CN116426658A - 泌尿生殖道病原体检测试剂盒及其引物探针组合物与应用 - Google Patents

泌尿生殖道病原体检测试剂盒及其引物探针组合物与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因技术领域，具体公开了一种泌尿生殖道病原体检测试剂盒及其引物探针组合物与应用。本发明的引物探针组合物及其检测试剂盒可用于同时检测大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌，便于病原体的快速筛查，且操作简单，耗时短。并在引物探针组合物的基础上开发了相应的基因芯片和检测试剂盒。本发明设计获得的引物和探针组合的特异性强、检测范围广、结果准确性好，不仅有助于传染性病原体的防控，还可用于相应病原体的室间质评等。

Description

泌尿生殖道病原体检测试剂盒及其引物探针组合物与应用
技术领域
本发明涉及基因技术领域，尤其是涉及一种泌尿生殖道病原体检测试剂盒及其引物探针组合物与应用。
背景技术
尿路感染是临床最常见的泌尿系统感染性疾病，致病原因和避孕不当、性行为传播以及细菌逆行感染等有关，部分患者可能因为近期手术等外界因素引起感染。作为一种高发性疾病，尿路感染给患者带来严重的心理负担和不适，若想改善其临床预后，应确保尿路感染的早期诊断和对症治疗的及时性和有效性。临床确诊为尿路感染的患者常采用抗感染治疗，然而，不同的病原菌对不同的抗生素的敏感度不同。以往临床中对泌尿系统感染患者大多进行常规性检验，但是对病原菌种类的辨别不够理想，因此，抗感染治疗之前应开展微生物病原菌检验以明确致病病原菌的种类。借助微生物检验技术能够对患者的各类致病菌进行归类，对于不同的病原菌其相对应的抗菌药物也不同，选取病原菌敏感度高的药物进行抗感染治疗，能够极大提升治疗效果，使得用药更具安全性、合理性，减少发生耐药的几率。
目前尿路感染的诊断主要依靠亚硝酸盐检测、白细胞检测以及尿液培养等检测方法。亚硝酸盐检测，白细胞检测无法确定是哪种病原微生物感染，检测灵敏度低。尿液培养可以判定病原微生物的种类，是检测尿路感染的“金标准”。此法耗时长(培养周期3-5天)、需要专业技术人员在无菌微生物实验室操作，对环境和设备要求高，不适合社区医院及乡镇医院推广使用。性传播疾病也是导致尿路感染的原因之一。临床中女性发生泌尿系统感染的风险受到其泌尿系统特殊解剖结构的影响而高于男性，男性患者泌尿系统感染发病率在患者群体中占比为15％～20％。
泌尿系统感染的致病病原菌种类十分复杂，因此临床确诊患者致病病原菌难度较大，一般分为尿路病原体和生殖道病原体。常见的尿路感染病原菌为大肠杆菌(Escherichia coli，Eco)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella Pneumoniae，KP)、奇异变形杆菌(Proteus Mirabilis，PM)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus，SA)、粪肠球菌(Enterococcus Faecalis，EF)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa，PA)和无乳链球菌(Streptococcus Agalactiae，StrA)等。沙眼衣原体(Chlamydia Trachomatis，CT)、解脲支原体(Ureaplasma Urealyticum，UU)和淋球菌(Neisseria Gonorrhoeae，NG)、人型支原体(M.hominis，Mh)为常见危害生殖道健康的病原体，可表现为单一病原体感染或混合感染，是导致女性不孕的高危因素。
美国CDC 2015《淋病诊断和治疗指南》、《沙眼衣原体感染的诊断和治疗指南》、《生殖器疱疹的诊断和治疗指南》和我国《生殖道支原体感染诊治专家共识》等指出，在成年女性中，NG、CT、UU等生殖道病原微生物多为无症状感染，多在出现并发症如盆腔炎时才能被发现，以致形成输卵管瘢痕，引起不孕或异位妊娠。NG、CT、UU、Mh和不孕不育存在一定的相关性。大量临床研究表明UU可粘附在精子的不同部位，影响精子运动轨迹和精子活力，并可通过精子作为载体进入女性生殖道，引起生殖道感染。女性患者感染解脲支原体后，会破坏女性的输卵管粘膜，造成输卵管粘连或是阻塞，使受孕的通道受阻导致不孕。解脲支原体感染细胞引发细胞凋亡会进一步激活免疫系统，诱发抗子宫内膜的抗体产生，使受精卵很难在子宫内膜着床导致不孕。由于生殖道病原微生物感染无症状及不典型，因此不能仅凭症状和体征判断病原体的存在，采用导流杂交方法可显著提高对生殖道病原微生物的检出率，有利于对被感染病人采取迅速的诊断和合适的治疗，从而控制疾病的传播，并使其性伴提前知晓、检查和合理治疗。所以女性生殖道感染的筛查和检测至关重要。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种泌尿生殖道病原体检测试剂盒及其引物探针组合物与应用。采用本发明的引物对或者组合物可以同时快速检测大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌。本发明检测的病原体种类多且检测特异性强，检测结果准确。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了用于检测泌尿生殖道病原体的引物对，所述引物对包括下述任意一种：
