JP5927243B2 - 眼および中枢神経系の細菌、真菌、寄生虫およびウイルス感染の同時検出と識別のための新規な方法 - Google Patents
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Description
1. 角膜炎や結膜炎のような外眼部感染症
2. 感染性眼球内炎
3. ブドウ膜炎
4. 網膜炎
単純ヘルペス(角膜炎を引き起こす)
・アデノウイルス角結膜炎(時折流行する)
・クラミジア・トラコマティス(トラコーマおよび成人封入体性結膜炎に繋がる濾胞性結膜炎を引き起こす)
・水痘結膜炎(帯状疱疹結膜炎とも呼ばれる)
・M.ケロネーや M.フォーチュイタムのような急速に生育するマイコバクテリア(屈折異常を減らすために実施される近視矯正手術(LASIK)後の感染を引き起こす)
・グラム陽性細菌
・グラム陰性細菌
・嫌気性微生物、すなわちプロピオニバクテリウム・アクネス
・真菌
・マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis;結核菌)
・マイコバクテリウム・ケロネー(Mycobacterium chelonae)
・マイコバクテリウム・フォーチュイタム(Mycobacterium fortuitum)
・トキソプラズマ・ゴンジイ(Mycobacterium gondii)
・サイトメガロウイルス
・単純ヘルペスウイルス
・水痘帯状疱疹ウイルス
急性化膿性髄膜炎:一般的に子供にみられ、次に示すような微生物に起因する。
・ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)
・髄膜炎菌(Neisseria meningitides)および
・肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)
・マイコバクテリウム・ツベルクローシス
・様々な真菌
・一連の治療で対応できるウイルスすなわちHSV、CMVやVZVに起因するウイルス性脳炎
臨床サンプルから病原体(細菌、酵母および他の真菌、寄生虫およびウイルス)を検出する古典的な方法として、標準的な検査室試験で同定し数値化できるよう存在する病原体の数を観察可能なコロニー生育に増やすためのサンプルの培養が挙げられる。所望により培養物は薬剤治療への病原体の感度を測定するための追加検査に付される。感染種の正確な同定のために臨床医は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの場合は3日(急速に増殖するマイコバクテリアを含む大部分の細菌の場合)から8週までの日数を必要とする培養結果に頼らなくてはならない。細菌の種類を正確に同定するために、培養は日数を追加したり週単位を必要とすることさえある長期にわたる生化学検査によることになる。多くの場合、その疾患の重症度や即時薬剤介入の必要性のためにこの測定を迅速に実施することが重要である。ここで述べる培養技術は一般に細菌感染や真菌感染の診断において有用であり、特に臨床サンプルから培養してウイルスが単離される頻度は15%より少ないことからウイルス感染の診断目的のためには通常用いられない。
・眼と脳の感染は非常に局在化している。血液、血清、血漿、唾液または膿または外傷あるいは潰瘍からの膿状の分泌物のような容易に得られる生物学的液体中に原因となる病原体の痕跡がない。
・C反応性タンパク質のような何らかの急性感染での推定上のバイオマーカーは一般的であり、人体をひどく苦しめている全ての感染に共通性がある。すなわちこれは非特異的である。
・原因となる特異的な病原体を同定するために、眼またはCSFからのサンプルが必要である。手に入るサンプルは角膜感染では角膜小片、結膜炎では結膜綿棒、眼球内炎では眼房水、ブドウ膜炎と網膜炎では硝子体液である。脳感染の場合に好まれるサンプルは常にCSFである。これら全てのサンプルで1回の患者との対面で得られるサンプル量には限りがある。一般的に角膜小片あるいは綿棒のおそらく2から3mgのサンプルで数千の細胞が得られる。患者の眼からいつでも採取することができる眼房水は約100μLであり、硝子体切断手術サンプルで200μLまでである。5mlまでのCSFサンプルは採取できるが、PCRで必要とするCSFのサンプル量は0.5mlより少ない。
・サンプル量の限度に付随してサンプル中に存在する細菌/ウイルス/寄生虫の数が限られている。加えて感染病原体の量は血液のような多くの他の体の部位に観察される量の病原体よりも少ない。
・サンプル中に存在する感染性の粒子の総計は、検出の成功とまさに比例している。ある決定的な量以下では、感染性病原体である細菌や真菌は培養で増殖しなくなり診断が困難になる。眼標本中に存在するウイルス粒子の数は検出感度を25%未満にするウイルス培養と同様に一般的に蛍光抗体検出検査の検出限度以下である。トキソプラズマ・ゴンジイのような寄生虫に対しては容易な検出系はなく、また寄生虫の数は検出するには少なすぎる。HSV、CMV、VZV、アデノウイルス、クラミジアおよびトキソプラズマのためのIgMまたはIgG検出のような検査は非常に非特異的であり診断上の意義はない。
・診断におけるもう一つの大きな問題は、上述してきた眼の全ての問題が急性的な性格であり、適切な治療を開始するためにも即刻正確な診断を必要とすることである。48時間以上遅くなると感染性眼球内炎の場合では失明に至り、ウイルス感染に起因する壊死性網膜炎では最初の症状の発現から96時間以内に治療する必要がある。
(Ecker, David J.: Griffey Richard 11.: Sampath, Rangarajan; Hofstandler, Steven A.: Meneil, John; Crooke, Sstanley T.(USA). U.S. Pat. Appl. Publ.(2004), 168 pp. Cont.-in-part of U.S. Ser. No. 323,233. Application:US 2003-660122 20030911. Priority:US 2001-798007 20010302; US 2002-431319 20021206; US 2002-323233 20021218; US 2002-326051 20021218; US 2002-325526 20021218; US 2002-325527 20021218; US 2003-443443 20030129; US 2003-443788 20030130; US 2003-447529 20030214)。
