KR20230016230A - 표적 물질의 검출용 키트 및 이를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법 - Google Patents
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Abstract
하이드로겔의 표면 또는 내부에 표적 물질의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브 또는 항체가 고정된 기판을 포함하는 표적 물질의 다중 검출을 위한 키트에 관한 것으로, 상기 키트를 이용하여 현장에서 신속하게 진단할 수 있고 민감도와 특이도가 우수한 질병 진단 검사 시스템을 구축할 수 있다.
Description
표적 물질 검출 키트 및 이를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
종래 급성호흡기 감염병은 대형 병원을 중심으로 검사 및 치료가 이루어지고 있다. 이때, 환자로부터 검체를 수집한 뒤 특수한 시설을 갖춘 진단검사실로 보내어 지고, 그 뒤, 검체 전처리와 검사가 이루어지는데 임상의가 결과를 받기까지 수 일이 걸리는 경우가 일반적이다. 따라서, 임상의는 결과를 받기 전까지 정확한 진단 없이 광범위 항생제 처방에 의존하고 있는 실정이다.
종래 급성호흡기 감염병의 병원체를 동정하는 방법은 전통적 세포배양법, 신속배양법(Shell vial culture), 면역형광염색법, 신속항원검출법, 핵산증폭법 등이 있다. 전통적 세포배양법은 다양한 바이러스 및/또는 박테리아의 진단 및 분리가 가능하다는 이점이 있으나, 진단에 3일 내지 10일의 장기간이 소요되고, 면역형광염색의 추가 방법이 요구되며, 숙련자에 의해 이루어지고, 배양이 불가능한 바이러스 또는 박테리아가 존재하여 진단에 한계가 있다. 또한, 검사자가 감염될 위험이 존재한다. 신속 배양법은 배양이 잘 되지 않는 바이러스 진단에 유용하고, 비숙련자도 쉽게 세포변성효과를 확인할 수 있으나, 진단에 24 시간 내지 72시간이 소요되고, 배양이 불가능한 바이러스 또는 박테리아가 존재하여 진단에 한계가 있다. 또한, 검사자가 감염될 위험이 존재한다. 최근에 분자생물학적 방법인 다중 중합효소 연쇄반응(Multiplex PCR)로 호흡기 병원체를 동정할 수 있는 방법들이 개발되었다. 다중 PCR은 한쌍 이상의 프라이머(primer) 조합을 이용하여 여러 개의 유전자를 동시에 증폭하는 방식이다. 하지만, 감별 및 진단할 수 있는 개수에 한계가 있고, 진단에 약 5 시간 이상이 소요되는 점에서, 현장진단에 적용하기에는 한계점이 존재한다.
따라서, 의료 현장에서 다양한 병원체를 현장에서 다중 진단하기 위하여, 표적 물질의 존재 여부를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 검출용 시스템에 대한 연구가 필요한 실정이다.
일 양상은 하이드로겔의 표면 또는 내부에 표적 물질의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브 또는 항체가 고정된 기판을 포함하는 표적 물질의 다중 검출을 위한 키트에 관한 것이다.
다른 양상은 개체의 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및 하이드로겔의 표면 또는 내부에 표적 물질의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브 또는 항체가 고정된 기판에, 상기 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 물질을 다중 검출하는 방법에 관한 것이다.
일 양상은 하이드로겔의 표면 또는 내부에 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브 또는 항체가 고정된 기판; 및 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 표적 물질의 다중 검출을 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 등온증폭 방법을 이용함으로써 실험실 내의 환경이 아니더라도 현장에서 특정 유전자의 검출이 가능한 바 보다 신속하고 간편하게 표적 물질을 검출할 수 있다. 또한, 상기 기판에 2개 이상의 프로브 또는 항체를 포함함으로써 서로 다른 표적 물질을 동시에 검출할 수 있다. 상기 항체는 예를 들어, 안티 합텐(anti-hapten)일 수 있다. 또한, 상기 표적 물질 검출 키트는 소형화 진단칩, 예를 들면, 랩 온 어 칩(lab on a chip)의 형태인 것일 수 있다.
