CN102586476B

CN102586476B - 重要肠道致病病毒检测基因芯片的制备和用途

Info

Publication number: CN102586476B
Application number: CN 201210015471
Authority: CN
Inventors: 王升启; 彭贤慧; 刘琪琦; 陈苏红; 张敏丽; 刘志红; 朱坤
Original assignee: Shenzhen Puruikang Bio Technology Co ltd; Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Shenzhen Puruikang Bio Technology Co ltd; Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2012-01-18
Filing date: 2012-01-18
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2032-01-18
Also published as: CN102586476A

Abstract

本发明涉及一种重要肠道致病病毒检测基因芯片，其制备方法包括制备特异引物，制备病毒特异性探针，制备寡核苷酸芯片，建立RT-PCR体系，建立杂交体系，制备可视化检测试剂及建立显色方法。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别10种常见肠道致病病毒，包括脊髓灰质炎病毒1、2、3型、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒B3、B4、B5型、埃可病毒30型、轮状病毒，为常见肠道致病病毒高通量、快速检测提供一种新的解决方案，可为肠道致病病毒的监测、临床诊断及治疗提供指导。

Description

重要肠道致病病毒检测基因芯片的制备和用途

技术领域

本发明涉及十种常见肠道致病病毒核酸检测可视化基因芯片的制备和用途，属基因芯片检测技术领域。

背景技术

肠道病毒(enterovirus)是一大群通过粪-口途径传播，经过消化道感染的病毒。其感染虽然始于胃肠道，但很少引起这些部位的疾病。肠道病毒属RNA病毒类的小RNA病毒科(picornaviridae)，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、致肠细胞病变人孤儿病毒(enterocytopathic human orphan virus，ECHO简称埃可病毒)及新型肠道病毒共71个血清型，肠道病毒属病毒引起的传染病。临床表现轻者只有倦怠、乏力、低热等，重者可全身感染，脑、脊髓、心、肝等重要器官受损，预后较差，并可遗留后遗症或造成死亡。本类疾病分布于世界各地，在热带和亚热带全年都有，在温带夏季多见，在温暖、潮湿、卫生条件差、人群拥挤的地区发病率高。

肠道病毒引起的疾病，临床表现复杂而多样化，同型病毒可引起不同的临床综合症，而不同型别病毒又可引起相似的临床表现。多数肠道病毒感染后不出现或只出现轻微症状，如发热或上呼吸道感染等，但有些肠道病毒感染可引起明显的临床症状，且肠道病毒引起的临床症状很少与肠道疾病有关。肠道病毒所致的疾病主要有：(1)脊髓灰质炎：85％的脊髓灰质炎由脊髓灰质炎病毒1型引起，偶有些由脊髓灰质炎病毒2、3型引起。(2)无菌性脑膜炎、脑炎和轻瘫：几乎所有的肠道病毒感染都与无菌性脑膜炎、脑炎和轻瘫有关。肠道病毒性脑膜炎几乎每年夏秋季均有发生。其中有些型别，如埃可病毒3、11、18、19、肠道病毒71型等曾引起过暴发流行。(3)疱疹性咽峡炎：主要由柯萨奇病毒A组引起，典型症状是在软腭、腭垂周围出现水疱性溃疡损伤。(4)手足口病：主要由柯萨奇病毒A组5、10、16型和肠道病毒71型引起，可导致暴发感染。(5)肋肌痛：主要由柯萨奇病毒B组1-5型引起，患者表现为突发性发热和单侧胸痛，有时扩展为双侧胸痛或腹痛。(6)心肌炎和心包炎：主要由柯萨奇病毒B组1-5型引起，散发流行于成人和儿童，但对新生儿威胁最大，在婴儿室可引起暴发流行。新生儿感染后，病毒可直接破坏心肌细胞，患儿出现发热和突然的、不明原因的心力衰竭，死亡率高。(7)急性非细菌性胃肠炎：轮状病毒呈世界性分布。A组轮状病毒感染最为常见，是引起6个月至2岁婴幼儿严重胃肠炎的主要病原体，占病毒性胃肠炎的80％以上，是导致婴幼儿死亡的主要原因之一。年长儿童和成人常呈无症状感染。轮状病毒感染的传染源是病人和无症状带毒者。病人每克粪便中排出的病毒体可达10¹⁰个，粪-口是主要的传播途径。病毒还可能通过呼吸道传播，从有呼吸道症状儿童的呼吸道分泌物中曾检出轮状病毒的存在，在动物中已证明气溶胶可传播病毒。B组轮状病毒可在成人中产生暴发流行，但至今仅在我国有过报道。C组轮状病毒对人的致病性类似A组，但发病率很低。

