cataatatcc cccagtttag tagttgg 37

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 14로 이루어진 군중에서 선택되는 적어도 한 조의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 성전파 질환 관련 원인균 DNA를 증폭하는 합성된 프라이머.
제 1항에 있어서,

서열번호 1과 서열번호 2로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 1 프라이머);

서열번호 3과 서열번호 4로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 2 프라이머);

서열번호 5와 서열번호 6으로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 3 프라이머);

서열번호 7과 서열번호 8로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 4 프라이머);

서열번호 9와 서열번호 10으로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 5 프라이머);

서열번호 11과 서열번호 12로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 6 프라이머);

서열번호 13과 서열번호 14로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 7 프라이머)로 이루어진 군중에서 적어도 1조 이상 선택되는 성전파질환 관련 원인균 DNA를 증폭하는 합성된 프라이머.
제 2항에 있어서,

상기 제 1 프라이머는 Ureaplasma urealyticum; UU DNA를 증폭하고,

상기 제 2 프라이머는 Mycoplasma hominis; MH DNA를 증폭하고,

상기 제 3 프라이머는 Chlamydia tracomatis; CT DNA를 증폭하고,

상기 제 4 프라이머는 Neisseria gonorrhea; NG DNA를 증폭하고,

상기 제 5 프라이머는 Mycoplasma genitalium; MG DNA를 증폭하고,

상기 제 6 프라이머는 Treponema vaginalis; TV DNA를 증폭하고,

상기 제 7 프라이머는 Herpes simplex virus 2; HSV2 DNA를 증폭하는 것을 특징으로 하는 성전파질환 관련 원인균 DNA를 증폭하는 합성된 프라이머.
서열번호 1 내지 서열번호 14로 이루어진 군중에서 선택되는 적어도 한 조의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하고,

생물학적 샘플로부터 얻어진 핵산을 표적 DNA로 하여 성전파질환 원인균 DNA를 증폭하는 방법 및 증폭산물을 자동화 전기영동 시스템을 사용하여 성전파질환 관련 원인균 DNA의 존재 유무를 확인하는 방법.
제 4항에 있어서,

서열번호 1과 서열번호 2로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 1 프라이머);

서열번호 3과 서열번호 4로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 2 프라이머);

서열번호 5와 서열번호 6으로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 3 프라이머);

서열번호 7과 서열번호 8로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 4 프라이머);

서열번호 9와 서열번호 10으로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 5 프라이머);

서열번호 11과 서열번호 12로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 6 프라이머);

서열번호 13과 서열번호 14로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 7 프라이머)로 이루어진 군중에서 적어도 1조 이상 선택되는 성전파질환 관련 원인균 DNA를 증폭하는 방법 및 증폭산물을 자동화 전기영동 시스템을 사용하여 성전파질환 관련 원인균 DNA의 존재 유무를 확인하는 방법.
제 5항에 있어서,

상기 제 1 프라이머는 Ureaplasma urealyticum; UU DNA를 증폭하고,

상기 제 2 프라이머는 Mycoplasma hominis; MH DNA를 증폭하고,

상기 제 3 프라이머는 Chlamydia tracomatis; CT DNA를 증폭하고,

상기 제 4 프라이머는 Neisseria gonorrhea; NG DNA를 증폭하고,

상기 제 5 프라이머는 Mycoplasma genitalium; MG DNA를 증폭하고,

상기 제 6 프라이머는 Treponema vaginalis; TV DNA를 증폭하고,

상기 제 7 프라이머는 Herpes simplex virus 2; HSV2 DNA를 증폭하는 것을 특징으로 하는 성전파질환 관련 원인균 DNA를 증폭하는 방법 증폭산물을 자동화 전기영동 시스템을 사용하여 성전파질환 관련 원인균 DNA의 존재 유무를 확인하는 방법.
서열번호 1 내지 서열번호 14로 이루어진 군중에서 선택되는 적어도 한 조의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하고 샘플로부터 얻어진 핵산을 표적 DNA로 하여 상기 표적 DNA를 증폭시키는 과정; 및

상기 증폭과정에서 증폭산물이 존재하는 것을 객관적으로 판정할 수 있는 자동화 전기영동 시스템을 이용하여 상기 샘플 내에 특정 유형의 성전파질환 원인균 DNA가 존재하는 것을 판단하는 과정을 포함하는 샘플 내의 성전파질환 관련 원인균 DNA의 존재를 분석하는 방법.
제 11항에 있어서,

서열번호 1과 서열번호 2로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 1 프라이머);