본 명세서 내 용어, "등온증폭"이란 일정한 반응 온도 조건하에서 목적으로 삼는 핵산을 증폭시키는 방법을 의미한다. 기존의 PCR 방법이 변성(denaturation), 접합(annealing), 신장(extension)의 단계를 거치면서 온도의 변화를 주어야 하는 반면, 등온증폭법은 일정한 온도에서 접합 및 신장이 가능하다는 이점이 있다. 이는 기존의 PCR에서 사용되는 Taq. DNA 중합효소 대신 Bst. DNA 중합효소를 사용함으로써 가능하게 되었다. Bst. DNA 중합효소는 일반 PCR의 Taq. DNA 중합효소와는 달리 5'
3' 엑소뉴클레아제(exonuclease)의 성격을 가지고 있어 DNA의 이중나선 구조를 열에 의한 변성을 거치지 않고 Tm 값에 가까운 접합 온도에서 접합 및 신장이 수행된다. 고리매개등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 먼저 내부 프라이머가 표적 핵산에 결합하여 신장되고, 이어 그 바깥쪽으로 외부 프라이머가 결합되어 신장되면서 가닥 변이(strand displacement)가 발생하며 먼저 형성된 가닥은 떨어져 나오게 된다. 떨어져 나온 단일 가닥의 5'말단에서부터 루프(loop) 구조가 형성되며 이는 3'말단에서도 같은 과정이 반복되고 루프 구조가 신장되게 된다. 상기 등온증폭을 수행하기 위해서는 증폭시킬 유전자의 위치를 인식하도록 특별히 고안된 4개 내지 6개의 프라이머를 사용하게 되는데 이는 일반 PCR이 2개의 위치를 인식하는 것과 비교했을 때, 표적 핵산에 대한 특이성이 매우 높아짐을 의미한다. 상기 프라이머는 내부 프라이머 세트, 외부 프라이머 세트 및/또는 루프 프라이머 세트인 것일 수 있다.
등온증폭법은 HAD (Helicase-Dependent Amplification), RPA (Recombinase Polymerase Amplification), RCA (Rolling Circle Amplification), LAMP (Loop mediated isothermal amplification), NASBA (Nucleic Acid-Sequence-Based Amplification), TMA (Transcription Mediated Amplification), SMART (Signal Mediated Amplification of RNA Technology), SDA (Strand Displacement Amplification), IMDA (Isothermal Multiple Displacement Amplification), SPIA (Single Primer Isothermal Amplification), HDA (Helicase-Dependent Amplification) 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브 또는 항체는 상기 하이드로겔의 표면 또는 내부에 3차원으로 고정된 것일 수 있다. 상기 핵산 프로브 또는 항체가 상기 하이드로겔의 표면 또는 내부에 고정됨으로써 프로브 또는 항체 간에 교차 반응이나 간섭 반응이 발생하지 않는바 다중 진단에 용이하다는 이점이 있다. 상기 프로브는 표적 핵산의 정방향 내부 프라이머(Forward inner primer, FIP) 세트 또는 역방향 내부 프라이머(Backward inner primer, BIP) 세트인 것일 수 있다. 상기 외부 프라이머 세트는 내부 프라이머 세트보다 표적 핵산의 양 말단 쪽에 가까운 서열과 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있으며 상기 내부 프라이머 세트는 외부 프라이머 세트 보다 표적 핵산의 중심에 가까운 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 핵산 프로브는 5' 말단에 하이드로겔의 표면 또는 내부와 결합할 수 있는 링커가 결합된 것일 수 있다. 또한 다른 구체예에서, 상기 정방향 내부 프라이머 및/또는 역방향 내부 프라이머의 5' 말단에 하이드로겔의 표면 또는 내부와 결합할 수 있는 링커가 결합된 것일 수 있다. 상기 링커는 예를 들어, 아크릴디트, 싸이올기 또는 이의 유도체를 포함한 화합물 등 일 수 있다. 상기 링커는 하이드로겔과 공유 결합에 의해 하이드로겔의 표면 또는 내부와 결합하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 핵산 정방향 내부 프라이머 및/또는 역방향 내부 프라이머는 5' 말단에 표지 물질이 결합될 수 있으며, 상기 표지 물질은 리포터(reporter) 또는 소광자(quencher)인 것일 수 있다.