及时准确的甄别病毒型别是临床诊治和疾病监控的关键环节。传统的肠道病毒实验室检测方法包括：组织细胞培养法；血清学和直接检测法(包括电镜法)；间接、直接免疫荧光抗体法(IFA/DFA)；酶免疫测定(EIA)、酶活性测定(神经氨酸酶测定)；核酸扩增法(PCR)。病毒的分离培养与鉴定及血清学实验等传统实验技术，在病毒性疾病诊断中曾起着十分重要的作用。组织细胞培养仍然是发现新病毒的重要技术手段，是其他任何技术不可替代的。然而，这些技术都还存在一些无法弥补的缺陷，操作费时、费力、敏感性差、诊断效率低等。总之，传统的实验室诊断方法和目前应用的实验技术，远远不能满足临床诊断的需要，医生单凭自己的临床经验进行病毒性疾病诊断的事是经常发生的。据此，病毒性疾病的实验室诊断技术必须改革，要寻找和建立快速、特异、敏感和简便的实验技术，以适应临床工作的需要。

基因芯片技术是20世纪90年代初发展起来的一种用于基因分析的高新生物技术，广泛用于临床疾病的研究，特别是用于诊断一些微生物病原体的感染。与传统的分子生物学技术相比，基因芯片技术其突出的特点是高通量、集成化、微型化、自动化等。特别适合于对大量未知样品进行平行快速高通量的分析。病毒的基因组较简单，每种病毒只有一种核酸，但是病毒增殖速度极快，故病毒较其他微生物更具有遗传不稳定性，即变异性。国内外文献专利报道的基因芯片技术用于检测肠道病毒的方法比较少，多数报道仅针对肠道病毒属中的一种或几种。因此文献中报道的方法不能充分利用基因芯片高通量检测这一特点，国内相关的研究包括顾大勇等人仅针对诺如病毒、轮状病毒做了相关研究，史蕾等人针对诺如病毒的分型作了介绍。

荧光检测法是基因芯片的常规检测方法，即将荧光色素化合物直接或间接标记在待检核酸上，产生的荧光信号采用激光共聚焦扫描检测。该方法的缺点：荧光信号易饱和，易淬灭；存在自发荧光现象；而且最大缺点是检测仪器价格昂贵，体积笨重，从而严重限制了基因芯片的推广应用，尤其是在中小医疗机构以及现场检测的推广应用。开发成本低廉、检测方便、适合现场检测的基因芯片检测新技术势在必行。

金标银染技术(GLSS)的出现弥补了荧光检测法的不足，使基因芯片可视化检测成为可能。该技术的原理是首先用纳米金标记待检的PCR产物，然后在体系中引入银离子。小尺寸效应使纳米金具有很强的催化还原作用，可以将周围的银离子还原成银颗粒；而这些银颗粒又可以进一步催化还原周围的银离子。这种级联瀑布催化作用使得银颗粒越聚越多，紧紧包裹纳米金颗粒积聚成团状银壳，形成肉眼可见的黑色颗粒，肉眼即可观测。

基于金标银染的原理的可视化检测技术能够大幅降低生物芯片的检测成本，但是单步金标银染的检测灵敏度还不能满足分子检测领域的更高要求，进一步提高可视化的灵敏度，使可视化检测能够完全代替荧光检测，对于生物芯片技术的推广应用具有重要意义。TSA(tyramine siganal amplification，酪胺信号放大技术)是一种基于辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)催化的生物信号放大技术，是由Bobrow等人于1989年首次提出的。信号放大分子酪胺是一个酚基化合物，可以作为HRP的作用底物。TSA的原理是在HRP酶催化下，大量连接半抗原的酪胺分子沉积，这些半抗原主要是生物素、荧光素等小分子物质。1992年，Adams将应用Biotin-Tyramine的TSA系统首先引入免疫组化，用于抗原或抗体的检测。现在，TSA技术在免疫印迹、ELISA分析以及原位杂交等诸多领域都得到了广泛的应用。

