KR20140099798A - 리퀴드 비드 어레이와 다중중합효소연쇄반응법을 이용한 성전파 질환 원인균 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 성전파 질환(Sexually transmitted diseases, STD) 원인균을 검출하기 위한 성전파 질환의 원인균 특이적 PCR 프라이머와 프로브 및 이를 이용한 다중중합효소연쇄반응과 리퀴드 비드 어레이를 이용한 성전파 질환 원인균의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 성전파 질환을 유발하는 12종의 원인균의 핵산 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 원인균 특이적 PCR 프라이머와 프로브 및 이를 이용하여 샘플 내에서 12종의 성전파 질환의 원인균의 핵산 서열을 동일한 검출 한계로 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 성전파 질환의 원인균 검출 및 확인 방법, 성전파 질환의 원인균 감염 여부 및 감염된 원인균의 확인에 의한 질병 진단을 위한 정보 제공 방법 및 성전파 질환 치료제의 스크리닝 방법에 의하면, 신속하고 정확하게 검체로부터 성전파 질환의 원인균 감염 여부 및 그 종류를 확인할 수 있으며, 치료제 후보 물질을 정확하고 간편하게 스크리닝할 수 있다.
Description
본 발명은 성전파 질환(Sexually transmitted diseases, STD) 원인균을 검출하기 위한 성전파 질환의 원인균 특이적 PCR 프라이머와 프로브 및 이를 이용한 다중중합효소연쇄반응과 리퀴드 비드 어레이를 이용한 성전파 질환 원인균의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 성전파 질환을 유발하는 12종의 원인균의 핵산 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 원인균 특이적 PCR 프라이머와 프로브 및 이를 이용하여 샘플 내에서 12종의 성전파 질환의 원인균의 핵산 서열을 동일한 검출 한계로 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
성전파성 질환(sexually transmitted disease, STD)이란, 성행위로 인해 전파되는 질병을 통틀어 이르는 말로서, 원인별로 살펴 보면 성전파 질환, 질염, 성기 궤양 및 비임균성 요도염(nongonorrheal urethritis, NGU) 원인균 가운데 몇몇 원인균들이 95% 이상으로 절대 다수를 차지하고 있다. 여기에서 비임균성 요도염이란 남성에서 요도염이 발생하였으나 임균(Neissetia gonorrhoeae)이 확인되지 않는 경우를 가리키며, 비임균성 요도염의 가장 흔한 원인균은 클라마이디아 트라코마티스이며, 그 외에 유레아플라스마 유레아라이티쿰(Ureaplasma urealyticum)과 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)도 중요 원인균으로 지적되고 있다. 즉, 임균과 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움 등 4가지 종류의 세균이 STD 원인의 절대 다수를 차지하며, 이들 세균은 모두 공통적으로 남성에서 요도염(anterior urethritis)의 중요 원인이 되며, 부고환염 및 전립선염을 합병할 수 있으며, 불임의 중요한 원인이 된다. 또한, 여성에서는 자궁경부염(cervicitis)과 골반염증성 질환(pelvic inflammatory diseases)의 주원인이 되며, 나팔관 폐쇄(fallopian tube occlusion)를 일으킴으로써 불임과 이소성 임신(ectopic pregnancy) 등의 합병증을 유발할 수 있다.
최근 발생 양상은 클라마이디아 감염이 가장 흔할 것으로 생각되었으나, 이 보다는 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis)와 유레아플라스마 유레아라이티쿰(Ureaplasma urealyticum)의 비임균성 요도염이 매우 흔하며, 국내에서도 최근에는 임질은 줄어드는 대신 이들 비임균성 요도염이 늘어나는 추세이다.
성전파성 질환은 다른 질환과 달리 무증상으로 잠복되어 증세가 악화되는 경우가 많고, 재감염이 용이하므로 상기 원인균을 조기에 검출하여 무증상의 보균자도 효과적으로 진단할 수 있는 방법의 개발이 중요하다. 만약, 어떤 환자에서 일단 요도염이 발견되면 그것이 임균성인지 비임균성인지를 먼저 감별해야 하는데 그 이유는 치료 방법과 경과가 서로 다르기 때문이다. 그러나, 근래에는 항균제의 오남용에 따른 세균의 변이와 혼합 감염의 증가로 인해 양자 간의 구별이 애매한 경향이 많고, 정확한 진단을 위해서는 관련 세균 및 바이러스의 존재 유무를 빠른 시간 내에 정확하게 판별하는 분자유전학적 검사법이 필요하다.
임균성 요도염을 일으키는 임균(N. gonorrhoeae)은 나이세리아(Neisseria)속에 속한다. 임균의 진단은 일차적으로 그람 염색(Gram stain)에 의한다. 그러나, 무증상이거나 증상이 미미한 임균성 요도염에서는 그람 염색으로 판단이 애매하거나 위음성(false negative)으로 나오는 경우가 많다. 이를 보완하기 위해 임균 배양을 시도하며, 여러모로 유용하고 정확한 검사 방법이지만 검사 결과를 알기까지 많은 시간과 비용이 소모되는 단점이 있다. 이 밖에 효소면역 검사법(enzyme immunoassay: EIA)과 면역형광 검사법(immuno-fluorescence technique)은 임균 감염 질환 진단에 있어 새로운 항원 확인 방법으로 이용되고 있는데 배양 검사에 비해 더 신속하게 결과를 얻을 수 있으며, 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 더 높은 것으로 보고되고 있으나 고비용의 단점이 있다.
클라마이디아 트라코마티스의 확인 방법으로는 (1) 가검물의 배양 및 분리법, (2) 도말 염색법, (3) 항원 항체 반응법, 최근에는 (4) 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)과 하브리다이제이션(hybridization) 등의 분자유전학적 기법을 이용하는 방법이 선호되고 있다. 그러나, 검체를 배양, 분리하는 방법은 장시간이 소요된다는 점, 진단 민감도가 낮다는 점 등으로 인해 임상 진단 목적으로는 적합하지 못하며, 감염 부위의 상피세포를 직접 도말 염색하여 균을 확인하는 간편성은 좋으나 진단 민감도가 낮다.
또한, 마이코플라스마와 유레아플라스마속에 속하며 비뇨생식기에 감염을 유발할 수 있는 유레아플라스마 유레알리트쿰과 마이코플라스마 제니탈리움은 배양하기가 기술적으로 매우 어렵고, 염색이나 면역학적 방법으로도 발견하기가 어렵다. 이에 따라 PCR에 의거한 분자유전학적 검사법으로 진단하려는 것이 최근의 추세이다. 이 경우 각 균의 종에 특이한 유전자의 DNA의 염기서열을 PCR로 증폭한 후 이를 시퀀싱 반응이나 히브리다이제이션 등으로 확인하는 방법이 주로 이용된다.
그러나, 상기한 모든 방법들을 이용할지라도 분자 진단의 목적은 세균 감염이 있을 때 그 원인균을 정확하게 파악하는 것으로서 정확한 진단뿐 아니라 감염의 근원을 파악하며, 병태를 파악하고, 경과와 예후를 예측하며, 치료 방침을 결정하고, 백신 개발을 하는데 필수적이다. 이때의 원인균 진단은 단순한 균의 속과 종뿐만 아니라 아종(subspecies) 내지 균주(strain)까지 파악할 수 있도록 하는 것이 중요하다. 세균 감염의 원인균을 정확하게 파악하기 위해서는 검사 방법은 민감도, 특이도 및 재현성이 100%에 가까워야 한다.