“ヌクレオチド”は、ひとつの窒素塩基、ひとつのフォスフェート分子、およびひとつの糖分子からなるDNAまたはRNAのビルディングブロックを意味する(DNA中のデオキシリボース、RNA中のリボース)。
i) 一般的な方法によってDNAを単離するため、眼またはCNS感染で苦しんでいると疑われる患者の角膜小片または結膜綿棒または眼房水または硝子体液または採取された硝子体切断洗浄液または髄液吸引液または脳膿瘍材料から採取された膿または網膜上膜のような臨床サンプルのプロセッシング。
2. 単純ヘルペスウイルス 1 & 2 UL 44 遺伝子
3. 単純ヘルペスウイルス 1 & 2 DNA ポリメラーゼ遺伝子
4. サイトメガロウイルス糖蛋白 O 遺伝子
5. サイトメガロウイルス形態学的形質転換遺伝子
6. サイトメガロウイルス UL 88 遺伝子
7. 水痘帯状疱疹 ORF 29
8. 水痘帯状疱疹 DNA ポリメラーゼ遺伝子
9. アデノウイルスヘキソン遺伝子
10. ユーバクテリア16s リボソーマル RNA 遺伝子 I
11. ユーバクテリア16s リボソーマル RNA 遺伝子領域 II
12. 16s リボソーマル RNA 遺伝子のグラム陽性細菌特異的領域
13. マイコバクテリウム・ツベルクローシス MPB 64 遺伝子
14. マイコバクテリウム・フォーチュイタム16s-23s RNA 遺伝子
15. マイコバクテリウム・ケロネー16s-23s RNA 遺伝子
16. トキソプラズマ・ゴンジイ B 1 遺伝子
17. クラミジア・トラコマティス 多形蛋白 II
18. 28s リボソーマル RNA 遺伝子の真菌特異的領域
19. 16s-23s リボソーマル RNA 遺伝子のプロピオネバクテリウム アクネ特異的領域 20. gyr B 遺伝子のグラム陰性細菌特異的領域
21. グラム陰性細菌のアコニテートヒドラターゼ遺伝子
22. グラム陰性リボヌクレアーゼ 1 遺伝子
それ故、公知の生化学的に有用な情報を取り入れた方法(bioinformatic methods)を用いてPCR増幅産物に相補的である適切なPCRプライマーおよびターゲットDNA配列をデザインする可能性を探求する必要が考えられた。
2. SEQ ID No 3 and 4 FP: 5' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3'(SEQ ID No.3)& RP: 5' cgggggggtcttgcgttac 3'(SEQ ID No.4)からなるプライマーセット2により増幅された単純ヘルペスウイルス 1 & 2 UL 44遺伝子
3. SEQ ID No 5 and 6 FP: 5' caagctgacggacatttacaagg 3'SEQ ID No.5)& RP: 5' gtcccacacgcgaaacacg 3'(SEQ ID No.6)からなるプライマーセット3により増幅された単純ヘルペスウイルス 1 & 2 DNAポリメラーゼ遺伝子
4. SEQ ID No 7 and 8 FP: 5' ttccggctcatggcgttaacc 3'(SEQ ID No.7)& RP: 5' cgccctgcttttacgttacgc 3'(SEQ ID No.8)からなるプライマーセット4により増幅されたサイトメガロウイルス糖蛋白O遺伝子
5. SEQ ID No 9 and 10 FP: 5' cggcgacgacgacgataaag 3'(SEQ ID No.9)& RP: 5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3'(SEQ ID No.10)からなるプライマーセット5により増幅されたサイトメガロウイルスの形態学的形質転換遺伝子
6. SEQ ID No 11 and 12 FP: 5' gggcacgtcctcgcagaag 3'(SEQ ID No.11)& RP: 5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3'(SEQ ID No.12)からなるプライマーセット6により増幅されたサイトメガロウイルスUL 88 遺伝子
7. SEQ ID No 13 and 14 FP: 5' ggtcttgccggagctggtattac 3'(SEQ ID No.13)& RP: 5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3'(SEQ ID No.14)からなるプライマーセット7により増幅された水痘帯状疱疹ORF 29
8. SEQ ID No 15 and 16 FP: 5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3'(SEQ ID No.15)& RP: 5' acgttccggtagcgagttatctg 3'(SEQ ID No.16)からなるプライマーセット8により増幅された水痘帯状疱疹DNAポリメラーゼ遺伝子
9. SEQ ID No 17 and 18 FP: 5' cgccgccaacatgctctacc 3'(SEQ ID No.17)& RP: 5' gttgcgggaggggatggata 3'(SEQ ID No.18)からなるプライマーセット9により増幅されたアデノウイルスヘキソン遺伝子
10. SEQ ID No 19 and 20 FP: 5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3'(SEQ ID No.19)& RP: 5' cggactacgatcggttttgtgaga 3'(SEQ ID No.20)からなるプライマーセット10により増幅されたユーバクテリア 16s リボソーマルRNA遺伝子領域 I
11. SEQ ID No 21 and 22 FP: 5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3(SEQ ID No.21)& RP: 5' ggcagattcctaggcattactcacc 3(SEQ ID No.22)からなるプライマーセット11により増幅されたユーバクテリア 16s リボソーマルRNA遺伝子領域 II
