CN117467799B - 念珠菌属、加德纳杆菌和阴道毛滴虫多重检测的引物探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents

念珠菌属、加德纳杆菌和阴道毛滴虫多重检测的引物探针组合、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种念珠菌属、加德纳杆菌和阴道毛滴虫多重检测的引物和探针的组合、试剂盒及应用，以念珠菌属（包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等）、加德纳杆菌、阴道毛滴虫为检测靶标，设计引物和探针的组合，制备多重定量PCR阴道微生物检测试剂盒，灵敏度高、特异性好，而且荧光信号强，为临床针对阴道微生物的检测提供可靠的诊断保障。

Description

念珠菌属、加德纳杆菌和阴道毛滴虫多重检测的引物探针组 合、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及阴道微生物检测技术领域，尤其涉及念珠菌属（包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等）、加德纳杆菌、阴道毛滴虫的引物探针组合及检测试剂盒及其应用。
背景技术
念珠菌是人类的主要真菌病原体。它作为共生体存在于大多数个体的口腔、肠道或生殖道中，受到当地微生物群、上皮屏障和免疫防御的限制。它们的干扰可能导致真菌生长和粘膜感染（例如口咽或外阴阴道念珠菌病）的发展，免疫力受损的患者容易受到危及生命的全身感染。其中，白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等为常见妇科念珠菌属病原菌。
阴道加德纳菌是一种存在于正常阴道菌群中的厌氧细菌。通常情况下，阴道菌群以乳酸菌为主，但当加德纳菌等微生物开始过度生长并成为优势菌种时，就会导致细菌性阴道病（BV）。细菌性阴道病的特征是存在线索细胞，这些细胞是覆盖有杆状细菌的子宫颈上皮细胞。
滴虫病是一种性传播疾病（STI），对公共卫生具有重要影响；它与阴道炎、宫颈炎、尿道炎和盆腔炎有关，并且是人类免疫缺陷病毒（HIV）传播和感染的辅助因素。阴道毛滴虫是一种运动生物，其大小与白细胞相当。它至少有四个鞭毛，提供波动的运动能力。该生物体存在于泌尿生殖道的管腔中。该生物体释放细胞毒性蛋白，破坏上皮内层。感染期间，阴道 pH 值通常会升高。
目前，阴道微生物的检测方法主要包括分离培养、酶化学、镜检等方法，分离培养是金标准，但对技术要求高，耗时长；酶化学法灵敏度特异性仍有提升空间，镜检法对实验人员要求较高。
目前，基于分子生物学方法的念珠菌属（包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等）、加德纳杆菌、阴道毛滴虫的多重检测qPCR试剂鲜有应用。因此，本领域对于上述病原体组合需要一种便捷、快速、准确的分子生物学方法的试剂，从而实现侵袭性阴道微生物的早筛早诊，便于及时进行干预治疗和控制病情。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种多重定量PCR检测阴道微生物，念珠菌属（包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等）、加德纳杆菌、阴道毛滴虫的试剂盒，以解决现有技术中多重检测上述靶标组合的试剂盒不足的问题，所用引物和探针组合特异性较强且灵敏度较高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于对念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫进行检测的引物和探针组合，所述念珠菌属（包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等）、加德纳杆菌、阴道毛滴虫检测引物探针组，以念珠菌属上述菌种28S基因中保守性DNA片段上第189~324位作为检测靶标、以加德纳杆菌tuf基因中保守性DNA片段上第262~341位作为检测靶标、以阴道毛滴虫AG基因中保守性DNA片段上第269~273位作为检测靶标。
本发明提供了一种用于对念珠菌属进行检测的引物和探针组合，其中，引物核苷酸序列如SEQ ID No. 1~2所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No. 3。
在一些实施方案中，所述念珠菌属包括本领域任何常见的念珠菌种类。优选地，包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌。
本发明提供了一种用于对加德纳杆菌进行检测的引物和探针组合，其中，引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4~5所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No. 6。