배양 검사나 면역 검사 등 기존의 세균 체형 검사법으로는 이와 같은 조건을 만족시키기 힘들다. 이에 대해 세균 지놈의 유전자형, 즉 DNA 및 RNA의 염기서열을 분석하는 유전자 검사는 이론적으로 상기한 3가지 조건을 모두 만족시킬 수 있으며, PCR기법을 이용하여 임균 감염과 클라미디아 감염만을 검사하는 진단 키트는 이미 상업화되어 사용되고 있다. 그러나, 세균 파악을 위한 유전자 검사법이 임상 진료나 기타 검사실에서 활발하게 사용되고 임상 진료에 실제 도움이 되기 위해서는 상기한 조건 외에도 추가로 갖추어야 할 조건이 많다. 즉, 검사의 방법이 용이하고 해석하기도 쉽고 간편해야 하며, 신속하게 결과를 얻을 수 있어야 하고, 특별한 고가의 장비가 필요 없이 검사할 수 있어야 하며, 검사가 자동화되어 있어서 다수의 검체를 신속하게 검사할 수 있어야 하고, 검사 비용도 저렴해야 한다. 이를 위해 PCR은 가급적 대상 세균 모두를 하나의 튜브 내에서 한번의 PCR 반응으로 검사하는 멀티플렉스형의 PCR일 필요가 있으며, 치료에 따른 예후 확인을 위해서는 정량적인 부분을 포함한 분석법이 되어야 하고 이에 따른 최적의 조건이 수립되어야 한다.
이러한 필요성에 따라 다양한 세균 및 바이러스 검출과 관련된 연구가 활발히 진행되어 왔으며, 그 검출 방법으로는 세포배양법으로부터 시작하여 현재는 분자생물학적 방법인 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 의한 방법이 실시되고 있다. 더 나아가 배양 시간을 3~4일로 단축시키고 중합효소연쇄반응의 단점인 활성이 없는 바이러스도 검출이 되는 점을 극복할 수 있는 세포배양연계 중합효소연쇄반응법(Integrated Cell Culture-Polymerase chain reaction; ICCPCR)이 개발되어 활발히 사용되어 왔다(Yoe-jin Choo et al., The Journal of Microbiology, p.162-170, 2006). 그러나, 모두 3~5일 정도의 시간을 소요하고 낮은 농도의 바이러스는 검출할 수 없는 단점을 갖고 있다.
최근에 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 방법이 바이러스 진단에 도입되면서 바이러스 진단의 감도 향상과 더불어 멀티플렉스(multiplex) PCR 방법과 혼합염기 프라이머(degenerate primer)를 이용한 동시 진단의 적용 범위가 확대되었다(Elnifro, E. M., Asishi A. M., Cooper R. J., Klapper P. E. (2002) Clinical Micrebiol. Rev, 13, 559-570; Kenji O, Ulrich M. VirOligo: a database of virus-specific oligonucleotides (2002) Nucleic Acid Research. vol.30. 1:203-204). 그러나, 바이러스의 타입과 서브타입을 구분하기 위해서는 PCR을 수행한 후 염기서열 분석, 혼성화 블로팅(hybridization blotting) 등 많은 시간과 노력이 필요하다. 더구나, 이러한 방법도 PCR에 사용되는 프라이머(primer)에 의한 증폭 대상의 한계에 제한을 받게 된다. 따라서, 이러한 동시 진단과 타입 구분 진단의 목적에 부합되는 진단제 개발로 DNA 칩(chip)의 개발이 가장 유력한 방법 중 하나로 주목받고 있다(David W, Laurent C, Maxine Z, Pedro C. A, Homer A. B., Don G., Joseph L.D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens (2002) PNAS. vol.99. 24:15687-15692; Elena C., Majid L., Vladimir C., Ekaterina K., Eugenia D., Vadim I. A., Konstantin C. Microarray analysis of evolution of RNA viruses: Evidence of circulation of virulent highly divergent vaccine-derived polioviruses (2003) PNAS. August5. vol.100. 16:9398-9403; Peter A. C. H., Floor de K., G. J. B. van O., Johan T., den D. Fluorescent labelling of cRNA for microarray applications (2003) Nucleic Acid Research. vol.31. 5:e20).
또한, 진단 검사에 있어서 보다 신속하고 효율적이면서도 민감도가 높은 검출 시스템을 개발할 필요성이 제기되고 있는데 본 발명의 리퀴드 비드 어레이(Liquid Beads Array)의 특징은 한 튜브(Tube) 안에서 교잡 반응이 일어나는 3차원적 방법으로 반응 후 Luminex 100(Luminex사, 미국) 시스템에서 동시에 532nm과 633nm 파장을 측정함으로써 형광 값을 표시하게 된다. 633nm 파장에서 측정된 형광 값은 프로브가 부착된 비드를 식별하며, 532nm 파장에서 측정된 형광 값은 각 프로브와 반응한 PCR 산물이 Streptavidin-Cy3 또는 Streptavidin-Phycoerythrin 결합으로 나타난 값이다(Keji et al., Cytometry 33:318-323, 1998). 리퀴드 비드 어레이는 프로우메트리(Fluorometry) 기술을 이용한 Luminex 100(Luminex사, 미국) 시스템을 사용함으로써 고속 측정이 가능하며, 1회 측정으로 100개 비드의 형광 값의 최대 빈도를 확인하기 때문에 정확한 분석이 가능하며, 형광 반응의 결과가 수치 값으로 나타남으로써 정량 분석 및 자동화 시스템 적용이 용이하다(Armstrong et al., Cytometry 40:102-108,2000).
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 성전파 질환의 원인균의 검출/진단을 위하여 성전파 질환의 원인균으로 널리 알려져 있는 12종의 원인균의 특정 서열과 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 성전파 질환 원인균 특이적 프라이머 및 프로브를 이용한 분석 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 성전파 질환 원인균 유전자 단일 가닥을 증폭하는 방법 및 이를 통한 성전파 질환 원인균 감염 여부 및 감염된 원인균의 종류의 진단을 위한 정보 제공과 성전파 질환의 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 1) 분석하고자 하는 시료로부터, 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea), 우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum), 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis), 클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis), 트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택된 성전파 질환 원인균 특이 프라이머를 사용하여 성전파 질환 원인균 특이적 유전자를 멀티플렉스-PCR(Multiplex-PCR)법으로 증폭하는 제 1단계; 2) 제 1단계에서 증폭된 이중 가닥의 성전파 질환 원인균 특이적 유전자 산물을 열 변성을 통해 단일 가닥 유전자 산물로 수득하는 제 2단계; 및 3) 제 2단계에서 수득된 단일 가닥의 유전자 산물을 성전파 질환 원인균 각각에 특이적인 프로브를 사용하여 성전파 질환의 원인균을 확인하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법을 제공한다.
상기 제 1단계의 프라이머는 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)에 특이적인 서열번호 3 및 서열번호 4 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)에 특이적인 서열번호 5 및 서열번호 6 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum)에 특이적인 서열번호 7 및 서열번호 8 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis)에 특이적인 서열번호 9 및 서열번호 10 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum)에 특이적인 서열번호 11 및 서열번호 12 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis)에 특이적인 서열번호 13 및 서열번호 14 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis)에 특이적인 서열번호 15 및 서열번호 16 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis)에 특이적인 서열번호 17 및 서열번호 18 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2)에 특이적인 서열번호 19 및 서열번호 20 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 특이적인 서열번호 21 및 서열번호 22 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및
헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)에 특이적인 서열번호 23 및 서열번호 24 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭은 Cy3-dCTP, dATP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물을 이용하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭의 어닐링(annealing) 온도는 67℃인 것이 바람직하다.
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭의 프라이머 농도는 0.02 내지 0.03M인 것이 바람직하다.