12. SEQ ID No 23 and 24 FP: 5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3'(SEQ ID No.23)& RP: 5' tgcagccctttgtaccgtccat 3'(SEQ ID No.24)からなるプライマーセット12により増幅された16s リボソーマルRNA遺伝子のグラム陽性細菌特異的領域
13. SEQ ID No 25 and 26 FP: 5' gcggaacgtgggaccaatac 3'(SEQ ID No.25)& RP: 5' cgacggggtgattttcttcttc 3'(SEQ ID No.26)からなるプライマーセット13により増幅されたマイコバクテリウム・ツベルクローシス MPB 64 遺伝子
14. SEQ ID No 27 and 28 FP: 5' aacttttttgactgccagacacactattg 3'(SEQ ID No.27)& RP: 5' ggatgccaccccccaaaag 3'(SEQ ID No.28)からなるプライマーセット14により増幅されたマイコバクテリウム・フォーチュイタム16s-23s RNA遺伝子
15. SEQ ID No 29 and 30 FP: 5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3'(SEQ ID No.29)& RP: 5' gacgttttgccgactacctatcc 3(SEQ ID No.30)からなるプライマーセット15により増幅されたマイコバクテリウム・ケロネー 16s−23s RNA遺伝子
16. SEQ ID No 31 and 32 FP: 5' cccctctgctggcgaaaagtg 3'(SEQ ID No.31)& RP: 5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3'(SEQ ID No.32)からなるプライマーセット17により増幅されたトキソプラズマ・ゴンジイ B 1 遺伝子
17. SEQ ID No 33 and 34 FP: 5' aatcgtatctcgggttaatgttgc 3'(SEQ ID No.33)& RP:5' tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3' (SEQ ID No.34)からなるプライマーセット18により増幅されたクラミジア・トラコマティス多型蛋白II
18. SEQ ID No 35 and 36 FP: 5' gctgggactgaggactgcgac 3'(SEQ ID No.35)& RP: 5' ttcaagacgggcggcatataac 3(SEQ ID No.36)からなるプライマーセット19により増幅された28sリボソーマルRNA遺伝子の真菌特異的領域
19. SEQ ID No 37 and 38 FP: 5' tggcgaacgggtgagtaaca 3'(SEQ ID No.37)& RP: 5' ccggtattagccccagtttcc 3'(SEQ ID No.38)からなるプライマーセット20により増幅された16s−23sリボソーマルRNA遺伝子のプロピオニバクテリウム・アクネス特異的領域
20. SEQ ID No 39 and 40 FP: 5' cggcggcaagttcgacgac 3'(SEQ ID No.39)& RP: 5' ccaccgagacgcccacacc 3'(SEQ ID No.40)からなるプライマーセット21により増幅されたgyr B 遺伝子のグラム陰性細菌特異的部分
21. SEQ ID No 41 and 42 FP: 5' ccaggtcggcggagaagc 3'(SEQ ID No.41)& RP: 5' ccaccggcccgatgacc 3'(SEQ ID No.42)からなるプライマーセット22により増幅されたグラム陰性細菌アコニテートヒドラターゼ遺伝子
22. SEQ ID No 43 and 44 FP: 5' gccgccctgaccaccttc 3'(SEQ ID No.43)& RP: 5' gcgggttgttcggcatcag 3'(SEQ ID No.44)からなるプライマーセット23により増幅されたグラム陰性リボヌクレアーゼ 1 遺伝子
1. (FP: 5' cgcttggtttcggatgggag 3'(SEQ ID No.1)& RP: 5' gcccccagagacttgttgtagg 3' (SEQ ID No.2)からなるプライマーセット1により増幅された)単純ヘルペスウイルス 1 & 2 糖蛋白D遺伝子のプローブ DNA 配列である “cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggc”(SEQ ID No. 45) 2. (FP: 5' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3'(SEQ ID No.3)& RP: 5' cgggggggtcttgcgttac 3'(SEQ ID No.4)からなるプライマーセット2により増幅された)単純ヘルペスウイルス 1 & 2 UL 44遺伝子のプローブ DNA 配列である “ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacgcaagacccccccg”(SEQ ID No. 46)
3. (FP: 5' caagctgacggacatttacaagg 3'(SEQ ID No.5)& RP: 5' gtcccacacgcgaaacacg 3'(SEQ ID No.6)からなるプライマーセット3により増幅された)単純ヘルペスウイルス 1 & 2 DNAポリメラーゼ遺伝子のプローブ DNA 配列である “caagctgacggacatttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccggggcgtgtttcgcgtgtgggac”(SEQ ID No. 47)
4. (FP: 5' ttccggctcatggcgttaacc 3'(SEQ ID No.7)& RP: 5' cgccctgcttttacgttacgc 3'(SEQ ID No.8))からなるプライマーセット4により増幅された)サイトメガロウイルス糖蛋白O遺伝子のプローブDNA 配列である “ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacgtaaaagcagggcg”(SEQ ID No. 48)