本发明提供了一种用于对阴道毛滴虫进行检测的引物和探针组合，其中，引物核苷酸序列如SEQ ID No. 7~8所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No. 9。
在一些实施方案中，所述念珠菌属（包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等）、加德纳杆菌、阴道毛滴虫检测引物和探针组合，包括：
以SEQ ID NO.1~9任意所示的核苷酸序列为基础，经删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物或探针。
在一些实施方案中，所述念珠菌属（包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等）、加德纳杆菌、阴道毛滴虫检测引物和探针组合，包括：
以SEQ ID NO.1~9任意所示的核苷酸序列为基础，经核苷酸取代或修饰，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物或探针。
在一些实施方案中，所述念珠菌属（包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等）、加德纳杆菌、阴道毛滴虫检测引物和探针组合，包括：
与SEQ ID NO.1~9任意所示的核苷酸序列具有80%以上同源性或与SEQ ID NO.1~9任意所示的核苷酸序列功能相似的衍生引物或探针。
在一些实施方案中，所述念珠菌属（包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等）、加德纳杆菌、阴道毛滴虫检测引物和探针组，包括如下引物和探针组合：
与SEQ ID NO.1~9任意所示的核苷酸序列互补的引物或探针。
在一些实施方案中，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记猝灭基团；所述荧光基团选自中所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、CY5、CY3、JOE和ROX中的任一种；所述荧光淬灭基团选自BHQ1，BHQ2，BHQ3和TAMRA中的任一种。
在一些实施方案中，SEQ ID No.3所示核苷酸序列的探针的5’端标记荧光基团FAM，3’端标记猝灭基团BHQ1；
在一些实施方案中，SEQ ID No.6所示核苷酸序列的探针的5’端标记荧光基团CY5，3’端标记猝灭基团BHQ2；
在一些实施方案中，SEQ ID No.9所示核苷酸序列的探针的5’端标记荧光基团ROX，3’端标记猝灭基团BHQ2。
另一方面，本发明提供了一种检测念珠菌属、加德纳杆菌或阴道毛滴虫中至少一种病原微生物的检测试剂盒：包括上述引物和探针的混合液。
进一步地，在一些实施方案中，本发明提供的试剂盒包括扩增反应液混合物（又称为“扩增反应液MIX”、“PCR反应MIX”）、阳性质控和阴性质控。
进一步地，扩增反应液MIX包括PCR缓冲液、dNTP溶液、TaqDNA聚合酶、UDG酶。
进一步地，PCR缓冲液包括Tris-HCl、MgCl2、KCl和Triton X-100，在PCR缓冲液中Tris-HCl的浓度为10~50mM、MgCl2的浓度为3~6mM、KCl的浓度为10~50mM、Triton X-100的浓度为1%~10% (v/v)。
进一步地，dNTP溶液包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP和dUTP，在dNTP溶液中dATP的浓度为0.1~0.3mM、dTTP的浓度为0.1~0.3mM、dCTP的浓度为0.1~0.3mM、dGTP的浓度为0.1~0.3mM，dUTP的浓度为0.1~0.3mM。
进一步地，单次检测反应液中包含1.5U~3U的TaqDNA聚合酶和0.5U~2U的UDG酶。
进一步地，阳性质控包括含有人工合成念珠菌属28S基因序列的pUC57质粒，浓度为1×103~1×106copies/mL、人工合成加德纳杆菌tuf基因序列的pUC57质粒，浓度为1×103~1×106copies/mL、人工合成阴道毛滴虫AG基因序列的pUC57质粒，浓度为1×103~1×106copies/mL，以及含有人工合成GAPDH基因序列的pUC57质粒，浓度为1×103~1×105copies/mL。
进一步地，阴性质控为含有人工合成GAPDH基因序列的pUC57质粒，浓度为1×103~1×105copies/mL。
进一步地，所述试剂盒还包括裂解液和稀释液；
所述裂解液组分包含：0.05%~2% 的Triton X-100（v/v），0.1%~0.5%的聚乙烯吡咯烷酮K30（w/v），0.001%~0.1% 的十二烷基硫酸钠（w/v），1mM~50mM的氢氧化钠，20mM~100mM的盐酸胍，10mM~100mM的三羟甲基氨基甲烷。
