TWI410491B - 眼睛與中樞神經系統之細菌、黴菌、寄生蟲及病毒感染之新穎同步檢測及鑑別方法 - Google Patents
眼睛與中樞神經系統之細菌、黴菌、寄生蟲及病毒感染之新穎同步檢測及鑑別方法 Download PDFInfo
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Description
本發明係關於一種診斷方法，用於在許多可能引起感染之病原體間，鑑定眼與神經系統感染之單一病原體或一種以上之病原體。所有侵襲眼睛或神經系統之個別區域的病原體一般都會引起相同的臨床徵狀或症候群。本發明係關於可在一組可能之病原體間，不需依賴一系列各別針對檢測單一病原體之試驗，於單一試驗中檢測及區別病原體。本發明之目的在於以症候群基礎診斷取代依個別病原體檢測之診斷。
根據解剖學上腔室的蓄留及因此所造成之感染可將眼睛感染臨床分類，許多可引起眼感染的病原體被詳細敘述於“Principles and Practice of Infectious Diseases,6th
Edition,Gerald Mandell et al(Eds)Elsevier Churchill Livingston,pp 1387-1418(2005)”，該揭示於本文中一併作為參考。
眼睛感染可根據臨床初步診斷分類成以下種類：
1.外眼感染，例如角膜炎及結膜炎
2.感染性眼內炎
3.葡萄膜炎
4.視網膜炎
許多外眼感染由數種細菌及黴菌引起，事實上，由結
膜或角膜取得之抹片或紗布中暴露於環境汙染特定病原體(細菌及黴菌)之檢測，結膜及角膜蓄留許多非病原性細菌及黴菌的“過客”。在化膿或有膿之潰瘍存在下，臨床醫師會暫時診斷為細菌感染並以廣效性抗生素局部施用治療病患。然而，難以診斷但極易治療的重要感染症為：單純疱疹(引起角膜炎)
˙腺病毒角膜-結膜炎(多次引起流行病的比例)
˙砂眼披衣菌(Chlamydia trachomati
s)(引起濾泡性結膜炎，導致砂眼及成人包涵體結膜炎)
˙水痘結膜炎(亦稱為帶狀疱疹結膜炎)
˙快速生長分枝桿菌，例如龜型分枝桿菌(M. chelonae
)及兩棲類分枝桿菌(M. fortuitum
)(引起LASIK後感染，LASIK為降低折射誤差所實施之外科手術)
感染性眼內炎一般可由以下引起：˙格蘭氏陽性菌
˙格蘭氏陰性菌
˙厭氧性微生物，即痤瘡桿菌(Propionibacterum acnes)
˙黴菌
通常感染為術後且發展快速而導致失明。治療所需要之最重要訊息為病原體究竟為細菌或黴菌，若為細菌，究竟其為需氧性或厭氧性。經血行傳佈之內源性感染較為罕見。
葡萄膜炎通常由以下引起：
˙結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis
)
˙龜型分枝桿菌
˙兩棲類分枝桿菌
˙弓蟲(Toxoplasma gondii
)
視網膜炎常見於免疫功能不足之個體，且由以下引起：˙細胞巨大病毒
˙單純疱疹病毒
˙水痘帶狀疱疹病毒
顯著的視覺喪失發生在所有此類病患中，且對於這些微生物早期及即時診斷在預防眼球全面性失明上是重要因素。在開發中國家這些感染之實際影響相對較高，許多用於診斷眼睛感染之診斷技術詳述於先前技術。
中樞神經系統感染可分成以下種類：急性化膿性腦膜炎：常見於孩童，且由以下微生物引起，例如˙流行性感冒嗜血桿菌(Haemophilus influenza
)
˙腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides
)及˙肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae
)
腦脊髓液(CSF)沉澱物之細菌培養或抹片鏡檢欠缺敏感性，其他複雜因素為病患以抗生素早期治療可導致格蘭氏染色及CSF培養之偽陰性結果。由於這些理由，醫師對於培養結果遲疑，並選擇完成全部10-14日靜脈內抗生素療程，大部份這些情況是不必要的。一旦部份治療，情況
難以和以下所引起之慢性腦膜炎區別，
‧結核分枝桿菌
‧各種黴菌
‧由一系列治療性馴化病毒引起之病毒性腦炎，即HSV、CMV及VZV
腦炎一般由各種地區性及流行性病毒引起。然而，單純疱疹、細胞巨大病毒及水痘帶狀疱疹可使用特定抗病毒療法，其他可治療之腦炎病原為弓蟲。
在臨床樣本中檢測病原體(細菌、酵母菌與其他黴菌、寄生蟲及病毒)之典型方法包含樣本培養，以便擴大病原體數目成為可觀察之菌落生長，然後可以標準實驗室試驗鑑定及計數。如果需要，培養物亦可提供為其他試驗以便決定病原體對於藥物治療之敏感性。為了精確鑑定感染種類，臨床醫師必須依賴培養結果，其在任何地方皆需要3日(就多數細菌而言，包括快速生長之分枝桿菌)至8週(就結核分枝桿菌而言)。為了精確鑑定細菌種類，培養物後續經由大規模的生化試驗，此另需要數日或甚至數週。因為疾病之嚴重性以及立即的藥物介入之必要性，快速做此確認甚為重要。本文中所提及之培養技術大部分用於細菌感染及黴菌感染之診斷，且如果是病毒感染，其通常不被用於診斷目的，特別是因為經由臨床樣本培養之病毒分離頻率低於15%。
對於例如眼睛感染及神經系統感染之診斷，適當樣本為下列症候群病原檢測診斷成功的另一關鍵問題，例如角
膜結膜炎、眼內炎、葡萄膜炎、視網膜炎、腦膜炎及腦炎。在這些情況中，感染被高度侷限，因而被限制於眼睛或CNS。例如血液、血漿或血清之體液並不含傳染性病原。外眼感染需要例如角膜抹片或結膜擦試片之樣本，然而感染性眼內炎需要在眼科醫院吸出玻璃體吸出液，或較佳為玻璃體手術之樣本，在此情況，於手術房中取漢克斯平衡鹽類溶液(Hank's Balanced Salt solution)作20 ml玻璃體清洗。簡單之玻璃體吸出液通常不適於經由塗抹檢查及培養診斷黴菌及細菌性眼內炎。在葡萄膜炎及視網膜炎之情況，較佳的樣本為27號(gauge)注射針所收集之0.2至0.3 mL玻璃狀液。用於診斷中樞神經系統感染之最佳生物體液為腦脊髓液，在本發明之一具體實施例中，在眼內炎之情況，為了檢測及區別感染性病原，水樣液或玻璃狀液已足夠，此排除了在手術房進行例如玻璃體切除術之外科手術的必要性。
基於DNA之病原體鑑定方法提供了簡單、健全及簡易的方法以代替費時且需要具有專門訓練及技巧的傳統方法。當進行傳統方法時，所產生的錯誤有時可能導致籠統的病原鑑定，因而造成錯誤的診斷/治療。另一方面，基於DNA之病原體鑑定提供在極早階段鑑定病原的優點，有時早於所見到之臨床症狀(無徵狀期；sub-clinical stage)。一旦條件標準化，病原鑑定就極為簡易，並可經半技術人員處理。基於DNA之程序亦可用於評估醫療介入之結果(預後值)。對人類病原體臨床樣本篩選，使用基於
DNA之方法(例如PCR)提供了敏感及可靠的診斷並開始有效的治療，甚至可由每一樣本含非常少量(約20-50個)病原體的少量體積之臨床樣本(水樣液、玻璃狀液、眼淚、唾液、血液、腦脊髓液、黏膜或上皮抹片，例如角膜抹片、結膜擦布、組織樣本等等)中篩選。
使用聚合酶連鎖反應(PCR)技術之潛在優點在於相當短的時間內鑑定特定細菌或病毒病原體，當病患仍在急診室時，活體基於PCR之分析潛在性地影響臨床醫師判斷如何開始治療，因為基於PCR之檢測方法並不以活的生物體存在為依據，反而是依賴基因材料，基於PCR之技術應用於所有病患情況，甚至當投與抗生素早於臨床樣本收集。然而，基於PCR之方法涉及一些難題，例如因核酸污染之偽陽性結果及因複雜樣本之PCR反應抑制。下列PCR分析揭示引發眼睛及CNS感染之微生物。
單純病疹1及2
：HSV之基於PCR的DNA檢測顯示高於病毒培養4至5倍之敏感性，且對於運輸條件並不敏感，此敘述於Wald A., et al. "Polymerase chain reaction for detection of Herpes simplex virus (HSV)on mucosal surface: Comparison with HSV isolation in cell culture". J. Inf. Dis.188:1345-1351 (2003)。PCR用於檢測眼睛樣本中HSV，例如水樣體液、角膜抹片、晶體吸出液、晶體囊狀物及玻璃狀液與其他例如CSF、生殖道檢體及子宮頸檢體之臨床樣本，Madhavan HN et al. "Detection of Herpes simplex virus (HSV)using polymerase chain reaction (PCR)
in clinical samples: Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV". J. Clin. Virol. 14:115-151 (1999)。於此，PCR可檢測臨床樣本中1至3個HSV顆粒。合併PCR及增幅子(amplicon)之限制性片段長度多樣性(Restriction length polymorphisms)，PCR亦有效用於鑑定疱疹病毒血清型，如敘述於發明者之一的一篇刊物，其之揭示一併作為參考，Madhavan HN et al. "Phenotypic and Genotypic methods for the detection of Herpes simplex virus serotypes". J. Virol. Methods, 108:97-102 (2003)。
水痘帶狀疱疹病毒
：PCR用於檢測水痘感染(Burke DG, et al. "Polymerase chain reaction detection and clinical significance of varicella zoster in cerebrospinal fluid in human immunodeficiency virus infected patients". J. Inf. Dis, 176:1080 (1996))。檢測中樞神經系統之HSV及VZV亦可使用PCR達成(Sauerbrei A and Wutzler P. "Laboratory diagnosis of central nervous system infection caused by herpes viruses". J. Clin. Virol, 25 s45-s51, (2002))，其中之結論為PCR是檢測VZV之最佳標準，該揭示於本文一併作為參考。
細胞巨大病毒A：
商業上可獲得之PCR試驗稱為COBAS Amplicor CMV Monitor of Roche Molecular診斷法(Pleasanton, CA, USA)，使用CMV之DNA聚合酶基因的365鹼基對區域經由增幅來檢測。為了檢測CMV在各種體
液中的存在，使用最早期抗原基因及DNA聚合酶的許多分析已被揭示(Stanier P, et al. "Detection of human cytomegalovirus in peripheral mononuclear cells and urine samples using PCR". Mol. Cell Probes, 6:51-58 (1992)及Gerna G, et al. "Monitoring human cytomegalovirus infection and gancyclovir treatment in heart transplant recipients by determination of viraemia, antigenemia and DNAemia". J. Inf. Dis., 164, 488-498 (1991))，該揭示於本文一併作為參考。病患之CMV感染亦可經由巢式PCR檢測各種樣本，例如血液、羊膜液、鼻抽出物、支氣管-肺泡灌洗液、尿液、胎盤物質及支氣管抽出物。
由HSV、VZV及CMV三種疱疹病毒引起之眼睛感染以PCR檢測，如本發明之一發明人於以下刊物中所揭示，Priya K et al. "Association of herpes viruses in aqueous humour of patients with serpigenous choroiditis: apolymerase chain reaction based study". Ocular Immunology and Inflammation 9:1-9(2003)，該揭示於本文一併作為參考。在此研究中，為了獲得必要的敏感性而進行巢式PCR檢測VZV。然而，在實驗室中，當第一輪增幅之PCR產物必須被移轉至第二PCR試管時，該試管含有第二組引子以擴大在PCR第一輪中所增幅之基因的較小區域，此巢式PCR具有引入增幅子污染的伴隨問題。
以PCR檢測結核分枝桿菌為二個FDA公認試驗架構，其為The Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct
test Gen-Probe San Deigo, USA及Amplicor M. tuberculosis test of Roche Diagnostic Systems, Basel, Switzerland。在此項技術領域中已知有許多其他試驗，然而，Madhavan HN等人揭示使用PCR檢測眼結核病，"Polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis inepiretinal membrane in Eales'". Disease. Invest. Ophthalmol. ViS. Sci. 41:822-825 (2000)。
Black CM, "Current methods oflaboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infection". Clin. Microbiol. Rev. 10:160-184 (1997)詳細敘述以核酸增幅之砂眼披衣菌檢測已使用於臨床環境。Malathi. Jet al. "A hospital based study on prevalence of conjunctivitis due to Chlamydia trachomatis". Ind. J. Med. Res., 117:71-75 (2003)詳細敘述在結膜擦試片上使用PCR檢測披衣菌結膜炎，且檢測30個少量微生物的臨床樣本。
如先前之敘述，於結膜擦試片上以巢式PCR診斷腺病毒結膜炎，Dalapathy S et al. "Development and use of nested polymerase chain reaction (PCR)for the detection of Adenoviruses from conjunctivitis specimen". J. Clin. Virol. 11:77-84 (1998)。
在具有免疫不全之病患情況，弓蟲引起嚴重之腦炎及葡萄膜炎，許多PCR試驗計劃已使用於研究各種體液及組織，且所有PCR試驗依賴B1基因之增幅(Danise A, et al. "Use of polymerase chain reaction assays of aqueous humor
