CN105907888B - 九种发热伴出疹病原体检测基因芯片的制备和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可检测九种发热伴出疹病原体基因芯片的制备和用途,其制备方法包括制备九种病原体的特异性引物和探针,制备寡核苷酸芯片,建立多重PCR体系,建立杂交体系。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别九种重要的发热伴出疹病原体,包括麻疹病毒、风疹病毒、肠道病毒71型、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、人类小DNA病毒B19、柯萨奇病毒A16型、A组β型溶血性链球菌、伤寒沙门氏菌。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势,可为发热伴出疹感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及九种发热伴出疹病原体检测基因芯片的制备和用途,属于基因芯片检测技术领域。
背景技术
发热伴出疹性疾病(rash and fever illness,RFIs)以发热(≥37.5℃)、出疹为主要临床表现伴有全身或局部皮肤或粘膜出疹,并可能伴有其他临床症状的一系列疾病总称,是我国重点监测的传染性疾病。此类症候群病原体目前主要包括风疹病毒、麻疹病毒、肠道病毒、水痘-带状疱疹病毒、人类小DNA病毒B19、登革热病毒、链球菌(猩红热)、伤寒沙门氏菌等,多数疾病在潜伏期末、临床症状不明显时已具有传染性,若旅行者在国内外旅行中受到感染,则容易造成此疾病的跨地区流行。因此,为有效监测口岸出入境人群中发热伴出疹症候群疑似患者,有必要建立用于口岸监测的发热伴出疹病原的高通量检测方法,满足出入境检验检疫机构快速筛查发热伴出疹病原的需求。
小儿发热伴出疹是世界各不同地区传染病监测的关注重点,小儿发热伴出疹不论是在发展中国家还是在发达国家中都是一个重要的公共卫生健康问题。流行病学调查显示0-1岁组、1-5岁组、5-15岁组引起发热伴出疹的病原存在显著差异。小儿发热伴出疹爆发突然,病程长,病痛对感染人群来说更是难以忍受.若能在感染早期做出正确的诊断,使用正确的治疗方法,可有效缩短病程减少感染人群的不适性和避免其他并发症的发生。因此快速、准确的早期诊断非常关键。传统的发热伴出疹病原的检测方法主要有分离培养、PCR和免疫学诊断。但分离培养耗时长,操作复杂;PCR和免疫学方法只能检测一种或几种病原体,不能完全满足检测种类多样病原体的需要。而基因芯片技术具有快速、准确、低成本等特点适用于发热伴出疹病原体的高通量检测。
发明内容
本发明的目的在于针对九种重要发热伴出疹病原体核酸高通量检测领域存在的一些不足,研制一种高通量、特异、敏感、快速的甄别检测基因芯片,能同时检测九种重要的发热伴出疹病原体,包括麻疹病毒、风疹病毒、肠道病毒71型、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、人类小DNA病毒B19、柯萨奇病毒A16型、A组β型溶血性链球菌、伤寒沙门氏菌,为发热伴出疹感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段。
为了达到上述目的,本发明九种病原体检测基因芯片,其制备方法如下:
1.步骤一:制备九种病原体的特异性引物
选择麻疹病毒的H1a基因、风疹病毒的e1基因、肠道病毒71型的vp1基因、水痘带状疱疹病毒的VZV84-7减毒株基因、登革热病毒的3’端非编码区基因、A组β型溶血性链球菌的speB基因、伤寒沙门氏菌的fviaB基因、人类小DNA病毒B19的VP1/VP2区、柯萨奇病毒A 16型的VP1区等作为检测靶基因,可以实现九种发热伴出疹病原体靶基因片段的扩增。优选九对引物序列及其对应的扩增靶标,如表1所示:
表1引物序列及对应的扩增靶标
2.步骤二:制备特异性寡核苷酸探针
根据九种发热伴出疹病原体基因序列间的比对及每种病原体种内的序列比对,在上下游引物范围内的序列相对特异区进行分型探针的设计。九种病原体特异性探针序列以及对应的靶标,如表2所示:
表2寡核苷酸探针序列及对应的靶标
3.步骤三:制备寡核苷酸芯片
一个优选的实施方案,步骤二中的各个寡核苷酸探针在点样时,用2×点样液(6×SSC,0.1%SDS)稀释至终浓度50μM。用市售的基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上,探针的点样量均为5μl。寡核苷酸芯片制备完毕后,使用前至少在室温放置干燥48小时。该芯片特征在于寡核苷酸探针阵列中同时包括腹泻病毒12条特异性探针,其探针阵列如表3所示。其中片基质控探针为20T序列,5’端bio标记、3’端NH2修饰,用来监测醛基片片基质量;阴性探针为与发热伴出疹病原体无关的植物基因序列,用来指示特异性;所有探针的点样量均为5μl,使用前至少在室温放置干燥48小时。
表3寡核苷酸探针阵列
4.步骤四:建立多重不对称PCR体系
本发明基因芯片中PCR体系的特征为2管多重不对称PCR反应体系。合适的多重不对称PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化,优选的多重PCR体系,如表4所示:
表4多重不对称PCR体系配方
优选的PCR扩增条件为:50℃逆转录30min;94℃预变性2min:94℃20s,55℃20s,72℃20s,共35个循环;72℃延伸5min。
