KR20080020475A - 다중-중합효소연쇄반응에 의한 성전파질환 원인균 검출을위한 신규한 유형 특이적 프라이머와 이를 이용한 검출방법 - Google Patents

다중-중합효소연쇄반응에 의한 성전파질환 원인균 검출을위한 신규한 유형 특이적 프라이머와 이를 이용한 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다양한 성전파질환 원인균에 특이적(specific) 염기서열의 DNA 단편과 결합하여 PCR 반응을 통하여 원인균 DNA를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 및 이를 이용하여 샘플 내에 존재하는 성전파질환 원인균 DNA를 검출 또는 증폭시킬 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에서 합성된 성전파질환 원인균 특이적 프라이머를 동시에 사용하면 1회의 PCR 증폭 과정을 통하여 샘플 내에 존재하는 다양한 성전파질환 원인균을 신속, 정확하게 검출할 수 있다.
성전파질환(Sexual Transmitted Diseases), 균주 특이적 프라이머(Strain Specific Primers), 다중-중합효소연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction)

Description

다중-중합효소연쇄반응에 의한 성전파질환 원인균 검출을 위한 신규한 유형 특이적 프라이머와 이를 이용한 검출방법{Novel Type-Specific Primers and Method for Detection of Sexual Transmitted Diseases by Multiplex-PCR}
본 발명은 성전파성 질환(sexually transmitted disease, "STD")의 원인균 진단에 관한 것으로, 보다 상세하게는 성전파질환과 밀접한 관련이 있는 다양한 원인균을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 이를 이용한 각종 성전파성 질환 원인균의 검출 방법에 관한 것이다.
성전파성 질환(sexually transmitted disease, STD)이란 성행위로 인해 전파되는 질병을 통틀어 이르는 말로서 원인 별로 살펴보면 (1) 성전파질환, (2) 질염, (3) 성기궤양 및 (4) 비-임균성 요도염 (nongonorrheal urethritis, NGU) 원인균 가운데 몇몇 원인균들이 95% 이상으로 절대 다수를 차지하고 있다. 여기에서 비-임균성 요도염이란 남성에서 요도염이 발생하였으나 임균 (Neisseria gonorrhoeae)이 확인되지 않는 경우를 가리키며 비-임균성 요도염의 가장 흔한 원인균은 클라마이 디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)이며, 그 외에 유레아플라스마 유레아라이티쿰(Ureaplasma urealyticum)과 마이코플라스마 제니탈리움 (Mycoplasma genitalium)도 중요 원인균으로 지적되고 있다. 즉 임균과 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움의 4가지 종류의 세균이 STD 원인의 절대 다수를 차지한다. 이들 세균은 모두 공통적으로 남성에서 요도염 (anterior urethritis)의 중요 원인이 되며 부고환염 및 전립선염을 합병할 수 있으며, 불임의 중요한 원인이 된다. 또한 여성에서는 자궁경부염 (cervicitis)과 골반염증성질환 (pelvic inflammatory diseases)의 주원인이 되며, 나팔관 폐쇄 (fallopian tube occlusion)를 일으킴으로써 불임과 이소성 임신 (ectopic pregnancy) 등의 합병증을 유발할 수 있다.
구미의 경우 오늘날 클라마이디아 감염이 가장 흔하며, 국내에서도 최근에는 임질은 줄어드는 대신 클라마이디아 감염과 비-임균성 요도염이 늘어나는 추세이다. STD는 다른 질환과 달리 무증상으로 잠복되어 증세가 악화되는 경우가 많고, 재감염이 용이하므로 상기 STD의 원인균을 조기에 검출하여 무증상의 보균자도 효과적으로 진단할 수 있는 방법의 개발이 중요하다. 만약 어떤 환자에서 일단 요도염이 발견되면 그것이 임균성인지 비-임균성인지를 먼저 감별해야 하는데 그 이유는 치료 방법과 경과가 서로 다르기 때문이다. 그러나 근래에는 항균제의 오남용에 따른 세균의 변이와 혼합감염의 증가로 인해 양자의 구별이 애매한 경향이 많고, 정확한 진단을 위해서는 본 발명에서와 같은 분자유전자적 검사법이 필요하다.
임균성 요도염을 일으키는 임균(N, gonorrhoeae)은 나이세리아(Neisseria)속에 속한다. 임균의 진단은 일차적으로 그람염색 (Gram stain)에 의한다. 그람염색으로 특징적인 세포내 그람음성 쌍구균의 존재를 확인하는 것은 간편하고 정확도가 비교적 높아서 널리 사용되는 방법이다. 그러나 무증상이거나 증상이 미미한 임균성 요도염에서는 그람염색으로 판단이 애매하거나 위-음성 (false negative)으로 나오는 경우가 많다. 그람염색법을 보완하기 위해서는 임균배양을 시도한다. 임균의 배양은 여러모로 유용하고 정확한 검사 방법이지만 검사결과를 알기까지 많은 시간과 비용이 소모되는 단점이 있다.
이외 효소면역 검사법 (enzyme immunoassay: EIA)과 면역형광검사법 (immunofluorescence technique)은 임균 감염질환 진단에 있어 새로운 항원 확인방법으로 이용되고 있는데 배양검사에 비해 더 신속하게 결과를 얻을 수 있으며, 민감도 (sensitivity)와 특이도 (specificity)가 더 높은 것으로 보고되고 있으나 고비용의 단점이 있다. 비-임균성 요도염은 최근 임균성요도염이 감소하는데 대해 역으로 발병률이 증가하고 있다. 비-임균성 요도염은 단일 질환이 아니라, 여러 가지 미생물에 의해 일어날 수 있는 일종의 증후군 (syndrome)이다.
비-임균성 요도염의 원인 미생물로서 가장 중요한 것이 클라마이디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)이다. 클라마이디아 트라코마티스는 세포내 기생성(intracellular parasitism)의 생존 주기(life cycle)를 가지는 미생물로 지놈에 DNA와 RNA를 모두 갖고 있으며 모두 15가지의 혈청형이 있는데 비-임균성 요도염을 일으키는 것은 D-K형이다. 이에 의해 발병할 수 있는 인체 질환으로는 트라코마와 호흡기감염, 요도염과 자궁경부염, 부고환염, 골반염증성질환을 포함한 STD 가 있다. 최근에는 클라마이디아가 심근염을 일으킨다는 보고도 있다.
클라마이디아 트라코마티스의 확인 방법으로는 (1) 감염부위에서 채취된 가검물을 배양, 분리 확인하는 방법, (2) 감염부위의 상피세포를 직접 도말 염색하여 균을 확인하는 방법, (3) 환자의 혈청에서 항체를 분리, 확인하는 방법이 사용되어 왔으며, 최근에는 (4) 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)과 하이브리다이제이션 (hybridization) 등의 분자유전학적 기법을 이용하는 방법이 선호된다. 상기 검체를 배양, 분리하는 방법은 장시간이 소요된다는 점, 진단 민감도가 낮다는 점 등으로 인해 임상 진단 목적으로는 적합하지 못하며 감염부위의 상피세포를 직접 도말 염색하여 균을 확인하는 간편성은 좋으나, 진단 민감도가 낮다. 또한 단일클론항체에 형광물질인 FITC (fluorescein isothiocynate)가 부착된 시약을 이용하는 형광항체법은 민감도는 비교적 높으나 고비용과 전용 장비를 요한다는 단점이 있어서 제한적으로 사용되고 있다.