所述稀释液为单一组分：可选的试剂包括无核酸酶水、纯化水、DEPC水、TE缓冲液或PBS缓冲液等。
在一些实施方案中，裂解液用于临床样本预处理和核酸释放，使用方法为将样品置于室温下10分钟进行裂解，或置于高温的加热模块中5分钟；所述高温可为65℃-95℃，优选为70-90℃，更优选为85℃。
在一些实施方案中，稀释液用于裂解液的稀释缓冲，使用方法为裂解物转移至稀释液管，充分混匀后，将适量稀释液转移至PCR体系中，所述裂解物体积为10-50 μL ，优选为30-40 μL ，更有选为20 μL。
另一方面，本发明提供了上述任何一种引物和探针组合在制备念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫多重定量PCR检测试剂盒中的应用。
本发明采用的所有试剂均可商业化购买获得。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）通过设计特定序列结构的引物和探针，制备念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫检测的引物和探针组合和检测试剂盒，适合多种妇科样本，不但灵敏度高、特异性好，而且荧光信号强，为临床针对念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫感染的检测提供可靠的诊断保障，所述念珠菌属可涵盖白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等多种常见妇科念珠菌属病原菌，具有广谱性。
（2）通过设计特定组成的裂解液和稀释液，实现可采用免提直扩法（无需提取、纯化直接扩增）进行检测，为临床提供了便捷、快速的测试方法。
附图说明
图1为实施例4检测白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌的参考品结果曲线图。
图2为实施例4检测加德纳杆菌参考品结果曲线图。
图3为实施例4检测阴道毛滴虫的参考品结果曲线图。
图4为实施例4检测阴性样本的结果曲线图。
图5为对比例中分别采用实施例1的探针引物组合与对比例的对照组合检测5000cfu/mL念珠菌参考品结果曲线图。
图6为对比例中分别采用实施例1的探针引物组合与对比例的对照组合检测2000copies/mL加德纳杆菌参考品结果曲线图。
图7为对比例中分别采用实施例1的探针引物组合与对比例的对照组合检测500cells/mL阴道毛滴虫参考品结果曲线。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。下列实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规试剂公司购买得到。
实施例1 念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫检测的引物和探针组合的设计
以念珠菌属的白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌28S基因中保守性DNA片段上第189-324位作为检测靶标、以加德纳杆菌tuf基因中保守性DNA片段上第262-341位作为检测靶标、以阴道毛滴虫AG基因中保守性DNA片段上第269-273位作为检测靶标，根据靶标区域序列分别设计引物，并进行筛选，最终得到引物的核苷酸序列如下表1所示。
表1本发明实施例引物和探针核苷酸序列
SEQ ID No.3的5’端标记FAM基团，3’端标记BHQ1基团；SEQ ID No.6的5’端标记CY5基团，3’端标记BHQ2基团；SEQ ID No.9的5’端标记ROX基团，3’端标记BHQ2基团。
实施例2 念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫的实时荧光定量PCR试剂盒的组成和制备
采用实施例1中的引物及探针组合、PCR反应MIX、阳性质控、阴性质控制备检测试剂盒。
PCR反应MIX：包含PCR缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶、UDG酶。其中，PCR缓冲液是由Tris-HCl (10~50mM)、MgCl2(3~6mM)、KCl (10~50mM)和Triton X-100 (1%~10%)等构成的缓冲体系。其中，dNTP为dATP（0.1~0.3mM）、dTTP（0.1~0.3mM）、dCTP（0.1~0.3mM）和dGTP（0.1~0.3mM）的混合物，混合溶液中还包含0.1~0.3mM的dUTP。
其中，单次检测PCR反应MIX中包含1.5U~3U的Taq DNA聚合酶和0.5U~2U的UDG酶。