상기 리포터는 예를 들어, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지 닐 (fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌 (thiadicarbocyanine) 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 또한, 상기 소광자는 예를 들어, 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처 (Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 프로브의 5' 말단에 표지 물질이 결합되지 않은 경우, 상기 키트는 이중가닥 형광 염료를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 염료는 DNA에 킬레이팅(chelating)되는 것일 수 있다. 상기 형광 염료는 예를 들어, SYBR green일 수 있다. 또한, 상기 형광 염료는 이중가닥 DNA에 킬레이팅 되기 전에는 형광신호를 거의 나타내지 않지만, 이중가닥 DNA에 킬레이팅된 후에는 형광신호가 크게 증가함으로써 표적 물질을 검출할 수 있다.
또한 하이드로겔의 표면 또는 내부에 항체가 고정된 경우 상기 항체에 표적 핵산의 등온증폭 산물; 및 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 복합체를 형성할 수 있다. 상기 하이드로겔의 표면 또는 내부에는 1 이상의 항체가 고정된 것일 수 있다. 상기 항체는 예를 들어, 스트렙타비딘, 항-디곡시게닌, 항-탐라, 항-텍사스레드, 안티-합텐 등인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 항원을 이용하여 항원-항체 복합체를 형성하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 하이드로겔의 표면 또는 내부에 안티-합텐이 고정된 경우, 상기 안티-합텐에 특이적으로 결합할 수 있는 합텐을 프라이머의 5'말단에 결합하여 안티-합텐과 합텐-프라이머의 항원-항체 복합체를 형성하는 것일 수 있다. 이때, 상기 5'합텐-프라이머는 등온증폭 반응에 참여하고 5'합텐-프라이머가 포함된 등온증폭 산물이 하이드로겔의 표면 또는 내부에 고정된 안티-합텐에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다(도 2).
다른 구체예에서, 상기 하이드로겔의 표면 또는 내부에 스트렙타비딘이 고정된 경우, 상기 스트렙타비딘과 이에 특이적으로 결합할 수 있는 비오틴이 스트렙타비딘-비오틴 복합체를 형성하는 것일 수 있다. 구체적으로, 5' 말단에 비오틴이 결합된 정방향 내부 프라이머 또는 역방향 내부 프라이머; 및 상기 외부 프라이머로 등온증폭된 산물과 스트렙타비딘이 복합체를 형성하는 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 하이드로겔의 표면 또는 내부에 핵산 프로브가 고정된 경우 상기 프로브에 표적 핵산의 등온증폭 산물; 및 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 프로브가 복합체를 형성할 수 있다. 상기 하이드로겔의 표면 또는 내부에는 핵산 프로브가 1 이상 고정된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산 프로브에 표적 핵산의 등온증폭 산물이 상보적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔의 표면 또는 내부에 아크릴디트가 결합된 프라이머 또는 아크릴디트가 결합된 핵산 프로브가 결합된 경우, 상기 프라이머 또는 프로브에 상보적으로 결합할 수 있는 표적 핵산의 등온증폭 산물이 결합할 수 있다. 이후, 상기 프라이머 또는 프로브와 결합한 표적 핵산의 등온증폭 산물의 등온증폭 반응을 추가적으로 수행할 수 있다(도 3a). 도 3b는 도 3a를 구체화한 것으로서, 하이드로겔의 표면 또는 내부에 고정되고 말단에 링커가 결합된 정방향 내부 프라이머 또는 프로브와, 등온증폭용 조성물에 포함되고 말단에 형광물질이 결합된 역방향 내부 프라이머를 이용한 검출 방법을 나타낸다. 도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, 일 구체예에 따른 키트는 정방향 내부 프라이머 또는 프로브의 말단에 하이드로겔의 표면 또는 내부와 결합할 수 있는 링커가 결합되어 있고, 역방향 내부 프라이머에 형광 표지 물질이 결합되어 있어 표적 물질의 등온증폭 산물이 상기 프라이머와 결합함으로써 표적 물질을 특이적으로 검출할 수 있다. 이때, 상기 역방향 내부 프라이머는 등옥증폭용 조성물에 포함된 것으로서, 등온증폭반응에 참여한 등온증폭산물이 하이드로겔에 고정된 정방향 내부 프라이머 또는 프로브와 상보적으로 결합함으로써 표적 물질을 특이적으로 검출할 수 있다.