5.步骤五:建立杂交体系
合适的杂交体系对芯片的特异性及灵敏度改善也有很大作用。通过优化得到了同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中PCR产物(A管和B管各2.5μl)与杂交液(5μl)等体积混合,优选的杂交液各成分为4×SSC,0.3%SDS,5%甲酰胺,10×Denhardt。优选的杂交条件为45℃水浴杂交1小时。优选的洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC,0.2%SDS),洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。
6.步骤六:化学发光显色
1)在芯片反应区加入10μl标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP),37℃水浴放置30min;取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05%Tween20)清洗20s,重复3次,置室温晾干。2)将显色试剂A液和B液等体积混合,每个芯片反应区立即避光加入20μl的A、B混合液,将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像,收集的芯片杂交信号使用Array Vision7.0软件分析结果。
以上制备的九种病原体甄别检测基因芯片,包括寡核苷酸芯片、PCR体系、杂交液、洗液A、洗液B、洗液C、标记液、显色液A、显色液B。
一个优选的实施方案使用市售的DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)提取核酸,提取参照相应的试剂盒说明书进行。提取的DNA/RNA溶液使用多重PCR体系按照步骤四中的扩增条件进行扩增。PCR产物与杂交液等体积混合,加入寡核苷酸芯片中,按照步骤五和步骤六的条件进行杂交和显色。
洗涤后的芯片使用便携式化学发光生物芯片成像仪进行成像,并运用分析软件判读结果。选择腺病毒7型、腺病毒55型、腺病毒14型、埃可病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒等病毒作为样本,利用上述制备的基因芯片进行检测,考察芯片的特异性。制备体外转录RNA和质粒DNA灵敏度参考品,考察芯片的最低检测限。结果:九种病原体的检测限均能达到4×1000copies/反应。
使用本发明制备的基因芯片检测发热伴出疹的病原样本。本芯片法检测发热伴出疹样本,从血标本、便样本、疱疹液和咽拭子等中提取病原核酸,与测序结果一致,经多重不对称RT-PCR扩增后与基因芯片杂交,结果显示,样本基因芯片检测符合率达到100%。表明本实验所建立的基因芯片方法可以对相应的临床样本进行准确检测。
本发明建立了一种基于化学发光成像法的基因芯片,可同时甄别九种重要的发热伴出疹病原体,包括麻疹病毒、风疹病毒、肠道病毒71型、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、人类小DNA病毒B19、柯萨奇病毒A组16型、A组β型溶血性链球菌、伤寒沙门氏菌。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势,可为发热伴出疹感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段。性能考察表明,本发明的基因芯片以对九种不同的发热伴出疹病原体进行准确甄别,特异性良好。本发明芯片对九种发热伴出疹病原体的检测灵敏度能达到4×1000copies/反应。
附图说明
图1:为本发明九种发热伴出疹病原体检测基因芯片的阵列示意图,每张芯片上分布有10个相同阵列。
图2:九种病原体检测基因芯片上每个阵列上具体排列布局。图中一个原点代表探针的一次点样,垂直方向的3个圆点为一条探针的3次重复点样。1号对应的是片基质控探针;2号对应的是阳性对照探针;3号对应的是麻疹病毒特异性探针;4号对应的是风疹病毒特异性探针;5号对应的是柯萨奇病毒A 16型特异性探针;6号对应的是肠道病毒71型特异性探针1;7号对应的是登革热病毒特异性探针;8号对应的是人类小DNA病毒B19特异性探针;9号对应的是肠道病毒71特异性探针2;10号对应的是A组β型溶血性链球菌;11号对应的是水痘带状疱疹病毒特异性探针1;12号对应的是水痘带状疱疹病毒探针3;13号对应的是伤寒沙门氏菌特异性探针;14号对应的是内标探针1;15号对应的是内标探针2;16号对应的是阴性探针;17号对应的是空白对照,18号对应的是阴性质控探针。
图3:九种病原体的芯片检测图。其中1-9依次为麻疹病毒、风疹病毒、柯萨奇病毒A16、肠道病毒71、登革热病毒、人类小DNA病毒B19、A组β型溶血性链球菌、水痘带状疱疹病毒、伤寒沙门氏菌九种发热伴出疹病原体检测芯片检测结果。
图4:基因芯片特异性检测结果图。其中1-7依次为腺病毒7型、腺病毒55型、腺病毒14型、埃可病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒的检测结果图。