本研究采用不对称RT-PCR结合可视化基因芯片检测技术研发了常见肠道致病病毒核酸检测可视化基因芯片，可对目前较常见的肠道致病病毒进行甄别，该芯片法敏感性好，特异性高，适合于多种肠道病毒的快速鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测常见肠道致病病毒核酸的可视化基因芯片，该芯片依托可视化芯片检测技术实现了检测信号的可视化，能同时检测十种肠道致病病毒，包括脊髓灰质炎病毒1、2、3型、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒B3、B4、B5型、埃可病毒30型、轮状病毒，从而实现高通量、特异、敏感、快速检测常见肠道致病病毒的目的。

为了达到上述目的，本发明开发了常见肠道致病病毒核酸检测可视化基因芯片，其制备方法如下：

1.步骤一：制备特异引物

经过比对各肠道病毒基因组，选择病毒的特异、保守片段作为检测靶基因，在保证各病毒靶基因特异性扩增的前提下兼顾其灵敏度，故将5对肠道致病病毒引物进行分管组合，经优化最终确定了3管多重RT-PCR体系。优选的5对肠道致病病毒引物及其对应的扩增靶病毒种类和分管组合情况，如表1所示：

表1肠道致病病毒引物及其对应的扩增靶病毒种类和分管组合情况

2.步骤二：制备病毒探针

本着型间保守、属间特异的原则，根据10种肠道致病病毒靶基因序列间的比对，在上下游引物范围内的序列相对特异区进行特异性探针的设计。每种靶病毒对应一条特异性寡核苷酸探针，同时设计了一条肠道病毒通用探针。优选的病毒特异性探针序列及对应的靶病毒如表2所示：

表2病毒特异性探针序列及对应的靶病毒

3.步骤三：制备寡核苷酸芯片

一个优选的实施方案，步骤二中各个寡核苷酸探针在点样时，用2×点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μM。用市售的基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，探针的点样量均为3nl。寡核苷酸芯片制备完毕后，使用前至少在室温放置干燥18小时。该芯片特征在于寡核苷酸探针阵列中包括10种肠道致病病毒特异性探针及一条肠道病毒属通用探针，如表3所示。其中片基质控探针为20T序列，5’端cy3标记、3’端NH2修饰，用来监测醛基片片基质量。

表3寡核苷酸探针阵列

片基质控

P1

P2

P3

CB3

CB4

CB5

片基质控

P1

P2

P3

CB3

CB4

CB5

片基质控

P1

P2

P3

CB3

CB4

CB5

片基质控

E30

CA16

Ro

Ev71

Ev-3P

空白对照

片基质控

E30

CA16

Ro

Ev71

Ev-3P

空白对照

片基质控

E30

CA16

Ro

Ev71

Ev-3P

空白对照

4.步骤四：建立RT-PCR体系

本发明基因芯片中RT-PCR体系的特征为多重不对称RT-PCR反应体系。合适的RT-PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、酶的用量等因素进行了优化。优选的RT-PCR体系，如表4所示：

表4RT-PCR体系配方

优选的RT-PCR扩增条件如表5所示：

表5优选的RT-PCR扩增条件

5.步骤五：建立杂交体系

合适的杂交体系对芯片的特异性及灵敏度改善也有很大作用。通过优化得到了同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中RT-PCR产物与杂交液等体积混合，优选的杂交液各成分终浓度为9×SSC，0.3％SDS，11％甲酰胺，11％50×Denhardt’s。优选的杂交条件为45℃水浴杂交1小时。优选的洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。

6.步骤六：制备可视化检测试剂及建立显色方法

①芯片每个杂交区加入按1∶1000比例稀释的Streptavidin-HRP 10μl，稀释液成分为1×PBS+0.1％BSA，37℃放置30min；取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)清洗20s，重复三次，置室温晾干。②在芯片每个杂交区加入按1∶500比例稀释的Biotin-Tyramine 10μl，稀释液成分为1×PBS+0.1％BSA，37℃放置30min；取出后用PBST洗液清洗20s，重复三次，置室温晾干。③在芯片每个杂交区加入按1∶40比例稀释的Streptavidin-Nanogold 10μl，稀释液成分：1×PBS+0.1％BSA，37℃放置30min；取出后用PBST洗液清洗20s，重复三次，用去离子水冲洗，置室温晾干。④将银染试剂A液(醋酸银的水溶液，浓度4mg/mL)和B液(氢醌的柠檬酸缓冲液溶液，浓度10mg/mL)等体积混合，每个杂交区立即避光加入30ul的A、B混合液，待芯片上出现肉眼可见的灰色或黑色圆点后停止显色，用去离子水清洗，晾干。