인간과 각종 포유류 동물에 광범위하게 존재하는 마이코플라스마와 유레아플라스마속에 속하며 비뇨생식기에 감염을 유발할 수 있는 유레아플라스마 유레아라이티쿰과 마이코플라스마 제니탈리움은 배양하기가 기술적으로 매우 어렵고, 염색이나 면역학적 방법으로도 발견하기가 어렵다. 이에 따라 PCR에 의거한 분자유전학적 검사법으로 진단하려는 것이 최근의 추세이다. 이 경우 각 균의 종에 특이한 유 전자의 DNA의 염기서열을 PCR로 증폭한 후 이를 시퀀싱 반응이나 하이브리다이제이션 등으로 확인하는 방법이 주로 이용된다. 현재까지 확인된 13종의 마이코플라스마와 2종의 유레아플라스마는 16S 리보솜 RNA(16S rRNA)의 V3의 5'방향 측 인접 부위(flanking region)와 V6의 3' 방향측 인접부위의 염기 서열이 서로 일치한다. 이에 대해 V4와 V5 부위의 약 250개의 염기 서열이나 16S-23S 리보솜 RNA 사이부위의 염기서열은 각 종별로 차이가 있다. 따라서 이를 검사하는 방법이 유효하다.
특히, 세균감염이 있을 때 그 원인균을 정확하게 파악하는 것은 정확한 진단 뿐 아니라 감염의 근원을 파악하며, 병태를 파악하고, 경과와 예후를 예측하며, 치료방침을 결정하고, 백신의 개발을 하는 데 필수적이다. 이때의 원인균 진단은 단순한 균의 속과 종 뿐 아니라 아종 (subspecies) 내지 균주 (strain)까지 파악할 수 있도록 하는 것이 중요하다. 세균감염의 원인균을 정확하게 파악하기 위해서는 검사방법은 민감도(sensitivity), 특이도 및 재현성이 100%에 가까워야 한다.
그런데, 배양검사나 면역검사 등 기존의 세균 체형 검사법으로는 이와 같은 조건을 만족시키기 힘들다. 이에 대해 세균 지놈의 유전자형, 즉 DNA 및 RNA의 염기서열을 분석하는 유전자 검사는 이론적으로 상기한 3가지 조건을 모두 만족시킬 수 있으며, PCR기법을 이용하여 임균감염과 클라마이디아 감염만을 검사하는 진단키트는 이미 상업화되어 사용되고 있다. 그러나 세균파악을 위한 유전자 검사법이 임상 진료나 기타 검사실에서 활발하게 사용되고 임상 진료에 실제 도움이 되기 위해서는 상기한 조건 외에도 추가로 갖추어야 할 조건이 많다. 즉 검사의 방법이 용이하고 해석하기도 쉽고 간편해야 하며, 신속하게 결과를 얻을 수 있어야 하고, 특 별한 고가의 장비가 필요 없이 검사할 수 있어야 하며, 검사가 자동화되어 있어서 다수의 검체를 신속하게 검사할 수 있어야 하고, 검사 비용도 저렴해야 한다. 이를 위해 PCR은 가급적 대상 세균 모두를 하나의 튜브 내에서 한번의 PCR반응으로 검사하는 멀티플렉스형의 PCR일 필요가 있으며 PCR시 각 대상 세균이 균주 수준에 까지 정확히 식별이 될 수 있도록 검사하는 유전자와 염기서열 부위가 적절하게 선택되어야 하고, 이에 맞추어 최적의 PCR 조건이 수립되어야 한다.
나아가 PCR 후 증폭된 산물이 정확하게 원하는 세균의 DNA인지를 정확하게 확인하는 검사도 중요하다. 아울러 세균의 유전자형을 정확하게 판독하여 항균제 내성이나 생물학적 침해도 등을 정확하게 예측할 수 있는 유전자검사법도 필요하다. 이를 위해 각종의 STD 원인균을 동시에 분석하고 나아가 항균제 내성 등의 정보도 함께 알 수 있는 다중-중합효소 연쇄반응 기술의 개발 필요성이 대두되었고 이에 따라 본 발명에서는 상기한 14종의 STD 원인균에 대한 PCR 방법 및 상기 14종의 원인균의 존재 여부를 분석할 수 있는 다중-중합효소연쇄반응 기술을 연구하게 되었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있도록 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 성전파성질환과 밀접한 관련이 있는 다양한 원인균을 신속하고 간단하게 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머를 사용하여 성전파성질환의 원인균을 선택적으로 검출할 수 있는 다중-중합효소연쇄반응 방법 및 위 원인균을 검출하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 프라이머를 통하여 성전파성질환 원인균의 존재 유무를 신속하게 진단할 수 있는 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 후술하는 발명의 구성 및 첨부하는 도면을 통하여 보다 분명해질 것이다.
상기와 같은 본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1 내지 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 한 조의 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 성전파성질환 관련 원인균의 DNA를 증폭하는 합성된 프라이머가 제공된다.
이때, 상기 합성된 프라이머는 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 1 프라이머); 서열번호 3과 서열번호 4로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 2 프라이머); 서열번호 5와 서열번호 6으로 구성되는 올리고 뉴클레오티 드(제 3 프라이머); 서열번호 7과 서열번호 8로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 4 프라이머); 서열번호 9와 서열번호 10으로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 5 프라이머); 서열번호 11과 서열번호 12로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 6 프라이머); 서열번호 13과 서열번호 14로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 7 프라이머 ); 서열번호 15와 서열번호 16으로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 8 프라이머); 서열번호 17과 서열번호 18로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 9 프라이머); 서열번호 19와 서열번호 20으로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 10 프라이머); 서열번호 21과 서열번호 22로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 11 프라이머); 서열번호 23과 서열번호 24로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 12 프라이머); 서열번호 25와 서열번호 26으로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 13 프라이머) 및 서열번호 27과 서열번호 28로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 14 프라이머)로 이루어진 군에서 적어도 한 조 이상 선택된다.