1)由序列SEQ ID NO:1～2所示的引物构成；2)由序列SEQ ID NO:3～4所示的引物构成；
3)由序列SEQ ID NO:5～6所示的引物构成；4)由序列SEQ ID NO:7～8所示的引物构成；
5)由序列SEQ ID NO:9～10所示的引物构成；6)由序列SEQ ID NO:11～12所示的引物构成；
7)由序列SEQ ID NO:13～14所示的引物构成；8)由序列SEQ ID NO:15～16所示的引物构成；
9)由序列SEQ ID NO:17～18所示的引物构成；10)由序列SEQ ID NO:19～20所示的引物构成。
由于本发明设计的多重PCR引物和探针组合具有相近的Tm值，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性显著增加。本发明的多重PCR引物和探针组合能够一次性对多种泌尿生殖系统常见病原体进行检测，检测病原体种类多且检测特异性强，检测结果准确。
作为本发明所述用于检测泌尿生殖道病原体的引物对的优选实施方式，所述泌尿生殖道病原体包括大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌中的至少一种；
所述序列SEQ ID NO:1～2用于检测大肠杆菌；所述序列SEQ ID NO:3～4用于检测肺炎克雷伯杆菌；所述序列SEQ ID NO:5～6用于检测奇异变形杆菌；所述序列SEQ ID NO:7～8用于检测金黄色葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO:9～10用于检测粪肠球菌；所述序列SEQID NO:11～12用于检测铜绿假单胞菌；所述序列SEQ ID NO:13～14用于检测无乳链球菌；所述序列SEQ ID NO:15～16用于检测沙眼衣原体；所述序列SEQ ID NO:17～18用于检测解脲支原体；所述序列SEQ ID NO:19～20用于检测淋球菌。
本发明以大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌，这10种病原体的核苷酸序列为目标，通过多序列对比与分析，设计了可用于检测上述病原体的多重PCR引物和探针。
第二目的，本发明提供了用于检测泌尿生殖道病原体的组合物，所述组合物包括引物对和探针；所述探针的序列如SEQ ID NO:21～30所示；其中：
所述序列SEQ ID NO:1～2对应的探针序列为SEQ ID NO:21；所述序列SEQ ID NO:3～4对应的探针序列为SEQ ID NO:22；
所述序列SEQ ID NO:5～6对应的探针序列为SEQ ID NO:23；所述序列SEQ ID NO:7～8对应的探针序列为SEQ ID NO:24；
所述序列SEQ ID NO:9～10对应的探针序列为SEQ ID NO:25；所述序列SEQ IDNO:11～12对应的探针序列为SEQ ID NO:26；
所述序列SEQ ID NO:13～14对应的探针序列为SEQ ID NO:27；所述序列SEQ IDNO:15～16对应的探针序列为SEQ ID NO:28；
所述序列SEQ ID NO:17～18对应的探针序列为SEQ ID NO:29；所述序列SEQ IDNO:19～20对应的探针序列为SEQ ID NO:30。
作为本发明所述用于检测泌尿生殖道病原体的组合物的优选实施方式，所述组合物还包括内标引物和内标探针，所述内标引物的序列如SEQ ID NO:31～32所示，所述内标探针的序列如SEQ ID NO:33所示。
优选地，所述组合物还包括标记有生物素点的显色体系控制探针，所述显色体系控制探针的序列如SEQ ID NO.34所示。本发明的显色体系控制探针可以用于监测样本的采集和提取过程，避免假阴性结果。
本发明还设计了内标引物、内标探针以及显色体系控制探针，用于监测样本的采集和提取过程，避免假阴性结果。
第三目的，本发明提供了用于检测泌尿生殖道病原体的试剂盒/基因芯片，所述试剂盒/基因芯片包括上述引物对和/或组合物。上述引物对和/或组合物置于基因芯片的固体载体上。
所述基因芯片上的探针的5′或3′端均进行了氨基化处理。所述引物的5’端均结合有标记物，所述标记物为生物素。
所述固定载体为硝酸纤维素、醋酸纤维素、玻璃片、硅胶晶片、尼龙膜、聚丙烯膜或微缩磁珠中的一种。优选地，所述固定载体为尼龙膜。