in diagnosis of in the differential diagnosis of retinitis in patients infected with human immunodeficiency virus". Clin. Infect. Dis 24:1100-1106(1997)、Montoyo. et al. "Use of polymerase chain reaction in diagnosis of ocular toxoplasmosis. Ophthalmology", 106:1554-1563 (1999))。
使用PCR反應於真細菌(eubacteria)基因並以探針區別格蘭氏陽性菌及格蘭氏陰性菌，以研究眼睛術後感染所造成之感染性眼內炎，其詳細揭示於Anand AR et al. "Use of polymerase chain reaction (PCR)and DNA probe hybridization to determine the gram reaction of the interacting bacterium in the intraocular fluids of patients with endophthalmitis". J. TnfectioD, 11:221-226 (2000)。此研究能於一個臨床樣本中檢測低至六個細菌。使用PCR快速檢測例如痤瘡桿菌之厭氧微生物所引起之眼感染，其詳細敘述於Therese KL et al. "Polymerase chain reaction in the diagnosis of bacterial endophthalmitis", Brit. J. Opthal. 82:1078-1082 (1998)。黴菌性眼內炎亦可使用PCR快速檢測，其詳細揭示於Anand AR et al. "Polymerase chain reaction in the diagnosis of Asperigillus endophthalmitis". Ind. J. Med. Res. 114:133-110 (2001)及Anand AR et al. "Use of polymerase chain reaction in fungal endophthalmitis". Ophthalmology 108:326-330 (2001)。在這二項研究中，可檢測約～0.4 pgs之黴菌DNA。
當各別PCR中之引子組及待測基因不相同時，本文所
述不同的PCR分析使用不同的反應溫度輪廓。此外，為了最佳化PCR對於本文所述該組反應物之最佳敏感度，調整上述各PCR試劑濃度。理想的反應條件根據欲增幅其大小之核苷酸鏈序列及待測微生物或病原體之整體靶DNA的複雜性而變化。
然而，對於基於PCR之分析仍有需求，即，可在引起細菌、黴菌、寄生蟲及病毒之眼睛及中樞神經系統感染的病原體之間同步檢測及區別，除快速外，不易污染，且比其他方法更增加敏感度及特異性，應該易於使用在臨床環境，因為於24至48小時內鑑定感染病原對於拯救生命十分重要。準確診斷眼睛及大腦之感染的關鍵問題可總結為：˙眼睛及大腦之感染為高度侷限性，在例如血液、血清、血漿、唾液或膿汁或外部傷口或潰瘍之化膿液體等容易取得之體液中並無微量病原體。
˙任何公認的急性感染生物標記，例如C反應蛋白，對於侵襲人體之感染而言是通常性且普遍的，因此並非特異性。
˙為了鑑定特異性病原體，需要取自眼睛或CSF之樣本，可獲得之樣本為角膜感染之角膜抹片；結膜炎之結膜擦試片；眼內炎之水樣液；葡萄膜炎及視網膜炎之玻璃狀液。在大腦感染之情況，較佳之樣本經常為CSF。在這些全部之樣本中，單一次可由病患獲得之樣本數量有所限制。一般而言，在角膜抹片或擦試片
中可得幾千個細胞，可能為二至三毫克之樣本。在任何時間可由病患眼睛取出之水樣液約為100 μL，而玻璃體切除之樣本可多至200 μL。可取出多至5 ml的CSF樣本，但PCR所需之CSF樣本體積少於0.5 ml。
˙因樣本體積受限的結果限制了存在於樣本中的細菌/病毒/寄生蟲數量。此外，感染性病原量少於許多身體其他部位(例如血液)中觀察到之數量。
˙存在於樣本之感染性粒子的總數與檢測成功直接成正比，臨界質量以下，感染性病原細菌及黴菌不易生長於培養基，因此難以診斷。眼睛樣本中病毒顆粒之數量一般低於螢光抗體檢測試驗之檢測極限，因此病毒培養使得檢測敏感性低於25%。對於例如弓蟲之寄生蟲並無簡易之檢測系統，且對於檢測而言，寄生蟲數量亦太少。例如對於HSV、CMV、VZV、腺病毒、披衣菌及弓蟲之IgM或IgG檢測之試驗極不具特異性且並無診斷上之重要性。
˙其他在診斷上主要之困難為上述所有眼睛之困擾皆為急性，且需要立即、精確的診斷以建立適當療法。在感染性眼內炎的情況，延遲48小時將造成失明，而因病毒感染之壞死性視網膜炎必須在第一徵狀呈現後96小時內加以治療。
多重引子PCR (multiplex PCR)亦已在一定的臨床狀況中被使用於一些病原體，且經由質譜儀確定分子量以鑑定
增幅之產物，其詳細敘述於Detection and identification of pathogens by mass spectrometric determination of the base composition of PCR products。(Ecker, Uavid J.: Griffey Richard ll.: Sampath, Rangarajan; Hofstandler, Steven A.: Meneil, John: Crooke, Sstanley T. (USA).U.S. Pat. Appl. Publ. (2004), 168 pp. Cont-in-part of U.S. Ser. No. 323,233. Application: US 2003-660122 20030911. Priority: US 2001-798007 20010302;US 2002-431319 20021206;US 2002-323233 20021218;US 2002-326051 20021218;US 2002-325526 20021218;US 2002-325527 20021218;US 2003-443443 20030129;US 2003-443788 20030130;US 2003-147529 20030214)。
多重引子PCR分析之後以膠體電泳鑑定產物被嘗試於中樞神經系統感染，其敘述於Read, SJ. and Kurtz, JB. "Laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system by using a single multiplex PCR screening assay". J. Clin. Microbiol. 37:1352-2355 (1999)。
多重引子PCR之後以微陣列檢測病原體被描述於檢測引起呼吸道疾病之病原體(Wang D et al. "Microarray based detection and genotyping of viral pathogens". Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:15687-15692 (2002))。增幅子之檢測亦嘗試使用微滴定皿比色分析系統，其中增幅子以洋地黃毒(digoxigenin)11-dUTP標示，且使用經生物素標記之探
針在微滴定皿上捕捉增幅子，使用抗洋地黃毒標示酵素呈現產物(Smalling TW et al. "Molecular approaches to detecting herpes virus and enteroviruses in the central nervous system". J. Clin. Microbiol. 40:2317-2322 (2002))。
為了定量臨床樣本中之病毒，成功嘗試以相同微生物之三種不同基因(即，細胞具大病毒之形態轉化區II、UL 83及糖蛋白O基因)的多重引子PCR分析，其詳述於Madhavan HN et al., "Development and application of a novel multiplex polymerase chain reaction for semiquantitation of human cytomegalovirus in clinical specimen",J Virol Methods. 141:166-72 (2007)。
以多重引子PCR分析以增幅所有19個乳突腫瘤病毒之高風險基因型L1區域後，亦使用線性探針分析(Line probe assay)檢測並區別女性子宮頸樣本中乳突腫瘤病毒之基因型(Bauer HM et al. "Detection of human papilloma viruses by Polymerase chain reaction" US Patent No 5639871)。
例如質譜儀之方法並不實用，甚至在先進的第三級醫學加護中心，且臨床設施上，依據昂貴掃描機的微陣列檢測並不易獲得。線性探針分析易有增幅子污染。
本發明提供一套化學標記病原體特定正向及反向引子，該引子獨特設計在多重引子聚合酶連鎖反應中，於95℃變性溫度、58至65℃之黏接溫度及於72℃延伸，由病原體特異性增幅靶序列。本發明亦提供一套衍生自病原體特異性基因之靶DNA序列，該基因固定於惰性載體上，並與使用病原體特定正向及反向PCR引子所獲得之PCR增幅產物特異性雜交。
本發明提供一種快速分析法，用於同步檢測眼睛及中樞神經系統感染之病原體，該感染之免疫學參數並無指示出主動感染，僅指示顯露病原體，且依例如細菌及黴菌培養之傳統微生物學分析，其敏感性皆不足以檢測病原體，或不夠快速地在48小時內鑑定病原體。
本發明結合PCR分析之高敏感性與雜交鑑定之高特異性，在宏陣列(macroarray)上，經色彩檢測法雜交檢測，其最終結果可經由裸眼監測。然而，亦可使用螢光標記，例如Quantum Dots、Cy3、Cy5、FITC，且產物可經由螢光顯微鏡看見。
本發明之特徵為一種多重引子(multiplex)分析，用於同步檢測及區別引起眼睛及CNS感染之病原體，其包含：
i)處理臨床樣本，例如由被懷疑受眼睛或CNS感染侵襲之病患所收集之角膜抹片，或結膜擦試片，或水樣液，或玻璃狀液，或玻璃體手術收集之灌洗液，或腦脊髓液
吸出液，或腦部膿瘡所收集之膿汁，或視網膜前膜；ii)經由單管PCR技術，使用標示增幅引子於各引起CNS及眼睛感染的已知病原體，由各病原體特有之基因增幅DNA特定區域；iii)使用DNA雜交檢測及區別病原體，其中對於各病原體特異性之固定化靶序列與經PCR反應所產生之增幅DNA探針反應，並經由使用特定試劑套組呈色以監測雜交。
"核苷酸"意指DNA或RNA之構成要素，由一含氮鹼基、一磷酸根分子及一糖分子(在DNA為去氧核醣，在RNA為核醣)所組成。
"寡核苷酸"意指短鏈核苷酸。寡核苷酸通常使用作為探針，以尋找DNA或RNA之配對序列，並可以各種標記標示，例如放射性同位素及螢光與化學發光部分。
"引子"意指互補於DNA特定靶序列的短股寡核苷酸，其用於最初DNA合成。
"單一引子(uniplex)"意指在增幅單一病原體特定DNA序列的各反應中，使用單套引子之基於PCR分析。
"多重引子"意指於單一反應中使用多套引子之基於PCR分析，其中各引子可增幅單一病原體特定DNA序列。
"探針"一詞意指由基於PCR增幅靶DNA所產生的DNA產物(增幅子)。
“靶”一詞意指，個別病原體特有之DNA序列，其被
固定於惰性基質上，例如尼龍。
"雜交"意指結合DNA之二個互補股以形成雙股分子之方法；更明確而言，本文所述係為"探針"與"靶"DNA序列之間的結合。
本文中所使用"檢測系統"一詞意指一種能將PCR增幅DNA產物可視化之方法，適當的檢測系統之實例包括根據顏色、放射性、螢光或化學發光之檢測的系統。
"泛黴菌(pan fungal)"意指發現於所有病原性黴菌之一般基因序列，例如在隱球菌(Cryptococcus)、念珠菌(Candida)、白黴菌(Mucormycosis)、曲黴菌(Asperigillus)及根黴菌(Rhizopus)等，且用於鑑定任何/所有黴菌種類。
由罹患眼睛感染之病患的臨床樣本中，設計適於病原體DNA多重引子PCR之獨特PCR引子。
根據文獻獲得的已知資料，選擇下列引起眼睛感染之各種已知病原體的基因。
1.單純疱疹病毒1及2糖蛋白D。
2.單純疱疹病毒1及2 UL44基因
3.單純疱疹病毒1及2 DNA聚合酶基因
4.細胞巨大病毒糖蛋白O基因
5.細胞巨大病毒形態轉化基因
6.細胞巨大病毒UL 88基因
7.水痘帶狀疱疹ORF 29
8.水痘帶狀疱疹DNA聚合酶基因
9.腺病毒Hexon基因
10.真細菌16s核醣體RNA基因I
11.真細菌16s核醣體RNA基因區II
12.格蘭氏陽性菌16s核醣體RNA基因之特異性部分
13.結合分枝桿菌MPB64基因
14.兩棲類分枝桿菌16s-23s RNA基因
15.龜鱉分枝桿菌16s-23s RNA基因
16.弓蟲B1基因
17.砂眼披衣菌多形性蛋白II
18.黴菌28s核醣體RNA基因之特異性部分
19.痤瘡桿菌16s-23s核醣體RNA基因之特異性部分
20.格蘭氏陰性菌gyr B基因之特異性部分
21.格蘭氏陰性菌烏頭酸水合酶(aconitate hydratase)基因
22.格蘭氏陰性菌核醣核酸酶基因
為了進一步改善檢測一些微生物之確實性，例如單純疱疹1及2、細胞巨大病毒、水痘帶狀疱疹及格蘭氏陰性菌，各微生物選擇一個以上之基因用於增幅之目的。在單純疱疹1及2與細胞巨大病毒之情況，各微生物選擇三種不同基因，而水痘帶狀疱疹則選擇二種基因。
疱疹病毒之DNA聚合酶基因為一種對於PCR敏感之基因，且使用於不同之研究。在第一種研究中，使用95℃變性45秒鐘、64℃黏接45秒、及72℃延伸45秒之熱循
環條件增幅179 bp產物(Madhavan HN et al,Detection of simplex virus(HSV)using polymerase chain reaction(PCR)in clinical samples Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV,J.Clin.Virol.14：145-151(1999))。而在另一研究中，使用不同套引子並於95℃變性45秒鐘、於60℃黏接45秒、及於72℃延伸45秒之熱循環條件增幅相同基因之469及391 bp區域(Madhavan HN et al,Phenotypic and Genotypic methods for the detection of simplex virus serotypes.J.Virol.Methods,108：97-102.(2003))。當檢測不同病毒時，例如就PCR用於HSV、CMV及VZV以鑑定眼睛感染而言，使用不同熱條件的任何方式(Priya K et al,Association of herpes viruses in aqueous humour of patients with serpigenous choroiditis：a polymerase chain reaction based study,Ocular Immunology and Inflammation 9：1-9(2003))。在此研究中，反應條件及引子濃度依不同病毒而不同，因此可顯見，為了能在所給予之臨床樣本中，進行可快速檢測及區別一或多種病原體的單管多重引子PCR反應，對於一組已知病原體設計引子及特異性靶序列是十分困難。