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭은 내부 대조군으로서 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머는 서열번호 25 및 서열번호 26 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트인 것이 바람직하다.
상기 제 3단계는 단일 가닥의 유전자 산물을 성전파 질환의 원인균 특이적 유전자 검출용 프로브와 교잡(hybridization) 반응시키고, 형광물질이 부착된 결합제를 반응시킨 후, 형광 값을 측정하는 것이 바람직하다.
상기 제 3단계의 프로브는 성전파 질환의 원인균 특이적 유전자 부위와 교잡 반응하는 것이 바람직하다.
상기 제 3단계의 프로브는 서열번호 27 또는 서열번호 28로 이루어지는 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)에 특이적인 프로브;
서열번호 29 또는 서열번호 30으로 이루어지는 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)에 특이적인 프로브;
서열번호 31 또는 서열번호 32로 이루어지는 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)에 특이적인 프로브;
서열번호 33 또는 서열번호 34로 이루어지는 우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum)에 특이적인 프로브;
서열번호 35 또는 서열번호 36으로 이루어지는 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis)에 특이적인 프로브;
서열번호 37 또는 서열번호 38로 이루어지는 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum)에 특이적인 프로브;
서열번호 39 또는 서열번호 40으로 이루어지는 가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis)에 특이적인 프로브;
서열번호 41 또는 서열번호 42로 이루어지는 클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis)에 특이적인 프로브;
서열번호 43 또는 서열번호 44로 이루어지는 트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis)에 특이적인 프로브;
서열번호 45 또는 서열번호 46으로 이루어지는 헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2)에 특이적인 프로브;
서열번호 47 또는 서열번호 48로 이루어지는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 특이적인 프로브; 및
서열번호 49 또는 서열번호 50으로 이루어지는 헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)에 특이적인 프로브로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.
상기 제 3단계의 프로브는 비드에 결합된 형태인 것이 바람직하다.
상기 형광물질이 부착된 결합제는 Streptavidin-Cy3 또는 Streptavidin- Phycoerythrin인 것이 바람직하다.
상기 교잡 반응의 온도는 35 내지 38℃인 것이 바람직하다.
상기 교잡 반응을 위한 유전자 증폭 산물은 10 내지 30μl인 것이 바람직하다.
상기 교잡 반응은 내부 대조군으로서 GAPDH 유전자 검출용인 서열번호 51 또는 서열번호 52로 표시되는 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 1) 분석하고자 하는 시료로부터, 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea), 우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum), 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis), 클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis), 트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택된 성전파 질환 원인균 특이 프라이머 및 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머를 사용하여 성전파 질환의 원인균 특이적 유전자 및 GAPDH 유전자를 멀티플렉스-PCR 증폭하는 제 1단계; 2) 제 1단계에서 증폭된 이중 가닥의 유전자 산물을 열 변성을 통해 단일 가닥 유전자 산물을 수득하는 제 2단계; 및 3) 제 2단계에서 수득된 단일 가닥의 유전자 산물을 성전파 질환의 원인균 각각의 유전자에 특이적인 프로브 및 GAPDH 프로브를 사용하여 성전파 질환의 원인균을 확인하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea), 우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum), 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis), 클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis), 트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택된 성전파 질환 원인균이 감염된 개체에 치료 후보 물질을 투여하는 단계; 및 2) 상기 개체로부터 DNA을 분리하여 상기한 방법으로 성전파 질환 원인균을 검출하는 단계를 포함하는 성전파 질환의 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 성전파 질환의 원인균 검출 및 확인 방법, 성전파 질환의 원인균 감염 여부 및 감염된 원인균의 확인에 의한 질병 진단을 위한 정보 제공 방법 및 성전파 질환 치료제의 스크리닝 방법에 의하면, 신속하고 정확하게 검체로부터 성전파 질환의 원인균 감염 여부 및 그 종류를 확인할 수 있으며, 치료제 후보 물질을 정확하고 간편하게 스크리닝할 수 있다.
도 1은 12종의 성전파 질환 원인균 표준물질에 대한 리퀴드 비드 어레이 분석을 수행한 결과이다.
도 2는 임상 샘플 10종의 다중중합효소연쇄반응 증폭산물 전기영동 사진이다.
도 3a 내지 도 3m은 STD 12유형 양성 대조물질과 1종의 음성 대조물질에 대한 다중중합효소연쇄반응 및 리퀴드 비드 어레이 분석을 수행한 결과이다.
도 4a 내지 도 4j는 임상검체를 대상으로 하여 PCR을 실시한 후 리퀴드 비드 어레이 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 2는 임상 샘플 10종의 다중중합효소연쇄반응 증폭산물 전기영동 사진이다.
도 3a 내지 도 3m은 STD 12유형 양성 대조물질과 1종의 음성 대조물질에 대한 다중중합효소연쇄반응 및 리퀴드 비드 어레이 분석을 수행한 결과이다.
도 4a 내지 도 4j는 임상검체를 대상으로 하여 PCR을 실시한 후 리퀴드 비드 어레이 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
종래 PCR 기법을 활용하여 샘플 내에 존재하는 여러 유형의 성전파 질환의 원인균 주형과 혼성화(hybridization) 또는 상보적 결합(complementary binding)을 할 수 있는 공통적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 현재까지 발견된 성전파 질환 유형의 수와 비교할 때, 검출/진단할 수 있는 유형의 수가 크게 제한될 뿐 아니라 각 유형에 따라 민감도가 크게 떨어진다.
본 발명자들은 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 성전파 질환을 유발하는 다종의 성전파 질환 원인균 유형의 핵산 서열과 상보적으로 결합할 수 있고, 이에 따라 해당 성전파 질환 원인균 유형의 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 유형 특이적 프라이머 및 상기 증폭 산물에 특이적으로 교잡할 수 있는 유형 특이적 프로브를 설계하였다. 본 발명에 따라 합성된 유형 특이적 프라이머는 각각의 성전파 질환 원인균과 특이적으로 결합할 수 있기 때문에, 샘플 내의 이들 유전자의 증폭 여부를 통하여 샘플 내에 성전파 질환 원인균 유형의 존부를 손쉽게 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 합성된 유형 특이 프라이머를 사용하면 1회의 PCR 과정을 통하여 다종의 성전파 질환 원인균의 존재 여부를 분석/검출할 수 있음은 물론 이들 유형을 정확하게 동정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 1) 분석하고자 하는 시료로부터, 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea), 우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum), 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis), 클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis), 트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택된 성전파 질환 원인균 특이 프라이머를 사용하여 성전파 질환 원인균 특이적 유전자를 멀티플렉스-PCR(Multiplex-PCR)법으로 증폭하는 제 1단계; 2) 제 1단계에서 증폭된 이중 가닥의 성전파 질환 원인균 특이적 유전자 산물을 열 변성을 통해 단일 가닥 유전자 산물로 수득하는 제 2단계; 및 3) 제 2단계에서 수득된 단일 가닥의 유전자 산물을 성전파 질환 원인균 각각에 특이적인 프로브를 사용하여 성전파 질환의 원인균을 확인하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법을 제공한다.
상기 제 1단계의 프라이머는 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)에 특이적인 서열번호 3 및 서열번호 4 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)에 특이적인 서열번호 5 및 서열번호 6 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum)에 특이적인 서열번호 7 및 서열번호 8 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis)에 특이적인 서열번호 9 및 서열번호 10 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum)에 특이적인 서열번호 11 및 서열번호 12 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis)에 특이적인 서열번호 13 및 서열번호 14 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis)에 특이적인 서열번호 15 및 서열번호 16 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis)에 특이적인 서열번호 17 및 서열번호 18 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2)에 특이적인 서열번호 19 및 서열번호 20 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 특이적인 서열번호 21 및 서열번호 22 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및
헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)에 특이적인 서열번호 23 및 서열번호 24 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭은 Cy3-dCTP, dATP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물을 이용하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭의 어닐링(annealing) 온도는 67℃인 것이 바람직하다.