阳性质控:包括含有人工合成念珠菌属28S基因序列的pUC57质粒，浓度为1×103~1×106copies/mL、人工合成加德纳杆菌tuf基因序列的pUC57质粒，浓度为1×103~1×106copies/mL、人工合成阴道毛滴虫AG基因序列的pUC57质粒，浓度为1×103~1×106copies/mL，以及含有人工合成GAPDH基因序列的pUC57质粒，浓度为1×103~1×105copies/mL。
阴性质控：含有人工合成GAPDH基因序列的pUC57质粒，浓度为1×103~1×105copies/mL。
实施例1的引物、探针参与配制反应体系，各引物、探针浓度为：引物28S-F、引物28S-R、引物tuf-F、引物tuf-R、引物AG-F、引物AG-R的终浓度分别均为0.25μM；探针28S-P-FAM、探针tuf-P-CY5、探针AG-P-ROX的终浓度分别为0.2μM。
实施例3：念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫的检测方法
1、样本来源
样本来源于妇科患者，包括但不限于生殖道拭子、阴道后穹隆采样、宫颈刮片等。作为举例说明，本实施例选用生殖道拭子样本进行实验。
2、引物及探针：采用实施例1中的念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫检测的引物及探针组合。
3、实验方法
（1）、核酸提取、纯化
将采样后的生殖道拭子放入含有裂解液的裂解管中，折断拭子末端并将拭子头留在裂解管中，拧紧盖子，给样品贴上标签并保持管子直立，根据核酸提取试剂盒说明书的步骤纯化核酸，如使用天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（货号DP315）或QIAGEN-QIAampDNA Mini Kit（货号51304），所得核酸转移5μL核酸至PCR体系中。
（2）、免提直扩法（无需提取、纯化直接扩增）
本发明的检测试剂盒还可包含裂解液和稀释液，当采用免提直扩法时，可采用所述裂解液和稀释液。所述裂解液组分包含：0.05%~2% 的Triton X-100，0.1%~0.5%的聚乙烯吡咯烷酮 K30，0.001%~0.1% 的十二烷基硫酸钠，1mM~50mM的氢氧化钠，20mM~100mM的盐酸胍，10mM~100mM的三羟甲基氨基甲烷。
所述稀释液为单一组分：可选的试剂包括无核酸酶水、纯化水、DEPC水、TE缓冲液、PBS缓冲液等。
具体步骤：将采样后的生殖道拭子放入含有裂解液的裂解管中，折断拭子末端并将拭子头留在裂解管中，拧紧盖子，给样品贴上标签并保持管子直立，轻轻涡旋30秒，将样品置于室温下10分钟进行裂解，或置于85℃的加热模块中5分钟；将20 μL裂解物转移至稀释液管，充分混匀后，将适量稀释液转移至PCR体系中。
（3）、试剂配制
每个待测样本/阳性质控/阴性质控的多重定量PCR反应体系组成为：样品DNA /阳性质控/阴性质控（三者选一）5μL、PCR反应MIX 15μL、引物探针混合液5μL，总反应体系25μL。
总测试数N =待测样本数（n）+阳性质控品数（1）+阴性质控品数（1）。如下表2所示，计算加到反应体系中的各个试剂的量：
表2 各个试剂的计算量统计
取1.5 mL离心管（无菌）配制反应体系，PCR反应MIX、引物探针混合液全部加入后，涡旋振荡10秒，离心待用，20μL/管分装至PCR反应管中(无菌和RNase-Free)，用毕PCR反应MIX和引物探针混合液立即放入-18℃以下冻存。
（4）、加样：将待测样本、阳性质控品、阴性质控品提取的核酸分别转移5μL/管到每个PCR反应管中，盖紧管盖、离心、转移至PCR检测区。
（5）、PCR扩增：将PCR反应管放入荧光定量PCR的样品槽中。按顺序设置阳性质控品、阴性质控品和待测样本，并设置样本名称/编号；定义荧光检测通道： FAM通道为念珠菌属核酸检测通道，CY5通道为加德纳杆菌核酸检测通道， ROX通道为阴道毛滴虫核酸检测通道，VIC通道内标通道；推荐PCR参数设置如下表3所示：
表3 PCR扩增程序
（6）、质量控制：
阳性质控品：FAM、CY5、ROX和IC（内标）通道：Ct≤35；
阴性质控品：FAM、CY5、ROX 通道无 Ct 值或 Ct>40，VIC（内标）通道Ct≤35；
以上要求必须在一个实验中同时满足。否则，该实验被视为无效，需要重新测试。
（7）、结果判定：
FAM通道检测有明显扩增曲线，且检测Ct值≤40，判定为念珠菌属阳性；
CY5通道检测有明显扩增曲线，且检测Ct值≤40，判定为加德纳杆菌阳性；
ROX通道检测有明显扩增曲线，且检测Ct值≤40，判定为阴道毛滴虫阳性；
FAM通道检测无明显扩增曲线或检测Ct值＞40，VIC（内标）通道检测有明显扩增曲线且检测Ct值≤40，判定念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫阴性或浓度低于试剂盒检出下限；