优选地，所述试剂盒中还含有PCR检测体系(PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、酶混合液)和灭菌注射水。
上述PCR检测体系包含UNG酶和dUTP，作为防污染措施，将可能存在的PCR产物污染充分降解，避免引起的假阳性结果。
本发明所述基因芯片或试剂盒的检测原理为：将探针结合于固相载体上用于和靶序列核酸杂交而捕捉样品；样品(经引物对扩展后的样品)流经置放于导流杂交装置的固相载体，其中的靶序列和探针杂交成结合体；通过检测与探针形成的复合物，若为阳性结果则提示样品中含有待测靶核酸序列。
第四目的，本发明提供了上述引物对和/或组合物在检测泌尿生殖道病原体中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的应用。
第五目的，本发明提供了上述引物对和/或组合物在制备检测检测泌尿生殖道病原体产品中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述产品包括试剂盒或基因芯片。
第六目的，本发明提供了一种非疾病诊断和治疗目的的检测泌尿生殖道病原体的方法，包括如下步骤：
S1、释放待测样本的核酸；
S2、以步骤S1所得核酸为模板，使用SEQ ID NO:1～30所示的引物和SEQ ID NO:31～32所示内标引物进行PCR，获得PCR扩增产物；
S3、利用含有SEQ ID NO:21～30和SEQ ID NO:33所示的探针的基因芯片对PCR扩增产物进行杂交，所述基因芯片的每个位点每个格子对应一条探针，通过化学显色对结果进行判读。显色结束后，若基因芯片上内标探针(IC)和探针均呈现深蓝色斑点且无非特异结果出现，则表明探针已检出提取样本中所含有的特异性序列，表示其对应病原体的检测结果为阳性。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤S3中所述杂交为导流杂交。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述泌尿生殖道病原体包括大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌中的至少一种。
所述样本为尿液。
具体地，PCR扩增程序为：95℃热启动10min，98℃变性30sec、58℃退火60sec、72℃延伸150sec，共35个循环，最后一步72℃延伸5min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种特异性强的用于检测泌尿生殖道病原体的引物对、组合物，可用于同时检测大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌，便于病原体的快速筛查，且操作简单，耗时短。同时，本发明所述引物和探针组合中各探针的Tm值相近，故将其制成基因芯片进行检测时，病原体核酸PCR扩增产物与相应探针杂交时最适温度条件基本一致，不会因为温度问题影响杂交结果；同时设置了内控系统来监测样本的采集和提取过程，避免了假阴性结果，检测准确性好。在所述多重PCR引物和基因芯片的基础上，本发明还提供了相应的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含UNG酶和dUTP防污染措施，能将可能存在的PCR产物污染充分降解，避免引起的假阳性结果。
本发明提供的多重PCR引物和探针组合，基因芯片以及对应检测试剂盒不仅有助于鉴别尿道感染的病原体种类，还可用于相应病原体的室间质评等。
附图说明
图1为本发明所述基因芯片中各病原体检测探针的排列顺序图；
图2为利用所述引物和探针对大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌和奇异变形杆菌的灵敏度检测结果；
图3为利用所述引物和探针对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌的灵敏度检测结果；
图4为利用所述引物和探针对无乳链球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌的灵敏度检测结果；
图5为利用所述引物和探针对未稀释核酸的病原体的检测结果；
图6为利用本发明所述试剂盒对不同未稀释核酸的病原体混合样本的检测结果图。
注：图2～3中，从上至下的检测浓度依次为1000、500和250copies/反应。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、多重PCR引物和探针组合