특히, 상기 제 1 프라이머는 Ureaplasma urealyticum DNA를 증폭시키고, 상기 제 2 프라이머는 Mycoplasma hominis DNA를 증폭시키고, 상기 제 3 프라이머는 Ureaplasma parvum DNA를 증폭시키고, 상기 제 4 프라이머는 Neisseria gonorrhea DNA를 증폭시키고, 상기 제 5 프라이머는 Mycoplasma genitalium DNA를 증폭시키고, 상기 제 6 프라이머는 Treponema pallidum DNA를 증폭시키고, 상기 제 7 프라이머는 Herpes simplex virus type 1 DNA를 증폭시키고, 상기 제 8 프라이머는 Candida albicans DNA를 증폭시키고, 상기 제 9 프라이머는 Herpes simplex virus type 2 DNA를 증폭시키고, 상기 제 10 프라이머는 Trichomonas vaginalis DNA를 증 폭시키고, 상기 제 11 프라이머는 Chlamydiae trachomatis DNA를 증폭시키고, 상기 제 12 프라이머는 Gardnerella vaginalis DNA를 증폭시키고 상기 제 13 프라이머는 Haemophilus ducreyi DNA를 증폭시키고 상기 제 14 프라이머는 human papillomavirus 6 및 11 DNA를 증폭시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 관점에서는 상기 적어도 한 조의 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 사용하고, 생물학적 샘플로부터 추출된 핵산을 표적 DNA로 하는 중합효소연쇄반응을 수행함으로써 성전파성질환 관련 원인균 DNA를 증폭하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 또 다른 관점에서는 상기 적어도 한 조의 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 사용하고 생물학적 샘플로부터 추출된 핵산을 표적 DNA로 하여 상기 표적 DNA를 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭 단계에서 증폭 산물의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는 성전파성질환 관련 원인균 DNA를 검출하는 방법이 제공된다. 이때, 상기 증폭 산물의 존재 여부는 전기영동 방법을 통하여 검출되는 것을 특징으로 한다.
더욱이, 본 발명의 또 다른 관점에서는 상기 적어도 한 조의 올리고 뉴클레오티드; dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 내열성 중합효소; 및 PCR 완충 용액을 포함하는 성전파성질환 관련 원인균 DNA 검출용 키트가 제공된다. 이때, 상기 한 조의 올리고 뉴클레오티드와 생물학적 샘플로부터 추출된 표적 DNA 사이의 특이적 결합에 의하여 얻어진 증폭 산물의 존재를 검출하기 위하여 예컨대 전기영동 장치와 같은 검출 수단이 더욱 포함될 수 있다.
본 발명에서는 성전파질환과 밀접한 관련이 있는 다수의 원인균 DNA 단편과 상보적으로 결합하여 유형 특이적 PCR 증폭 산물을 생성시킬 수 있는 총 14조의 올리고 뉴클레오티드 염기서열로 이루어진 PCR 프라이머를 합성하였다.
이와 같은 신규 PCR 프라이머의 사용은 성전파질환의 발병과 관련도가 높은 특정 원인균 DNA에 감염된 샘플을 신속하고 용이하게 검출할 수 있기 때문에 성전파질환의 조기 진단 및 예후에 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에서 합성된 프라이머는 성전파질환 원인균별 게놈과 상보적으로 결합할 수 있기 때문에 직접적으로 특정 유형의 원인균을 검출할 수 있는 프로브(probe)로 활용될 수 있다.
더욱이 본 발명에서 합성된 다수의 올리고뉴클레오티드를 동시에 프라이머로 사용하면 샘플 시료가 극미량으로 존재하더라도 1회의 PCR 과정만으로 신속하게 성전파질환 관련 원인균 DNA의 감염여부를 확인할 수 있다.
나아가 발생빈도가 높은 성전파질환을 조기에 진단함으로써, 국민건강 증진에 일익을 담당할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명자는 성전파성질환과 밀접한 관련이 있는 원인균을 검출하기 위한 방법을 연구하여, 특히 성전파성질환 원인균으로서 Neisseria gonorrhea, Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis와 질염 원인균인 Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, 성기궤양 원인균인 Herpes simplex virus type 1 & 2, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi, 자궁경부 이형성증이나 곤지름을 야기하는 원인균인 Human papillomavirus 6 및 11 및 상기 Ureaplasma urealyticum과 구별되는 Ureaplasma parvum을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 올리고 뉴클레오티드 프라이머와 상기 프라이머를 이용하여 STD 원인균을 신속 정확하게 검출, 진단할 수 있는 다중-중합효소 연쇄반응 기술을 이용한 STD 원인균 진단 키트를 고안하였는바, 본 발명을 설명하면 다음과 같다.
상기에서 설명한 바와 같이, STD 원인균은 100여종 이상이 밝혀졌으며, 특히 성전파성 질환과 밀접한 관련성이 있는 세균으로는 약 18종이 보고되고 있다. 이들을 성전파질환별로 세분화하여 살펴보면 성전파성질환(sexually transmitted diseases; STD) 원인균인 Neisseria gonorrhea(NG), Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis), 질염 원인균(Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans), 성기궤양 원인균(Herpes simplex virus type 1 & 2, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi), 자궁경부이형성증 및 곤지름 원인균인 human papillomavirus(HPV, 예를 들어 HPV-6, HPV-11) 등이 있다.
이에, 본 발명에서는 성전파성질환과 밀접한 관련이 있는 다양한 원인균을 탐지할 수 있는 프라이머를 설계하고, 상기 프라이머를 이용하여 다양한 샘플 내에 존재하고 있는 다수의 성전파질환 원인균을 검출할 수 있도록 하였다. 이를 위하여 본 발명에서는 총 100 여 가지 성전파질환 원인균의 전 서열 중 질환에 직접적으로 많은 영향을 미치고 있는 14종의 STD 원인균 DNA 서열을 기준으로 컴퓨터 프로그램을 이용하여 특이적 프라이머를 설계하였다. 상기 설계된 프라이머는 다른 컴퓨터 프로그램을 사용하여 다양한 STD 원인균에 대한 결합 능력을 확인한 후 최종적으로 14조의 프라이머를 선별하였다.
상기와 같이 합성된 STD 원인균 특이적 프라이머와 다중 중합효소연쇄반응 기술을 이용하여 STD 감염 여부를 신속 정확하게 검출할 수 있도록, 상기와 같이 구성되는 다중 중합효소연쇄반응 기술을 이용한 진단 키트를 이용하여 우선 대표적인 6종의 세균을 표적 DNA로 하여 본 발명에서 합성한 프라이머를 이용하여 single PCR을 실시하여 결과를 판독한 후 본 발명에서 확인한 14조의 STD 원인균 특이적 병용 프라이머 세트를 이용한 다중 중합효소연쇄반응 실험을 실시한 결과 모두 이에 상응하는 특정 원인균의 STD DNA가 선택적으로 증폭된다는 사실을 확인하였다.
하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 자세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 예시에 불과한 것으로 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 결코 아니다.
실시예 1 : 성전파질환 원인균 특이적 프라이머 설계
(1) PCR 프라이머의 설계
본 발명의 목적인 성전파질환 원인균 특이적 DNA와 상보적으로 결합하여 균주 특이적 DNA를 선택적으로 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머로 사용될 수 있는 올리고 뉴클레오티드를 설계하였다.