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭의 프라이머 농도는 0.02 내지 0.03M인 것이 바람직하다.
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭은 내부 대조군으로서 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머는 서열번호 25 및 서열번호 26 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트인 것이 바람직하다.
상기 제 3단계는 단일 가닥의 유전자 산물을 성전파 질환의 원인균 특이적 유전자 검출용 프로브와 교잡(hybridization) 반응시키고, 형광물질이 부착된 결합제를 반응시킨 후, 형광 값을 측정하는 것이 바람직하다.
상기 제 3단계의 프로브는 성전파 질환의 원인균 특이적 유전자 부위와 교잡 반응하는 것이 바람직하다.
상기 제 3단계의 프로브는 서열번호 27 또는 서열번호 28로 이루어지는 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)에 특이적인 프로브;
서열번호 29 또는 서열번호 30으로 이루어지는 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)에 특이적인 프로브;
서열번호 31 또는 서열번호 32로 이루어지는 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)에 특이적인 프로브;
서열번호 33 또는 서열번호 34로 이루어지는 우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum)에 특이적인 프로브;
서열번호 35 또는 서열번호 36으로 이루어지는 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis)에 특이적인 프로브;
서열번호 37 또는 서열번호 38로 이루어지는 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum)에 특이적인 프로브;
서열번호 39 또는 서열번호 40으로 이루어지는 가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis)에 특이적인 프로브;
서열번호 41 또는 서열번호 42로 이루어지는 클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis)에 특이적인 프로브;
서열번호 43 또는 서열번호 44로 이루어지는 트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis)에 특이적인 프로브;
서열번호 45 또는 서열번호 46으로 이루어지는 헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2)에 특이적인 프로브;
서열번호 47 또는 서열번호 48로 이루어지는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 특이적인 프로브; 및
서열번호 49 또는 서열번호 50으로 이루어지는 헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)에 특이적인 프로브로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.
상기 제 3단계의 프로브는 비드에 결합된 형태인 것이 바람직하다.
상기 형광물질이 부착된 결합제는 Streptavidin-Cy3 또는 Streptavidin- Phycoerythrin인 것이 바람직하다.
상기 교잡 반응의 온도는 35 내지 38℃인 것이 바람직하다.
상기 교잡 반응을 위한 유전자 증폭 산물은 10 내지 30μl인 것이 바람직하다.
상기 교잡 반응은 내부 대조군으로서 GAPDH 유전자 검출용인 서열번호 51 또는 서열번호 52로 표시되는 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 1) 분석하고자 하는 시료로부터, 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea), 우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum), 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis), 클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis), 트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택된 성전파 질환 원인균 특이 프라이머 및 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머를 사용하여 성전파 질환의 원인균 특이적 유전자 및 GAPDH 유전자를 멀티플렉스-PCR 증폭하는 제 1단계; 2) 제 1단계에서 증폭된 이중 가닥의 유전자 산물을 열 변성을 통해 단일 가닥 유전자 산물을 수득하는 제 2단계; 및 3) 제 2단계에서 수득된 단일 가닥의 유전자 산물을 성전파 질환의 원인균 각각의 유전자에 특이적인 프로브 및 GAPDH 프로브를 사용하여 성전파 질환의 원인균을 확인하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea), 우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum), 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis), 클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis), 트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택된 성전파 질환 원인균이 감염된 개체에 치료 후보 물질을 투여하는 단계; 및 2) 상기 개체로부터 DNA을 분리하여 상기한 방법으로 성전파 질환 원인균을 검출하는 단계를 포함하는 성전파 질환의 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 예증적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 올리고
DNA
합성
이를 위하여 본 발명에서 프라이머(primer)는 유형별 즉, 성전파 질환 원인균 유형 특이적인 증폭이 가능하도록 타겟 부위(target region)를 선별하였다. 또한, 필요한 경우 유형별 타겟 부위 염기서열을 ClustalW method를 이용하여 다중정렬(multiple alignment)을 실시하고, 이에 따라 각 유형 특이적인(specific) 프라이머 타겟 부위를 선별하였다. 이후, 선별된 프라이머 타겟 부위로부터 프라이머 프리미어(Primer premier version 5, Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA), 디엔에이시스 맥스(DNASIS MAX Version 2.7, MiraiBio Group, South San Francisco, CA, USA) 프로그램을 응용하여 유전자-특이적 프라이머를 디자인하였다. 프라이머 선발의 기본 요건은 다음과 같다. 프라이머 길이(30-35 base pair), 융해온도[Tm, 74-80℃], 3' 말단의 GC 함량이 높지 않아야 하며, 프라이머 서열 내 염기 4개 이상 연속해서 상보적이지 않도록 함으로써 hairpin 이차구조 형성을 방지하였으며, 3' 말단에 동일한 염기가 3개 이상 연속해서 위치하지 않도록 함으로써 프라이머 이합체(dimer)의 형성을 방지하였다. 그리고, 타겟 부위 내에 단일염기 다형성(single nucletide polymorphism, SNP)이 포함되지 않도록 하여 높은 특이도를 확보하였다. 또한, 해당 프라이머 염기서열이 본 발명이 목적하는 리퀴드 비드 어레이를 구성하는 타 유전자 또는 병원체 염기서열들과 cross-reactive한 특성을 나타내지 않음을 미국 NCBI 염기서열 데이터베이스 등 다양한 염기서열 검색 툴(tool)을 활용하여 검증하였다. 본 발명에 사용하는 서열번호 1 내지 서열번호 26의 프라이머(primer)는 마크로젠사(한국)를 통해 합성하였다(표 1).
본 발명의 바람직한 구현을 통해, 성전파 질환 원인균 유형 진단을 위한 프라이머는 형광 색소가 표지되지 않은 일반적인 프라이머를 사용하고 멀티플렉스 PCR 반응 중에 형광 색소가 표지된 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(Cy3-dCTP) 형광 색소를 표지시키는 방법을 사용하였다.
본 발명에 사용하는 형광 색소는 6-FAM(6-carboxyfluorescein), Cy3, JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimethoxy-fluorescein), Rhodamine Green, TAMRA NHS(N-hydroxysuccinimide) Ester, Texas Red 등일 수 있다. 프라이머의 농도는 제조사(마크로젠사, 한국)의 QC 보고서를 통해 확인하고, 최종 100pmole/uL 범위의 농도가 되도록 3차 탈이온 멸균 증류수로 재현탁(resuspension)하고 aliquots으로 -70℃에서 냉동 보관하였다.