因此，必須考慮探究使用已知的生物資訊方法，設計與PCR增幅產物互補之適當PCR引子及靶DNA序列的可能性。
為了達到此一目的，本發明之發明者首先決定下列較佳地進行多重引子PCR反應以檢測HSV、CMV及VZV
的條件，即於95℃變性，之後於58℃-65℃黏接，然後於72℃延伸。因此，獲得特異性靶DNA序列之PCR增幅產物，該產物與固定在固相基質之各病原體的理想雜交溫度固定在48℃至55℃。故，必須考慮設計一組靶DNA序列用於各該病原體，特定PCR增幅產物與其互補之靶DNA序列在相同溫度雜交，而不會造成DNA序列之非特異性結合。
在設計多重引子PCR反應之引子上，最困難的要素為在此方法中設計引子全部具有相同融化溫度，以便在相同熱循環條件下能夠增幅所有基因。
增幅用引子組由上述基因序列中選擇，以致於所有引子具有黏接溫度範圍為58-65℃，因而所有23個基因可在相同試管中使用PCR增幅，在該特定病原體之所有品系或血清型中維持不變。
不同大小的增幅子可妨礙以PCR法多重引子增幅之效率，因此，選擇引子之第二標準為固定相同大小之增幅子於66-90個核苷酸範圍內。上節中所述之所有基因選擇含66-90 bp長度(包括引子序列)之範圍。
為保持融化溫度一致，引子長度在17至29個鹼基對之間變化。
此外，在多重引子反應中，因存在互補區而使引子中形成環或交叉雜交，其可干擾PCR增幅。為避免所有此類阻礙，謹慎地設計所有引子，以完全排除其中引子之環的形成或交叉雜交。小心避免經引子組之任何非特異性(交叉
-)增幅，即，一微生物/基因之引子不應與反應混合物中其他任何微生物/基因之基因反應。
所有引子一般而言以配對病原體基因之所有核苷酸鹼基的方法設計。然而，若在一些品系或種別中錯誤配對，例如在設計於增幅格蘭氏陽性、格蘭氏陰性菌及黴菌引子之情況，錯誤配對被限制在引子中間最多二個核苷酸。須保證在所有診斷之種別品系中，各引子之3'端一直具有較理想之配對。
除了技術中所述之選擇引子序列的標準準則外，所述準則經參考文獻詳細揭示於本文，Molecular cloning: A laboratory manual, Vol 2, Sambrook. J, Russell DW (Eds)Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (2001)，這些準則為3'端為G或C，避免串聯GC重複，且通常不以T中止任何引子等等。
設計後，各別使用引子，並使用所有列出之病原體的標準DNA序列(基因)，以多重引子形式核對敏感性及特異性。無論是在辨識一些微生物或病毒顆粒之敏感性未達先前技術所報告者，即Madhavan HN, et al, Detection of herpes simplex (HSV)using polymerase chain reaction (PCR)in clinical samples Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV, J. Clin. Virol. 14:145-151 (1999);Malathi. Jet al. A hospital based study on prevalence of conjunctivitis due toChlamydia trachomaits
Ind. J. Medical research, 117:71-75 (2003);
Anand ARet al Use of polymerase chain reaction(PCR)and DNA probe hybridization to determine the gram reaction of the interacting bacterium in the intraocular fluids of patients with endophthalmitis.Journal of Infection,41：221-226 (2000)；Anand AR et al.Use of polymerase Chain reaction in fungal endophthalmitis Ophthalmology 108：326-330(2001)，使用相同準則選擇不同套之引子，即使一些引子於58℃黏接，實驗上需保證所有引子在60℃有良好之增幅。
本具體實施例在小心評估後，選擇下列 獨特引子
，並用於檢測及區別病原體。這些序列為獨特的，並且為此項技藝上所未知的。
1.單純疱疹病毒1及2糖蛋白D基因，經含SEQ ID No 1及2之引子組1增幅，FP：5' cgcttggtttcggatgggag 3'(SEQ ID No.1)及RP：5' gcccccagagacttgttgtagg 3'(SEQ ID No.2)。
2.單純疱疹病毒1及2 UL 44基因，經含SEQ ID No 3及4之引子組2增幅，FP：5' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3'(SEQ ID No.3)及RP：5' cgggggggtcttgcgttac 3'(SEQ ID No.4)。
3.單純疱疹病毒1及2 DNA聚合酶基因，經含SEQ ID No 5及6之引子組3增幅，FP：5' caagctgacggacatttacaagg 3'(SEQ ID No.5)及RP：5' gtcccacacgcgaaacacg 3'(SEQ ID No.6)。
4.細胞巨大病毒糖蛋白O基因，經含SEQ ID No 7及8之引子組4增幅，FP:5' ttccggctcatggcgttaacc 3'(SEQ ID No.7)及RP: 5' cgccctgcttttacgttacgc 3'(SEQ ID No.8)。
5.細胞巨大病毒形態轉化基因，經含SEQ ID No 9及10之引子組5增幅，FP:5' cggcgacgacgacgataaag 3'(SEQ ID No.9)及RP: 5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3'(SEQ ID No.10)。
6.細胞巨大病毒UL88基因，經含SEQ ID No 11及12之引子組6增幅，FP:5' gggcacgtcctcgcagaag 3'(SEQ ID No.11)及RP:5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3' (SEQ ID No.12)。
7.水痘帶狀疱疹ORF 29，經含SEQ ID No 13及14之引子組7增幅，FP:5' ggtcttgccggagctggtattac 3'(SEQ ID No.13)及RP:5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3'(SEQ ID No.14)。
8.水痘帶狀疱疹DNA聚合酶基因，經含SEQ ID No 16及16之引子組8增幅，FP:5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3'(SEQ ID No.15)及RP:5' acgttccggtagcgagttatctg 3'(SEQ ID No.16)。
9.腺病毒Hexon基因，經含SEQ ID No 17及18之引子組9增幅，FP:5' cgccgccaacatgctctacc 3'(SEQ ID No.17)及RP:5' gttgcgggaggggatggata 3'(SEQ ID No.18)。
10.真細菌16s核醣體RNA基因區I，經含SEQ ID No 19及20之引子組10增幅，FP:5' tgggctacacacgtgctacaatgg
3' (SEQ ID No.19)及RP:5' cggactacgatcggttttgtgaga 3'(SEQ ID No.20)。
11.真細菌16s核醣體RNA基因區II，經含SEQ ID No 21及22之引子組11增幅，FP:5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3(SEQ ID No.21)及RP:5' ggcagattcctaggcattactcacc 3(SEQ ID No.22)。
12.格蘭氏陽性菌16s核醣體RNA基因特異性部分，經含SEQ ID No 23及24之引子組12增幅，FP:5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3'(SEQ ID No.23)及RP:5' tgcagccctttgtaccgtccat 3'(SEQ ID No.24)。
13.結核分枝桿菌MPB 64基因，經含SEQ ID No25及26之引子組13增幅，FP:5' gcggaacgtgggaccaatac 3'(SEQ ID No.25)及RP:5' cgacggggtgattttcttcttc 3' (SEQ ID No.26)。
11.兩棲類分枝桿菌16s-23s RNA基因，經含SEQ ID No 27及28之引子組14增幅，FP:5' aacttttttgactgccagacacactattg 3'(SEQ ID No.27)及RP:5' ggatgccaccccccaaaag 3'(SEQ ID No.28)。
15.龜型分枝桿菌16s-23s RNA基因，經含SEQ ID No 29及30之引子組15增幅，FP:5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3'(SEQ ID No.29)及RP:5' gacgttttgccgactacctatcc 3(SEQ ID No.30)。
16.弓蟲B1基因，經含SEQ ID No 31及32之引子組17增幅，FP:5' cccctctgctggcgaaaagtg 3'(SEQ ID No.31)及RP:5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3'(SEQ ID No.32)。
17.砂眼披衣菌多形性蛋白II，經含SEQ ID No 33及34之引子組18增幅，FP:5' aatcgtatctcgggttaatgttgc 3'(SEQ ID No.33)及RP:5' tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3'(SEQ ID No.34)。
18.黴菌28s核醣體RNA基因特異性部分，經含SEQ ID No 35及36之引子組19增幅，FP:5' gctgggactgaggactgcgac 3'(SEQ ID No.35)及RP:5' ttcaagacgggcggcatataac 3(SEQ ID No.36)。
19.痤瘡桿菌16s-23s核醣體RNA基因特異性部分，經含SEQ ID No 37及38之引子組20增幅，FP:5' tggcgaacgggtgagtaaca 3'(SEQ ID No.37)及RP:5' ccggtattagccccagtttcc 3'(SEQ ID No.38)。
20.格蘭氏陰性菌gyr B基因特異性部分，經含SEQ ID No 39及10之引子組21增幅，FP:5' cggcggcaagttcgacgac 3'(SEQ ID No.39)及RP:5' ccaccgagacgcccacacc 3'(SEQ ID No.40)。
21.格蘭氏陰性菌烏頭酸水合酶基因，經含SEQ ID No 41及42之引子組22增幅，FP:5' ccaggtcggcggagaagc 3'(SEQ ID No.41)及RP:5' ccaccggcccgatgacc 3'(SEQ ID No.42)。
22.格蘭氏陰性菌核醣核酸酶1基因，經含SEQ ID No 43及44之引子組23增幅，FP:5' gccgccctgaccaccttc 3'(SEQ ID No.43)及RP:5' gcgggttgttcggcatcag 3'(SEQ ID No.44)。
在本發明另一具體實施例中，以用於設計引子以鑑定所述病原體特有之特定基因片段的電腦程式獲得SEQID 45-67之探針序列
。探針序列在66-90個核苷酸長度間變化。探針本身並不形成髮夾環，其與其他任何增幅子並無同源性，探針可由病原體DNA之任一股增幅。
探針序列詳述如下：1.單純疱疹病毒1及2糖蛋白D基因之探針DNA序列"cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagt acaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggc"(SEQ ID No. 45)
(經引子組1增幅，該引子包含FP:5' cgcttggtttcggatgggag 3'(SEQ ID No.1)及RP:5' gcccccagagacttgttgtagg 3'(SEQ ID No.2))。
2.單純疱疹病毒1及2UL44基因之探針DNA序列"ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggc ggtaacgcaagacccccccg" (SEQ ID No. 46)(經引子組2增幅，該引子包含FP:5' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3'(SEQ ID No.3)及RP:5' cgggggggtcttgcgttac 3'(SEQ ID No.4)。
3.單純疱疹病毒1及2DNA聚合酶基因之探針DNA序列"caagctgacggacatttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatga
acggccggggcgtgtttcgcgtgtgggac" (SEQ ID No. 47)(經引子組3增幅，該引子包含FP:5' caagctgacggacatttacaagg 3'(SEQ ID No.5)及RP:5' gtcccacacgcgaaacacg 3'(SEQ ID No.6))。
4.細胞巨大病毒糖蛋白O基因之探針DNA序列"ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg cgtaacgtaaaagcagggcg" (SEQ ID No. 48)(經引子組4增幅，該引子包含FP:5' ttccggctcatggcgttaacc 3'(SEQ ID No.7)及RP:5' cgccctgcttttacgttacgc 3'(SEQ ID No.8))。
5.細胞巨大病毒形態轉化區II基因之探針DNA序列"cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcgtccagagga ttacgcgaccagattg" (SEQ ID No.49)，經引子組5增幅，該引子包含FP:5' cggcgacgacgacgataaag 3'(SEQ ID No.9)及RP:5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3'(SEQ ID No.10)。