우선, 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스로부터 14종의 성전파질환 원인균(Neisseria gonorrhea, Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, Herpes simplex virus type 1 & 2, Treponema pallidum, Human papillomavirus 6 및 11, Haemophilus ducreyi)의 DNA 염기서열을 확보하였다.
확보한 DNA 서열을 컴퓨터 프로그램 'DNASTAR(MegAlignTM 5, DNASTAR Inc.)'를 활용하여 ClustalW 방법으로 쌍정렬(pairwise alignment) 및 다중서열정렬(multiple sequence alignment)을 실행한 후 계통도(Phylogenetic tree)를 작성하고 각 원인균별 특이적 염기서열을 선별한 다음, 다시 컴퓨터 프로그램 프라이머 프리미어 5(primer premier 5, PREMIER Biosoft International Co.)를 활용하여 원인균 특이 프라이머를 설계하였다. 이때 프라이머의 길이는 32±3 및 39±2의 올리고 뉴클레오티드로 설정하여 14조의 STD 원인균 특이적 프라이머를 설계하였다.
발명에 따라 성전파성질환과 관련이 있는 원인균에 특이적으로 결합되는 14조의 프라이머(서열번호 1 내지 28)와 함께 서열번호 29, 30의 내부 컨트롤용 프라이머를 예상 증폭산물이 다른 증폭 산물과 구분될 수 있도록 구분하여 2조의 병용 프라이머 세트를 설계하였다.
즉, 하기 표 1에서 알 수 있는 것처럼 내부 컨트롤 프라이머(STD-IC), Haemophilus ducreyi에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-HD), Ureaplasma urealyticum에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-UU), Mycoplasma hominis에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-MH), Ureaplasma parvum에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-UP), Neisseria gonorrhea에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-NG), Mycoplasma genitalium에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-MG), Treponema pallidum에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-TP)가 함께 사용된 병용 프라이머 세트(STDMP1)와; 내부 컨트롤 프라이머(STD-IC), Human papillomavirus 6/11에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-HP), Herpes simplex virus type 1에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-HSV1), Candida albicans에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-CA), Herpes simplex virus type 2에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-HSV2), Trichomonas vaginalis에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-TV), Chlamydiae trachomatis에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-CT), Gardnerella vaginalis에 특이적으로 결합하는 프라이머(STD-GV)가 함께 사용된 병용 프라이머 세트(STDMP2)를 설계하였다.
(2) 설계한 프라이머의 가상 증폭 확인
상기 과정에서 설계한 총 14조의 프라이머를 대상으로 다른 컴퓨터 프로그램(Amplify 1. 2, University of Wisconsin)을 사용하여 각각 증폭도를 확인하였다. 설계 과정에서 기 확보된 총 72가지의 다른 성전파질환 원인균을 대상으로 가상 증폭 실험을 수행하였다. 본 발명에서 병용 프라이머 세트를 통하여 사용될 수 있도록 설계된 상기 14조의 프라이머의 서열번호, 증폭되는 STD 유형, 증폭산물의 크기, 증폭위치는 병용되어 사용된 프라이머 세트를 기준으로 하기 표 1에 상세히 나타내었다. 하기 표 1에 표시되어 있는 서열번호 중 홀수의 서열번호는 정방향 프라이머(forward primer)로 사용되며, 짝수의 서열번호는 역방향 프라이머(reverse primer)를 나타낸다.
한, 본 실시예에서 명명한 총 14조의 프라이머는 모두 생식기에 감염하여 조산 등 여타 질환의 발생과 관련이 있는 특정 유형의 성전파질환 원인균 DNA와 상보적으로 결합하여 각 유형에 특이적인 증폭 산물을 얻을 수 있을 것으로 예상되었다. 특히, 표 1의 예측 결과에서 알 수 있는 것처럼, 본 발명에서 사용된 총 2조의 병용 프라이머 세트 가운데 STDMP1 병용 프라이머 세트는 모두 7종의 성전파질환 원인균 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머로 구성되어 있으며, STDMP2 프라이머 세트는 나머지 7종의 성전파질환 원인균 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머로 구성되어 있음을 알 수 있다.
표 1. 선별된 프라이머 가상 증폭 특성
병용 프라이머 프라이머 서열번호 프라이머 염기 특성 증폭되는 STD 유형 증폭산물 크기(bp)
STDMP1 STD-IC 서열번호 29 서열번호 30 unwobble Internal control 120
STD-HD 서열번호 25 서열번호 26 unwobble Haemophilus ducreyi 150
STD-UU 서열번호 1 서열번호 2 unwobble Ureaplasma urealyticum 221
STD-MH 서열번호 3 서열번호 4 unwobble Mycoplasma hominis 300
STD-UP 서열번호 5 서열번호 6 unwobble Ureaplasma parvum 351
STD-NG 서열번호 7 서열번호 8 unwobble Neisseria gonorrhea 455
STD-MG 서열번호 9 서열번호 10 unwobble Mycoplasma genitalium 530
STD-TP 서열번호 11 서열번호 12 unwobble Treponema pallidum 646
STDMP2 STD-IC 서열번호 29 서열번호 30 unwobble Internal control 120
STD-HP 서얼변호 27 서열번호 28 unwobble Human papillomavirus 6/11 142
STD-HSV1 서열번호 13 서열번호 14 unwobble Herpes simplex virus type 1 200
STD-CA 서열번호 15 서열번호 16 unwobble Candida albicans 245
STD-HSV2 서열번호 17 서열번호 18 unwobble Herpes simplex virus type 2 319
STD-TV 서열번호 19 서열번호 20 unwobble Trichomonas vaginalis 420
STD-CT 서열번호 21 서열번호 22 unwobble Chlamydiae trachomatis 523
STD-GV 서열번호 23 서열번호 24 unwobble Gardnerella vaginalis 660
실시예 2 : 플라스미드 및 클론을 대상으로 한 PCR 증폭
(1) 선별된 프라이머의 합성
상기 과정을 통하여 선별된 총 14조의 프라이머를 합성한 후 이들 프라이머를 상기 표 1에 기재되어 있는 것과 같이 병용한 2조의 병용 프라이머 세트를 완성하였다.
본 실시예에 따라 특정 성전파성질환 원인균의 DNA와 결합될 수 있는 총 28개의 프라이머와 내부 컨트롤로서의 프라이머는 올리고 뉴클레오티드 포스포르아미다이트 합성화학에 근거한 고체상 합성기법을 탑재하고 있는 Expedite™ 8909 핵산 합성기(ABI사)를 이용하여 합성되었다. 우선, 합성반응은 올리고 뉴클레오티드 3' 말단에 위치한 뉴클레오시드를 고정시킨 CPG 컬럼에서 수행되었으며, 기본적으로 디트리틸레이션(detritylation), 커플링(coupling), 캡핑(caping), 산화(oxidation) 반응을 반복주기로 하여 선별된 PCR 프라이머의 올리고 뉴클레오티드 중합반응이 수행되었다. 합성 종료후 30% 암모니아를 CPG 컬럼에 가하여 상기 올리고머를 격리시킨 다음 55℃에서 12시간 이상 탈보호(deprotection)시켜 고속진공(Speed Vac.)으로 농축 건조되었다. 이어서 역상액체크로마토그래피 및 음이온교환 크로마토그래피를 행하여 총 28개의 올리고 뉴클레오티드가 순수 정제되었다. 최종 정제된 올리고머는 260㎚에서 흡광도를 측정하여 정량되었다.