本发明以大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌，这10种病原体的核苷酸序列为目标，在NCBI数据库中下载了上述病原体的核苷酸序列，通过多序列对比与分析，设计了可用于检测上述病原体的多重PCR引物和探针，同时还设计了内标引物、内标探针以及显色体系控制探针，用于监测样本的采集和提取过程，避免假阴性结果。
本发明共设计了11对引物，11条探针；经过特异性、灵敏性等检测效果的考察，最终得到表1所示的多重PCR引物及内标引物，以及表2所示的特异性探针、内标探针及显色体系控制探针。
表1引物核苷酸序列
Figure BDA0004119551030000071
Figure BDA0004119551030000081
表2探针核苷酸序列
Figure BDA0004119551030000082
注：Bio为显色体系控制探针。
实施例2、基因芯片及检测试剂盒
在实施例1所述多重PCR引物及探针的基础上，本发明开发了用于检测上述10种病原体的基因芯片及检测试剂盒。所述基因芯片包括固定载体和固定在固定载体上的病原体特异性探针，即SEQ ID No:21～30所示的探针序列，此外还含有SEQ ID No.33所示内标探针序列和SEQ ID No.34所示显色体系控制探针序列，探针交由引物合成厂家(上海百力格生物技术有限公司)合成并修饰，所述探针的5′和3′端均进行了氨基化处理(氨基基团Amino)，所述显色体系控制探针上标记有生物素点。
1、基因芯片及其制备方法
(1)探针的排列
此实施例中，本发明制备基因芯片所用固定载体为尼龙膜，将其划分为12个小格，各病原体特异性探针在基因芯片上的具体分布位置如图1所示，基因芯片的12个格子中，每个位点每个格子对应一条探针。
(2)尼龙膜的处理
对尼龙膜进行处理，首先将其放入0.1M的HCl溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放入20％的EDAC溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200mL纯化水冲洗10秒钟，重复此步骤3次，放到吸水纸上除去多余的残液；将膜转入温度为20℃、湿度为45％的烘干箱内烘干12小时；将已烘干的尼龙膜用Kimwipes纸隔开，转入封口薄膜袋中，贮藏在4℃的温度下，备用。
(3)点样
将合成所得的探针(表2所示探针)用探针稀释液(pH8.4的0.5M Na2CO3和0.5MNaHCO3的溶液)溶解混合后进行点样；启动点样装置，在芯片制作程序的控制下，进行DNA探针的打印；通过DNA打印针每次取一个DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传递到指定的点样位置；完成一次打印后，荷样打印针清洗、干燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。
本发明通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在上述的尼龙膜上，每滴0.4μL；点膜结束后，将膜放置于室温15分钟进行反应；然后将膜转入0.1MNaOH溶液中浸泡10分钟，停止反应；将洗好的膜转入温度为20℃、湿度为45％的烘干箱内烘干12小时，即制得基因芯片。
2、检测试剂盒及其制备方法
本实施例还提供了一种用于检测上述10种病原体的试剂盒，所述试剂盒中含有表1所示引物对1～11、制备所得基因芯片、PCR检测体系(PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、酶混合液)和灭菌注射水；试剂盒中所有引物对的5’端均标记有生物素。
本发明所述试剂盒中设置了内控系统，用于监测样本采集、提取过程，避免假阴性结果。
上述PCR检测体系包含UNG酶和dUTP防污染措施，可以将可能存在的PCR产物污染充分降解，避免引起的假阳性结果。
实施例3、一种非疾病诊断和治疗目的的检测泌尿生殖道病原体的方法
本发明以实施例2制备的试剂盒为例，简述利用所述试剂盒进行的以非疾病诊断为目的的检测所述10种病原体的方法。所述泌尿生殖道病原体包括大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌。
具体方法如下：
(1)释放待测样本的核酸；
(2)PCR扩增；
利用试剂盒中所述引物对1～11对待测样品进行PCR扩增，PCR反应液体积为45μL，DNA加样量为5μL，总反应体积为50μL。PCR扩增的反应体系如表3所示：
表3多重PCR反应体系
Figure BDA0004119551030000101
Figure BDA0004119551030000111
注：Q-solution为基因扩增的辅助试剂，引物的5’端均标记有荧光素。
PCR扩增程序为：95℃热启动10min，98℃变性30sec、58℃退火60sec、72℃延伸150sec，共35个循环，最后一步72℃延伸5min。
本发明可以在同一个条件下扩增多种病原体，减少了PCR试剂的用量以及PCR仪的需求量，减少了操作步骤，降低了成本。