6.細胞巨大病毒UL 88基因之探針DNA序列"gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccttgacgtactggtcac ctatcacctgcatcttgg'' (SEQ ID No.50)(經引子組6增幅，該引子包含FP:5' gggcacgtcctcgcagaag 3'(SEQ ID No.11)及RP:5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3'(SEQ ID No.12))。
7.水痘帶狀疱疹ORF 29之探針DNA序列"ggtcttgccggagctggtattaccttaaaactcactaccagtcatttctatcc
atctgtctttgtctttcacggaggca" (SEQ ID No. 51)(經增幅the引子組7，該引子包含FP:5' ggtcttgccggagctggtattac 3'(SEQ ID No.13)及RP:5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3'(SEQ ID No.14))。
8.水痘帶狀疱疹DNA聚合酶基因之探針DNA序列"tccatttaacgttgcatcattttgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggc aagtaatacagataactcgctaccggaacgt" (SEQ ID No. 52)(經引子組8增幅，該引子包含FP:5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3'(SEQ ID No.15)及RP:5' acgttccggtagcgagttatctg 3'(SEQ ID No.16))。
9.腺病毒Hexon基因之探針DNA序列"cgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgccca tatccatcccctcccgcaac" (SEQ ID No. 53)(經引子組9增幅，該引子包含FP:5' cgccgccaacatgctctacc 3'(SEQ ID No.17)及RP:5' gttgcgggaggggatggata 3'(SEQ ID No.18))。
10.真細菌16s核醣體RNA基因區I之探針DNA序列"tgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtcgccaaaccgc gaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccg" (SEQ ID No. 54)(經引子組10增幅，該引子包含FP:5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3'(SEQ ID No.19)及RP:5' cggactacgatcggttttgtgaga 3'(SEQ ID No.20))。
11.真細菌16s核醣體RNA基因區II之探針DNA序列"ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattc
agcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcc" (SEQ ID No. 55)(經引子組11增幅，該引子包含FP:5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3'(SEQ ID No.21)及RP:5' ggcagattcctaggcattactcacc 3'(SEQ ID No.22))。
12.格蘭氏陽性菌16s核醣體RNA基因之特異性部分之探針DNA序列"acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatg gacggtacaaagggctgca" (SEQ ID No. 56)(經引子組12增幅，該引子包含FP:5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3'(SEQ ID No.23)及RP:5' tgcagccctttgtaccgtccat 3'(SEQ ID No.24))。
13.結核分枝桿菌MPB64基因之探針DNA序列"gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggctgcttcgggcagca actcccccgggttgaagaagaaaatcaccccgtcg" (SEQ ID No. 57)(經引子組13增幅，該引子包含FP:5' gcggaacgtgggaccaatac 3'(SEQ ID No.25)及RP: 5' cgacggggtgattttcttcttc 3'(SEQ ID No.26))。
14.兩棲類分枝桿菌16s-23s RNA基因之探針DNA序列"aacttttttgactgccagacacactattgggctttgagacaacaggcccgtg ccccttttggggggtggcatcc" (SEQ ID No. 58)(經引子組14增幅，該引子包含FP:5' aacttttttgactgccagacacactattg 3'(SEQ ID No.27)及RP:5' ggatgccaccccccaaaag 3'(SEQ ID No.28))。
15.龜型分枝桿菌16s-23s RNA基因之探針DNA序列"tggttactcgcttggtgaatatgttttataaatcctgtccaccccgtggatag gtagtcggcaaaacgtc" (SEQ ID No. 59)(經引子組15增幅，該引子包含FP:5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3'(SEQ ID No.29)及RP:5' gacgttttgccgactacctatcc 3(SEQ ID No.30))。
16.弓蟲B 1基因之探針DNA序列"cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgt attcgcagattggtcgcc" (SEQ ID No. 60)(經引子組16增幅，該引子包含FP:5' cccctctgctggcgaaaagtg 3'(SEQ ID No.31)及RP:5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3'(SEQ ID No.32))。
17.砂眼披衣菌多形性蛋白II之探針DNA序列"aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgctttatcaaatgacaagcttagat ccgtttctcatacggttttcctcga" (SEQ ID No. 61)(經引子組17增幅，該引子包含FP:5' aatcgtatctcgggttaatgttgc 3'(SEQ ID No.33)及RP:5' tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3'(SEQ ID No.34))。
18.黴菌28s核醣體RNA基因之特異性部分之探針DNA序列"gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttat atgccgcccgtcttgaa" (SEQ ID No. 62)(經引子組18增幅，該引子包含FP:5' gctgggactgaggactgcgac 3'(SEQ
ID No.35)及RP:5' ttcaagacgggcggcatataac 3'(SEQ ID No.36))。
19.痤瘡桿菌16s-23s核醣體RNA基因之特異性部分之探針DNA序列"tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataa cttcaggaaactggggctaataccgg" (SEQ ID No. 63)(經引子組19增幅，該引子包含FP:5' tggcgaacgggtgagtaaca 3'(SEQ ID No.37)及RP:5' ccggtattagccccagtttcc 3'(SEQ ID No.38))。
20.格蘭氏陰性菌gyr B基因之特異性部分之探針DNA序列"cggcggcaagttcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcac ggtgtgggcgtctcggtgg" (SEQ ID No. 64)(經引子組20增幅，該引子包含FP:5' cggcggcaagttcgacgac 3'(SEQ ID No.39)及RP:5' ccaccgagacgcccacacc 3'(SEQ ID No.40))。
21.格蘭氏陰性菌烏頭酸水合酶基因之探針DNA序列"ccaggtcggcggagaagccgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg ggtcatcgggccggtgg" (SEQ ID No. 65)(經引子組21增幅，該引子包含FP:5' ccaggtcggcggagaagc 3'(SEQ ID No.41)及RP:5' ccaccggcccgatgacc 3'(SEQ ID No.42))
22.格蘭氏陰性菌核醣核酸酶1之探針DNA序列"gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgttacctggtgctgatg ccgaacaacccgc" (SEQ ID No. 66)(基因經引子組22增
幅，該引子包含FP:5' gccgccctgaccaccttc 3'(SEQ ID No.43)及RP:5' gcgggttgttcggcatcag 3'(SEQ ID No.44))。
在本發明另一具體實施例中，使用電腦程式由探針序列產生SEQID 67-88之靶序列
。這些靶用於固定在例如尼龍之惰性基質上，並使用UV-輻射交聯或化學固定。該靶根據下列準則選擇：1.所有靶序列為病原體特異的，並不與他種病原體之其他任何序列重疊。
2.所有靶序列的長度大小範圍為23至38鹼基。
3.所有靶具有58.9℃-88℃之相同的融化溫度範圍。
4.該靶序列存在於增幅子區，且並不含正向或反向引子序列，因而標記探針(具有SEQ ID Nos 67-91)不會非特異性結合至這些靶。
5.一般而言，所有之靶以配對所有核苷酸鹼基之方式設計，然而，若在一些探針中有錯誤配對，則該錯誤配對被限制於在探針當中間最大為二個核苷酸，以便保證雜交。
該靶序列詳述如下：1. 5'gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct 3'(SEQ ID No. 67)用於HSV糖蛋白D之靶，經引子組1增幅。
2. 5'cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3'(SEQ ID No. 68)用於HSV UL 44之靶，經引子組2增幅。
3. 5'tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3'(SEQ ID No. 69)用於HSV聚合酶基因之靶，經引子組3增幅。
4. 5'aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3'(SEQ ID No. 70)用於CMV糖蛋白O之靶，經引子組4增幅。
5. 5'aatacaaagccgcagtgtcgtc 3'(SEQ ID No. 71)用於細胞巨大病毒形態轉化基因II之靶，經引子組5增幅
6. 5'gactccaggtacaccttgacgtactg 3'(SEQ ID No. 72)用於細胞巨大病毒之UL88基因之靶，經引子組6增幅。
7. 5'cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3'(SEQ ID No. 73)用於水痘帶狀疱疹病毒ORF29基因之靶，經引子組7增幅。
8. 5'ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3'(SEQ ID No. 74)用於水痘帶狀疱疹病毒之DNA聚合酶基因之靶，經引子組8增幅。
9. 5' ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3'(SEQ ID No. 75)用於腺病毒Hexon基因之靶，經引子組9增幅。
10. 5'tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3'(SEQ ID No. 76)用於真細菌16s核醣體基因區I之靶，經引子組10增幅。
11. 5'ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3'(SEQ ID No. 77)用於真細菌16s核醣體基因區II之靶，經引子組11增幅。
12. 5' gacctgggctacacacgtgctaca 3'(SEQ ID No. 78)用於格蘭氏陽性微生物16s核醣體基因之靶，經引子組12增幅。
13. 5'ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3'(SEQ ID No. 79)用於結核分枝桿菌MPB 64基因之靶，經引子組13增幅。
14. 5' ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3'(SEQ ID No. 80)用於兩棲類分枝桿菌16s-23s RNA基因之靶，經引子組14增幅。
15. 5' tttataaatcctgtccaccccgt 3'(SEQ ID No. 81)用於龜型分枝桿菌16s-23s RNA基因之靶，經引子組15增幅。
16. 5' aaattcatgagtatctgtgcaactttg 3'(SEQ ID No. 82)用於弓蟲B1基因之靶，經引子組16增幅。
17. 5' atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc 3'(SEQ ID No. 83)用於砂眼披衣菌多形性蛋白II之靶，經引子組17增幅。
18. 5' gtaagtcaaggatgctggcataatg 3'(SEQ ID No. 84)用於所有黴菌28s核醣體RNA基因之靶，經引子組18增幅。
19. 5' gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3'(SEQ ID No. 85)用於痤瘡桿菌16s核醣體RNA基因之靶，經引子組19增幅。
20. 5' aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3'(SEQ ID No. 86)用於格蘭氏陰性微生物促旋酶(gyrase)基因之靶，經引子組20增幅。