서열번호 3과 서열번호 4로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 2 프라이머);

서열번호 5와 서열번호 6으로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 3 프라이머);

서열번호 7과 서열번호 8로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 4 프라이머);

서열번호 9와 서열번호 10으로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 5 프라이머);

서열번호 11과 서열번호 12로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 6 프라이머);

서열번호 13과 서열번호 14로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 7 프라이머)로 이루어진 군중에서 적어도 1조 이상 선택되는 샘플 내의 성전파질환 관련 원인균 DNA의 존재를 객관적으로 판정할 수 있는 자동화 전기영동 시스템을 이용하여 상기 샘플 내에 특정 유형의 성전파질환 원인균 DNA가 존재하는 것을 판단하는 과정을 포함하는 샘플 내의 성전파질환 관련 원인균 DNA의 존재를 분석하는 방법.
제 8항에 있어서,

상기 제 1 프라이머는 Ureaplasma urealyticum; UU DNA를 증폭하고,

상기 제 2 프라이머는 Mycoplasma hominis; MH DNA를 증폭하고,

상기 제 3 프라이머는 Chlamydia tracomatis; CT DNA를 증폭하고,

상기 제 4 프라이머는 Neisseria gonorrhea; NG DNA를 증폭하고,

상기 제 5 프라이머는 Mycoplasma genitalium; MG DNA를 증폭하고,

상기 제 6 프라이머는 Treponema vaginalis; TV DNA를 증폭하고,

상기 제 7 프라이머는 Herpes simplex virus 2; HSV2 DNA를 증폭하는 것을 특징으로 하는 샘플 내의 성전파질환 관련 원인균 DNA의 존재를 객관적으로 판정할 수 있는 자동화 전기영동 시스템을 이용하여 상기 샘플 내에 특정 유형의 성전파질환 원인균 DNA가 존재하는 것을 판단하는 과정을 포함하는 샘플 내의 성전파질환 관련 원인균 DNA의 존재를 분석하는 방법.
서열번호 1 내지 서열번호 14로 이루어진 군중에서 선택되는 적어도 한 조의 올리고뉴클레오티드;

dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP);

내열성 중합효소;

PCR 완충용액; 및

상기 프라이머를 통한 PCR 증폭 산물을 탐지하는 수단자동화 전기영동 시스템)을 포함하는 성전파질환 관련 원인균 DNA 검출용 키트.
제 10항에 있어서,

서열번호 1과 서열번호 2로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 1 프라이머);

서열번호 3과 서열번호 4로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 2 프라이머);

서열번호 5와 서열번호 6으로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 3 프라이머);

서열번호 7과 서열번호 8로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 4 프라이머);

서열번호 9와 서열번호 10으로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 5 프라이머);

서열번호 11과 서열번호 12로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 6 프라이머);

서열번호 13과 서열번호 14로 구성된 올리고뉴클레오티드(제 7 프라이머)로 이루어진 군중에서 적어도 1조 이상 선택되는 상기 프라이머를 이용하여 PCR 증폭 후 증폭산물을 확인하기 위한 EtBr이 충진된 agarose gel과 12 well capillary 전기영동장치가 포함된 자동화 전기영동 시스템을 사용하는 것을 특징으로 하는 성전파질환 원인균 DNA 검출용 키트.
제 11항에 있어서,

상기 제 1 프라이머는 Ureaplasma urealyticum; UU DNA를 증폭하고,

상기 제 2 프라이머는 Mycoplasma hominis; MH DNA를 증폭하고,

상기 제 3 프라이머는 Chlamydia tracomatis; CT DNA를 증폭하고,

상기 제 4 프라이머는 Neisseria gonorrhea; NG DNA를 증폭하고,

상기 제 5 프라이머는 Mycoplasma genitalium; MG DNA를 증폭하고,

상기 제 6 프라이머는 Treponema vaginalis; TV DNA를 증폭하고,

상기 제 7 프라이머는 Herpes simplex virus 2; HSV2 DNA를 증폭하는 것을 특징으로 하는 성전파질환 관련 원인균 DNA 검출용 키트.
제 12항에 있어서,

상기 DNA 시료를 증폭시키는 수단은 물론 증폭산물을 객관적으로 판정할 수 있는 판독 수단을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파질환 원인균 DNA 검출용 키트.
제 13항에 있어서,

상기 DNA 검출용 키트는 DNA 추출 유무를 확인할 수 있는 인터널 콘트롤(internal control)을 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파질환 원인균 DNA 검출용 키트.