FAM、ROX、CY5通道检测无明显扩增曲线或检测Ct值＞40，VIC（内标）通道检测无明显扩增曲线或检测Ct值＞40，测试无效，建议临床重新采样并重复测试。具体结果判定标准如表4所示：
表4 检测结果判断标准
实施例4：念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫检测试剂盒对参考品的检测
将实施例1、实施例2所示的引物和探针组合及试剂盒，按照实施例3中的方法对美国标准生物品收藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）的参考品稀释成特定浓度后进行检测。所述参考品包括：白色念珠菌标准菌株，ATCC 10231；光滑念珠菌标准菌株，ATCC 2001；近平滑念珠菌标准菌株，ATCC 22019；热带念珠菌标准菌株，ATCC 750；克柔念珠菌标准菌株，ATCC 6258；加德纳杆菌核酸参考品，ATCC 14019，浓度≥1×105copies/μL；阴道毛滴虫标准菌株，ATCC 30001；阴性临床样本或含人员内参的阴性质控品作为阴性待测样本。
采用实施例1的免提直扩法的实验步骤，将特定浓度梯度的标准菌株参考品进行检测，检测结果如图1-3所示。从图1结果可以看出，采用实施例1设计的引物、探针对5000cfu/mL的五种念珠菌种参考品进行检测，实验结果符合预期，表明本发明的引物和探针组合能够准确的鉴别念珠菌属的念珠菌：白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌；图2-3结果可以看出，采用实施例1设计的引物、探针对加德纳杆菌2000copies/mL、阴道毛滴菌种500 cells/mL参考品进行检测，实验结果符合预期，表明本发明的引物和探针组合能够准确的鉴别加德纳杆菌、阴道毛滴虫。从图4可以看出，阴性质控品的检测结果为阴性。
实施例5：灵敏度试验—念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫检测试剂盒的针对念珠菌属的检测灵敏度
根据实施例3的免提直扩法的实验步骤，将特定浓度梯度的标准菌株参考品进行检测，将前述标准菌株参考品分别使用阴性临床样本梯度稀释至10000 cfu/mL、5000cfu/mL、2000cfu/mL、1000cfu/mL作为待测样本，每个梯度重复测试20次，采用三个独立批次的试剂盒（即实施例1、实施例2的引物和探针组合及构成的试剂盒，总共第一批、第二批、第三批三个生产批次）分别进行检测，以95%检出水平作为最低检测限，结果如下表5-7所示：
表5 念珠菌生殖道拭子样本检测限三批试剂检测结果（第一批）
表6 念珠菌生殖道拭子样本检测限三批试剂检测结果（第二批）
表7 念珠菌生殖道拭子样本检测限三批试剂检测结果（第三批）
表8 念珠菌生殖道拭子样本检测结果统计
从表5-8所示结果可以看出，针对生殖道拭子样本，经三批引物和探针组合各进行20次检测，白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌在样本浓度为
2000 cfu/mL时阳性检出率均在95%以上，热带念珠菌、克柔念珠菌在样本浓度为5000 cfu/mL时阳性检出率均在95%以上，灵敏度较高。
由此可以看出，本发明的引物探针组合试剂，对于念珠菌属的检测灵敏度较高，可以用作念珠菌属核酸检测的试剂盒。
实施例6：灵敏度试验—念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫检测试剂盒的针对加德纳杆菌、阴道毛滴虫的检测灵敏度
根据实施例3的免提直扩法的实验步骤，将特定浓度梯度的标准菌株参考品进行检测，将前述加德纳株参考品使用阴性临床样本梯度稀释至2000 copies/mL、1000copies/mL、500 copies/mL，将前述滴虫参考品分别使用阴性临床样本梯度稀释至500cells/mL、200 cells/mL、100 cells/mL，作为待测样本，每个梯度重复测试20次，采用三个独立批次的试剂盒（即实施例1、实施例2的引物和探针组合及构成的试剂盒，总共第一批、第二批、第三批三个生产批次）分别进行检测，以95%检出水平作为最低检测限，结果如下表9-10所示：
表9 加德纳杆菌、阴道毛滴虫生殖道拭子样本检测限三批试剂检测结果
表10 加德纳杆菌、阴道毛滴虫生殖道拭子样本检测结果统计
从表9-10所示结果可以看出，针对生殖道拭子样本，经三批引物和探针组合各进行20次检测，加德纳杆菌在样本浓度为1000 copies/mL时阳性检出率均在95%以上，阴道毛滴虫在样本浓度为200 cells/mL时阳性检出率均在95%以上，灵敏度较高。
由此可以看出，本发明的引物探针组合试剂，对于加德纳杆菌、阴道毛滴虫的检测灵敏度较高，可以用作加德纳杆菌、阴道毛滴虫核酸检测的试剂盒。
实施例7： 特异性及抗干扰性试验——念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫检测试剂盒的特异性及抗干扰性