21. 5' cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3'(SEQ ID No. 87)用於格蘭氏陰性微生物烏頭酸水合酶基因之靶，經引子組21增幅。
22. 5' atcagcctggccggccgttacctggtg 3'(SEQ ID No. 88)用於格蘭氏陰性微生物核醣核酸酶基因之靶，經引子組22增幅。
上述報告及用於固定在惰性基質上的這些寡核苷酸使用由標準DNA及臨床樣本所產生之產物確認(經序列分析)，這些序列為獨特的，且並非多重引子或單一引子PCR所已知或敘述。
在本發明另一具體實施例中，提供使用上述所有或一些引子組之多重引子PCR分析，其中該所有引子可一起用於相同熱循環條件之單一試管，該條件包含94℃5分鐘之變性步驟、之後於60-64℃ 45秒、72℃ 45秒及94℃ 45秒40個循環，之後於72℃反應延伸10分鐘。
在另一具體實施例中，引子組在5'端使用生物素標示之部分可呈色檢測。
在另一具體實施例中，該引子經螢光標誌標示，例如有機螢光標誌，如螢光異硫氰酸鹽(Fluorescene isothiocyanate; FITC)，或無機螢光奈米顆粒，例如Quantum DotsTM
或Cy3或Cy5，可經由任何螢光掃描裝置或顯微鏡檢測。
在另一具體實施例中，本發明提供該引子及探針庫之用途，其中該分析為病原體檢測之即時PCR。
在另一具體實施例中，本發明提供該引子及探針庫之用途，其中該分析為於臨床樣本中定量病原體之即時PCR，用以監控預後或疾病治療。
在另一具體實施例中，本發明提供該引子庫之用途，其中可以宏陣列或墨點法(slot blot)或線性探針分析之型式偵測增幅產物。
在另一具體實施例中，本發明提供一種由固定於一固相物之探針構成之宏陣列，該固相物包含硝化纖維、尼龍、荷電尼龍、玻璃或聚苯乙烯。
在另一具體實施例中，本發明提供一種檢測及區別病原體之方法，該病原體引起例如感染性眼內炎、或角膜炎、或葡萄膜炎、或視網膜炎、或腦膜炎之症候群，其中偵測之病原體為單純疱疹病毒1及2、細胞巨大病毒、水痘帶狀疱疹病毒、腺病毒、真細菌、格蘭氏陽性微生物、格蘭氏陰性菌、黴菌、結核分枝桿菌、龜鱉分枝桿菌、兩棲類分枝桿菌、弓蟲、砂眼披衣菌。
在另一具體實施例中，本發明提供一種在引起具有相似症狀之眼睛或神經系統疾病的可能病原體群組中，檢測個別病原體之方法。
在另一具體實施例中，本發明提供一種選擇使用少數或所有前述引子之任何多重引子PCR分析，其中調查由一些或所有該微生物引起之任何臨床症候群，以檢測存在於臨床樣本中任一個別病原體或病原體群組。
在另一具體實施例中，本發明提供一種同步檢測引起
外眼感染、眼內炎、或葡萄膜炎、或視網膜炎或腦膜腦炎之所有病原體之方法，包含：[a]由罹患該感染之病患獲得臨床樣本；[b]由步驟[a]所獲得之部分或全部樣本中萃取出DNA; [c]使用申請專利範圍第1項所主張之引子庫、以生物素或螢光示踪元素標示及PCR標準試劑，將步驟[b]所獲得之DNA進行多重引子PCR; [d]將步驟[c]所獲得之PCR產物變性；[e]將步驟[d]所獲得之PCR產物與固定於固體基質上之靶雜交；及[f]以酵素或螢光法在步驟[e]所獲得之固體基質上檢測DNA雜交物。
在另一具體實施例中，本發明提供一種套組，用於同步檢測引起外眼感染、眼內炎、或葡萄膜炎、或視網膜炎、或腦膜腦炎之所有病原體，其包含：a)一前述之正向及反向引子庫；b)一前述DNA靶之基質，其固定於一適當固體載體上；c)增幅DNA之聚合酶連鎖反應所需之標準試劑；d)PCR增幅產物與DNA探針之固定基質雜交所需之標準試劑；e)檢測最終雜交產物所需之標準試劑，用以檢測及區別特定致病病原體。
在另一具體實施例中，本發明提供一種用於同步檢測引起外眼感染、眼內炎、或葡萄膜炎、或視網膜炎、或腦膜腦炎之所有病原體的方法，其包含：[a]由罹患該感染之病患獲得臨床樣本；[b]由步驟[a]所獲得之部分或全部樣本中萃取出DNA; [c]使用前述引子庫、以生物素或螢光示踪元素標示及PCR標準試劑，將步驟[b]所獲得之DNA進行多重引子PCR；[d]將步驟[c]所獲得之PCR產物變性；[e]將步驟[d]所獲得之PCR產物與前述固定於固體基質上之靶雜交；[f]以酵素或螢光法在固體基質上檢測步驟[e]所獲得之DNA雜交物。
下列實施例提供作為說明本發明，因此不應被解釋為限制本發明之範圍。
以分別可增幅腺病毒六鄰體(hexon)基因及砂眼披衣菌多形性蛋白II基因之引子組9及18進行多重引子PCR，PCR混合物含有正向及反向引子各10至20 pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTP與d-GTP各200 μM、含2單位Taq聚合酶之10 mM Tris-HCl pH 9.0、1.5 mM MgCl2
、5 mM
KCl、0.01%明膠、1 mM EDTA及含1單位UDP糖基化酶，以防止增幅子污染。循環條件為37℃培養30分鐘以完全消化任何增幅子汙染物，於50℃ 2分種，於94℃ 5分鐘之變性步驟，之後以60℃ 45秒、72℃ 45秒及94℃ 45秒共40個循環，然後於72℃反應延伸10分鐘。產物以6%洋菜膠分析，如第1圖所見，兩組基因被增幅，腺病毒之1 pg標準DNA及10 fg披衣菌DNA被用於增幅。
以引子組1、2及3進行多重引子PCR，其可分別增幅糖蛋白D、UL 44及DNA聚合酶基因。PCR混合物含正向及反向引子各10 pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTP及d-GTP各200 μM、含2單位Taq聚合酶之10 mM Tris-HCl(pH 7.5)、1.5 mM MgCl2
、5mM KCl、0.01%明膠、1mM EDTA及1單位UDP糖基化酶，以防止增幅子污染。循環條件為37℃培養30分鐘以完全消化任何增幅子汙染物，於50℃ 2分種，於94℃ 5分鐘之變性步驟，之後以60℃ 45秒、72℃ 45秒及94℃ 45秒共40個循環，然後於72℃反應延伸10分鐘。產物以6%洋菜膠分析，如第2圖所見，三組基因全被增幅。
以引子組1、2、3、9及17進行多重引子PCR，其分別可增幅HSV之糖蛋白D基因、UL 44基因、DNA聚合
酶基因、腺病毒六鄰體基因與砂眼披衣菌多形性蛋白II基因。PCR混合物含正向及反向引子各10 pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTP及d-GTP各200 μM、含2單位Taq聚合酶之10 mM Tris-HCl(pH 9.0)、1.5 mM MgCl2
、5mM KCl、0.01%明膠、1mM EDTA及1單位UDP糖基化酶，以防止增幅子污染。循環條件為37℃培養30分鐘以完全消化任何增幅子汙染物，50℃ 2分種，及94℃ 5分鐘之變性步驟，之後以60℃ 45秒、72℃ 45秒及94℃ 45秒共40個循環，然後於72℃反應延伸10分鐘。上述5支PCR混合物試管與以下DNA製劑培養，其中管NC並不含任何DNA，管1內含1皮克(pictogram)HSV DNA，管2內含4毫沙克(femtograms)砂眼披衣菌，管3內含10皮克腺病毒DNA，而管4內含所有三種前述數量之DNA。產物以6%洋菜膠分析，如第3圖所見，三組基因全被增幅。
含100 p mole SEQ ID No. 67、68、69、75及83靶之0.26 N NaOH各點上Nylon膜(第4圖)。然後使用含0.1%SDS及1% BSA之2X SSPE將膜於37℃阻斷1小時。加熱增幅子至95℃ 10分鐘，並混合於含0.1% SDS之2X SSPE，且於52℃雜交2小時。雜交後，將膜於含0.1% SDS之1X SSPE清洗5次，每次各3分鐘。將膜與鏈黴抗生物素過氧化酶(Streptavidin peroxidase)結合物培養於0.1 M Tris-HCl(pH 7.4；含1% BSA、150mM NaCl及0.3% tween-20)。於37℃ 30分鐘後，將膜以相同緩衝液清洗5次，每次各3分鐘。為了呈色，以每毫升含0.5 mg鹽酸二
氨基聯苯胺(Diaminobenzidine HCl)之磷酸鹽緩衝液，將膜於37℃培養10分鐘，出現棕色點表示存在特定病原體。
以引子組13、14、15及16進行多重引子PCR，其可增幅結核分枝桿菌MPB 64基因、兩棲類分枝桿菌16s-23sRNA基因、龜型分枝桿菌16s-23s RNA基因與弓蟲B1基因，PCR混合物含各正向及反向引子各10 pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTP及d-GTP各200 μM、含2單位Taq聚合酶之50 mM Tris-HCl(pH 9.0)、1.5 mM MgCl2
、5mM KCl、0.01%明膠、1mM EDTA及1單位UDP糖基化酶，以防止增幅子污染。循環條件為37℃培養30分鐘以完全消化任何增幅子汙染物，50℃ 2分種，及94℃ 5分鐘之變性步驟，之後以60℃ 45秒、72℃ 45秒及94℃ 45秒共40個循環，然後於72℃反應延伸10分鐘。上述5支PCR混合物試管與以下DNA製劑培養，其中管NC並不含任何DNA，管1內含1毫沙克結核分支桿菌DNA，管2內含100毫沙克兩棲類分枝桿菌DNA，管3內含100毫沙克龜型分枝桿菌DNA，管4內含1毫沙克弓蟲DNA。第5圖顯示五個尼龍膜，其各點上含100 p mole SEQ ID No 79、80、81及82靶之0.26 N NaOH。然後使用含0.1%SDS及1% BSA之2X SSPE將膜於37℃阻斷1小時。加熱增幅子至95℃ 10分鐘，並混合於含0.1% SDS之1 ml 2X SSPE，且於52℃雜交2小時。雜交後，將膜於含0.1% SDS之1X SSPE清
洗5次，每次各3分鐘。將膜與鏈黴抗生物素過氧化酶結合物培養於0.1 M Tris-HCl(pH 7.4；含1% BSA、150mM NaCl及0.3% tween-20)。於37℃ 30分鐘後，將膜以相同緩衝液清洗5次，每次各3分鐘。為了呈色，以每毫升含0.5 mg鹽酸二氨基聯苯胺之磷酸鹽緩衝液，將膜於37℃培養10分鐘，出現棕色點表示存在特定病原體。
以引子組1、2、3、4、5、6、7及8進行多重引子PCR，其各可增幅HSV之糖蛋白D基因、UL 44基因及DNA聚合酶基因、CMV之糖蛋白O基因、形態轉化及UL 88基因、與VZV之ORF 29基因及DNA聚合酶基因。PCR混合物含各正向及反向引子各10 pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTP及d-GTP各200 μM、含2單位Taq聚合酶之10 mMTris-HCl(pH 9.0)、1.5 mM MgCl2
、5mM KC1、0.01%明膠、1mM EDTA及1單位UDP糖基化酶，以防止增幅子污染。循環條件為37℃培養30分鐘以完全消化任何增幅子汙染物，50℃ 2分種，及94℃ 5分鐘之變性步驟，之後以60℃45秒、72℃ 45秒及94℃ 15秒共40個循環，然後於72℃反應延伸10分鐘。
上述4支PCR混合物試管與以下DNA製劑培養，其中管NC並不含任何DNA，管1內含1皮克HSV DNA，管2內含10皮克CMV DNA 且管3內含1皮克VZV DNA。第6圖顯示四個尼龍膜，其各點上含100 p mole SEQ ID No
67、68、69、70、71、72、73及74靶之0.26 N NaOH。然後使用含0.1% SDS及1% BSA之2X SSPE，將膜於37℃阻斷1小時。加熱增幅子至95℃ 10分鐘，並混合於含0.1% SDS之2X SSPE，且於52℃雜交2小時。雜交後，將膜於含0.1% SDS之1X SSPE清洗5次，每次各3分鐘。將膜與鏈黴抗生物素過氧化酶結合物培養於0.1 M Tris-HCl(pH 7.4；含1% BSA、150mM NaCl及0.3% tween-20)。於37℃ 30分鐘後，將膜以相同緩衝液清洗5次，每次各3分鐘。為了呈色，以每毫升含0.5 mg鹽酸二氨基聯苯胺之磷酸鹽緩衝液，將膜於37℃培養10分鐘，出現棕色點表示存在特定病原體。
以引子組10、11、12、18、19、20、21及22進行多重引子PCR，其各可增幅真細菌基因組之16s核醣體RNA基因組I及II、格蘭氏陽性菌16s核醣體RNA基因、所有黴菌之28s RNA基因、痤瘡桿菌之16s核醣體RNA基因、格蘭氏陰性菌之gyr B基因、烏頭酸水合酶基因及核醣核酸酶基因。PCR混合物含各正向及反向引子各10至20pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTP及d-GTP各200 μM、含2單位Taq聚合酶之50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、5 mM MgCl2
、5mM KCl、1%牛血清白蛋白、1 mM EDTA及1單位UDP糖基化酶，以防止增幅子污染。循環條件起始為37℃培養30分鐘以完全消化任何增幅子汙染物，於94℃ 5分鐘之
變性步驟，之後以60℃ 45秒、72℃ 45秒及於94℃ 45秒共40個循環，然後於72℃反應延伸10分鐘。上述5支PCR混合物試管與以下DNA製劑培養，其中管NC並不含任何DNA，管1內含5 fg E.coli之DNA，管2內含10 fg金黃色葡萄球菌DNA、管3內含10 fg痤瘡桿菌DNA，且管4內含10 fg白色念珠菌DNA。第7圖顯示5張尼龍膜，其各點上含100 p mole SEQ ID No 76、77、78、84、85、86、87及88靶之0.26 N NaOH。然後使用含0.1% SDS及1% BSA之2X SSPE，將膜於37℃阻斷1小時。加熱增幅子至95℃ 10分鐘，並混合於含0.1% SDS之2X SSPE，且於52℃雜交2小時。雜交後，將膜於含0.1% SDS之1XSSPE清洗5次，每次各3分鐘。將膜與鏈黴抗生物素過氧化酶結合物培養於0.1 M Tris-HCl(pH 7.4；含1% BSA、150mM NaCl及0.3% tween-20)。於37℃ 30分鐘後，將膜以相同緩衝液清洗5次，每次各3分鐘。為了呈色，以每毫升含0.5 mg鹽酸二氨基聯苯胺之磷酸鹽緩衝液，將膜於37℃培養10分鐘，出現棕色點表示存在特定病原體。
由屍體解剖11位死前罹患葡萄膜炎/視網膜炎的AIDS病患，收集之玻璃狀液接受多重引子PCR測試，之後在宏陣列上以增幅子鑑定。使用QIAGEN DNA純化套組由100μl之各玻璃體樣本萃取DNA，於50 μl洗提緩衝液中重建DNA。以引子組1至23進行多重引子PCR，該引子
組可增幅單純疱疹病毒1及2糖蛋白D、單純疱疹病毒1及2UL 44基因、單純疱疹病毒1及2 DNA聚合酶基因、細胞巨大病毒糖蛋白O基因、細胞巨大病毒形態轉化基因、細胞巨大病毒UL 88基因、水痘帶狀疱疹ORF 29、水痘帶狀疱疹DNA聚合酶基因、腺病毒六鄰體基因、真細菌16s核醣體RNA基因I、真細菌16s核醣體RNA基因區II、格蘭氏陽性菌16s核醣體RNA基因特異性部分、結核分枝桿菌MPB 64基因、兩棲類分枝桿菌16s-23s RNA基因、龜型分枝桿菌16s-23s RNA基因、弓蟲B1基因、砂眼披衣菌多形性蛋白II、黴菌28s核醣體RNA基因特異性部分、痤瘡桿菌16s-23s核醣體RNA基因特異性部分、格蘭氏陰性菌gyr B基因特異性部分、格蘭氏陰性菌烏頭酸水合酶基因、格蘭氏陰性菌核醣核酸酶I基因所有23組基因。