5. (FP: 5' cggcgacgacgacgataaag 3'(SEQ ID No.9)& RP: 5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3'(SEQ ID No.10)からなるプライマーセット5により増幅された)サイトメガロウイルス形態学的形質転換領域II遺伝子のプローブDNA配列である “cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcgtccagaggattacgcgaccagattg”(SEQ ID No.49)
6. (FP: 5' gggcacgtcctcgcagaag 3'(SEQ ID No.11)& RP: 5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3’(SEQ ID No.12)からなるプライマーセット6により増幅された)サイトメガロウイルス UL 88 遺伝子のプローブDNA配列である “gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccttgacgtactggtcacctatcacctgcatcttgg”(SEQ ID No.50)
7. (FP: 5' ggtcttgccggagctggtattac 3'(SEQ ID No.13)& RP: 5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3'(SEQ ID No.14)からなるプライマーセット7により増幅された)水痘帯状疱疹ORF29 のプローブDNA配列である “ggtcttgccggagctggtattaccttaaaactcactaccagtcatttctatccatctgtctttgtctttcacggaggca”(SEQ ID No. 51)
8. (FP: 5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3'(SEQ ID No.15)& RP: 5' acgttccggtagcgagttatctg 3'(SEQ ID No.16)からなるプライマーセット8により増幅された)水痘帯状疱疹DNAポリメラーゼ遺伝子のプローブDNA配列である “tccatttaacgttgcatcattttgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaatacagataactcgctaccggaacgt”(SEQ ID No. 52)
9. (FP: 5' cgccgccaacatgctctacc 3'(SEQ ID No.17)& RP: 5' gttgcgggaggggatggata 3'(SEQ ID No.18)からなるプライマーセット9により増幅された)アデノウイルスヘキソン遺伝子のプローブDNA配列である “cgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaac”(SEQ ID No. 53)
10. (FP: 5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3'(SEQ ID No.19)& RP: 5' cggactacgatcggttttgtgaga 3'(SEQ ID No.20)からなるプライマーセット10により増幅された)ユーバクテリア 16s リボソーマルRNA遺伝子領域IのプローブDNA配列である “tgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccg”(SEQ ID No. 54)
11. (FP: 5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3(SEQ ID No.21)& RP: 5' ggcagattcctaggcattactcacc 3(SEQ ID No.22)からなるプライマーセット11により増幅された)ユーバクテリア 16s リボソーマルRNA遺伝子領域IIのプローブDNA配列である“ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcc”(SEQ ID No. 55)
12. (FP: 5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3'(SEQ ID No.23)& RP: 5' tgcagccctttgtaccgtccat 3'(SEQ ID No.24)からなるプライマーセット12により増幅された)16s リボソーマルRNA遺伝子のグラム陽性細菌特異的領域のプローブDNA配列である“acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagggctgca”(SEQ ID No. 56) 13. (FP: 5' gcggaacgtgggaccaatac 3'(SEQ ID No.25)& RP: 5' cgacggggtgattttcttcttc 3’(SEQ ID No.26)からなるプライマーセット13により増幅された)マイコバクテリウム・ツベルクローシス MPB64 遺伝子のプローブDNA配列である “gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggttgaagaagaaaatcaccccgtcg”(SEQ ID No. 57)
14. (FP: 5' aacttttttgactgccagacacactattg 3'(SEQ ID No.27)& RP: 5’ ggatgccaccccccaaaag 3'(SEQ ID No.28)からなるプライマーセット14により増幅された)マイコバクテリウム・フォーチュイタム 16s−23s RNA遺伝子のプローブDNA配列である“aacttttttgactgccagacacactattgggctttgagacaacaggcccgtgccccttttggggggtggcatcc”(SEQ ID No. 58)
15. (FP: 5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3'(SEQ ID No.29)& RP: 5' gacgttttgccgactacctatcc 3(SEQ ID No.30)からなるプライマーセット15により増幅された)マイコバクテリウム・ケロネー 16s−23s RNA遺伝子のプローブDNA配列である“tggttactcgcttggtgaatatgttttataaatcctgtccaccccgtggataggtagtcggcaaaacgtc”(SEQ ID No. 59)