1、特异性：针对与念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫检测试剂盒具有同源性、易引起相同或相似临床症状的8种病原体样本作为干扰物样本，样本信息及检测结果如表11-12所示。
表11近似病原体及其浓度
近似病原体 浓度
人乳头瘤病毒 1.00E+06 pfu/mL
单纯疱疹病毒 1.00E+06 pfu/mL
淋球菌 1.00E+06cfu/mL
人支原体 1.00E+06ccu/mL
沙眼衣原体 1.00E+06ccu/mL
解脲脲原体 1.00E+06ccu/mL
B族链球菌 1.00E+06cfu/mL
惰性乳酸杆菌 1.00E+06cfu/mL
表12干扰物样本检测结果
将上述8种干扰物与最低检测限（LOD）浓度的白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌参考品混合作为待测样本，使用不同批次试剂盒进行检测，检测结果如表13所示。
表13 三批试剂竞争性干扰检测结果
表14 三批试剂竞争性干扰检测结果
从表12的检测结果可以看出，针对8种病原体的特异性，经本发明的三批检测试剂检测后，均显示阴性，未出现假阳性的情况。
从表13-14可以看出，8种病原体干扰物与最低检测限浓度的念珠菌属（白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌）、加德纳杆菌、阴道毛滴虫参考品混合后，本发明的三批检测试剂均可成功检出最低检测限浓度的参考品。因此，本发明可以排除不同病原体的干扰，精准的检测出念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫的携带情况。
2 、干扰物：各干扰物及其浓度统计如表14所示，将各干扰物中加入最低检测限浓度的病原体核酸参考品作为待测样本，使用三批次试剂盒对上述待测样本进行检测，检测结果如表15所示。
表15 加入的干扰物及浓度
表16 干扰物检测结果
表17 干扰物检测结果
从表16-17可以看出，本发明在不同浓度的外源干扰物存在的条件下，仍然可以准确的检测出最低检测限浓度的念珠菌属（白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌）、加德纳杆菌、阴道毛滴虫参考品，且Ct值同对照无明显区别。在不同干扰物存在的条件，本发明可以准确的检测出待测样本中念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫的存在情况。
因此，本发明对各种干扰物的抗干扰能力强，对念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫的特异性好。
对比例 分别采用实施例1的探针引物组合与对照组合检测念珠菌属菌、加德纳杆菌、阴道毛滴虫参考品
在采用核酸检测平台中，引物和探针的组合是影响检测能力的关键性因素。在不同的检测条件下，如多种病原体或不同干扰物存在下，要求所用引物和探针组合能保持较高的特异性和灵敏度，同时具有很好的扩增曲线和检测信号强度。对此，发明人设计对照引物和探针组合（详见表18），分别为对照组合1和对照组合2，其中，对照组合1包括：SEQ IDNO:10至SEQ ID NO:15所示的念珠菌属对照引物1-F、念珠菌属对照引物1-R、加德纳杆菌对照引物1-F、加德纳杆菌对照引物1-R、阴道毛滴虫对照引物1-F、阴道毛滴虫对照引物1-R，对照组合2包括：SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:21所示的念珠菌属对照引物2-F、念珠菌属对照引物2-R、加德纳杆菌对照引物2-F、加德纳杆菌对照引物2-R、阴道毛滴虫对照引物2-F、阴道毛滴虫对照引物2-R。
并且，以念珠菌属（白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌）、加德纳杆菌、阴道毛滴虫参考品作为待测样本进行检测，使用ABI 7500平台进行检测，结果如图5-7所示。其中，待测样本中念珠菌属（白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌）参考品浓度均为5000 cfu/mL、加德纳杆菌参考品浓度均为2000 copies/mL、阴道毛滴虫参考品浓度均为500 cells/mL。
表18 本发明对比例引物和探针核苷酸序列
从图5-7结果可以知，相同的念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫模板浓度下，对照组合一和对照组合二的Ct值整体比本发明滞后大约2~4，本发明引物和探针组合不但Ct更低，且荧光信号值大约是对照组合的1.5~2倍，重复性较好。因此，本发明的引物和探针组合的效能更高，灵敏度更高。