以上制备的常见肠道致病病毒核酸的可视化基因芯片包括寡核苷酸芯片、RT-PCR体系、杂交液、洗液A、洗液B、洗液C、Streptavidin-HRP、Biotin-Tyramine、Streptavidin-Nanogold、稀释液、PBST洗液、银染试剂A液和B液。

一个优选的实施方案使用市售的RNA提取试剂盒提取病毒RNA，如Qiagen公司的QIAamp viral RNA mini kit提取病毒RNA，提取参照相应的RNA提取试剂盒说明书进行。提取病毒RNA使用RT-PCR体系按照步骤四中的扩增条件进行扩增。RT-PCR产物与杂交液等体积混合，加入寡核苷酸芯片中，按照步骤五的杂交条件进行杂交，按照步骤五的洗涤条件进行洗涤，再按照步骤六的可视化检测方法进行显色。

显色后的芯片可以使用肉眼进行判读，也使用市售的可视化芯片扫描仪进行扫描，并运用分析软件判读结果。

本发明建立了一种基于可视化检测法的基因芯片，可以对常见的10种肠道致病病毒进行区分，包括脊髓灰质炎病毒1型、脊髓灰质炎病毒2型、脊髓灰质炎病毒3型、柯萨奇病毒B3型、柯萨奇病毒B4型、柯萨奇病毒B5型、埃可病毒30型、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、轮状病毒。性能考察表明，本发明可以准确区分10种常见肠道致病病毒，并可以对脊髓灰质炎病毒中的1、2、3型及柯萨奇病毒中的B3、B4、B5进行准确分型，特异性良好。本发明对10种肠道病毒均能够检测10²copies/体系的体外转录RNA。通过肠道病毒感染疑似病人咽拭子或粪便的检测，本发明的方法与实时荧光定量RT-PCR法具有较高的一致率。

本发明的基因芯片和相应的制备方法，具有较强的实用性。与常规培养方法比较，具有快速、准确、灵敏的优势，与免疫学方法和其他核酸检测方法相比，具有高通量、特异性高的优点。本发明的另一个突出优势是无需使用价格昂贵的荧光扫描仪，信号肉眼可见，可以实现在基层医疗机构以及现场检测中的应用。本发明的基因芯片为常见肠道致病病毒高通量、快速检测提供一种新的解决方案，可为肠道致病病毒的监测、临床诊断及治疗提供指导。

附图说明

图1：10种肠道病毒特异性扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图中M为分子量标准(从上到下条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)；1为脊髓灰质炎病毒1型，扩增产物长度260bp；2为脊髓灰质炎病毒2型，扩增产物长度260bp；3为脊髓灰质炎病毒3型，扩增产物长度260bp；4为柯萨奇病毒B3型，扩增产物长度190bp；5为柯萨奇病毒B4型，扩增产物长度190bp；6为柯萨奇病毒B5型，扩增产物长度190bp；7为埃可病毒30型，扩增产物长度190bp；8为肠道病毒71型，扩增产物长度490bp；9为轮状病毒，扩增产物长度200bp；10为柯萨奇病毒A16型，扩增产物长度330bp。

图2：重要肠道致病病毒核酸可视化检测基因芯片最终的探针阵列图。图中一个圆点代表探针的一次点样，垂直方向的3个圆点为一条探针的3次重复点样。虚线框内的彩色圆点为各肠道病毒特异性探针，最后一条为空白对照。虚线框外的红色圆点为标识列。

图3：重要肠道致病病毒核酸可视化检测基因芯片特异性评价结果图。图中1为肠道病毒71型；2为轮状病毒；3为柯萨奇病毒A16型；4为脊髓灰质炎病毒1型；5为脊髓灰质炎病毒2型；6为脊髓灰质炎病毒3型；7为柯萨奇病毒B3型；8为柯萨奇病毒B4型；9为柯萨奇病毒B5型；10为埃可病毒30型。

图4：重要肠道致病病毒核酸可视化检测基因芯片灵敏度芯片检测结果图。以肠道病毒71型和轮状病毒为例。其中图中A1-G1代表肠道病毒71型灵敏度评价结果；A2-G2代表轮状病毒灵敏度评价结果。A-G依次表示阳性对照、10⁵copies/μl、10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10¹copies/μl和阴性对照。