(2) 합성된 PCR 프라이머에 의한 STD 플라스미드와 클론을 대상으로 한 PCR 증폭
상기 합성과정을 통하여 합성된 총 14조의 프라이머를 상기 표 1에 기재된 것과 같이 병용한 2조의 병용 프라이머 세트를 사용하여 다양한 STD DNA를 함유하고 있는 E.coli 균주 및 클론을 대상으로 PCR 증폭 실험을 수행하였다. 본 실시예에서 사용된 균주는 다음과 같다.
Ureaplasma urealyticum (Clone);
Mycoplasma hominis (ATCC 23114D);
Ureaplasma parvum (ATCC 700970D);
Neisseria gonorrhoeae (ATCC 700825D);
Mycoplasma genitalium (ATCC 33530D);
Treponema pallidum (Clone);
Herpes simplex virus type 1 (Clone);
Candida albicans (ATCC 14053D);
Herpes simplex virus type 2 (Clone);
Trichomonas vaginalis (ATCC 30001D);
Chlamydiae trachomatis (Clone);
Gardnerella vaginalis (ATCC 49145D);
Haemophilus ducreyi (Clone) ;
Human papillomavirus 6/11 (Clone);
상기와 같은 유형의 STD 플라스미드 DNA를 함유하는 각 E.coli 균주는 37℃ LB 액체 배지에서 16시간 동안 진탕 배양한 다음 'Qiafilter Plasmid Maxi Kit(Cat. No. 12263, QIAGEN 사)'로 분리 정제하여 10 ng/㎕로 농도 조정되어 주형 DNA로 활용하였고 클론들은 다음의 방법을 토대로 획득하였다. 즉, Salt solution : 1㎕, Vector : 0.5㎕, Template DNA : 4.5㎕를 넣은 후 혼합하여 22℃ 에서 30분간 방치한 다음 Competent cell을 17 ㎕넣고 섞은 후 30분간 ice에 방치하였다. 이 후 42℃ heat block에서 30초간 heat shock한 후, Ice에 5분간 방치한 후 SOC용액 200㎕을 즉시 넣어서 37℃ incubator에서 200rpm으로 1시간 배양한 다음 Ampicillin(50㎍/ml), X-Gal(40mg/ml), 100mM IPTG가 포함된 LB배지에 spreading한 후,Overnight 배양(Invitrogen TOPO TA cloning vector 사용)한 다음 'Qiafilter Plasmid Maxi Kit(Cat. No. 12263, QIAGEN 사)'로 분리 정제하여 10 ng/㎕로 농도 조정되어 주형 DNA로 활용하였다.
PCR 증폭은 타카라(TakaRa) 사로부터 구입한 10ㅧ buffer 2.5㎕, 10 mM MgCl2 3.75㎕, 10 mM dNTP 0.5㎕, Taq 중합효소 0.5㎕ (5unit)와 프라이머 1㎕ (50 pmoles), 증류수 5.2 ㎕ 주형 DNA 11.5㎕로 구성된 반응액을 94℃에서 15분간 1회, 94℃ 1분-67℃ 1분-72℃ 1분의 35회 반복, 72℃에서 5분간 1회의 조건에서 처리하였으며, 최종 반응액 5㎕를 DNA 사이즈 스탠더드 마커(size standard marker)와 함께 2% 아가로스 겔(agarose gel)에 부과하여 전기영동하였다. 이때 전기영동 겔의 염색은 0.00005% 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 용액으로 행하였으며, 겔의 각 경로에서 출현한 밴드의 유효여부는 상기 표 1의 가상증폭 실험에서 얻진 PCR 산물의 예상크기와 비교하여 판정하였다. 겔의 각 경로 상에서 출현된 밴드의 유효 여부는 본 실시예에서 사용된 STD 유형 DNA에 대한 가상 증폭 실험에서 얻어진 PCR 산물의 크기(하기 표 2 참조)와 비교하여 판정하였다.
도 1a 내지 도 1b는 성전파질환 원인균 각각을 증폭할 수 있는 표적 프라이머와 STDMP1및 STDMP2 프라이머 세트의 병용 프라이머 세트를 사용하여 본 실시예에서 사용된 다양한 STD DNA를 포함하는 플라스미드가 포함된 균주 및 클론을 대상으로 PCR 증폭 실험을 실시한 후 전기영동한 사진이다.
도 1a에서 레인 1은 Treponema pallidum(TP) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 2는 Mycoplasma genitalium(MG) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 3은 Neisseria gonorrhoeae(NG) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 4는 Ureaplasma parvum(UP) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 5는 Mycoplasma hominis(MH) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 6은 Ureaplasma urealyticum(UU) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 7은 Haemophilus ducreyi(HD) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 8은 음성대조군 DNA가 삽입된 플라스미드 DNA가 포함된 균주를 PCR 증폭실험 후 전기영동한 것이고, M은 사이즈 마커이다.
STDMP1 병용 프라이머 세트는 개별적으로 사용된 TP 유형(레인 1), MG 유형(레인 2), NG 유형(레인 3), UP 유형(레인 4), MH 유형(레인 5), UU 유형(레인 6) 및 HD 유형(레인 7)에 대해서 모두 증폭 산물이 만들어졌으며, 7개 유형의 STD DNA 삽입된 균주 혼합물에서도 각각의 유형 특이적으로 동일한 증폭 산물이 얻어졌음을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 상기 표 1에서 예측한 증폭 산물과 본 실시예에서 사용된 STD DNA 유형을 비교하여 표시한 하기 표 2에 제시된 결과와 동일한 것이 다.
한편, 도 1b에서 레인 1은 ardnerella vaginalis (GV) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 2는 Chlamydiae trachomatis (CT) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 3은 Trichomonas vaginalis; (TV) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 4는 Herpes simplex virus type 2 (HSV2) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 5는 Candida albicans(CA) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 6은 Herpes simplex virus type 1(HSV1) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 7은 Human papillomavirus 6/11 (HPV6/11) DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 8은 음성 대조군 DNA가 삽입된 플라스미드 DNA가 포함된 균주를 PCR 증폭실험에서 PCR 증폭실험 후 전기영동한 것이고, M은 사이즈 마커이다.