PCR混合物含各正向及反向引子各10至20 pmole、d-ATP、d-UTP、d-CTP及d-GTP各200 μM、含2單位Taq聚合酶之50 mM Tris-HCl(pH 9.0)、1.5 mM MgCl2
、5mM KCl、0.01%明膠、1mM EDTA及1單位UDP糖基化酶，以防止增幅子污染，與10μl由樣本萃取之DNA。循環條件起始為37℃培養30分鐘以完全消化任何增幅子汙染物，50℃ 2分鐘，94℃ 5分鐘之變性步驟，之後以60℃ 45秒、72℃ 45秒及94℃ 45秒共40個循環，然後於72℃反應延伸10分鐘。
以23組含序列ID No 1-46之引子，於10-20 p moles/50
μl反應混合物之濃度，依上所述進行PCR。在點上SEQ ID No. 47-71探針之尼龍膜上，將所有樣本之PCR產物雜交，尼龍膜各點上100 p moles含SEQ ID No. 67-88靶之0.26 NNaOH。然後使用含0.1% SDS及1% BSA之2X SSPE，將膜於37℃阻斷1小時。加熱增幅子至95℃ 10分鐘，並混合於含0.1% SDS之2X SSPE，且於52℃雜交2小時。雜交後，將膜於含0.1% SDS之1X SSPE清洗5次，每次各3分鐘。將膜與鏈黴抗生物素過氧化酶結合物培養於0.1 MTris-HCl(pH 7.4；含1% BSA、150mM NaCl及0.3% tween-20)。於37℃ 30分鐘後，將膜以相同緩衝液清洗5次，每次各3分鐘。為了呈色，以每毫升含0.5 mg鹽酸二氨基聯苯胺之磷酸鹽緩衝液，將膜於37℃培養10分鐘，出現棕色點表示存在特定病原體。
所獲得之結果簡述於表1，所有11個樣本被鑑定為HSV視網膜炎及結核分枝桿菌葡萄膜炎，同時其中10名病患玻璃體內另有弓蟲。多重引子PCR及DNA宏陣列精確地鑑定所有樣本。
由屍體解剖AIDS病患所收集之6個CSF樣本於多重引子PCR測試，之後在宏陣列上測試。死亡原因確認為中樞神經系統感染，使用商業上可獲得之QIAGEN DNA純化套組，由200μl之樣本萃取DNA，於50 μl洗提緩衝液中重建DNA。以引子組1至23進行多重引子PCR，該引子組可增幅單純疱疹病毒1及2糖蛋白D、單純疱疹病毒1及2UL 44基因、單純疱疹病毒1及2 DNA聚合酶基因、細胞巨大病毒糖蛋白O基因、細胞巨大病毒形態轉化基因、細胞巨大病毒UL 88基因、水痘帶狀疱疹ORF 29、水痘帶狀疱疹DNA聚合酶基因、腺病毒六鄰體基因、真細菌16s核醣體RNA基因I、真細菌16s核醣體RNA基因區II、格蘭氏陽性菌16s核醣體RNA基因特異性部分、結核分枝桿菌MPB 64基因、兩棲類分枝桿菌16s-23s RNA基因、龜型分枝桿菌16s-23s RNA基因、弓蟲B 1基因、
砂眼披衣菌多形性蛋白II、黴菌28s核醣體RNA基因特異性部分、痤瘡桿菌16s-23s核醣體RNA基因特異性部分、格蘭氏陰性菌gyr B基因特異性部分、格蘭氏陰性菌烏頭酸水合酶基因、格蘭氏陰性菌核醣核酸酶I基因所有23組基因。
PCR混合物含各正向及反向引子各10至20 pmole、d-APP、d-UTP、d-CTP及d-GTP各200 μM、含2單位Taq聚合酶之50 mM Tris-HCl(pH 9.0)、1.5 mM MgCl2
、5 mM KCl、0.01%明膠、1 mM EDLA及1單位UDP糖基化酶，以防止增幅子污染，與10μl由樣本萃取之DNA。循環條件起始為37℃培養30分鐘以完全消化任何增幅子汙染物，50℃ 2分鐘，94℃ 5分鐘之變性步驟，之後以60℃ 45秒、72℃ 45秒及94℃ 45秒共40個循環，然後於72℃反應延伸10分鐘。以23組含序列ID No 1-46之引子，於10-20 p moles/50 μl反應混合物之濃度，依上所述進行PCR。於點上100 p moles含SEQ ID No. 67-88靶之0.26 N NaOH的尼龍膜上，將所有樣本之PCR產物雜交。然後使用含0.1% SDS及1% BSA之2X SSPE，將膜於37℃阻斷1小時。加熱增幅子至95℃ 10分鐘，並混合於含0.1% SDS之2X SSPE，且於52℃雜交2小時。雜交後，將膜於含0.1% SDS之1X SSPE清洗5次，每次各3分鐘。將膜與鏈黴抗生物素過氧化酶結合物培養於0.1 M Tris-HCl(pH 7.4；含1% BSA、150mM NaCl及0.3% tween-20)。於37℃ 30分鐘後，將膜以相同緩衝液清洗5次，每次各3分鐘。為了
呈色，以每毫升含0.5 mg鹽酸二氨基聯苯胺之磷酸鹽緩衝液，將膜於37℃培養10分鐘，出現棕色點表示存在特定病原體。
取得不同臨床診斷之19個水樣液或玻璃狀液之眼睛樣本，使用商業上可獲得之DNA萃取套組，由約50-100 μl樣本萃取DNA，並於50 μl水中重建DNA，並將10 μl用於多重引子PCR，包含10 p 20 p moles含SEQ ID No 1-46之各引子組1-23。PCR試劑組成物及熱循環條件與上述實施例6及7相同，增幅子與上述實施例所述之具有SEQ ID No 67-88之靶雜交。結果簡述於下，其可證實引子組及探
針之臨床應用。
1.高效能及省時套組。
2.在非常早期感染的特定病原體鑑定將有助於醫師對
於疾病擴展選擇適當之治療方法及照護。
3.由相同樣本鑑定多重感染亦有助於使用藥物組合處理來有效治療。
第1圖為6%洋菜膠電泳，顯示腺病毒六鄰體基因及砂眼披衣菌基因組之單一引子及多重引子PCR增幅產物。其中第1圖之欄位(lane)分別為：NC-陰性對照組；1-陽性對照組-腺病毒；2-陽性對照組-砂眼披衣菌；3-陽性對照組-多重引子PCR(腺病毒及砂眼披衣菌)；MW-100 bp DNA梯形條帶(ladder)。
第2圖為4%洋菜膠電泳，顯示單純疱疹病毒(HSV)之糖蛋白D、DNA聚合酶、UL-44區的增幅產物。其中第
2圖之欄位各為：NC-陰性對照組；1-陽性對照組-糖蛋白D區；2-陽性對照組-DNA聚合酶區；3-陽性對照組-UL-44區：MW-100 bp DNA梯形條帶。
第3圖為6%洋菜膠電泳，顯示外眼感染之多重引子PCR增幅產物。其中第3圖之欄位各為：NC-陰性對照組；1-陽性對照組(HSV);2-陽性對照組(砂眼披衣菌);3-陽性對照組(腺病毒);4-陽性對照組(所有三種基因組)；MW-ψ X 174 ONA之Hinf
I消化物。
第4圖為與多重引子PCR之增幅子雜交，在尼龍膜上產生斑點之宏陣列照片，用以鑑定外眼感染，特別是鑑定HSV、砂眼披衣菌、腺病毒之基因組。第4圖之DNA陣列，其由左至右為：以DNA探針噴點於尼龍膜上之模板。HSV-單純疱疹病毒顯示之點標示為HGD=HSV糖蛋白D;HDP=HSV DNA聚合酶；HUL=UL 44基因；1st
Comp.=HGD互補股探針。CT-砂眼披衣菌；AV-腺病毒。NC-陰性對照組、HSV-與管1之增幅子雜交之膜，CT-與管2之增幅子雜交之膜；AV-與管3之增幅子雜交之膜。
第5圖為與多重引子PCR之增幅子雜交，在尼龍膜上產生斑點之宏陣列照片，用以檢測葡萄膜炎及其他受懷疑之分枝桿菌感染，特別是鑑定弓蟲、結核分枝桿菌、兩棲類分枝桿菌及龜型分枝桿菌之基因組。第5圖由左至右先為顯示於膜上點上靶之模板，MBT-結核分支桿菌，MBF-兩棲類分枝桿菌，MBC-龜型分枝桿菌，TG-弓蟲。其次，與陰性對照組試管雜交之NC標示為NC，與管1、2、3
及4所獲得之增幅子雜交之尼龍膜分別標示為MBT、MBF、MBC及TG。
第6圖為與多重引子PCR之增幅子雜交，在尼龍膜上產生斑點之宏陣列照片，用以鑑定病毒性視網膜炎，特別是鑑定HSV、CMV及VZV之基因組。第6圖由左至右為顯示各尼龍膜上點上靶的模板，HSV-單純疱疹病毒顯示出HGD=HSV糖蛋白D，HDP=HS DNA聚合酶，HUL=UL44基因，1st
Comp.=HGD互補股探針；CMV-細胞巨大病毒顯示出CMT=形態轉化基因II，CGO=細胞巨大病毒糖蛋白O，CUL=UL 83基因，5th
Comp=CMT互補股探針；VZV-水痘帶狀疱疹病毒顯示出VO=水痘帶狀疱疹ORF29基因，VDP=水痘帶狀疱疹DNA聚合酶；與試管內容物雜交之NC膜標示為NC，HSV-與獲自管1增幅子雜交之尼龍膜；CMV-與獲自管2增幅子雜交之尼龍膜，與VZV-與獲自管3增幅子雜交之尼龍膜。
第7圖為與多重引子PCR之增幅子雜交，在尼龍膜上產生斑點之宏陣列照片，用以鑑定感染性眼內炎，特別是鑑定真細菌、格蘭氏陽性菌、格蘭氏陰性菌、痤瘡桿菌及黴菌之基因組。第7圖中，NC=陰性控制組。GN顯示出ERR=真細菌組I之16s核醣體RNA基因、ERW=真細菌組II之16s核醣體RNA基因、GN 31=格蘭氏陰性gyrB基因、GN 67=格蘭氏陰性烏頭酸水合酶基因、GN 87=格蘭氏陰性核醣核酸酶基因、GP=格蘭氏陽性16s核醣體RNA基因、PA=痤瘡桿菌16s核醣體RNA基因、PF=黴菌
28s核醣體RNA基因。左上角為用於點上探針之模板，NC為與陰性控制組試管雜交之尼龍膜，GN、GP、PA及PF為各與管1、2、3及4之增幅子雜交之膜。
<110>印度科學與工業研究理事會(COUNCIL OF SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH)
<120>眼睛與中樞神經系統之細菌、黴菌、寄生蟲及病毒感染之新穎同步檢測及鑑別方法A NOVEL METHOD FOR SIMULTANEOUS DETECTION AND DISCRIMINATION OF BACTERIAL, FUNGAL, PARASITIC AND VIRAL INFECTIONS OF EYE AND CENTRAL NERVOUS SYSTEM
<130>LLS073 (210NF2006)
<160>88
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>單純疱疹病毒(Herpes simplex viras)
<400>1
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<211>22
<212>DNA
<213>單純疱疹病毒
<400>2
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<212>DNA
<213>單純疱疹病毒
<400>3
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>單純疱疹病毒
<400>4
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>單純疱疹病毒
<400>5
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>單純疱疹病毒
<400>6
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>細胞巨大病毒(Cytomegalovirus)
<400>7
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>細胞巨大病毒
<400>8
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>細胞巨大病毒形態轉化基因(Cytomegalovirus Morphological transformation gene)
<400>9
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>細胞巨大病毒
<400>10
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>細胞巨大病毒
<400>11
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>細胞巨大病毒
<400>12
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>水痘帶狀疱疹ORF 29(Varicella zoster ORF 29)
<400>13
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>水痘帶狀疱疹ORF 29
<400>14
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>水痘帶狀疱疹
<400>15
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>水痘帶狀疱疹
<400>16
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>腺病毒
<400>17
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>腺病毒六鄰體(Hexon)基因
<400>18
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>真細菌(eubacteria)16s核醣體RNA基因區I
<400>19
<210>20
<211>24
<212>DNA
<213>真細菌16s核醣體RNA基因區I
<400>20
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>真細菌16s核醣體RNA基因區II
<400>21
<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>真細菌16s核醣體RNA基因區II
<400>22
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>格蘭氏陽性菌16s核醣體RNA基因特異性部分
<400>23
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>格蘭氏陽性菌16s核醣體RNA基因特異性部分
<400>24
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400>25
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>結核分枝桿菌
<400>26
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>兩棲類分枝桿菌(Mycobacterium foituitum)
<400>27
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>兩棲類分枝桿菌
<400>28
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>龜型分枝桿菌(Mycobacterium chelonae)
<400>29
<210>30
<211>23
<212>DNA
<213>龜型分枝桿菌
<400>30
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>弓蟲(Toxoplasma gondii)
<400>31
<210>32
<211>22
<212>DNA
<213>弓蟲
<400>32