상기한 바와 같이, 하이드로겔의 표면 또는 내부에 고정된 1 이상의 항체 또는 핵산 프로브에 등온증폭 산물이 결합함으로써 여러 개의 표적 물질을 동시에 검출할 수 있다. 구체적으로, 하이드로겔의 표면 또는 내부에 1 이상의 박테리아 또는 바이러스 핵산에 특이적으로 결합하는 핵산 프라이머, 프로브 또는 항체가 고정되어 있어, 상기 프라이머, 프로브 또는 항체에 등온증폭 산물이 결합함으로써 하이드로겔의 위치마다 특이적인 형광 발현을 모니터링 함으로써 표적 물질을 동시에 다중으로 검출할 수 있다.
상기 하이드로겔은 PEG (polyehthylene glycol), PEGDA (Poly ethylene glycol diacrylate), PEGDMA (Poly ethylene glycol dimetacrylate), 광개시제(photoinitiator) 또는 이의 조합인 것일 수 있다. 상기 광개시제는 예를 들어, 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논(2-Hydroxy-2-methylpropiophenone) 또는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤졸포스페이트(Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphate)인 것일 수 있다. 또한, 상기 하이드로겔에 스트렙타비딘, 항-디곡시게닌, 항-TAMRA, 항-텍사스레드, 및 그라핀(graphene)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이 추가로 포함될 수 있다. 상기 스트렙타비딘은 그 자체 또는 비드에 코팅된 것일 수 있다. 하이드로겔에 스트렙타비딘이 코팅된 비드를 포함하는 경우 겔의 포어(pore) 사이즈를 증가시킬 수 있다. 일반적으로 등온증폭법은 기존 PCR 방법보다 반응시 프라이머의 농도가 10 내지 1,000배 정도 높다. 증폭산물을 검출하기 위한 형광표지물질은 DNA 이중 가닥에 킬레이팅(chelating)한 후 형광을 띄지만, 비일반적으로는 단일 가닥의 농도가 높을 경우에 형광을 띄기도 한다. 따라서, 상기 그라핀은 등온증폭 산물의 형광 검출에 위양성을 감소시키기 위해 추가될 수 있다. 상기 그라핀은 예를 들어, 하이드로겔에 첨가되거나 또는 스트렙타비딘, 항-디곡시게닌, 항-TAMRA 또는 항-텍사스레드가 추가된 하이드로겔에 추가로 첨가될 수 있다. 이때 상기 그라핀은 단일 가닥과 결합하여 형광표지물질과 킬레이팅 하기 어렵고, 단일 가닥과 결합된 형광표지물질은 그라핀에 의해 형광이 ??칭(quenching)될 수 있다. 또한, 이중 가닥은 그라핀과 결합하지 않아 형광 염료와 킬레이팅 할 수 있는바 프라이머에 의한 형광 백그라운드를 제거할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 표적 물질은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 폐렴미코플라스마(Mycoplasma pneumoniae), 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumoniae), 메타누모바이러스(Metapneumovirus), 코로나바이러스 229E(Coronavirus 229E), 코로나바이러스 NL63(Coronavirus NL63) 및 코로나바이러스 OC43(Coronavirus OC43)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
상기한 바와 같이, 일 양상에 따른 키트는 하이드로겔의 표면 또는 내부에 핵산 프로브 또는 항체가 고정되어 있어 등온증폭 산물과 특이적으로 결합함으로써 여러 개의 표적 물질을 동시에 검출할 수 있다. 이때, 정방향 내부 프라이머 또는 역방향 내부 프라이머가 형광 염료에 결합되어 있거나, 이중 가닥 DNA에 결합 가능한 형광 염료가 변위(displacement)함으로써 형광 신호를 발생할 수 있으며 방출된 형광을 모니터링 함으로써 등온증폭 산물을 검출할 수 있다.