STDMP2 병용 프라이머 세트는 개별적으로 사용된 GV 유형(레인 1), CT 유형(레인 2), TV 유형(레인 3), HSV2 유형(레인 4), CA 유형(레인 5), HSV1 유형(레인 6) 및 HPV6/11 유형(레인 7)에 대해서 모두 증폭 산물이 만들어졌으며, 7개 유형의 STD DNA 삽입된 균주 혼합물에서도 각각의 유형 특이적으로 동일한 증폭 산물이 얻어졌음을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 상기 표 1에서 예측한 증폭 산물과 본 실시예에서 사용된 STD DNA 유형을 비교하여 표시한 하기 표 2에 제시된 결과와 동일한 것이다.
표 2. 플라스미드에 삽입된 STD DNA 및 프라이머 증폭산물의 예상 크기
프라이머 유형 STDMP1 STDMP2
Internal control; IC 120bp
Haemophilus ducreyi; HD 150bp
Ureaplasma urealyticum; UU 221bp
Mycoplasma hominis; MH 300bp
Ureaplasma parvum; UP 351bp
Neisseria gonorrhoeae; NG 455bp
Mycoplasma genitalium; MG 530bp
Treponema pallidum; TP 646bp
Internal control; IC 120bp
Human papillomavirus; HP 142bp
Herpes simplex virus type 1; HSV1 200bp
Candida albicans; CA 245bp
Herpes simplex virus type 2, HSV2 319bp
Trichomonas vaginalis; TV 420bp
Chlamydiae trachomatis; CT 523bp
Gardnerella vaginalis; GV 660bp
이와 같은 결과로 볼 때, STDMP1 병용 프라이머 세트와 STDMP2 병용 프라이머 세트는 상기 표 1에서 제시된 것과 같이 특정 유형의 STD DNA에 대해서 상보적으로 결합하여 유형 특이적인 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있으며 비선택적 증폭이 없음을 확인하였다.
실시예 3 : 검체로부터 추출된 DNA를 대상으로 한 PCR 실험
본 실시예에서는 인체 유래 샘플(요도나 자궁경부, 구강 분비물 및 세포)을 면봉이나 세포솔로 채취하여 얻은 다양한 검체를 대상으로 성전파질환 원인균 존재여부를 확인하였다. 검체 채취방법과 사용되는 도구 및 보관방법은 다음과 같다.
STD 검사에 필요한 표준 검체는 남성의 경우 요도 스왑 검체, 아침 첫 소변(VB1) 및 전립선마사지 후 소변(VB3)을 추가하였으며 여성의 경우 자궁경부내의 스왑 검체를 표준검체로 하였으며, 여기에 필요에 따라 질(vagina) 분비물이나 소변을 추가하였다.
샘플의 채취 과정에서 남성의 경우 멸균된 면봉을 요도구(2-3cm) 안쪽으로 삽입해서 좌우로 돌려 요도 내 분비물 및 세포가 잘 집적 (collect)되게 하여 채취하였고 여성의 경우 자궁경부의 스왑 검체를 얻을 때는 멸균된 면봉을 자궁경부 내부에 삽입해서 좌우로 돌려 분비물 및 세포가 잘 집적되게 하여 채취하였으며 이후 멸균된 검체보관 용액이 들어있는 튜브 내에 면봉을 넣어서 이동 및 보관시켰다.
이와 같은 방법을 통하여 다양한 검체로 부터 DNA를 분리하기 위해 본 연구자가 개발한 방법 및 시약을 이용하여 DNA를 분리 및 정제하였다. 즉, 소변이나 스왑 검체를 5분 동안 13,000rpm에서 원심분리한 후 상층액은 버리고, 획득한 펠렛(pellet)에 완충용액(lysis buffer, pH 6.8) 400㎕와 프로티나아제 K 20㎕를 넣은 후, 펠렛이 완전히 풀어질 때까지 혼합한 후 95℃에서 5분간 반응시키고, 여기에 6M 소디움 클로라이드 150㎕를 넣고 진탕 혼합한 후 13,000rpm에서 3분간 원심분리 하였다. 이 후 새로운 2ml 튜브에 상층액을 옮기 고 여기에 2배의 에탄올을 첨가하고 혼합한 후 12,000rpm에서 3분간 원심분리하였다. 이후 상층액을 버리고 실온에서 건조시킨 후 멸균된 3차 증류수나 혹은 TE 완충액(10mM Tris-HCl[pH 8.0], 1mM EDTA) 50㎕에 녹였다. 이 중 3 내지 5㎕를 PCR에 사용하였다.
실시예 4: 단일 PCR 조건 수립
위 실시예 3의 검체 보관용액, 그리고 감염의 증후가 없는 정상인 시료와 실시예 1에서 확보한 각 세균 별로 검사할 표적 유전자의 플라스미드 클론을 이용하여 각각의 균 별로 표적 유전자에 대해 단일(single) PCR을 반복 수행하여 적정 조건을 수립하였으며, 이때 PCR시에는 반드시 내부참조 유전자인 베타글로빈 유전자의 PCR도 함께 수행하였다. 더불어 멀티플렉스 PCR을 감안하여 각 PCR 산물의 크기가 서로 뚜렷하게 차이가 나도록 고안하였으며, 이에 대해 결합온도(annealing temperature)는 동일한 조건에서 증폭될 수 있도록 고려하였다.
실시예 5: 멀티플렉스 PCR의 조건 수립
실시예 3의 검체 보관용액, 그리고 감염의 증후가 없는 정상인의 시료와 실시예 1에서 확보한 각 세균 별로 검사할 표적 유전자의 플라스미드 클론을 이용하여 각각의 균 별로 표적 유전자에 대해 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 또한 상기한 멀티플렉스 PCR 시에는 대조 유전자로 하우스키핑유전자(housekeeping gene)인 GAPDH 유전자도 함께 증폭하였다. 본 실시예에 따른 PCR 조건은 하기 표 3에 표시되어 있다.
표 3. 멀티플렉스 PCR 조건
PCR 조성 PCR 조건
STDMP1 그룹 STDMP2 그룹 예비 변성(Pre-denaturation) : 94℃/15 min. 변성(Denaturation) : 94℃/0.5 min. 결합(Annealing) : 67℃/1.5 min. 연장(Extension) 72℃/1.5 min. 35 cycles 최종 연장(Final extension) : 72℃/5 min.
TP 0.5uM GV 0.2uM
MG 0.3uM CT 0.3uM
NG 0.3uM TV 0.3uM
UP 0.2uM HSV2 0.2uM
MH 0.4uM CA 0.3uM
UU 0.2uM HSV1 0.3uM
HD 0.2uM HPV6/11 0.3uM
IC 0.3uM IC 0.3uM
프라이머 혼합액 2.0ul
주형 DNA(>10ng) 3ul 전기영동 2% agarose gel : 5ul/10ul loading
PCR Master mix 5.0ul
최종 부피 10ul
본 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 후 그 산물은 2.0% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다. 도 1a의 PCR 산물의 전기영동 이미지를 보면 아래에서부터 STDMP1 병용 프라이머 세트에서 균주들은 각각 Haemophilus ducreyi(HD)의 산물이 150bp, Ureaplasma urealyticum(UU)의 산물이 221bp, Mycoplasma hominis(MH)의 산물이 300bp, Ureaplasma parvum(UP)의 산물이 351bp, Neisseria gonorrhoeae(NG)의 산물이 455bp, Mycoplasma genitalium(MG)의 산물이 530bp 및 Treponema pallidum( TP)의 산물이 646bp로 각각 나타났다.