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>砂眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)
<400>33
<210>34
<211>23
<212>DNA
<213>砂眼披衣菌
<400>34
<210>35
<211>21
<212>DNA
<213>28s核醣體RNA基因
<400>35
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>28s核醣體RNA基因
<400>36
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>痤瘡桿菌(Propionibacterium acnes)
<400>37
<210>38
<211>21
<212>DNA
<213>痤瘡桿菌
<400>38
<210>39
<211>19
<212>DNA
<213>格蘭氏陰性菌gyr B基因特異性部分
<400>39
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>格蘭氏陰性菌gyr B基因特異性部分
<400>40
<210>41
<211>18
<212>DNA
<213>格蘭氏陰性菌烏頭酸水合酶(aconitate hydratase)基因
<400>41
<210>42
<211>17
<212>DNA
<213>格蘭氏陰性菌烏頭酸水合酶基因
<400>42
<210>43
<211>18
<212>DNA
<213>格蘭氏陰性菌核醣核酸酶1基因
<400>43
<210>44
<211>19
<212>DNA
<213>格蘭氏陰性菌核醣核酸酶1基因
<400>44
<210>45
<211>87
<212>DNA
<213>單純疱疹病毒
<400>45
<210>46
<211>70
<212>DNA
<213>單純疱疹病毒
<400>46
<210>47
<211>79
<212>DNA
<213>單純疱疹病毒
<400>47
<210>48
<211>72
<212>DNA
<213>細胞巨大病毒
<400>48
<210>49
<211>65
<212>DNA
<213>細胞巨大病毒
<400>49
<210>50
<211>68
<212>DNA
<213>細胞巨大病毒
<400>50
<210>51
<211>79
<212>DNA
<213>水痘帶狀疱疹
<400>51
<210>52
<211>85
<212>DNA
<213>水痘帶狀疱疹
<400>52
<210>53
<211>70
<212>DNA
<213>腺病毒
<400>53
<210>54
<211>86
<212>DNA
<213>真細菌16s核醣體RNA基因區I
<400>54
<210>55
<211>86
<212>DNA
<213>真細菌16s核醣體RNA基因區II
<400>55
<210>56
<211>71
<212>DNA
<213>格蘭氏陽性菌16s核醣體RNA基因特異性部分
<400>56
<210>57
<211>84
<212>DNA
<213>結核分枝桿菌
<400>57
<210>58
<211>74
<212>DNA
<213>兩棲類分枝桿菌
<400>58
<210>59
<211>70
<212>DNA
<213>龜型分枝桿菌
<400>59
<210>60
<211>70
<212>DNA
<213>弓蟲
<400>60
<210>61
<211>79
<212>DNA
<213>砂眼披衣菌
<400>61
<210>62
<211>68
<212>DNA
<213>黴菌28s核醣體RNA基因之特異性部分
<400>62
<210>63
<211>77
<212>DNA
<213>痤瘡桿菌
<400>63
<210>64
<211>68
<212>DNA
<213>格蘭氏陰性菌gyr B基因特異性部分
<400>64
<210>65
<211>66
<212>DNA
<213>格蘭氏陰性菌烏頭酸水合酶基因
<400>65
<210>66
<211>64
<212>DNA
<213>格蘭氏陰性菌核醣核酸酶1
<400>66
<210>67
<211>45
<212>DNA
<213>單純疱疹病毒
<400>67
<210>68
<211>30
<212>DNA
<213>單純疱疹病毒
<400>68
<210>69
<211>37
<212>DNA
<213>單純疱疹病毒
<400>69
<210>70
<211>31
<212>DNA
<213>細胞巨大病毒
<400>70
<210>71
<211>22
<212>DNA
<213>細胞巨大病毒
<400>71
<210>72
<211>26
<212>DNA
<213>細胞巨大病毒
<400>72
<210>73
<211>33
<212>DNA
<213>水痘帶狀疱疹
<400>73
<210>74
<211>36
<212>DNA
<213>水痘帶狀疱疹
<400>74
<210>75
<211>30
<212>DNA
<213>腺病毒
<400>75
<210>76
<211>38
<212>DNA
<213>真細菌16s核醣體基因區I
<400>76
<210>77
<211>38
<212>DNA
<213>真細菌16s核醣體基因區II
<400>77
<210>78
<211>24
<212>DNA
<213>格蘭氏陽性微生物16s核醣體基因
<400>78
<210>79
<211>42
<212>DNA
<213>結核分枝桿菌
<400>79
<210>80
<211>26
<212>DNA
<213>兩棲類分枝桿菌
<400>80
<210>81
<211>23
<212>DNA
<213>龜型分枝桿菌
<400>81
<210>82
<211>27
<212>DNA
<213>弓蟲
<400>82
<210>83
<211>32
<212>DNA
<213>砂眼披衣菌
<400>83
<210>84
<211>25
<212>DNA
<213>黴菌28s核醣體RNA基因
<400>84
<210>85
<211>26
<212>DNA
<213>痤瘡桿菌
<400>85
<210>86
<211>30
<212>DNA
<213>格蘭氏陰性微生物促旋酶(gyrase)基因
<400>86
<210>87
<211>31
<212>DNA
<213>格蘭氏陰性微生物烏頭酸水合酶基因
<400>87
<210>88
<211>27
<212>DNA
<213>格蘭氏陰性微生物核醣核酸酶基因
<400>88
Claims (22)
- 一種用於偵測及區別引起症候群病原體之引子組之組合，其中，該組合包含兩組以上之引子組，係專一性地偵測及區別兩種以上之病原體，其中，該引子組係選自由下列所成群組：第1組為FP：5' cgcttggtttcggatgggag 3'(SEQ ID No.1)、RP：5' gcccccagagacttgttgtagg 3'(SEQ ID No.2)；第2組為FP：5' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3'(SEQ ID No.3)、RP：5' cgggggggtcttgcgttac 3'(SEQ ID No.4)；第3組為FP：5' caagctgacggacatttacaagg 3'(SEQ ID No.5)、RP：5' gtcccacacgcgaaacacg 3'(SEQ ID No.6)；第4組為FP：5' ttccggctcatggcgttaacc 3'(SEQ ID No.7)、RP：5' cgccctgcttttacgttacgc 3'(SEQ ID No.8)；第5組為FP：5' cggcgacgacgacgataaag 3'(SEQ ID No.9)、RP：5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3'(SEQ ID No.10)； 第6組為FP：5' gggcacgtcctcgcagaag 3'(SEQ ID No.11)、RP：5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3’(SEQ ID No.12)；第7組為FP：5' ggtcttgccggagctggtattac 3'(SEQ ID No.13)、RP：5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3'(SEQ ID No.14)；第8組為FP：5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3'(SEQ ID No.15)、RP：5' acgttccggtagcgagttatctg 3'(SEQ ID No.16)；第9組為FP：5' cgccgccaacatgctctacc 3'(SEQ ID No.17)、RP：5' gttgcgggaggggatggata 3'(SEQ ID No.18)；第10組為FP：5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3'(SEQ ID No.19)、RP：5' cggactacgatcggttttgtgaga 3'(SEQ ID No.20)；第11組為FP：5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3'(SEQ ID No.21)、RP：5' ggcagattcctaggcattactcacc 3'(SEQ ID No.22)； 第12組為FP：5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3'(SEQ ID No.23)、RP：5' tgcagccctttgtaccgtccat 3'(SEQ ID No.24)；第13組為FP：5' gcggaacgtgggaccaatac 3'(SEQ ID No.25)、RP：5' cgacggggtgattttcttcttc 3'(SEQ ID No.26)；第14組為FP：5' aacttttttgactgccagacacactattg 3'(SEQ ID No.27)、RP：5’ggatgccaccccccaaaag 3'(SEQ ID No.28)；第15組為FP：5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3'(SEQ ID No.29)、RP：5' gacgttttgccgactacctatcc 3(SEQ ID No.30)；第16組為FP：5' cccctctgctggcgaaaagtg 3'(SEQ ID No.31)、RP：5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3'(SEQ ID No.32)；第17組為FP：5’aatcgtatctcgggttaatgttgc 3'(SEQ ID No.33)、RP：5’tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3'(SEQ ID No.34)； 第18組為FP：5' gctgggactgaggactgcgac 3'(SEQ ID No.35)、RP：5' ttcaagacgggcggcatataac 3'(SEQ ID No.36)；第19組為FP：5' tggcgaacgggtgagtaaca 3'(SEQ ID No.37)、RP：5' ccggtattagccccagtttcc 3'(SEQ ID No.38)；第20組為FP：5' cggcggcaagttcgacgac 3'(SEQ ID No.39)、RP：5' ccaccgagacgcccacacc 3'(SEQ ID No.40)；第21組為FP：5' ccaggtcggcggagaagc 3'(SEQ ID No.41)、RP：5' ccaccggcccgatgacc 3'(SEQ ID No.42)；第22組為FP：5' gccgccctgaccaccttc 3'(SEQ ID No.43)、RP：5' gcgggttgttcggcatcag 3'(SEQ ID No.44)；其中，各病原體係引起至少一種症候群。
- 如申請專利範圍第1項之引子組之組合，其中，該病原體係選自由單純疱疹病毒1及2、細胞巨大病毒、水痘帶狀疱疹病毒、腺病毒、真細菌(Eubacteria)、格蘭氏陽性菌、格蘭氏陰性菌、黴菌、結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis )、龜鱉分枝桿菌(Mycobacterium chelonei )、兩棲類分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum )、弓蟲(Toxoplasma gondii )、及砂眼披衣菌(Chlamydia trachomatis )所成群組。
- 如申請專利範圍第1項之引子組之組合，其中，該症候群係選自由感染性眼內炎、角膜炎、葡萄膜炎、視網膜炎、腦膜炎、腦膜腦炎所成群組。