(3)利用基因芯片进行检测；
将获得的扩增产物在95℃下变性5～10分钟，然后迅速转移到冰水混合物中放置2分钟，加入0.8mL预先温浴到42℃的杂交液(2×SSC/0.1％SDS)，混合后加入杂交仪的反应孔中，应用于制得的基因芯片；42℃杂交30分钟，然后用溶液WB1(0.5×SSC/0.1％SDS，42℃温浴)清洗3～4遍；加入0.5mL封阻液(0.25％脱脂奶粉，0.05％硫柳汞)，25℃封闭5分钟；抽干后加入0.5mL的酶标液(TBS中溶解的带有链霉亲和素标记的AP酶)，酶标5分钟；用0.8mL溶液A(TBS，0.1％ Tween20及0.05％叠氮钠)清洗4遍，然后加入0.5mL的显色液(NBT/BCIP)，避光显色5分钟；最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况。
(4)结果判读。
实施例4、本发明引物和探针组合的灵敏度和准确性测试
本发明利用大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌，对本发明所述引物和探针组合的检测灵敏度和准确性进行了测试。
大肠杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌和无乳链球菌购自泰斯拓生物，肺炎克雷伯杆菌、沙眼衣原体、解脲支原体和淋球菌采购自广州邦德盛生物。
1、灵敏度测试
(1)核酸抽提
将10种待测病原体混合阴性尿液样本作为人工模拟样本，使用核酸提取试剂盒进行DNA抽提，具体步骤参照潮州凯普生物化学有限公司核酸提取或纯化试剂(磁珠法DR-4801-KZ型)说明书进行。
(2)核酸稀释
将上述提取的样本DNA分别进行倍比稀释，使检测浓度依次为1000copies/反应、500copies/反应和250copies/反应。
(3)PCR扩增
参照实施例3所述反应体系和反应程序进行PCR扩增。
(4)杂交
将杂交液先预热到42℃，把点入与待测病原体相应的寡核苷酸探针的尼龙膜(基因芯片)放入杂交仪中，加入杂交液；将获得的扩增产物在95℃下变性5～10分钟，迅速转移到冰水混合物中放置2分钟，加入杂交仪的反应孔中与基因芯片反应，于42℃杂交30分钟；然后用溶液WB1(0.5×SSC/0.1％SDS，42℃温浴)清洗3～4遍，加入0.5mL封阻液，25℃封闭5分钟；抽干后加入0.5mL的酶标液酶标5分钟；用0.8mL溶液A清洗4遍，然后加入0.5mL的显色液，避光显色5分钟；最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况，通过化学显色对结果进行判读。
(5)结果判读
若尼龙膜上，IC内标探针和对应探针均呈现深蓝色斑点且无非特异结果出现，则表明探针已检出提取样本中所含有的特异性序列，表示其对应病原体的检测结果为阳性。
上述10种样本梯度稀释后的灵敏度检测结果依次如图2～4所示，其中，图2为大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌和奇异变形杆菌样本的灵敏度检测结果，图3为金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和铜绿假单胞菌样本的灵敏度检测结果，图4为无乳链球菌、沙眼衣原体、解脲支原体和淋球菌样本的灵敏度检测结果，图2～4中，从上至下的检测浓度依次为1000、500和250copies/反应。
由图2～4所示结果可知，利用本发明所述引物和探针检测10种样本，准确性达100％；从核酸倍比稀释检测浓度结果可知，其最低检出限为500copies/反应。
本发明同时对上述10种未稀释核酸的人工模拟混合样本进行了检测，以验证检测结果的特异性和准确性，结果如图5所示。由图5所示结果可知，检测结果正常，未出现非特异性结果，表明利用本发明所述引物和探针检测10种病原体的检测特异性好，检测结果准确。
实施例5、试剂盒混检测试
本发明还利用实施例2所述试剂盒对未稀释核酸的不同病原体的混合人工模拟样本进行了检测，以测试其混检效果。此实施例中以大肠杆菌/肺炎克雷伯杆菌/奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌/粪肠球菌/铜绿假单胞菌、无乳链球菌/沙眼衣原体/解脲支原体/淋球菌的混合样本为例，展示混检效果，结果如图6所示；图6中第一幅图为大肠杆菌/肺炎克雷伯杆菌/奇异变形杆菌混合样本的检测结果，图6中第二幅图为金黄色葡萄球菌/粪肠球菌/铜绿假单胞菌混合样本的检测结果，图6中第三幅图为无乳链球菌/沙眼衣原体/解脲支原体/淋球菌混合样本的检测结果。
由图6所示结果可知，利用本发明所述试剂盒对混合样本进行检测的检测结果正常，未出现非特异性结果，表明本发明所述试剂盒可用于同时对不同病原体进行检测，且对混合样本的检测结果也准确。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.用于检测泌尿生殖道病原体的引物对，其特征在于，所述引物对包括下述任意一种：