또한 도 1b의 PCR 산물의 전기영동 이미지 에서도 보면 아래에서부터 STDMP2 병용 프라이머 세트에서 균주들은 각각 Human papillomavirus 6/11(HPV 6/11)의 산물이 142bp, Herpes simplex virus type 1(HSV1)의 산물이 200bp, Candida albicans(CA)의 산물이 245bp, Herpes simplex virus type 2(HSV2)의 산물이 319bp, Trichomonas vaginalis(TV)의 산물이 420bp, Chlamydiae trachomatis(CT)의 산물이 523bp 및 Gardnerella vaginalis(GV)의 산물이 660bp로 각각 나타났다. 더불어 본 방법으로 분석을 수행할 경우 각각의 균주들이 한 튜브에서 정확하게 반응하여 검색이 가능하였다.
실시예 6: 임상 검체에서 멀티플렉스 PCR의 수행
상기 실시예 5에서 단일 PCR 분석으로 STD감염의 유무와 원인균이 미리 확인된 바 있는 인체 검체의 DNA를 대상으로 위에서 수립된 방법대로 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 검사 대상에 포함시킨 DNA검체로는 15개의 임상 샘플로 감염 검체 모두 복합감염 검체였다. 본 멀티플렉스 PCR의 검사결과를 상업적으로 분석을 시행하고 있는 타사의 키트와 비교 분석하여 STD원인균 진단의 정확도를 조사하였다. 이로서 본 멀티플렉스 PCR이 임상에서 STD 원인균을 선별하고 1차 검색하는 데 사용할 수 있을 지를 분석하였다.
도 2a~2o의 임상검체에 대한 PCR 산물의 전기영동 이미지를 보면 M은 사이즈 마커이고, 레인 1과 2는 2조의 병용 프라이머 세트를 이용하여 임상검체를 대상으로 분석을 수행한 결과로서 도 2a의 검체는 NG, MH, GV 및 CT에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2b의 검체는 TP, GV 및 CT에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2c의 검체는 NG, MH, UU, GV 및 CT에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2d의 검체는 MH, UU 및 CA에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2e의 검체는 UU, GV 및 HPV6/11에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2f의 검체는 UP, GV 및 CA에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2g의 검체는 UP, MH 및 GV에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2h의 검체는 UP, GV 및 HPV6/11에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2i의 검체는 MH 및 GV에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2j의 검체는 MH HSV1, GV 및 CT에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2k의 검체는 MH, GV, CT 및 TV에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2l의 검체는 MG, UP, MH, GV 및 CA에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2m의 검체는 UP및 CA에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2n의 검체는 MH, GV 및 CT에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었고 도 2o의 검체는 MH 및 GV에 복합 감염되어 있는 것으로 확인되었다.
이는 하우스키핑 유전자인 GAPDH 유전자를 통해 PCR이 정확하게 수행되었고 이를 통해 확인을 할 수 있었다. 이는 단일 PCR 결과와도 동일한 양상을 보인 것으로서 이를 토대로 본 발명을 이용한 성전파질환 원인균 분석을 수행할 경우 각각의 균주들이 한 튜브에서 정확하게 반응하여 검색이 가능함을 확인하였다.
더불어, 총 70개의 검체를 대상으로 상업적 분석 키트의 결과와 비교한 본 발명의 멀티플렉스 PCR 분석의 결과는 표 4에 정리하였다. 상업적 분석 키트의 PCR 분석 결과를 기준으로 할 때 본 멀티플렉스 PCR의 정확도는 95%로 타사의 76.7%~90%에 비해 높게 나타났으며 단일 감염 및 복합감염에 있어서도 각각 95%로 타사의 70~85% 및 80~92.5%에 비해 높은 수치를 나타내었다. 이러한 결과는 상기 실시예 1에 제시된 표 1의 결과와 일치하는 것임을 확인할 수 있었으며, 본 실시예에서 확인하지 못한 다른 많은 성전파질환 원인균에 대해서도 표 1에서와 동일한 결과가 도출될 수 있을 것으로 기대되었다.
표 4. 임상검체의 상업적 분석키트와 비교한 결과
진단의 정확도
M사 S사 G사 본 발명
STD 환자군(N=70)
Haemophilus ducreyi; HD 5 5 - 5
Ureaplasma urealyticum; UU 5 5 5 5
Mycoplasma hominis; MH - 5 - 5
Ureaplasma parvum; UP - - - 5
Neisseria gonorrhoeae; NG 5 5 5 5
Mycoplasma genitalium; MG - 5 5 5
Treponema pallidum; TP - 5 - 5
Human papillomavirus 6/11; HPV6/11 - - - 5
Herpes simplex virus type 1; HSV1 - 5 - 5
Candida albicans; CA - 5 - 5
Herpes simplex virus type 2, HSV2 - 5 - 5
Trichomonas vaginalis; TV - 5 - 5
Chlamydiae trachomatis; CT 5 5 5 5
Gardnerella vaginalis; GV - - - 5
단일 감염(N=20) 14(70) 17(85) 13(65) 19(95)
복합 감염(N=50) 42(80) 47(92.5) 44(85) 48(95)
전체 56(76.7) 64(90) 57(78.3) 67(95)
정상대조군(N=20) 20(100) 20(100) 20(100) 20(100)
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 기술하였으나, 본 발명의 정신을 훼손하지 않는 범위 내에서 다양한 변형과 변경이 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게는 자명한 사실이라 할 것이다. 또한 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은 첨부된 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.
도 1a 내지 도 1b는 각각 본 발명에서 합성된 균주 특이적 프라이머를 동시에 사용한 병용 프라이머 세트를 사용하여 14종의 성전파질환 원인균 플라스미드 DNA를 대상으로 PCR 증폭 후, 증폭 산물에 대하여 전기영동을 수행한 사진이다.
도 2a 내지 도 2o는 각각 본 발명에서 합성된 프라이머를 동시에 사용한 병용 프라이머 세트를 사용하여 임상 시료를 대상으로 PCR 증폭 후, 증폭 산물에 대하여 전기영동을 수행한 사진이다.