16. (FP: 5' cccctctgctggcgaaaagtg 3'(SEQ ID No.31)& RP: 5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3'(SEQ ID No.32)からなるプライマーセット16により増幅された)トキソプラズマ・ゴンジイ B 1遺伝子のプローブDNA配列である “cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattcgcagattggtcgcc”(SEQ ID No. 60)
17. (FP:5' aatcgtatctcgggttaatgttgc 3'(SEQ ID No.33) & RP:5' tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3'(SEQ ID No.34)からなるプライマーセット17により増幅された)クラミジア・トラコマティス多型蛋白IIのプローブDNA配列である “aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgctttatcaaatgacaagcttagatccgtttctcatacggttttcctcga”(SEQ ID No. 61)
18. (FP: 5' gctgggactgaggactgcgac 3'(SEQ ID No.35)& RP: 5' ttcaagacgggcggcatataac 3(SEQ ID No.36)からなるプライマーセット18により増幅された)28s リボソーマルRNA遺伝子の真菌特異的領域のプローブDNA配列である “gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaa”(SEQ ID No. 62)
19. (FP: 5' tggcgaacgggtgagtaaca 3'(SEQ ID No.37)& RP: 5' ccggtattagccccagtttcc 3' (SEQ ID No.38)からなるプライマーセット19により増幅された)16s−23s リボソーマルRNA遺伝子のプロピオニバクテリウム・アクネス特異的領域のプローブDNA配列である “tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataacttcaggaaactggggctaataccgg”(SEQ ID No. 63)
20. (FP: 5' cggcggcaagttcgacgac 3'(SEQ ID No.39)& RP: 5' ccaccgagacgcccacacc 3'(SEQ ID No.40)からなるプライマーセット20により増幅された)gyr B 遺伝子のグラム陰性細菌特異的部分のプローブDNA配列である “cggcggcaagttcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgggcgtctcggtgg”(SEQ ID No. 64)
21. (FP: 5' ccaggtcggcggagaagc 3'(SEQ ID No.41)& RP: 5' ccaccggcccgatgacc 3' (SEQ ID No.42)からなるプライマーセット21により増幅された)グラム陰性細菌アコニテートヒドラターゼ遺伝子のプローブDNA配列である “ccaggtcggcggagaagccgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcgggtcatcgggccggtgg”(SEQ ID No. 65)
22. (FP: 5' gccgccctgaccaccttc 3'(SEQ ID No.43)& RP: 5' gcgggttgttcggcatcag 3' (SEQ ID No.44)からなるプライマーセット22により増幅された)グラム陰性リボヌクレアーゼ1 遺伝子のプローブDNA配列である “gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgttacctggtgctgatgccgaacaacccgc”(SEQ ID No. 66)
本発明の他の実施形態によると、SEQ ID Nos 67−88を有するターゲット配列は、コンピュータプログラムを使用してプローブ配列から作られた。それらのターゲットはナイロンのような不活性基盤上で固定のために使用され、紫外線放射または化学的固定でクロスリンクされる。本ターゲットは次の基準に従って選ばれた:
1. 全てのターゲット配列は病原体に特異的であり、他の病原体のどの配列とも重複しない。
2. 全てのターゲット配列は23から38の塩基長の範囲のサイズの中にある。
3. 全てのターゲットは58.9℃から88℃の範囲で一定の融点を有している。
4. 本ターゲット配列は増幅産物領域に存在し、フォワードまたはリバースプライマー配列を含まないことから(SEQ ID No 67−91を有する)ラベルされたプローブはそれらターゲットに非特異的には結合しない。
5. 全てのターゲットは一般的に全てのヌクレオチド塩基とマッチするというやり方でデザインされる。しかしながら、もし幾つかのプローブでミスマッチがあれば、そのミスマッチはプローブの間でふたつのヌクレオチドの最大側に限られることになりハイブリダイゼーションは保障される。
1. プライマーセット1により増幅されたHSV糖蛋白D のための5’gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3’(SEQ ID No. 67)ターゲット
2. プライマーセット2により増幅されたHSV UL 44のための 5’cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3’(SEQ ID No. 68)ターゲット
3. プライマーセット3により増幅されたHSVポリメラーゼ遺伝子のための 5’tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3’(SEQ ID No. 69)ターゲット