图5：柯萨奇病毒B5型、埃可病毒30型梯度稀释后芯片检测结果图。图中1：病毒培养液原液；2：病毒培养液10倍稀释；3：病毒培养液100倍稀释；4：病毒培养液1000倍稀释；5：病毒培养液10000倍稀释；6：病毒培养液100000倍稀释；7：病毒培养液1000000倍稀释；8：病毒培养液10000000倍稀释；9：阴性对照。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：重要肠道致病病毒核酸可视化检测基因芯片的研制

一、特异性引物设计和筛选

为了实现对10种肠道致病病毒的特异性扩增，使用经筛选的5对特异性引物分三管多重RT-PCR体系进行扩增，引物序列及对应的靶病毒信息见表1。扩增产物的琼脂糖电泳结果见附图1，由图可知，10种肠道致病病毒均被特异性扩增。

二、特异性探针的筛选

各型探针的筛选首先排除探针与呼吸道、消化道其他病毒之间的非特异性交叉，然后使用10种的病毒RNA为模板的RT-PCR产物与备选探针分别杂交，考察各病毒探针特异性。最终筛选到10条特异性探针和1条通用探针。探针序列及对应的靶病毒见表2。

三、寡核苷酸芯片制备及探针阵列

完成探针筛选后，确定了最终的探针阵列，见表3和附图2。其中阵列的第一排和第一列为片基质控，空白对照为2×点样液。

四、RT-PCR体系及扩增条件

本发明中RT-PCR体系的特征在于为多重不对称RT-PCR反应合适的RT-PCR体系。合适的RT-PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、酶的用量等因素进行了优化。体系最终确定的RT-PCR体系见表4及扩增条件见表5，此时参考品的探针灰度值较强，且低拷贝模板10³copie/μl仍然可以检出。

五、建立并优化杂交体系

通过优化得到了同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中RT-PCR产物与杂交液等体积混合，杂交液各成分终浓度为9×SSC，0.3％SDS，11％甲酰胺，11％50×Denhardt’s。杂交条件为45℃水浴杂交1小时。洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。

六、建立可视化检测方法

配制稀释液、PBST洗液，稀释液成分为1×PBS、0.1％BSA，PBST洗液成分为1×PBS、0.05％Tween20。

稀释以下原料：Streptavidin-HRP使用稀释液按1∶1000比例进行稀释；Biotin-Tyramine使用稀释液按1∶500比例进行稀释；Streptavidin-Nanogold使用稀释液按1∶40比例进行稀释。

①在芯片每个杂交区加入稀释后的Streptavidin-HRP 10μl，37℃放置30min；取出后用PBST洗液清洗20s，重复三次，置室温晾干。②在芯片每个杂交区加入稀释后的Biotin-Tyramine 10μl，37℃放置30min；取出后用PBST洗液清洗20s，重复三次，置室温晾干。③在芯片每个杂交区加入稀释后的Streptavidin-Nanogold 10μl，37℃放置30min；取出后用PBST洗液清洗20s，重复三次，用去离子水冲洗，置室温晾干。④将银染试剂A液和B液等体积混合，每个杂交区立即避光加入30ul的A、B混合液，待芯片上出现肉眼可见清晰的灰色或黑色圆点后停止显色，显色时间约为2min30s，用去离子水清洗，晾干。

使用深圳市普瑞康生物技术有限公司生产的可视化芯片扫描仪进行扫描，并用ArrayVision7.0软件分析结果。

实施例2：基因芯片阳性判定标准的确定

Cutoff值是判断基因芯片信号值是否为阳性的标准，每条分型探针分别选取非肠道病毒(即阴性毒株)、空白对照进行基因芯片杂交，通过反复的实验和数据统计，将阴性毒株和空白对照的背景统计平均值+2SD作为每条探针的Cutoff值，见表6。将各肠道致病病毒检测探针的区分能力在2.5倍以上作为该病毒阳性的判断标准。

表6各探针Cutoff值的确定

实施例3：重要肠道致病病毒核酸可视化检测基因芯片特异性评价

特异性是诊断方法最重要的考核指标，本发明使用优化好的体系和条件，检测了各型常见肠道病毒等10株，芯片检测结果见附图3。由图可以看出，利用本发明可以将10种常见肠道病毒正确区分，特异性良好。