다른 양상은 개체의 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 하이드로겔의 표면 또는 내부에 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브 또는 항체가 고정된 기판에, 상기 시료를 접촉시키는 단계; 및 등온증폭용 조성물을 첨가하여 등온증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 표적 물질을 다중 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 의해 표적 물질을 동시에 다중으로 검출함으로써 개체의 바이러스 및/또는 박테리아의 감염 여부를 신속하게 진단할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 방법은 개체의 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계를 포함한다. 상기 개체는 급성호흡기 감염병을 검출하기 위한 대상이 되며, 예를 들어 급성호흡기 감염병의 가능성을 예측하기 위한 대상, 급성호흡기 감염병의 상태를 진단하기 위한 대상, 급성호흡기 감염병의 예후 예측을 판단하기 위한 대상, 급성호흡기 감염병의 예방 또는 치료용 약제의 투여량을 결정하기 위한 대상, 급성호흡기 감염병의 진행에 따른 치료 방법을 결정하기 위한 대상 등을 의미한다. 상기 개체는 척추동물인 것일 수 있고, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등 인 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, 포유동물인 것일 수 있고, 예를 들면 인간(Homo sapiens)일 수 있으며, 한국인일 수 있다. 상기 시료는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 방법은 하이드로겔의 표면 또는 내부에 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 항체가 고정된 기판에, 상기 시료를 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 기판의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
일 구체예에서, 상기 방법은 등온증폭용 조성물을 첨가하여 등온증폭 반응을 수행하는 단계를 포함한다. 상기 등온증폭용 조성물은 내부 프라이머 세트 및 외부 프라이머 세트를 포함한다. 상기 내부 프라이머 세트 및 외부 프라이머 세트의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 또한, 상기 조성물은 등온증폭 반응을 수행하기 위한 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼를 추가로 포함할 수 있다. 상기 등온증폭 반응은 30 내지 75℃에서 20 내지 120분 동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 등온증폭 반응은 예를 들어 30 내지 75℃, 30 내지 70℃, 30 내지 65℃, 50 내지 75℃ 또는 55 내지 70℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 등온증폭 반응은 예를 들어 20 내지 120분, 20 내지 100분, 30 내지 80분, 30 내지 60분, 50 내지 120분, 50 내지 100분 또는 50 내지 80분 동안 수행될 수 있다. 이때, 반응 온도가 상기 범위 미만인 경우 Bst 중합효소가 충분히 활성화되지 못할 뿐만 아니라 프로브 및 프라이머가 핵산에 비정상적으로 결합한다는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우 Bst 중합효소가 충분히 활성화되지 못할 뿐만 아니라 프로브 및 프라이머가 핵산에 결합하지 못하게 되는 문제점이 있다. 또한, 반응 시간이 상기 범위 미만인 경우 증폭 반응이 충분히 일어나지 않아 위음성 결과를 나타낼 수 있다는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우 비특이적인 증폭 반응이 일어나 위양성 결과를 나타낼 수 있다는 문제점이 있다. 상기와 같은 등온증폭반응을 통해 증폭된 등온증폭 산물과 결합된 하이드로겔에 고정된 프로브는 등온증폭용 조성물 내의 형광표지물질이 결합된 내부 프라이머 세트 및 외부 프라이머 세트와 상보적으로 결합할 수 있다. 이때 상기 형광표지물질에서 방출된 형광 신호를 측정함으로써 표적 물질을 검출할 수 있다. 일 실시예에서는, 내부 프라이머에 형광염료를 결합하여 등온증폭 반응을 수행하여 형광도를 측정하였고 반응 후 UV 하에서 형광현미경을 통하여 형광 검출 여부를 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 방법에 따라 여러 개의 표적 물질을 동시에 검출할 수 있으므로 현장에서 바이러스 및/또는 박테리아의 감염 여부를 신속하게 진단할 수 있다.
일 구체예에 따른 키트는 기판 상에, 하이드로겔의 표면 또는 내부에 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 항체가 고정 되어 있는 바 프로브 또는 항체 간에 교차 반응이나 간섭 반응 없이 여러 개의 표적 물질을 동시에 검출할 수 있다. 또한, 등온증폭법을 이용함으로써 현장에서 신속하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라 민감도와 특이도가 우수한 진단검사 시스템을 구축할 수 있다.
도 1은 등온증폭산물과 특이적으로 결합하는 핵산을 포함하는 3차원 겔을 이용한 표적 물질 검출 키트의 일 모식도이다.
도 2는 표적 물질 검출 키트의 동작 원리를 나타내는 일 모식도로서, 안티 헵텐이 고정된 하이드로겔을 이용한 검출 방법을 나타낸다.
도 3a는 표적 물질 검출 키트의 동작 원리를 나타내는 일 모식도로서, 핵산 프라이머 또는 프로브가 결합된 하이드로겔을 이용한 검출 방법을 나타낸다.
도 3b는 도 3a를 구체화한 것으로서, 하이드로겔의 표면 또는 내부에 고정되고 말단에 링커가 결합된 정방향 내부 프라이머 또는 프로브와, 등온증폭용 조성물에 포함되고 말단에 형광물질이 결합된 역방향 내부 프라이머를 이용한 검출 방법을 나타낸다.