4. プライマーセット4により増幅されたCMVの糖蛋白Oのための 5’aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3’(SEQ ID No. 70)ターゲット
5. プライマーセット5により増幅されたサイトメガロウイルスの形態学的形質転換遺伝子IIのための 5’aatacaaagccgcagtgtcgtc 3’(SEQ ID No. 71)ターゲット
6. プライマーセット6により増幅されたサイトメガロウイルスの UL 88 遺伝子のための 5’gactccaggtacaccttgacgtactg 3’(SEQ ID No. 72)ターゲット
7. プライマーセット7により増幅された水痘帯状疱疹ウイルスの ORF 29 遺伝子のための 5’cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3’(SEQ ID No. 73)ターゲット
8. プライマーセット8により増幅された水痘帯状疱疹ウイルスのDNAポリメラーゼ遺伝子のための 5’ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3’(SEQ ID No. 74)ターゲット
9. プライマーセット9により増幅されたアデノウイルスのヘキソン遺伝子のための 5’ ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3’(SEQ ID No. 75)ターゲット
10. プライマーセット10により増幅されたユーバクテリア 16 s リボソーマル遺伝子領域Iのための 5’tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3’(SEQ ID No. 76)ターゲット
11. プライマーセット11により増幅されたユーバクテリア 16 s リボソーマル遺伝子領域IIのための 5’ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3’(SEQ ID No. 77)ターゲット
12. プライマーセット12により増幅されたグラム陽性微生物の 16s リボソーマル遺伝子のための 5’gacctgggctacacacgtgctaca 3’(SEQ ID No. 78)ターゲット
13. プライマーセット13により増幅されたマイコバクテリウム・ツベルクローシスの MPB 64 遺伝子のための 5’ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3’(SEQ ID No. 79)ターゲット
14. プライマーセット14により増幅されたマイコバクテリウム・フォーチュイタムの 16s−23s RNA遺伝子のための 5’ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3’(SEQ ID No. 80) ターゲット
15. プライマーセット15により増幅されたマイコバクテリウム・ケロネーの 16s−23s RNA遺伝子のための 5’tttataaatcctgtccaccccgt 3’(SEQ ID No. 81)ターゲット
16. プライマーセット16により増幅されたトキソプラズマ・ゴンジイのB1遺伝子のための 5’aaattcatgagtatctgtgcaactttg 3’(SEQ ID No. 82)ターゲット
17. プライマーセット17により増幅されたクラミジア・トラコマティスの多型蛋白IIのための 5’atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc 3’(SEQ ID No. 83)ターゲット
18. プライマーセット18により増幅された全ての真菌の 28s リボソーマルRNA遺伝子のための 5’gtaagtcaaggatgctggcataatg 3’(SEQ ID No. 84)ターゲット
19. プライマーセット19により増幅されたプロピオニバクテリウム・アクネスの16s リボソーマルRNA遺伝子のための 5’gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3’(SEQ ID No. 85)ターゲット
20. プライマーセット20により増幅されたグラム陰性微生物のジャイレース遺伝子のための 5’aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3’(SEQ ID No. 86)ターゲット
21. プライマーセット21により増幅されたグラム陰性微生物のアコニテートヒドラターゼ遺伝子のための 5’cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3’(SEQ ID No. 87)ターゲット
22. プライマーセット22により増幅されたグラム陰性微生物のリボヌクレアーゼ遺伝子のための 5’atcagcctggccggccgttacctggtg 3’(SEQ ID No. 88)ターゲット
a) 前記感染に苦しんでいる患者からの臨床サンプルの採取、
b) ステップaで得られた一部または全サンプルからのDNAの抽出、
c) ビオチンまたは蛍光トレーサーでラベルされた請求項1に記載のプライマーのプールおよびPCRの標準試薬を用いてステップbで得られたDNAのためのマルチプレックスPCRの実施、
d) ステップcで得られたPCR産物の変性、
e) 固体基盤上に固定されたターゲットを用いたステップdで得られたPCR産物のハイブリダイジング、
f) 酵素または蛍光法により固体基盤上でステップeで得られたDNAハイブリッドの検出。
a) 前述のフォワードおよびリバースプライマーのプール、
b) 適切な固体支持体上に固定した前述のDNAターゲットのマトリックス、
c) ポリメラーゼ連鎖反応によるDNAの増幅に必要な標準試薬、
d) DNAプローブの固定されたマトリックスにPCR増幅産物をハイブリダイズするのに必要な標準試薬、
e) 特異的原因病原体の検出と識別のためのハイブリダイズされた最終産物を検出するために必要な標準試薬。
a) 前記感染に苦しんでいる患者からの臨床サンプルの採取、
b) ステップaで得られた一部または全サンプルからのDNAの抽出、
c) ビオチンまたは蛍光トレーサーでラベルされた前述のプライマーのプールおよびPCRの標準試薬を用いてステップbで得られたDNAのためのマルチプレックスPCRの実施、 d) ステップcで得られたPCR産物の変性、