<
실시예
2> 임상검체 채취 및 이로부터
DNA
분리
본 발명이 실현하고자 하는 비침습적(non-invasive) 진단을 위해서, 자궁경부세포진에서 채취한 검체를 채취 후 바이러스 수송배지(viral transport media)에 넣어서 검사실로 운송하였다. 성전파 질환 원인균 유형 진단을 위해 검체로부터 DNA를 분리하였으며, 상용화된 DNA 추출 키트(G-SpinTM Total Genomoc DNA extraction kit, 인트론바이오테크놀로지, 성남, 한국)를 사용하였다. 수송배지 검체를 비롯한 여타 검체가 점도가 낮아서 바로 pipetting이 가능하면 2N 수산화나트륨(NaOH)을 사용하지 않고 검체 200ul를 1.5ml 튜브로 옮기고 여기에 200ul의 세포 용해 완충용액이 들어있는 1.5mL 에펜도르프 튜브에 첨가하고 약하게 교반(vortex)한 후 80℃에서, 10분간 반응시켰다. 이후 실온(15~20℃)에서 10분간 방치 후, 20ul의 프로테나아제 K를 넣고 70℃에서 10분간 반응시켰다. 여기에 350ul의 바인딩 완충용액을 넣고 조심스럽게 파이펫팅하여 혼합하고, 반응물을 스핀 칼럼(spin column)의 상층부에 로딩(loading)하고 13,000rpm으로 1분 동안 원심분리하였다. 컬렉션 튜브를 새로 교체하고, 멤브레인으로부터 불순물을 제거하는 WB-A 완충용액 500uL를 첨가하고, 13,000rpm에서 1분 동안 원심분리하고 다시 WB-B 완충용액 500uL를 첨가하고 13,000rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 컬럼을 2ml 튜브로 옮긴 후, 튜브를 다시 한번 13,000rpm에서 1분간 동안 원심분리하고 다시 컬럼을 빈 튜브로 옮기고 100ul의 일루션 완충용액을 첨가하고 실온에서 1분 처리하고 13,000rpm에서 1분 동안 원심분리하여 순수한 DNA를 분리하였다.
<
실시예
3> 성전파 질환 원인균 유형 동정을 위한
PCR
증폭
성전파 질환 원인균 비드 어레이 분석에 앞서, 임상 검체로부터 분리한 원인균 DNA를 주형으로 하여 멀티플렉스 PCR 반응을 통해 리퀴드 비드 어레이 분석을 위한 타겟 유전자들을 증폭하고 전기영동을 통해 확인하였다(도 2). 이후, 증폭된 앰플리콘들은 리퀴드 비드 어레이 표면의 cDNA 프로브들과 듀플렉스(duplex)를 형성함으로써 성전파 질환 원인균 별 유형 판정 결과가 확인된다. 본 발명의 바람직한 일 양태에 따른 멀티플렉스 PCR은 내부 대조군(internal control)으로 인간 GAPDH 유전자를 포함한다.
본 실시예에 바람직하게 기술하는 성전파 질환 원인균 12종 멀티플렉스 PCR 반응은 퀴아젠사의 다중중합효소연쇄반응 키트(Multiplex PCR 키트)를 사용한다. 성전파 질환 원인균 유형 진단을 위한 멀티플렉스 PCR에 포함되는 개별 dNTPs들 가운데 dCTP에 Cy3 형광 색소를 표지시켜 합성하였다(마크로젠사, 한국).
본 발명의 바람직한 일 양태에 따른 말단에 형광 색소 변형이 없는 프라이머를 포함하는 멀티플렉스 PCR 키트는 PCR 과정 중에 Cy3 형광 색소가 표지된 디옥시사이토신 트리포스페이트(Cy3-dCTP)가 증폭산물을 구성하는 뉴클레오티드로 첨가되도록 하여 반응의 민감도와 특이도를 향상시킬 수 있었다. Cy3-dCTP를 사용하는 12종 멀티플렉스 PCR 반응에 사용하는 PCR 완충용액은 최종 농도 50mM KCl, 3.5mM MgCl2, 10mM Tris-HCl, pH 8.2이였으며, 2.5unit의 Taq 중합효소, 300uM dATP, 300uM dGTP, 300uM dTTP, 25uM dCTP, 275uM Cy3-dCTP(FluoroLink Cy3-dCTP, Amersham Pharmacia Biotech AB, Piscataway, NJ, USA), 10mg/mL 소혈청알부민(Bovine serum albumin)을 첨가하여 PCR 분석은 94℃에서 10분간 예비변성시키고 94℃에서 30초간 변성, 67℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1.5분간 확장의 반응을 총 35회 시행한 후 최종 확장은 72℃에서 5분간 반응시켜 증폭하였다.
<
실시예
4>
성전파
질환 원인균
리퀴드
비드
어레이 제작을 위한
프로브
합성
리퀴드 비드의 카르복실기와 공유결합을 시키기 위하여 모든 프로브의 5' 말단에 아미노 링크를 붙이고 교잡 반응시 반응을 용이하게 하기 위하여 15개의 올리고(dT)를 부착한 다음 표 2와 같은 염기서열을 붙여 합성하였다(서열번호 27 내지 서열번호 52). 즉, "Amino link-Oligo(dT)15-프로브 염기서열"의 순서로 하여 마크로젠사(한국)에 의뢰하여 합성하였다. 이때 결정한 성전파 질환 원인균 유형의 염기서열은 총 12종의 성전파 질환 원인균 유형을 분석하여 결정하였다.
<
실시예
5>
성전파
질환 원인균 유형 분석
비드
어레이
키트
제작
본 발명의 성전파 질환 원인균 유형 진단 리퀴드 비드 어레이는 12종의 성전파 질환 원인균 유형을 고-특이도로 판별할 수 있는 탐침이 포함되는데, 이들 탐침과 준비된 비드(xMAP carboxylated microspheres; Luminex Corp. Austin, TX)를 이용하여 비드에 탐침을 붙이는 작업을 통해 아래와 같이 리퀴드 비드 어레이를 제작하였다. 그 절차는 아래와 같다.
1) 100pmol의 아미노기가 붙어있는 프로브를 0.1M MES(M2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid pH 4.5)에 10M이 되도록 혼합하였다.
2) 리퀴드 비드에 프로브를 부착하기 위하여 Miraibio LabMaP bead(미국)에서 구입하여 사용하였다. LabMAP bead 10uL를 1.5ml tube로 분주한 후 10,000g에서 1분간 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하였다.
3) 침사물에 50uL의 0.1M MES buffer(pH 4.5)를 넣고 sonication하였다.
4) 10M 프로브 2.5uL를 취하여 상기 제조된 비드에 첨가하였다.
5) 1% EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimided hydrochlo ride) 용액 2.5uL를 첨가하여 암소에서 30분간 2회 반복 반응하였다.
6) 0.02% Tween 20 용액 200uL를 첨가한 후 10,000g에서 1분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
7) 0.1% SDS 용액 200uL을 첨가한 후 10,000g에서 1분간 원심분리 후 상층액을 제거하였다.
8) 침사물을 0.1M MES(pH4.5) 100uL에 녹인 후 암소에 냉장 보관하였다.
<
실시예
6>
성전파
질환 원인균
리퀴드
비드
어레이 교잡 반응 및 분석
1) 상기에서 제조한 프로브가 포함된 리퀴드 비드를 상온에서 30분간 방치한 후 2분간 vortex mixer를 이용하여 비드를 풀어주었다.
2) 하이브리다이제이션 용액(3X SSC, 0.3% SDS)을 60℃에서 10분간 방치하였다.
3) PCR 증폭산물 10ul를 95℃에서 5분간 변성시킨 다음 즉시 아이스에서 2분간 방치한 후 상기 2)에서 준비한 하이브리다이제이션 용액(3X SSC, 0.3% SDS)과 l:4의 비율로 혼합한 후 Streptavidin-Cy3 또는 Streptavidin- Phycoerythrin이 1/500이 되도록 첨가하였다.
4) 배양기에서 60℃에서 1시간 동안 반응시켜 결합 반응을 수행하였다.
3) 반응이 완료된 후 각 튜브에 멸균증류수를 첨가하여 반응을 종료시킨 후 리퀴드 비드 어레이 전용 플레이트로 옮겨 담았다.