图5:九种发热伴出疹病原体体外转录RNA和质粒DNA参考品的灵敏度检测结果图。其中1-5依次为麻疹病毒2×105copies、2×104copies、2×103copies、2×102copies、2×101copies体外转录RNA参考品和阴性对照检测结果;6-10依次为风疹病毒4×105copies、4×104copies、4×103copies、4×102copies、4×101copies体外转录RNA参考品和阴性对照检测结果;11-15依次为柯萨奇病毒A16型,3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×101copies体外转录RNA参考品和阴性对照检测结果;16-20依次为肠道病毒71型,3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×101copies体外转录RNA参考品和阴性对照检测结果;21-25依次为登革热病毒3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×101copies体外转录RNA参考品和阴性对照检测结果;26-30依次为人类小DNA病毒B19,3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果;31-35依次为A组β型溶血性链球菌1×105copies、1×104copies、1×103copies、1×102copies、1×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果;36-40依次为水痘带状疱疹病毒2×105copies、2×104copies、2×103copies、2×102copies、2×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果;41-45依次为伤寒沙门氏菌3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果。
图6:九种发热伴出疹病原体检测基因芯片样本检测结果图。1为麻疹病毒样本检测结果;2为风疹病毒样本检测结果;3为柯萨奇病毒A16型样本检测结果;4为肠道病毒71型样本检测结果;5为登革热病毒样本检测结果;6为人类小DNA病毒B19样本检测结果;7为A组β型溶血性链球菌样本检测结果;8为水痘带状疱疹病毒样本检测结果;9为伤寒沙门氏菌样本检测结果。
具体实施方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1:腹泻病毒甄别检测基因芯片的研制
一、引物探针设计和筛选
首先从NCBI基因数据库中下载这九种发热伴出疹病原体的靶基因序列,使用Vector NTI Advance 10(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认的参数设置对各病原体基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针、通用及特异性引物。经过筛选最终确定共18条上下游引物,将反向引物进行5’端bio标记,作为芯片使用的引物;确定11条特异性检测探针,3’端NH2修饰。
二、寡核苷酸芯片制备及探针阵列
完成探针筛选后,确定了最终的探针阵列,见附图1和附图2。1号对应的是片基质控探针;2号对应的是阳性对照探针;3号对应的是麻疹病毒特异性探针;4号对应的是风疹病毒特异性探针;5号对应的是柯萨奇病毒A 16型特异性探针;6号对应的是肠道病毒71型特异性探针1;7号对应的是登革热病毒特异性探针;8号对应的是人类小DNA病毒B19特异性探针;9号对应的是肠道病毒71特异性探针2;10号对应的是A组β型溶血性链球菌;11号对应的是水痘带状疱疹病毒特异性探针1;12号对应的是水痘带状疱疹病毒探针3;13号对应的是伤寒沙门氏菌特异性探针;14号对应的是内标探针1;15号对应的是内标探针2;16号对应的是阴性探针;17号对应的是空白对照,18号对应的是阴性质控探针。
三、多重不对称PCR体系
本发明中PCR体系的特征为两管分别为五重和四重不对称PCR体系。合适的PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化。当上下游引物终浓度为0.16μM:0.8μM,Taq酶的用量2.5U/体系,参考品的探针信号值较强,且低拷贝模板103copie/μl仍然可以检出。优选的PCR扩增条件为:50℃逆转录30min;94℃预变性2min;94℃20s,55℃20s,72℃20s,共35个循环;72℃延伸5min。
四、建立并优化杂交体系
通过优化得到同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中PCR产物与杂交液等体积混合,杂交液各成分终浓度为4×SSC,0.3%SDS,5%甲酰胺,10×Denhardt。杂交条件为45℃水浴杂交1小时。洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC,0.2%SDS),洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。
五、化学发光显色
1)在芯片反应区加入10μl标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP),37℃水浴放25min;取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05%Tween20)清洗10s,重复3次,置室温晾干。