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫多重定量PCR检测的试剂盒，其由以下试剂组成：
（1）念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫多重定量PCR检测的引物和探针组合，所述引物和探针组合为：SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的引物28S-F，SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的引物28S-R, SEQ ID No. 3所示核苷酸序列的探针28S-P-FAM；SEQ ID No. 4所示核苷酸序列的引物tuf-F，SEQ ID No. 5所示核苷酸序列的引物tuf-R，SEQ ID No. 6所示核苷酸序列的探针tuf-P-CY5；SEQ ID No. 7所示核苷酸序列的引物AG-F，SEQ ID No. 8所示核苷酸序列的引物AG-R, SEQ ID No. 9所示核苷酸序列的探针AG-P-ROX；所述引物28S-F、引物28S-R、引物tuf-F、引物tuf-R、引物AG-F、引物AG-R的终浓度独立地分别为0.25-0.5μM；探针28S-P-FAM、探针tuf-P-CY5、探针AG-P-ROX的终浓度独立地分别为0.2-0.25μM；
（2）裂解液和稀释液，所述裂解液组分包含：0.05%~2% 的曲拉通100，0.1%~0.5%的聚乙烯吡咯烷酮 K30，0.001%~0.1% 的十二烷基硫酸钠，1mM~50mM的氢氧化钠，20mM~100mM的盐酸胍，10mM~100mM的三羟甲基氨基甲烷；所述稀释液为单一组分，选自无核酸酶水、纯化水、DEPC水、TE缓冲液或PBS缓冲液；
（3）扩增反应液混合物，所述扩增反应液混合物包括PCR缓冲液、dNTP溶液、TaqDNA聚合酶、UDG酶；
（4）阳性质控和阴性质控。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液包括Tris-HCl、MgCl2、KCl和Triton X-100，在PCR缓冲液中Tris-HCl的浓度为10~50mM、MgCl2的浓度为3~6mM，KCl的浓度为10~50mM，Triton X-100的浓度为1%~10%；所述dNTP溶液包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP和dUTP，在dNTP溶液中dATP的浓度为0.1~0.3mM、dTTP的浓度为0.1~0.3mM、dCTP的浓度为0.1~0.3mM、dGTP的浓度为0.1~0.3mM，dUTP的浓度为0.1~0.3mM；在单次检测反应液中包含1.5U~3U的TaqDNA聚合酶和0.5U~2U的UDG酶。
3.权利要求1-2任一项所述的引物和探针组合在制备念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫多重定量PCR检测试剂盒中的应用，所述试剂盒由以下试剂组成：
（1）念珠菌属、加德纳杆菌、阴道毛滴虫多重定量PCR检测的的引物和探针组合，所述引物和探针组合为：SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的引物28S-F，SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的引物28S-R, SEQ ID No. 3所示核苷酸序列的探针28S-P-FAM；SEQ ID No. 4所示核苷酸序列的引物tuf-F，SEQ ID No. 5所示核苷酸序列的引物tuf-R，SEQ ID No. 6所示核苷酸序列的探针tuf-P-CY5；SEQ ID No. 7所示核苷酸序列的引物AG-F，SEQ ID No. 8所示核苷酸序列的引物AG-R, SEQ ID No. 9所示核苷酸序列的探针AG-P-ROX；所述引物28S-F、引物28S-R、引物tuf-F、引物tuf-R、引物AG-F、引物AG-R的终浓度独立地分别为0.25-0.5μM；探针28S-P-FAM、探针tuf-P-CY5、探针AG-P-ROX的终浓度独立地分别为0.2-0.25μM；
（2）裂解液和稀释液，所述裂解液组分包含：0.05%~2% 的曲拉通100，0.1%~0.5%的聚乙烯吡咯烷酮 K30，0.001%~0.1% 的十二烷基硫酸钠，1mM~50mM的氢氧化钠，20mM~100mM的盐酸胍，10mM~100mM的三羟甲基氨基甲烷；所述稀释液为单一组分，选自无核酸酶水、纯化水、DEPC水、TE缓冲液或PBS缓冲液；
（3）扩增反应液混合物，所述扩增反应液混合物包括PCR缓冲液、dNTP溶液、TaqDNA聚合酶、UDG酶；
（4）阳性质控和阴性质控。
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