e) 固体基盤上に固定された前述のターゲットを用いたステップdで得られたPCR産物のハイブリダイジング、
f) 酵素または蛍光法により固体基盤上でステップeで得られたDNAハイブリッドの検出。
間の変性ステップ、引き続いて60℃で45秒、72℃で45秒および94℃で45秒のサイクルを40回繰り返し、続いて72℃で10分間の伸長反応で行った。上述のPCR混合物の五つのチューブを次のDNA調製法、すなわちDNAを入れていないチューブNC、5 fgのE.coli由来DNAを入れたチューブ1、10 fgの黄色ブドウ球菌(S.aureus)DNAを入れたチューブ2、10 fg のP.アクネスDNAを入れたチューブ3および10 fgのC.アルビカンスDNAを入れたチューブ4で培養した。図7は0.26 N NaOH中SEQ ID No. 76、77、78、84、85、86、87および88を有する100pmoleのターゲットでそれぞれスポットした五つのナイロン膜を示す。本膜を37℃で1時間、0.1% SDSおよび1% BSAを含んだ2X SSPEでブロックした。増幅産物を95℃で10分間加熱し、0.1% SDSを含む2X SSPEに混ぜ、52℃で2時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、膜を0.1% SDSを含む 1X SSPEで3分間洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。膜を1% BSA、150mMのNaClおよび0.3% tween-20を含んだ0.1 MのTris-HCl(pH 7.4)中ストレプトアビジンパーオキシダーゼ複合体(Streptavidin peroxidase conjugate)とともに培養した。37℃で30分後、膜を同じバッファで3分洗浄し、この洗浄を5回繰り返した。発色のため、膜を37℃で10分間、ホスフェートでバッファされた生理食塩水1ml あたり0.5mgのジアミノベンジジン塩酸塩を用いて培養した。茶色のスポットが出現すると特異的な病原体の存在を示したことになる。
2. 感染の非常に早期の段階で特異的な病原体の同定により臨床医がその病気の進展と治癒に対して適切な治療法を選択するのを助けるものである。
3. 同じサンプルでの複合感染の同定も同様に効果的な治療のための薬剤併用療法を有用なものとさせるものである。
Claims (4)
- 感染性眼球内炎、角膜炎、ブドウ膜炎、網膜炎、髄膜炎または脳炎からなる群から選ばれる症候群を引き起こす特異的な病原体の検出および識別のための、病原体に特異的なDNAプローブの組み合わせであって、当該組み合わせが:
1. プローブDNA配列 “cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtaca
ccgaatgctcctacaacaagtctctgggggc”(SEQ ID No. 45)
2. プローブDNA配列 “ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacg
caagacccccccg”(SEQ ID No. 46)
3. プローブDNA配列 “caagctgacggacatttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccg
gggcgtgtttcgcgtgtgggac”(SEQ ID No. 47)
4. プローブDNA配列 “ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaa
cgtaaaagcagggcg”(SEQ ID No. 48)
5. プローブDNA配列 “cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcgtccagaggattacgc
gaccagattg”(SEQ ID No.49)
6. プローブDNA配列 “gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccttgacgtactggtcacctatca
cctgcatcttgg”(SEQ ID No.50)
7. プローブDNA配列 “ggtcttgccggagctggtattaccttaaaactcactaccagtcatttctatccatct
gtctttgtctttcacggaggca”(SEQ ID No. 51)
8. プローブDNA配列 “tccatttaacgttgcatcattttgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaag
taatacagataactcgctaccggaacgt”(SEQ ID No. 52)
9. プローブDNA配列 “cgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccat
cccctcccgcaac”(SEQ ID No. 53)
10. プローブDNA配列 “tgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtgg
agctaatctcacaaaaccgatcgtagtccg”(SEQ ID No. 54)
11. プローブDNA配列 “ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggc
ggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcc”(SEQ ID No. 55)
12. プローブDNA配列 “acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacg
gtacaaagggctgca”(SEQ ID No. 56)
13. プローブDNA配列 “gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccc
cgggttgaagaagaaaatcaccccgtcg”(SEQ ID No. 57)
14. プローブDNA配列 “aacttttttgactgccagacacactattgggctttgagacaacaggcccgtgcccc
ttttggggggtggcatcc”(SEQ ID No. 58)
15. プローブDNA配列 “tggttactcgcttggtgaatatgttttataaatcctgtccaccccgtggataggta