<110> KIM, yeon soo <120> Novel Type-Specific Primers and Method for Detection of Sexual Transmitted Diseases by Multiplex-PCR <150> KR1020060082968 <151> 2006-08-30 <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for detecting Ureaplasma urealyticum <400> 1 cactaggggt aactttagtg ggagcagggg tagttgctg 39 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Ureaplasma urealyticum <400> 2 tcagctgatg taattgcaac attgaattca gcttcgt 37 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Mycoplasma hominis <400> 3 cgctgtaagg cgccactaaa agatgagggt gcggaac 37 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Mycoplasma hominis <400> 4 cgctttctga caaggtaccg tcagtctgca atc 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Ureplasma parvum <400> 5 gtccatttca acaagcacgc aaacttgcaa aag 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Ureaplasma parvum <400> 6 tgcaccgaat cctggtagtt cttcaaaatc agg 33 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Neisseria gonorrhea <400> 7 ccctgaaagg acgcaaagcc gccctttacg tctccg 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Neisseria gonorrhea <400> 8 gccgaatacg tcgacggtta cgaatacgtc ggtgtc 36 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Mycoplasma genitalium <400> 9 aggattggca atttttatgc ctggttgcat cttactttc 39 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Mycoplasma genitalium <400> 10 acgagtttga acttggtagt tcatctcttc tggtttgg 38 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Treponema pallidum <400> 11 tcgtgcgtac tcggagcttg cagagaagac atac 34 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Treponema pallidum <400> 12 gtcaccttgt attgcgcagg tagcacacga cccttc 36 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Herpse simplex virus type 1 <400> 13 gcggccagca cgctgtggtt gcttggcctg gacg 34 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Herpse simplex virus type 1 <400> 14 cacgatccgc gttgggttgg cacagatccg tcagg 35 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Candida albicans <400> 15 cggatctctt ggttctcgca tcgatgaaga acgcagcga 39 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Candida albicans <400> 16 ggttagacct aagccattgt caaagcgatc ccgccttac 39 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Herpse simplex virus type 2 <400> 17 tggtgatgtt tgcttggtcg ttcctggtcc tcaagcc 37 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Herpse simplex virus type 2 <400> 18 agctggctgg cggtgatcca atggaaaagc ccg 33 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Trichomonas vaginalis <400> 19 cgaatccatc ctcgatgtca tccgtaagga agctgaatc 39 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Trichomonas vaginalis <400> 20 gcgagcttac gaaggtcgga gttgagctga cctgggaagc g 41 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Chlamydiae trachomatis <400> 21 gcgcatctaa aggagctagc tcgcaacaat gc 32 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Chlamydiae trachomatis <400> 22 tcaagccaag accgcaagtg aataatgcgg atac 34 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Gardnerella viginalis <400> 23 gagaactgga tagtggacac gagtaagaat agtgagac 38 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Gardnerella vaginalis <400> 24 acggtctggg cagattcacg cgggattcca cgagg 35 <210> 25 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Haemophilus ducreyi <400> 25 agggctgaat atcgcttgct cttacgcgaa gataatg 37 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Haemophilus ducreyi <400> 26 tgttttagcc gttcacgctc acgttctata ttttcc 36 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Human papillomavirus <400> 27 gcctagcgac agcacagtat atgtgcctcc tcccaacc 38 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Human papillomavirus <400> 28 agagtaatat ggatgtccca cagcaaggag tctagaac 38 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control primer <400> 29 caccagtgca ggctgcctat cagaaagtgg tggctg 36 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control primer <400> 30 ggacagcaag aaagcgagct tagtgatact tgtgg 35

Claims (8)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 한 조의 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 성전파성질환 관련 원인균의 DNA를 증폭하는 합성된 프라이머.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 합성된 프라이머는
    서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 1 프라이머);
    서열번호 3과 서열번호 4로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 2 프라이머);
    서열번호 5와 서열번호 6으로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 3 프라이머);
    서열번호 7과 서열번호 8로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 4 프라이머);
    서열번호 9와 서열번호 10으로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 5 프라이머);
    서열번호 11과 서열번호 12로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 6 프라이머);
    서열번호 13과 서열번호 14로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 7 프라이머 );
    서열번호 15와 서열번호 16으로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 8 프라이 머);
    서열번호 17과 서열번호 18로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 9 프라이머);
    서열번호 19와 서열번호 20으로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 10 프라이머);
    서열번호 21과 서열번호 22로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 11 프라이머); 및
    서열번호 23과 서열번호 24로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 12 프라이머); 및
    서열번호 25와 서열번호 26으로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 13 프라이머); 및
    서열번호 27과 서열번호 28로 구성되는 올리고 뉴클레오티드(제 14 프라이머)로 이루어진 군에서 적어도 한 조 이상 선택되는 합성된 프라이머.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머는 Ureaplasma urealyticum DNA를 증폭시키고,
    상기 제 2 프라이머는 Mycoplasma hominis DNA를 증폭시키고,
    상기 제 3 프라이머는 Ureaplasma parvum DNA를 증폭시키고,
    상기 제 4 프라이머는 Neisseria gonorrhea DNA를 증폭시키고,
    상기 제 5 프라이머는 Mycoplasma genitalium DNA를 증폭시키고,
    상기 제 6 프라이머는 Treponema pallidum DNA를 증폭시키고,
    상기 제 7 프라이머는 Herpes simplex virus type 1 DNA를 증폭시키고,
    상기 제 8 프라이머는 Candida albicans DNA를 증폭시키고,
    상기 제 9 프라이머는 Herpes simplex virus type 2 DNA를 증폭시키고,
    상기 제 10 프라이머는 Trichomonas vaginalis DNA를 증폭시키고,
    상기 제 11 프라이머는 Chlamydiae trachomatis DNA를 증폭시키고,
    상기 제 12 프라이머는 Gardnerella vaginalis DNA를 증폭시키고,
    상기 제 13 프라이머는 Haemophilus ducreyi DNA를 증폭시키고,
    상기 제 14 프라이머는 Human papillomavirus 6 및 11 DNA를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 합성된 프라이머.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 기재된 적어도 한 조의 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 사용하고, 생물학적 샘플로부터 추출된 핵산을 표적 DNA로 하는 중합효소연쇄반응을 수행함으로써 성전파성질환 관련 원인균 DNA를 증폭하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 기재된 적어도 한 조의 올리고 뉴 클레오티드를 프라이머로 사용하고 생물학적 샘플로부터 추출된 핵산을 표적 DNA로 하여 상기 표적 DNA를 증폭시키는 단계; 및
    상기 증폭 단계에서 증폭 산물의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는 성전파성질환 관련 원인균 DNA를 검출하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 증폭 산물의 존재 여부는 전기영동 방법을 통하여 검출되는 것을 특징으로 하는 성전파성질환 관련 원인균 DNA를 검출하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 기재된 적어도 한 조의 올리고 뉴클레오티드;
    dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP);
    내열성 중합효소; 및
    PCR 완충 용액을 포함하는 성전파성질환 관련 원인균 DNA 검출용 키트.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 한 조의 올리고 뉴클레오티드와 생물학적 샘플로부터 추출된 표적 DNA 사이의 특이적 결합에 의하여 얻어진 증폭 산물의 존재를 검출하기 위한 수단을 더욱 포함하는 성전파성질환 관련 원인균 DNA 검출용 키트.
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