도 4a는 각각 스트렙타비딘, 항-디곡시게닌, 항-텍사스레드 및 항-TAMRA가 고정된 기판을 나타낸 그림이다.
도 4b는 하이드로겔에 아크릴디트 정방향 내부 프라이머가 결합된 기판을 나타낸 그림이다.
도 5는 스트렙타비딘이 고정된 하이드로겔에서 비오틴-정방향 내부 프라이머, FAM-역방향 내부 프라이머 및 외부 프라이머를 이용하여 등온증폭하고 형광 분석한 결과이다.
도 6은 아크릴디트-핵산 프라이머가 고정된 하이드로겔에서 정방향 내부 프라이머, FAM-역방향 내부 프라이머 및 외부 프라이머를 이용하여 등온증폭하고 형광 분석한 결과이다.
도 2는 표적 물질 검출 키트의 동작 원리를 나타내는 일 모식도로서, 안티 헵텐이 고정된 하이드로겔을 이용한 검출 방법을 나타낸다.
도 3a는 표적 물질 검출 키트의 동작 원리를 나타내는 일 모식도로서, 핵산 프라이머 또는 프로브가 결합된 하이드로겔을 이용한 검출 방법을 나타낸다.
도 3b는 도 3a를 구체화한 것으로서, 하이드로겔의 표면 또는 내부에 고정되고 말단에 링커가 결합된 정방향 내부 프라이머 또는 프로브와, 등온증폭용 조성물에 포함되고 말단에 형광물질이 결합된 역방향 내부 프라이머를 이용한 검출 방법을 나타낸다.
도 4a는 각각 스트렙타비딘, 항-디곡시게닌, 항-텍사스레드 및 항-TAMRA가 고정된 기판을 나타낸 그림이다.
도 4b는 하이드로겔에 아크릴디트 정방향 내부 프라이머가 결합된 기판을 나타낸 그림이다.
도 5는 스트렙타비딘이 고정된 하이드로겔에서 비오틴-정방향 내부 프라이머, FAM-역방향 내부 프라이머 및 외부 프라이머를 이용하여 등온증폭하고 형광 분석한 결과이다.
도 6은 아크릴디트-핵산 프라이머가 고정된 하이드로겔에서 정방향 내부 프라이머, FAM-역방향 내부 프라이머 및 외부 프라이머를 이용하여 등온증폭하고 형광 분석한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 표적 물질 검출 키트의 제작
1-1. 프라이머 세트의 제작
각 박테리아 및 바이러스 유전체에 대한 등온증폭 반응을 위한 프라이머 세트는 Primer Explore(http://primerexplorer.jp/e/index.html)를 사용하여 제작하였으며, 프라이머의 염기서열은 하기 표 1과 같다.
| 표적물질/프라이머 | 정방향 외부 프라이머(Forward outer primer, FO) | 정방향 내부 프라이머(Forward inner primer, FIP) | 역방향 외부 프라이머(Backward outer primer, BO) | 역방향 내부 프라이머(Backward inner primer, BIP) |
| Streptococcus pneumoniae | TCAGACAGAGTGGAAGCA | CCTGTTACAACTCGGGCACCGATTTTGGACAATACAGAAGTGAA | GCAACTACATTGTCACGTAA | AAGGTGGATATGGTAGAGGACTTGAGTTGTATAGGAAATCGGCAA |
| Haemophilus influenzae | CTCATTTAGGAGAAATCTAATGAAC | GCATCGTTGTTAGAGGAACTACAAGAAATCATTATTAGTTGCAGGTTCTG | GTGATGTCGTATTTATCAAAACC | AGGCAATGGTGCTGCTCAAAGTTGTAACGTTGTTGAAGATCAG |
| Mycoplasma pneumoniae | GCTAGAGTTTGACTGTACCATT | CGGATAACGCTTGCGACCTATATAAGTGACGACTAACTATGTGC | AAAACTCCCTACCACACTC | CGCAGGCGGATTGAAAAGTCTTTCCAATGCATACAACTGT |
| Chlamydophila pneumoniae | AATGAACTACCAAACGTTTCT | CATTCCCATAAAGCTCCACGAGATGGAGTTGTTGAACTCTACAC | CTTGGGTTTGTTTACAGAGAA | CGGTTGTGCAACTTTGGGAGGTTACAGATCACATTAAGTTCTTCA |
| Metapneumovirus | TTAAGAATGCCCTCAAAACG | CTTTCAGCTCTCTCACTGCAGTAGCAGTATCTACATTGGGGA | TCTGTTGAATTGACTGAAGC | TGTGAGCAAGAATTTAACTCGTGCCGGCCATTTTTAGGTCATC |