4) 결과 확인은 상기에서 준비된 샘플을 이용하여 리퀴드 비드 어레이에서 well 별로 Bead를 읽었다. Luminex 100은 2개의 lazer를 이용하여 한 개는 Bead 번호를, 한 개는 반응된 피코에리트린의 양을 계산하여 수치로 나타내었다. 총 12종류의 비드를 읽으며 각각의 성전파 질환 원인균 유형의 판정은 그 유형을 대표하는 비드의 MFI 값으로 대변되고, 이를 통해 그 유형을 판정하였다. 분석 소프트웨어를 이용하여 양성 대조군 비드에 결합되어 있는 프로브들 간의 평균 MFI 값 및 표준 오차 값들과 비교하여 이 비율을 구한 뒤 그 값이 인터널 콘트롤의 MFI 값 150~200 이상이며 각 유형별 MFI 값이 100 이상일 경우에 양성 값으로 스코어링(scoring) 처리하였다.
<
실시예
7> 양/음성 대조물질을 통한
프로브
테스트
도 3a 내지 도 3m, 표 1 및 표 3은 12종의 성전파 질환 원인균에 대한 프로브의 최대 검출 수치를 확인하기 위한 리퀴드 비드 어레이 이미지를 나타낸다. 리퀴드 비드 어레이의 MFI 값을 특정하기 위하여 Luminex 100(Luminex사, 미국) 시스템을 이용하여 프로브 간의 MFI 값을 측정하여 분석하였다. 표 3에서 보는 바와 같이, Luminex 100(Luminex사, 미국) 시스템 소프트웨어를 이용하여 프로브간의 MFI 값을 분석한 결과 그 값이 1500~2000의 값에서 최대 검출 수치를 나타내었고, 양성판정 기준은 인터널 콘트롤의 양성 기준인 100~200 사이의 값을 최소 검출 한계치며 양성판정 기준치로 판정하였다.
<
실시예
8> 임상검체 실험
본 실시예는 임상시료를 대상으로 종래의 검사법에 따른 성전파 질환 원인균 감염 여부를 검진하고 이를 토대로 수탁기관에서 의뢰된 검체 10건을 대상으로 다중 PCR 분석을 통한 증폭능을 확인한 다음 증폭 반응이 끝난 튜브에 각각의 타입을 대표하는 프로브가 붙어 있는 비드들을 섞어 만든 혼합 비드와 교잡 반응 후, 세척 과정 후 스트렙타비딘 피코에리트린과 반응 후 읽은 형광 수치(Mean fluorescent intensity; MFI)를 나타내었다. 피검자 모두에서 각각 서로 다른 유형의 성전파 질환 원인균 유형이 검출되었다.
그 결과를 도4a 내지 4j에 나타내었다. 도 4a는 532nm 파장에서 측정한 리퀴드 어레이의 MH(800), UU(1500) 및 GV(2100) 유형에 관한 MFI 값으로 12개의 프로브 중에서 표 2의 "반응 STD형"에 표시된 것과 같이 프로브 35번, 37번 및 39번이 고정된 리퀴드 어레이의 비드에서 측정된 MFI 값을 그래프화하여 나타낸 것이며, 도 4b는 532nm 파장에서 측정한 리퀴드 어레이의 GV(1500), CT(2100) 유형에 관한 MFI 값으로 12개의 프로브 중에서 표 2의 "반응 STD형"에 표시된 것과 같이 프로브 39번과 41번이 고정된 리퀴드 어레이의 비드에서 측정된 MFI 값을 그래프화하여 나타낸 것이며, 도 4c는 532nm 파장에서 측정한 리퀴드 어레이의 NG(1400)과 CT(2100) 유형에 관한 MFI 값으로 12개의 프로브 중에서 표 2의 "반응 STD형"에 표시된 것과 같이 프로브 31번, 41번이 고정된 리퀴드 어레이의 비드에서 측정된 MFI 값을 그래프화하여 나타낸 것이며, 도 4d는 532nm 파장에서 측정한 리퀴드 어레이의 GV(2100), TV(1800) 유전자형에 관한 MFI 값으로 12개의 프로브 중에서 표 2의 "반응 STD형"에 표시된 것과 같이 프로브 39번, 43번이 고정된 리퀴드 어레이의 비드에서 측정된 MFI 값을 그래프화하여 나타낸 것이며, 도 4e는 532nm 파장에서 측정한 리퀴드 어레이의 MG(2100), UU(380), CT(1500) 유전자형에 관한 MFI 값으로 12개의 프로브 중에서 표 2의 "반응 STD형"에 표시된 것과 같이 프로브 29번, 37번 및 39번이 고정된 리퀴드 어레이의 비드에서 측정된 MFI 값을 그래프화하여 나타낸 것이며, 도 4f는 532nm 파장에서 측정한 리퀴드 어레이의 TP(1800), MH(200) 유전자형에 관한 MFI 값으로 12개의 프로브 중에서 표 2의 "반응 STD형"에 표시된 것과 같이 프로브 27번, 35번이 고정된 리퀴드 어레이의 비드에서 측정된 MFI 값을 그래프화하여 나타낸 것이며, 도 4g는 532nm 파장에서 측정한 리퀴드 어레이의 UP(380), UU(280), GV(1500) 유전자형에 관한 MFI 값으로 12개의 프로브 중에서 표 2의 "반응 STD형"에 표시된 것과 같이 프로브 33번, 37번 및 39번이 고정된 리퀴드 어레이의 비드에서 측정된 MFI 값을 그래프화하여 나타낸 것이며, 도 4h는 532nm 파장에서 측정한 리퀴드 어레이의 MH(280), GV(1500), HSV2(2100) 유전자형에 관한 MFI 값으로 12개의 프로브 중에서 표 2의 "반응 STD형"에 표시된 것과 같이 프로브 35번, 39번 및 45번이 고정된 리퀴드 어레이의 비드에서 측정된 MFI 값을 그래프화하여 나타낸 것이며, 도 4i는 532nm 파장에서 측정한 리퀴드 어레이의 HSV2(2100), HSV1(1400) 유형에 관한 MFI 값으로 12개의 프로브 중에서 표 2의 "반응 STD형"에 표시된 것과 같이 프로브 45번, 49번이 고정된 리퀴드 어레이의 비드에서 측정된 MFI 값을 그래프화하여 나타낸 것이며, 도 4j는 532nm 파장에서 측정한 리퀴드 어레이의 GV(1200), CA(620), HSV1(1400) 유형에 관한 MFI 값으로 12개의 프로브 중에서 표 2의 "반응 STD형"에 표시된 것과 같이 프로브 39번, 47번 및 49번이 고정된 리퀴드 어레이의 비드에서 측정된 MFI 값을 그래프화하여 나타낸 것이다.
이와 같이 STD 유형을 분석하는데 유형 특이적 부위을 다중중합효소연쇄반응으로 증폭하여 STD 유형을 검출하면 광역 스크리닝용 공통 프라이머가 지니는 한계를 극복하고 그 단점을 최소화하였다. 또한, 유형 특이적 STD 유형 분석은 기존 광역 스크리닝 프라이머에 비해 민감도와 특이도가 높게 STD 유형을 판독하는데 있어서 그 근본적인 문제인 프라이머 및 프로브 선택에 크게 구애받지 않는다는 점이 본 발명의 이점이라 할 수 있다.
상기에서 본 발명의 바람직한 실시예를 기술하였으나, 이는 어디까지나 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야의 당업자라면 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형과 변경이 가능하다는 점은 자명하다. 그러나, 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 첨부하는 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.