gtcggcaaaacgtc”(SEQ ID No. 59)
16. プローブDNA配列 “cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattc
gcagattggtcgcc”(SEQ ID No. 60)
17. プローブDNA配列 “aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc
gtttctcatacggttttcctcga”(SEQ ID No. 61)
18. プローブDNA配列 “gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgcc
gcccgtcttgaa”(SEQ ID No. 62)
19. プローブDNA配列 “tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataacttca
ggaaactggggctaataccgg”(SEQ ID No. 63)
20. プローブDNA配列 “cggcggcaagttcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgg
gcgtctcggtgg”(SEQ ID No. 64)
21. プローブDNA配列 “ccaggtcggcggagaagccgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcgggtcat
cgggccggtgg”(SEQ ID No. 65)
22. プローブDNA配列 “gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgttacctggtgctgatgccg
aacaacccgc”(SEQ ID No. 66)
からなることを特徴とする、病原体に特異的なDNAプローブの組み合わせ。 - 前記DNAプローブを発色産物の形成によって検出されるようにビオチン部位を用いて5’末端をラベルする請求項1に記載の病原体に特異的なDNAプローブの組み合わせ。
- 前記DNAプローブを何らかの蛍光走査装置または顕微鏡で検出を可能にする、蛍光イソチオシアナートFITCからなるグループより選択される有機蛍光ラベル、またはQuantum DotsTM、Cy3またはCy5のような無機蛍光ナノ粒子のような蛍光ラベルによってラベルする請求項1に記載の病原体に特異的なDNAプローブの組み合わせ。
- 58.9℃から83℃の範囲で一定の融点を持ち、固相基盤上で固定した後、感染性眼球内炎、角膜炎、ブドウ膜炎、網膜炎、髄膜炎または脳炎からなる群から選ばれる症候群を引き起こす特異的な病原体を更に検出および識別するためのハイブリダイゼーション中に使用される増幅した配列に相補的であるDNAターゲットの組み合わせで、その組み合わせは:
1. 5’gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3’ (SEQ ID No. 67)
2. 5’cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3’ (SEQ ID No. 68)
3. 5’tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3’ (SEQ ID No. 69)
4. 5’aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3’(SEQ ID No. 70)
5. 5’aatacaaagccgcagtgtcgtc 3’(SEQ ID No. 71)
6. 5’gactccaggtacaccttgacgtactg 3’(SEQ ID No. 72)
7. 5’cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3’(SEQ ID No. 73)
8. 5’ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3’(SEQ ID No. 74)
9. 5’ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3’(SEQ ID No. 75)
10. 5’tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3’(SEQ ID No. 76)
11. 5’ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3’(SEQ ID No. 77)
12. 5’gacctgggctacacacgtgctaca 3’(SEQ ID No. 78)
13. 5’ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3’(SEQ ID No. 79)
14. 5’ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3’(SEQ ID No. 80)
15. 5’tttataaatcctgtccaccccgt 3’(SEQ ID No. 81)
16. 5’aaattcatgagtatctgtgcaactttg 3’(SEQ ID No. 82)
17. 5’atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc 3’(SEQ ID No. 83)
18. 5’gtaagtcaaggatgctggcataatg 3’(SEQ ID No. 84)
19. 5’gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3’(SEQ ID No. 85)
20. 5’aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3’(SEQ ID No. 86)
21. 5’cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3’(SEQ ID No. 87)
22. 5’atcagcctggccggccgttacctggtg 3’(SEQ ID No. 88)
からなることを特徴とする、DNAターゲットの組み合わせ。
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