实施例4：重要肠道致病病毒核酸可视化检测基因芯片灵敏度评价

为了评价芯片各检测探针的灵敏度，我们构建了各肠道致病病毒扩增靶基因的质粒和体外转录RNA作为参考品。以各型肠道病毒RNA为模板，使用对应的引物(下游引物为标记)进行一步法RT-PCR，产物经过纯化后使用T4DNA连接酶连接至PGM-T vector(TIANGEN)，转化感受态大肠杆菌DH5α(TIANGEN)，经测序验证重组质粒序列正确。将质粒DNA用限制性内切酶Spe I酶切进行进行线性化并回收纯化，以线性化的DNA为模板，按照

Large Scale RNA Production System-T7试剂盒(Promega)说明书的步骤进行体外转录，转录产物经酚仿抽提后，异丙醇沉淀，用无RNase酶的水溶解后定量待用，分装并于-70℃保存，作为体外转录RNA参考品。共制备了10种含有靶基因的病毒体外转录RNA参考品。每种体外转录RNA参考品梯度稀释制备灵敏度参考品。

使用肠道致病病毒灵敏度参考品对芯片的检测灵敏度进行评价，结果发现芯片对每种肠道致病病毒均能够检测到10²copies/体系的体外转录RNA，芯片的检测限为10²copies/体系体外转录RNA。以肠道病毒71型和轮状病毒为例，选择10⁵copies/μl、10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10¹copies/μl的体外转录RNA及阴、阳性对照进行芯片检测，结果见附图4。由图可以看出，芯片对每种肠道致病病毒均能够检测到10²copies/体系的体外转录RNA，芯片的检测限为10²copies/体系体外转录RNA。

柯萨奇病毒B5型和埃可病毒30型还使用了另外的方式进行灵敏度评价，病毒培养液经过10倍梯度稀释后提取RNA，使用优化好的芯片方法检测，结果当病毒经过100000倍稀释后提取的RNA，芯片检测柯萨奇病毒B5型和埃可病毒30型探针信号值仍大于相应的Cutoff值，即可以使用芯片的方法检出。相应的芯片检测结果见附图5。

除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡是采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均在本发明要求的保护范围内。

Claims

1.一种检测常见肠道致病病毒核酸的可视化基因芯片，可用于脊髓灰质炎病毒1、2、3型、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒B3、B4、B5型、埃可病毒30型、轮状病毒的检测，其制备方法包括：

1)步骤一：

制备5对肠道致病病毒引物，分别放入3管RT-PCR体系中，序列如表1所示：

表1引物序列

2)步骤二：

制备10条病毒特异性探针和1条肠道病毒通用探针，序列如表2所示：

表2探针序列

3)步骤三：

将步骤二中的各个寡核苷酸探针用6×SSC，0.1％SDS稀释至终浓度50μM，并点到空白的醛基化修饰玻片上，阵列如表3所示，其中片基质控探针为20T序列，5’端cy3标记、3’端氨基修饰，所有探针的点样量均为3nl，使用前至少在室温放置干燥18小时；

表3寡核苷酸探针阵列

片基质控片基质控片基质控片基质控片基质控片基质控片基质控片基质控 P1 P2 P3 CB3 CB4 CB5 片基质控 P1 P2 P3 CB3 CB4 CB5 片基质控 P1 P2 P3 CB3 CB4 CB5 片基质控 E30 CA16 Ro Ev71 Ev-3P 空白对照片基质控 E30 CA16 Ro Ev71 Ev-3P 空白对照片基质控 E30 CA16 Ro Ev71 Ev-3P 空白对照

4)步骤四：

制备RT-PCR体系，配方如表4所示：

表4RT-PCR体系配方

5)步骤五：

制备杂交液，其组成为9×SSC，0.3％SDS，11％甲酰胺，11％50×Denhardt’s；制备洗液A，其组成为1×SSC，0.2％SDS；制备洗液B，其组成为0.2×SSC；制备洗液C，其组成为0.1×SSC；

6)步骤六：

制备可视化检测试剂，包括Streptavidin-HRP、Biotin-Tyramine、Streptavidin-Nanogold、稀释液、PBST洗液、银染试剂A液和B液，其中稀释液组分为1×PBS+0.1％BSA，PBST洗液组分为1×PBS+0.05％Tween20，银染试剂A液组分为醋酸银的水溶液，浓度4mg/mL，银染试剂B液组分为氢醌的柠檬酸缓冲液溶液，浓度10mg/mL。