<110> diogene
<120> A METHOD FOR DETECTING MICROORGANISMS OCCURING SEXUALLY
TRANSMITTED DISEASES USING LIQUID BEADS ARRAY AND MULTIPLEX PCR
<160> 52
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TP forward primer
<400> 1
tcgtgcgtac tcggagcttg cagagaagac atac 34
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TP reverse primer
<400> 2
gtcaccttgt attgcgcagg tagcacacga cccttc 36
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MG forward primer
<400> 3
aggattggca atttttatgc ctggttgcat cttactttc 39
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MG reverse primer
<400> 4
acgagtttga acttggtagt tcatctcttc tggtttgg 38
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NG forward primer
<400> 5
gaaatggact tgtccgccct gaaaggacgc aaagc 35
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NG reverse primer
<400> 6
cggttacgaa tacgtcggtg tcggcgtatt cgggcg 36
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UP forward primer
<400> 7
gtccatttca acaagcacgc aaacttgcaa aag 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UP reverse primer
<400> 8
tgcaccgaat cctggtagtt cttcaaaatc agg 33
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MH forward primer
<400> 9
ctacattagc tcacctattg aaatacgata cagctcatgg 40
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MH reverse primer
<400> 10
tatcttcgtt tactgaataa acaactgttt taacgccttc g 41
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UU forward primer
<400> 11
cactaggggt aactttagtg ggagcagggg tagttgctg 39
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UU reverse primer
<400> 12
tcagctgatg taattgcaac attgaattca gcttcg 36
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GV forward primer
<400> 13
gttgaagaac ataaactcga tgacgctcag cttgatgatt cac 43
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GV reverse primer
<400> 14
caactgctgt taatccttct cgaacatcgt caccag 36
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT forward primer
<400> 15
gcgcatctaa aggagctagc tcgcaacaat gc 32
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT reverse primer
<400> 16
tcaagccaag accgcaagtg aataatgcgg atac 34
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TV forward primer
<400> 17
caagctccgt gaagagtacc cagatcgtat cc 32
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TV reverse primer
<400> 18
gatgggatcc actcgacgaa gtaggatgtg ttacg 35
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HSV2 forward primer
<400> 19
tggtgatgtt tgcttggtcg ttcctggtcc tcaagcc 37
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HSV2 reverse primer
<400> 20
agctggctgg cggtgatcca atggaaaagc ccg 33
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA forward primer
<400> 21
cggatctctt ggttctcgca tcgatgaaga acgc 34
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA reverse primer
<400> 22
ggttagacct aagccattgt caaagcgatc ccgc 34
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HSV1 forward primer
<400> 23
gcggccagca cgctgtggtt gcttggcctg gacg 34
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HSV1 reverse primer
<400> 24
cacgatccgc gttgggttgg cacagatccg tcag 34
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH forward primer
<400> 25
cccacaagta tcactaagct cgctttcttg ctgtcc 36
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH reverse primer
<400> 26
gcagaatcca gatgctcaag gcccttcata atatcc 36
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TP probe 1
<400> 27
tttttttttt tttttgaatt gcagcccaga aagcgc 36
<210> 28
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TP probe 2
<400> 28
tttttttttt tttttggcac gaaaactcga agaacaaaga attgc 45
<210> 29
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MG probe 1
<400> 29
tttttttttt tttttcaatc attcttattg ggtaggtttg ccaatcc 47
<210> 30
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MG probe 2
<400> 30
tttttttttt tttttcttat tgggtaggtt tgccaatcct aag 43
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NG probe 1
<400> 31
tttttttttt tttttctacc gcaacgaaac cctgct 36
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NG probe 2
<400> 32
tttttttttt tttttgactg tccgtcaacg gcac 34
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UP probe 1
<400> 33
tttttttttt tttttgctcc aggtatttta ttacctgctg 40
<210> 34
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UP probe 2
<400> 34
tttttttttt tttttcacct attcaaaaag atgatagcca aattaatgct ccag 54
<210> 35
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MH probe 1
<400> 35
tttttttttt tttttcgatg aaggtcttcg gattgtaaag tgctg 45
<210> 36
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MH probe 2
<400> 36
tttttttttt tttttgtgct gttataaggg aagaacattt gcaatagg 48
<210> 37
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UU probe 1
<400> 37
tttttttttt tttttcgaaa agagctttta cgctgtttac gacattg 47
<210> 38
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UU probe 2
<400> 38
tttttttttt tttttgcttt tacgctgttt acgacattga aaatttcgat g 51
<210> 39
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GV probe 1
<400> 39
tttttttttt tttttccgta gcaggttgcg cgatgtc 37
<210> 40
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GV probe 2
<400> 40
tttttttttt tttttgaatt cccagccgta gagg 34
<210> 41
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT probe 1
<400> 41
tttttttttt tttttgtctg gaaccaactc taccatggat accg 44
<210> 42
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT probe 2
<400> 42
tttttttttt tttttcaaag tgatgattgg ggttaccgtg gc 42
<210> 43
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TV probe 1
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tttttttttt tttttggtta tgtccggcac aacatgcg 38
<210> 44
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TV probe 2
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<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HSV2 probe 1
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HSV2 probe 2
<400> 46
tttttttttt tttttgttgt gcgtgatcat gg 32
<210> 47
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA probe 1
<400> 47
tttttttttt tttttcttgg gtttgcttga aagacggtag 40
<210> 48
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA probe 2
<400> 48
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<210> 49
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HSV1 probe 1
<400> 49
tttttttttt tttttgccat catctaaccc gccaagtg 38
<210> 50
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HSV1 probe 2
<400> 50
tttttttttt tttttgatac cgaacaggcc ctggac 36
<210> 51
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH probe 1
<400> 51
tttttttttt tttttggttc ctttgttccc taagtccaac tac 43
<210> 52
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH probe 2
<400> 52
tttttttttt tttttgttcc ctaagtccaa ctactaaact ggg 43
Claims (17)
1) 분석하고자 하는 시료로부터, 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea), 우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum), 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis), 클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis), 트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택된 성전파 질환 원인균 특이 프라이머를 사용하여 성전파 질환 원인균 특이적 유전자를 멀티플렉스-PCR(Multiplex-PCR)법으로 증폭하는 제 1단계;
2) 제 1단계에서 증폭된 이중 가닥의 성전파 질환 원인균 특이적 유전자 산물을 열 변성을 통해 단일 가닥 유전자 산물로 수득하는 제 2단계; 및
3) 제 2단계에서 수득된 단일 가닥의 유전자 산물을 성전파 질환 원인균 각각에 특이적인 프로브를 사용하여 성전파 질환의 원인균을 확인하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
2) 제 1단계에서 증폭된 이중 가닥의 성전파 질환 원인균 특이적 유전자 산물을 열 변성을 통해 단일 가닥 유전자 산물로 수득하는 제 2단계; 및
3) 제 2단계에서 수득된 단일 가닥의 유전자 산물을 성전파 질환 원인균 각각에 특이적인 프로브를 사용하여 성전파 질환의 원인균을 확인하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 1항에 있어서,
상기 제 1단계의 프라이머는 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)에 특이적인 서열번호 3 및 서열번호 4 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)에 특이적인 서열번호 5 및 서열번호 6 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum)에 특이적인 서열번호 7 및 서열번호 8 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis)에 특이적인 서열번호 9 및 서열번호 10 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum)에 특이적인 서열번호 11 및 서열번호 12 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis)에 특이적인 서열번호 13 및 서열번호 14 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis)에 특이적인 서열번호 15 및 서열번호 16 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis)에 특이적인 서열번호 17 및 서열번호 18 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2)에 특이적인 서열번호 19 및 서열번호 20 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 특이적인 서열번호 21 및 서열번호 22 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및
헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)에 특이적인 서열번호 23 및 서열번호 24 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 제 1단계의 프라이머는 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)에 특이적인 서열번호 3 및 서열번호 4 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)에 특이적인 서열번호 5 및 서열번호 6 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum)에 특이적인 서열번호 7 및 서열번호 8 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis)에 특이적인 서열번호 9 및 서열번호 10 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum)에 특이적인 서열번호 11 및 서열번호 12 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis)에 특이적인 서열번호 13 및 서열번호 14 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis)에 특이적인 서열번호 15 및 서열번호 16 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis)에 특이적인 서열번호 17 및 서열번호 18 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2)에 특이적인 서열번호 19 및 서열번호 20 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 특이적인 서열번호 21 및 서열번호 22 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및
헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)에 특이적인 서열번호 23 및 서열번호 24 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 1항에 있어서,
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭은 Cy3-dCTP, dATP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭은 Cy3-dCTP, dATP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 1항에 있어서,
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭의 어닐링(annealing) 온도는 67℃인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭의 어닐링(annealing) 온도는 67℃인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 1항에 있어서,
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭의 프라이머 농도는 0.02 내지 0.03M인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭의 프라이머 농도는 0.02 내지 0.03M인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 1항에 있어서,
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭은 내부 대조군으로서 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 제 1단계의 멀티플렉스-PCR 증폭은 내부 대조군으로서 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 6항에 있어서,
상기 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머는 서열번호 25 및 서열번호 26 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머는 서열번호 25 및 서열번호 26 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 1항에 있어서,
상기 제 3단계는 단일 가닥의 유전자 산물을 성전파 질환의 원인균 특이적 유전자 검출용 프로브와 교잡(hybridization) 반응시키고, 형광물질이 부착된 결합제를 반응시킨 후, 형광 값을 측정하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 제 3단계는 단일 가닥의 유전자 산물을 성전파 질환의 원인균 특이적 유전자 검출용 프로브와 교잡(hybridization) 반응시키고, 형광물질이 부착된 결합제를 반응시킨 후, 형광 값을 측정하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 1항에 있어서,
상기 제 3단계의 프로브는 성전파 질환의 원인균 특이적 유전자 부위와 교잡 반응하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 제 3단계의 프로브는 성전파 질환의 원인균 특이적 유전자 부위와 교잡 반응하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 1항에 있어서,
상기 제 3단계의 프로브는 서열번호 27 또는 서열번호 28로 이루어지는 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)에 특이적인 프로브;
서열번호 29 또는 서열번호 30으로 이루어지는 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)에 특이적인 프로브;
서열번호 31 또는 서열번호 32로 이루어지는 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)에 특이적인 프로브;
서열번호 33 또는 서열번호 34로 이루어지는 우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum)에 특이적인 프로브;
서열번호 35 또는 서열번호 36으로 이루어지는 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis)에 특이적인 프로브;
서열번호 37 또는 서열번호 38로 이루어지는 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum)에 특이적인 프로브;
서열번호 39 또는 서열번호 40으로 이루어지는 가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis)에 특이적인 프로브;
서열번호 41 또는 서열번호 42로 이루어지는 클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis)에 특이적인 프로브;
서열번호 43 또는 서열번호 44로 이루어지는 트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis)에 특이적인 프로브;
서열번호 45 또는 서열번호 46으로 이루어지는 헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2)에 특이적인 프로브;
서열번호 47 또는 서열번호 48로 이루어지는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 특이적인 프로브; 및
서열번호 49 또는 서열번호 50으로 이루어지는 헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)에 특이적인 프로브로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 제 3단계의 프로브는 서열번호 27 또는 서열번호 28로 이루어지는 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)에 특이적인 프로브;
서열번호 29 또는 서열번호 30으로 이루어지는 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)에 특이적인 프로브;
서열번호 31 또는 서열번호 32로 이루어지는 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)에 특이적인 프로브;
서열번호 33 또는 서열번호 34로 이루어지는 우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum)에 특이적인 프로브;
서열번호 35 또는 서열번호 36으로 이루어지는 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis)에 특이적인 프로브;
서열번호 37 또는 서열번호 38로 이루어지는 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum)에 특이적인 프로브;
서열번호 39 또는 서열번호 40으로 이루어지는 가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis)에 특이적인 프로브;
서열번호 41 또는 서열번호 42로 이루어지는 클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis)에 특이적인 프로브;
서열번호 43 또는 서열번호 44로 이루어지는 트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis)에 특이적인 프로브;
서열번호 45 또는 서열번호 46으로 이루어지는 헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2)에 특이적인 프로브;
서열번호 47 또는 서열번호 48로 이루어지는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 특이적인 프로브; 및
서열번호 49 또는 서열번호 50으로 이루어지는 헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)에 특이적인 프로브로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 1항에 있어서,
상기 제 3단계의 프로브는 비드에 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 제 3단계의 프로브는 비드에 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 8항에 있어서,
상기 형광물질이 부착된 결합제는 Streptavidin-Cy3 또는 Streptavidin- Phycoerythrin인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 형광물질이 부착된 결합제는 Streptavidin-Cy3 또는 Streptavidin- Phycoerythrin인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 8항에 있어서,
상기 교잡 반응의 온도는 35 내지 38℃인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 교잡 반응의 온도는 35 내지 38℃인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 8항에 있어서,
상기 교잡 반응을 위한 유전자 증폭 산물은 10 내지 30μl인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 교잡 반응을 위한 유전자 증폭 산물은 10 내지 30μl인 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
제 8항에 있어서,
상기 교잡 반응은 내부 대조군으로서 GAPDH 유전자 검출용인 서열번호 51 또는 서열번호 52로 표시되는 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
상기 교잡 반응은 내부 대조군으로서 GAPDH 유전자 검출용인 서열번호 51 또는 서열번호 52로 표시되는 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 검출 방법.
1) 분석하고자 하는 시료로부터, 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea), 우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum), 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis), 클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis), 트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택된 성전파 질환 원인균 특이 프라이머 및 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머를 사용하여 성전파 질환의 원인균 특이적 유전자 및 GAPDH 유전자를 멀티플렉스-PCR 증폭하는 제 1단계;
2) 제 1단계에서 증폭된 이중 가닥의 유전자 산물을 열 변성을 통해 단일 가닥 유전자 산물을 수득하는 제 2단계; 및
3) 제 2단계에서 수득된 단일 가닥의 유전자 산물을 성전파 질환의 원인균 각각의 유전자에 특이적인 프로브 및 GAPDH 프로브를 사용하여 성전파 질환의 원인균을 확인하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 진단을 위한 정보 제공 방법.
2) 제 1단계에서 증폭된 이중 가닥의 유전자 산물을 열 변성을 통해 단일 가닥 유전자 산물을 수득하는 제 2단계; 및
3) 제 2단계에서 수득된 단일 가닥의 유전자 산물을 성전파 질환의 원인균 각각의 유전자에 특이적인 프로브 및 GAPDH 프로브를 사용하여 성전파 질환의 원인균을 확인하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파 질환의 원인균 진단을 위한 정보 제공 방법.
1) 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea), 우레아플라스마 파르붐(Ureaplasma parvum), 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 가르데넬라 바기날리스(Gardenella vaginalis), 클라미디아에 트라초마티스(Chlamydiae trachomatis), 트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 헤르페스 심플렉스 타입 2(Herpes simplex type 2), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 헤르페스 심플렉스 타입 1(Herpes simplex type 1)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택된 성전파 질환 원인균이 감염된 개체에 치료 후보 물질을 투여하는 단계; 및
2) 상기 개체로부터 DNA을 분리하여 상기 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 방법으로 성전파 질환 원인균을 검출하는 단계를 포함하는 성전파 질환의 치료제의 스크리닝 방법.
2) 상기 개체로부터 DNA을 분리하여 상기 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 방법으로 성전파 질환 원인균을 검출하는 단계를 포함하는 성전파 질환의 치료제의 스크리닝 방법.
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