| Coronavirus 229E | AGAAAATGTATTTGCTGTTGAGA | CCTCACAACACCATCTACAACAGATTGGTGGTTATATACCCTCCG | AAACATCTGAGGAAAAACCTT | GTTGCTTAATTGCTTATGGTCTGTTATCACCTCTCCCAGTACC |
| Coronavirus OC43 | ACAATGTATGTTAGGCCGAT | GCCAAAGAATAGCCAGTACCTAGTTAGGACTATCATACTCTGACGG | ACATAAACAGCAAAACCACTA | AGATTTGCCAGCTTATATGACTGTTATCGCTTATCCTGTCAAGAA |
| Coronavirus NL63 | TTCCACACTAGTGGACGG | CCAGTTGAAGATTTAAGACCAGGTACTAGACTTTATCAACCACTCCG | CCAAAGAATTAGCACTGAAGTT | TAATGCCACTGGTTCTGATGTTAAGTAACGCATAACATCAACAAC |
1-2. 표적 물질 검출 키트의 제작
PBS를 포함하는 버퍼에, 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트(Poly(ethyleneglycol)diacrylate) 및 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논(2-Hydroxy-2-methylpropiophenone)이 각각 0.6 g/㎖ 및 0.01 g/㎖이 되도록 증류수를 혼합하고 60℃에서 약 30분 동안 용해시켜 투명한 제1 겔 조성물 용액을 제조하였다.
이어서, 증류수에 등온증폭산물과 특이적으로 결합하는 핵산 프로브 10 μM이 용해된 용액을 제1 겔 조성물과 1:10의 비율로 혼합한 후 약 5초 동안 볼텍싱하여 제2 겔 조성물 용액을 제조하였다. 이때, 상기 프로브는 스트렙타비딘 또는 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumonia)에 대한 아크릴티드-정방향 내부 프라이머를 사용하였다. 상온 및 오염되지 않은 공간에서, 상기 제2 겔 조성물 용액을 96 웰 플레이트의 각 웰에 1 ㎛ 간격으로 0.5 ㎕씩 분주하고 UV를 이용하여 겔화 시켰다. 이를 통해 표적 물질에 대한 등온증폭산물과 특이적으로 결합하는 핵산이 고정 또는 결합된 겔 스팟이 부착된 표적 물질 검출 키트를 제작하였다.
실시예 2. 급성호흡기 감염병을 유발하는 바이러스 및 박테리아의 검출
클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumonia) Omp A gene DNA를 (주)바이오니아에서 합성하여 주형으로 사용하였다. 상기 실시예 1에서 제작한 표적 물질 검출 키트에 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumonia)에 대한 등온증폭 조성물을 첨가하여 60℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 세척 버퍼로 세척하여 형광을 분석하였다. 스트렙타비딘이 고정된 하이드로겔이 부착된 키트를 사용할 경우, 정방향 외부 프라이머, 비오틴-정방향 내부 프라이머, 역방향 외부 프라이머, FITC-역방향 외부 프라이머, 역방향 내부 프라이머, dNTP, Bst 폴리머라아제 및 버퍼를 등온증폭 조성물로 사용하였다. 또한, 상기 아크릴디트-정방향 내부 프라이머가 고정된 하이드로겔이 부착된 키트를 사용한 경우, 정방향 외부 프라이머, 정방향 내부 프라이머, 역방향 외부 프라이머, FITC-역방향 외부 프라이머, 역방향 내부 프라이머, dNTP, Bst 폴리머라제 및 버퍼를 등온증폭 조성물로 사용하였다.
도 5는 스트렙타비딘을 겔에 고정한 후 등온증폭하여 형광 분석한 결과이고, 도 6은 Acrydite-핵산 프로브를 겔에 결합한 후 등온 증폭하여 형광 분석한 결과이다. Positive는 표적 물질 포함 군, Negative는 표적 물질 미포함 군, w/o dntp는 뉴클레오사이드 삼인산 미포함 군, Non-target probe는 표적 물질이 아닌 다른 물질에 대한 핵산 프로브가 하이드로겔에 고정된 군, Control은 아무 처리 하지 않은 하이드로겔을 의미한다.