2)将显色试剂A液和B液等体积混合,每个芯片反应区立即避光加入20μl的A、B混合液,将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像,收集的芯片杂交信号使用Array Vision7.0软件分析结果。
实施例2:九种发热伴出疹病原体检测基因芯片的特异性评价
特异性是诊断方法最重要的考核指标,本发明的基因芯片使用优化好的体系和条件,检测了腺病毒7型、腺病毒55型、腺病毒14型、埃可病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒由附图4可以看出,上述病毒检测结果都呈阴性,特异性良好。本发明检测九种发热伴出疹病原体,由附图3可以看出,九种病原体可以明显区分,说明本发明特异性良好。
实施例3:九种发热伴出疹病原体检测基因芯片灵敏度评价
构建九种病原体质粒DNA作为检测参考品,从105copies/μl梯度稀释至101copies/μl,进行芯片检测,结果见附图5。由附图5可以看出,本发明的检测限:九种病原体的检测限均能达到4×1000copies/反应。
实施例4:九种发热伴出疹病原体检测基因芯片样本检测
使用本发明制备的基因芯片,检测血标本、便样本、疱疹液和咽拭子样本中的发热伴出疹病原体。样本前处理,粪便样本经灭菌的PBS缓冲溶液(pH7.4)充分洗涤,并将洗涤液转移至干净的EP管中。4℃,3000r/min离心3min,取上清。上清液于4℃,12000r/min离心10min,收集沉淀。将收集的沉淀用PBS液充分洗涤后备用。采集的血液在36小时内将血清析出,血清样本置于-20℃冰箱冻存。采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中如维持液或生理盐水。样本中核酸的提取,使用DNA/RNA核酸提取试剂盒(磁珠法)提取样本中的发热伴出疹病原体核酸,与测序结果一致。样本核酸检测,按照说明书中的操作方法进行检测,检测结果阳性率为100%,部分检测结果见附图6。
除上述实施例外,本发明还有其他实施方式。凡是采用等同替换或等效变换形成的技术方案,均在本发明要求的保护范围。
Claims (5)
1.一种可以检测九种发热伴出疹病原体的基因芯片,用于同时检测麻疹病毒、风疹病毒、肠道病毒71、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、A组β型溶血性链球菌、伤寒沙门氏菌、人类小DNA病毒B19、柯萨奇病毒A组16,其特征是包含检测九种病原体的9对特异性引物和2对外源性内标引物;11条发热伴出疹病原体的特异性寡核苷酸探针;1条片基质控探针,一条阳性对照探针,一条空白对照探针,1条阴性对照探针,2条外源性内标探针和载体,上述探针分别分布在载体上;
表1 麻疹病毒扩增引物
表2 风疹病毒扩增引物
表3 肠道病毒71扩增引物
表4 水痘带状疱疹病毒扩增引物
表5 登革热病毒扩增引物
表6 A组β型溶血性链球菌扩增引物
表7 伤寒沙门氏菌扩增引物
表8 人类小DNA病毒B19扩增引物
表9 柯萨奇病毒A组16扩增引物
表10 外源性内标扩增引物1
表11 外源性内标扩增引物2
表12 发热伴出疹病原体特异性寡核苷酸探针序列
2.根据权利1所述的九种发热伴出疹病原体的检测基因芯片,其特征是所述的载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙稀基片、尼龙基片。
3.九种发热伴出疹病原体检测基因芯片的制备方法,包括以下步骤:
步骤一,探针和引物的设计:首先从NCBI基因数据库中下载九种病原体序列,序列下载完成后,使用Vector NTI Advance 10(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认的参数设置对各病原体基因序列进行全局比对,根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针、特异性引物;
步骤二,探针的合成,每条探针的3’端加入12个碱基T且3’末端T氨基修饰作为连接臂,以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上;质控探针除3’末端T进行氨基修饰外,5’端同时标记生物素标记;
步骤三,芯片的制备:将合成后的探针用去离子水稀释成100μM,分别取10μL探针溶液,和10μL芯片点样液混匀,使探针点样终浓度为50μM,装于384孔板,将芯片表面贴上10样品孔阵列膜,用PersonalArrayerTM16个人点样仪,将探针点制在载体上,点样过程中保持一定湿度,点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置48h,点制好的芯片常温干燥保存。
4.根据权利要求3所述的九种发热伴出疹病原体检测基因芯片的制备方法,其特征是步骤一中11条特异性寡核苷酸探针及9对引物,探针长度在31-44nt,引物长度在18-27nt。
5.根据权利要求3所述的九种发热伴出疹病原体检测基因芯片的制备方法,其特征是步骤三种所述的载体为醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
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