1)由序列SEQ ID NO:1～2所示的引物构成；2)由序列SEQ ID NO:3～4所示的引物构成；
3)由序列SEQ ID NO:5～6所示的引物构成；4)由序列SEQ ID NO:7～8所示的引物构成；
5)由序列SEQ ID NO:9～10所示的引物构成；6)由序列SEQ ID NO:11～12所示的引物构成；
7)由序列SEQ ID NO:13～14所示的引物构成；8)由序列SEQ ID NO:15～16所示的引物构成；
9)由序列SEQ ID NO:17～18所示的引物构成；10)由序列SEQ ID NO:19～20所示的引物构成。
2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述泌尿生殖道病原体包括大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌中的至少一种；
所述序列SEQ ID NO:1～2用于检测大肠杆菌；所述序列SEQ ID NO:3～4用于检测肺炎克雷伯杆菌；所述序列SEQ ID NO:5～6用于检测奇异变形杆菌；所述序列SEQ ID NO:7～8用于检测金黄色葡萄球菌；所述序列SEQ ID NO:9～10用于检测粪肠球菌；所述序列SEQ IDNO:11～12用于检测铜绿假单胞菌；所述序列SEQ ID NO:13～14用于检测无乳链球菌；所述序列SEQ ID NO:15～16用于检测沙眼衣原体；所述序列SEQ ID NO:17～18用于检测解脲支原体；所述序列SEQ ID NO:19～20用于检测淋球菌。
3.用于检测泌尿生殖道病原体的组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1或2所述的引物对和探针；所述探针的序列如SEQ ID NO:21～30所示；其中：
所述序列SEQ ID NO:1～2对应的探针序列为SEQ ID NO:21；所述序列SEQ ID NO:3～4对应的探针序列为SEQ ID NO:22；
所述序列SEQ ID NO:5～6对应的探针序列为SEQ ID NO:23；所述序列SEQ ID NO:7～8对应的探针序列为SEQ ID NO:24；
所述序列SEQ ID NO:9～10对应的探针序列为SEQ ID NO:25；所述序列SEQ ID NO:11～12对应的探针序列为SEQ ID NO:26；
所述序列SEQ ID NO:13～14对应的探针序列为SEQ ID NO:27；所述序列SEQ ID NO:15～16对应的探针序列为SEQ ID NO:28；
所述序列SEQ ID NO:17～18对应的探针序列为SEQ ID NO:29；所述序列SEQ ID NO:19～20对应的探针序列为SEQ ID NO:30。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括内标引物和内标探针，所述内标引物的序列如SEQ ID NO:31～32所示，所述内标探针的序列如SEQ ID NO:33所示。
5.用于检测泌尿生殖道病原体的试剂盒/基因芯片，其特征在于，所述试剂盒/基因芯片包括如权利要求1或2所述的引物对和/或如权利要求3或4所述的组合物，所述试剂盒/基因芯片还包括标记有生物素点的显色体系控制探针，所述显色体系控制探针的序列如SEQID NO.34所示。
6.如权利要求1或2所述的引物对和/或如权利要求3或4所述的组合物在检测泌尿生殖道病原体中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的应用。
7.如权利要求1或2所述的引物对和/或如权利要求3或4所述的组合物在制备检测检测泌尿生殖道病原体产品中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒或基因芯片。
9.一种非疾病诊断和治疗目的的检测泌尿生殖道病原体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、释放待测样本的核酸；
S2、以步骤S1所得核酸为模板，使用SEQ ID NO:1～30所示的引物和SEQ ID NO:31～32所示内标引物进行PCR，获得PCR扩增产物；
S3、利用含有SEQ ID NO:21～30和SEQ ID NO:33所示的探针的基因芯片对PCR扩增产物进行杂交，所述基因芯片的每个位点每个格子对应一条探针，通过化学显色对结果进行判读。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述杂交为导流杂交。
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