도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이 표적 물질이 존재할 때, 표적 물질에 대한 핵산 프로브가 고정된 겔에서만 형광이 검출되어 감별 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
Claims (14)
- 하이드로겔의 표면 또는 내부에 제1 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브 또는 항체, 및 제2 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브 또는 항체가 고정된 기판; 및 상기 제1 또는 제2 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 표적 물질의 다중 검출을 위한 키트로서,
상기 제1 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 항체와 제2 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 항체는 상기 기판의 분리된 구획에 고정되고,
상기 표적 물질은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 폐렴미코플라스마(Mycoplasma pneumoniae), 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumoniae), 메타누모바이러스(Metapneumovirus), 코로나바이러스 229E(Coronavirus 229E), 코로나바이러스 NL63(Coronavirus NL63) 및 코로나바이러스 OC43(Coronavirus OC43)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상이며,
상기 제1 또는 제2 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 4, 서열번호 5 내지 8, 서열번호 9 내지 12, 서열번호 13 내지 16, 서열번호 17 내지 20, 서열번호 21 내지 24, 서열번호 25 내지 28 또는 서열번호 29 내지 32인 것인 키트. - 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 프로브는 표적 핵산의 정방향 내부 프라이머(Forward inner primer, FIP), 역방향 내부 프라이머(Backward inner primer, BIP), 표적 핵산과 상보적인 염기 서열을 가지는 DNA 또는 이들의 조합인 것인 키트.
- 청구항 2에 있어서, 상기 핵산 프로브는 5'말단에 하이드로겔과 결합할 수 있는 링커가 결합된 것인 키트.
- 청구항 2에 있어서, 상기 정방향 내부 프라이머 또는 역방향 내부 프라이머의 5' 말단에 하이드로겔과 결합할 수 있는 링커가 결합된 것인 키트.
- 청구항 2에 있어서, 상기 정방향 내부 프라이머 또는 역방향 내부 프라이머의 5' 말단에 표지 물질이 결합된 것인 키트.
- 청구항 5에 있어서, 상기 표지 물질은 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지 닐 (fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌 (thiadicarbocyanine) 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 키트.
- 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 항-디곡시게닌, 항-탐라, 항-텍사스레드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 키트.
- 청구항 7에 있어서, 상기 하이드로겔에 그라핀(graphene)이 추가로 포함된 것인 키트.
- 청구항 1에 있어서, 기판 상에 항체가 고정된 경우 상기 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 외부 프라이머 세트; 및 정방향 내부 프라이머 또는 역방향 내부 프라이머가 복합체를 형성하는 것인 키트.
- 청구항 1에 있어서, 등온증폭 반응 동안 정방향 내부 프라이머 및 역방향 내부 프라이머가 변위(displacement)함으로써 형광 신호를 발생하는 것인 키트.
- 개체에서 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계;
하이드로겔의 표면 또는 내부에 제1 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 항체, 및 제2 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 항체가 고정된 기판에, 상기 시료를 접촉시키는 단계; 및
등온증폭용 조성물을 첨가하여 등온증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 표적 물질을 다중 검출하는 방법으로서,
상기 제1 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 항체와 제2 표적 핵산의 등온증폭 산물과 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 항체는 상기 기판의 분리된 구획에 고정되고,
상기 표적 물질은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 폐렴미코플라스마(Mycoplasma pneumoniae), 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumoniae), 메타누모바이러스(Metapneumovirus), 코로나바이러스 229E(Coronavirus 229E), 코로나바이러스 NL63(Coronavirus NL63) 및 코로나바이러스 OC43(Coronavirus OC43)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상이며,
상기 제1 또는 제2 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 4, 서열번호 5 내지 8, 서열번호 9 내지 12, 서열번호 13 내지 16, 서열번호 17 내지 20, 서열번호 21 내지 24, 서열번호 25 내지 28 또는 서열번호 29 내지 32인 것인 방법. - 청구항 11에 있어서, 상기 등온증폭용 조성물은 내부 프라이머 세트 및 외부 프라이머 세트를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 11에 있어서, 등온증폭 반응은 30 내지 75℃에서 20 내지 120분 동안 수행되는 것인 방법.
- 청구항 11에 있어서, 방출된 형광 신호를 측정함으로써 표적 물질을 검출하는 것인 방법.
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