- 如申請專利範圍第1項之引子組之組合，其中，由第1組[(SEQ ID No.1)及(SEQ ID No.2)]、第2組[(SEQ ID No.3)及(SEQ ID No.4)]、第3組[(SEQ ID No.5)及(SEQ ID No.6)]、第4組[(SEQ ID No.7)及(SEQ ID No.8)]、第5組[(SEQ ID No.9)及(SEQ ID No.10)]、第6組[(SEQ ID No.11)及(SEQ ID No.12)]、第7組[(SEQ ID No.13)及(SEQ ID No.14)]、及第8組[(SEQ ID No.15)及(SEQ ID No.16)]所組成之組合係用以偵測病毒性視網膜炎；或由第1組[(SEQ ID No.1)及(SEQ ID No.2)]、第2組[(SEQ ID No.3)及(SEQ ID No.4)]、第3組[(SEQ ID No.5)及(SEQ ID No.6)]、第9組[(SEQ ID No.17)及(SEQ ID No.18)]、及第17組[(SEQ ID No.33)及(SEQ ID No.34)]所組成之組合係用以偵測角膜結膜炎；或 由第13組[(SEQ ID No.25)及(SEQ ID No.26)]、第14組[(SEQ ID No.27)及(SEQ ID No.28)]、第15組[(SEQ ID No.29)及(SEQ ID No.30)]、第16組[(SEQ ID No.31)及(SEQ ID No.32)]所組成之組合係用以偵測葡萄膜炎；或由第10組[(SEQ ID No.19)及(SEQ ID No.20)]、第11組[(SEQ ID No.21)及(SEQ ID No.22)]、第12組[(SEQ ID No.23)及(SEQ ID No.24)]、第18組[(SEQ ID No.35)及(SEQ ID No.36)]、第19組[(SEQ ID No.37)及(SEQ ID No.38)]、第20組[(SEQ ID No.39)及(SEQ ID No.40)]、第21組[(SEQ ID No.41)及(SEQ ID No.42)]、及第22組[(SEQ ID No.43)及(SEQ ID No.44)]所組成之組合係用以偵測感染性眼內炎；或由第1組[(SEQ ID No.1)及(SEQ ID No.2)]、第2組[(SEQ ID No.3)及(SEQ ID No.4)]、第3組[(SEQ ID No.5)及(SEQ ID No.6)]、第4組[(SEQ ID No.7)及(SEQ ID No.8)]、第5組[(SEQ ID No.9)及(SEQ ID No.10)]、第6組[(SEQ ID No.11)及(SEQ ID No.12)]、第7組[(SEQ ID No.13)及(SEQ ID No.14)]、第8組[(SEQ ID No.15)及(SEQ ID No.16)]、第13組[(SEQ ID No.25)及(SEQ ID No.26)]、第16組[(SEQ ID No.31)及(SEQ ID No.32)]、及第18組[(SEQ ID No.35)及(SEQ ID No.36)]所組成之組合係用以偵測腦膜腦炎；或由第10組[(SEQ ID No.19)及(SEQ ID No.20)]、第11組[(SEQ ID No.21)及(SEQ ID No.22)]、第12組[(SEQ ID No.23)及(SEQ ID No.24)]、第18組[(SEQ ID No.35)及(SEQ ID No.36)]、第20組[(SEQ ID No.39)及(SEQ ID No.40)]、第21組[(SEQ ID No.41)及(SEQ ID No.42)]、及第22組[(SEQ ID No.43)及(SEQ ID No.44)]所組成之組合係用以偵測格蘭氏陽性菌/格蘭氏陰性菌；或由第10組[(SEQ ID No.19)及(SEQ ID No.20)]、第11組[(SEQ ID No.21)及(SEQ ID No.22)]、第12組[(SEQ ID No.23)及(SEQ ID No.24)]、第13組[(SEQ ID No.25)及(SEQ ID No.26)]、第18組[(SEQ ID No.35)及(SEQ ID No.36)]、第20組[(SEQ ID No.39)及(SEQ ID No.40)]、第21組[(SEQ ID No.41)及(SEQ ID No.42)]、及第22組[(SEQ ID No.43)及(SEQ ID No.44)]所組成之組合係用以區別急性及慢性腦炎。
- 如申請專利範圍第1項之引子組之組合，其中，由第1至22組(SEQ ID No.1至44)所組成之組合係用以偵測單純疱疹病毒1及2、細胞巨大病毒、水痘帶狀疱疹病毒、腺病毒、真細菌、格蘭氏陽性菌、格蘭氏陰性菌、 黴菌、結核分枝桿菌、龜鱉分枝桿菌、兩棲類分枝桿菌、弓蟲、及砂眼披衣菌之一個以上之目標核酸。
- 如前述申請專利範圍任一項之引子組之組合，其所用樣本係選自水樣液、玻璃狀液或玻璃體灌洗液、角膜抹片、結膜擦布、腦脊髓液、血液、及血漿所成群組。
- 如前述申請專利範圍第1項之引子組之組合，其中，該引子係於5' 端以生物素部分標示，而經由形成呈色產物檢測；或該引子經由螢光標記標示，該螢光標記為有機螢光標誌，選自螢光異硫氰酸鹽(FITC)所成群組，或無機螢光奈米顆粒，包括Quantum DotsTM 、Cy3、Cy5，其係經由任何螢光掃描裝置或顯微鏡檢測。
- 一種病原體特定DNA探針序列之組合，用於偵測及區別兩種以上之病原體，其中，該組合包含兩組以上之探針組，其中，該DNA探針序列為使用申請專利範圍第1項所述之引子組之增幅產物，其係選自由下列所成群組：(1)探針DNA序列
- 如申請專利範圍第8項之病原體特定DNA探針序列之組合，其中，該DNA探針係於5' 端以生物素部分標示，而經由形成呈色產物檢測；或該DNA探針經由螢光標記標示，該螢光標記為有機螢光標誌，選自螢光異硫氰酸鹽(FITC)所成群組，或無機螢光奈米顆粒，包括Quantum DotsTM 、Cy3、Cy5，其係經由任何螢光掃描裝置或顯微鏡檢測。
- 一種DNA靶序列之組合，其包含兩組以上之DNA靶序列，係專一性地偵測及區別兩種以上之病原體，係選自由下列所成群組：(1)5’gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct 3’(SEQ ID No.67)、(2)5’cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg3’(SEQ ID No.68)、(3)5’tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg3’(SEQ ID No.69)、(4)5’aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg3’(SEQ ID No.70)、(5)5’aatacaaagccgcagtgtcgtc3’(SEQ ID No.71)、(6)5’gactccaggtacaccttgacgtactg3’(SEQ ID No.72)、(7)5’cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc3’(SEQ ID No.73)、(8)5’ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata3’(SEQ ID No.74)、(9)5’ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca3’(SEQ ID No.75)、(10)5’tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa3’(SEQ ID No.76)、(11)5’ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg3’(SEQ ID No.77)、(12)5’gacctgggctacacacgtgctaca 3’(SEQ ID No.78)、 (13)5’ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt3’(SEQ ID No.79)、(14)5’ggctttgagacaacaggcccgtgccc3’(SEQ ID No.80)、(15)5’tttataaatcctgtccaccccgt3’(SEQ ID No.81)、(16)5’aaattcatgagtatctgtgcaactttg3’(SEQ ID No.82)、(17)5’atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc3’(SEQ ID No.83)、(18)5’gtaagtcaaggatgctggcataatg3’(SEQ ID No.84)、(19)5’gcttcagcgccgtcagcgaggataac3’(SEQ ID No.85)、(20)5’aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac3’(SEQ ID No.86)、(21)5’cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg3’(SEQ ID No.87)、以及(22)5’atcagcctggccggccgttacctggtg3’(SEQ ID No.88)。
- 一種檢測及區別病原體之方法，包括下列步驟：(i)進行多重引子PCR(聚合酶連鎖反應)，使用第1組[(SEQ ID No.1)及(SEQ ID No.2)]、第2組[(SEQ ID No.3)及(SEQ ID No.4)]、第3組[(SEQ ID No.5)及(SEQ ID No.6)]、第4組[(SEQ ID No.7)及(SEQ ID No.8)]、第5組[(SEQ ID No.9)及(SEQ ID No.10)]、第6組[(SEQ ID No.11)及(SEQ ID No.12)]、第7組[(SEQ ID No.13)及(SEQ ID No.14)]、第8組[(SEQ ID No.15)及(SEQ ID No.16)]、第13組[(SEQ ID No.25)及(SEQ ID No.26)]、第16組[(SEQ ID No.31)及(SEQ ID No.32)]、及第18組[(SEQ ID No.35)及(SEQ ID No.36)]之引子組以獲得增幅產物；(ii)將步驟(i)所得之增幅產物與固定於固相基質上之互補DNA靶序列雜交，其中，該靶序列係選自由SEQ ID No.67至88所成群組；以及(iii)檢測該雜交產物，以進一步檢測及區別該病原體，其中，該病原體係選自由單純疱疹病毒1及2、細胞巨大病毒、水痘帶狀疱疹病毒、腺病毒、真細菌、格蘭氏陽性菌、格蘭氏陰性菌、黴菌、結核分枝桿菌、龜鱉分枝桿菌、兩棲類分枝桿菌、弓蟲、及砂眼披衣菌所成群組。
- 一種檢測及區別兩種以上之引起症候群病原體之方法，包括下列步驟：(i)進行多重引子PCR(聚合酶連鎖反應)，使用第1至22組引子組(SEQ ID No.1至SEQ ID No.44)之組合由臨床樣本獲得增幅PCR產物；(ii)將該PCR產物變性；(iii)將該變性之PCR產物與DNA靶序列雜交；以及(iv)檢測該雜交作用以鑑定出該病原體。
- 如申請專利範圍第12項之方法，其中，該症候群係選自由感染性眼內炎、角膜炎、葡萄膜炎、視網膜炎、腦膜炎、眼部感染、及腦膜腦炎所成群組。
- 如申請專利範圍第12項之方法，其中，該DNA靶序列係選自由SEQ ID No.67至88所成群組。
- 如申請專利範圍第12項之方法，其中，該第1至22組之引子組(SEQ ID No.1至44)可一起用於相同熱循環條件之單一試管，該條件之特徵在於，94℃ 5分鐘之變性步驟、之後於60-64℃ 45秒、72℃ 45秒及94℃ 45秒40個循環，之後於72℃反應延伸10分鐘。
- 如申請專利範圍第12項之方法，其中該引子係於5’端以生物素部分標示，而經由形成呈色產物檢測；或該引子經由螢光標記標示，該螢光標記為有機螢光標誌，選自螢光異硫氰酸鹽(FITC)所成群組，或無機螢光奈米顆粒，包括Quantum DotsTM、Cy3、Cy5，其係經由任何螢光掃描裝置或顯微鏡檢測。
- 如申請專利範圍第11至16項任一項之方法，其中，該雜交作用之檢測係使用選自由SEQ ID No.45至66所成群組之增幅PCR產物作為探針，以宏陣列(macro array)或墨點法(slot blot)或線性探針分析(line probe assay)之形式之檢測；其中，該探針為使用申請專利範圍第1項所述之引子組之增幅產物。
- 如申請專利範圍第17項之方法，其中，該宏陣列包括DNA靶序列(SEQ ID No.67至88)，固定於固 相物上，該固相物包含硝化纖維、尼龍、荷電尼龍、玻璃或聚苯乙烯。
- 一種用於同步檢測及區分引起外眼感染、眼內炎、或葡萄膜炎、或視網膜炎、或腦膜腦炎之病原體之套組，其包含：a)第1至22組之引子組(SEQ ID No.1至44)；b)一種包含SEQ ID No.67至88之DNA序列之基質，其固定於一固相物上；c)增幅DNA之聚合酶連鎖反應所需之標準試劑；d)雜交PCR增幅產物與固定於該固相物上之DNA序列之基質所需之標準試劑；及e)檢測及區別最終雜交產物所需之標準試劑。
- 一種用於檢測樣本中病原體之套組，包含：第1至22組之引子組(SEQ ID No.1至44)，其中，該病原體為單純疱疹病毒1及2、細胞巨大病毒、水痘帶狀疱疹病毒、腺病毒、真細菌、格蘭氏陽性菌、格蘭氏陰性菌、黴菌、結核分枝桿菌、龜鱉分枝桿菌、兩棲類分枝桿菌、弓蟲、及砂眼披衣菌。
- 一種套組，包含：引子組：第1組[(SEQ ID No.1)及(SEQ ID No.2)]、第2組[(SEQ ID No.3)及(SEQ ID No.4)]、第3組[(SEQ ID No.5)及(SEQ ID No.6)]、第4組[(SEQ ID No.7)及(SEQ ID No.8)]、第5組[(SEQ ID No.9)及(SEQ ID No.10)]、第6組[(SEQ ID No.11)及(SEQ ID No.12)]、第7組[(SEQ ID No.13)及(SEQ ID No.14)]、及第8組[(SEQ ID No.15)及(SEQ ID No.16)]，用以偵測病毒性視網膜炎；或引子組：第1組[(SEQ ID No.1)及(SEQ ID No.2)]、第2組[(SEQ ID No.3)及(SEQ ID No.4)]、第3組[(SEQ ID No.5)及(SEQ ID No.6)]、第9組[(SEQ ID No.17)及(SEQ ID No.18)]、及第17組[(SEQ ID No.33)及(SEQ ID No.34)]，用以偵測角膜結膜炎；或引子組：第13組[(SEQ ID No.25)及(SEQ ID No.26)]、第14組[(SEQ ID No.27)及(SEQ ID No.28)]、第15組[(SEQ ID No.29)及(SEQ ID No.30)]、第16組[(SEQ ID No.31)及(SEQ ID No.32)]，用以偵測葡萄膜炎；或引子組：第10組[(SEQ ID No.19)及(SEQ ID No.20)]、第11組[(SEQ ID No.21)及(SEQ ID No.22)]、第12組[(SEQ ID No.23)及(SEQ ID No.24)]、第18組[(SEQ ID No.35)及(SEQ ID No.36)]、第19組[(SEQ ID No.37)及(SEQ ID No.38)]、第20組[(SEQ ID No.39)及(SEQ ID No.40)]、第21組[(SEQ ID No.41)及(SEQ ID No.42)]、及第22組[(SEQ ID No.43)及(SEQ ID No.44)]，用以偵測感染性眼內炎；或引子組：第1組[(SEQ ID No.1)及(SEQ ID No.2)]、第2組[(SEQ ID No.3)及(SEQ ID No.4)]、第3組 [(SEQ ID No.5)及(SEQ ID No.6)]、第4組[(SEQ ID No.7)及(SEQ ID No.8)]、第5組[(SEQ ID No.9)及(SEQ ID No.10)]、第6組[(SEQ ID No.11)及(SEQ ID No.12)]、第7組[(SEQ ID No.13)及(SEQ ID No.14)]、第8組[(SEQ ID No.15)及(SEQ ID No.16)]、第13組[(SEQ ID No.25)及(SEQ ID No.26)]、第16組[(SEQ ID No.31)及(SEQ ID No.32)]、及第18組[(SEQ ID No.35)及(SEQ ID No.36)]，用以偵測腦膜腦炎；或引子組：第10組[(SEQ ID No.19)及(SEQ ID No.20)]、第11組[(SEQ ID No.21)及(SEQ ID No.22)]、第12組[(SEQ ID No.23)及(SEQ ID No.24)]、第18組[(SEQ ID No.35)及(SEQ ID No.36)]、第20組[(SEQ ID No.39)及(SEQ ID No.40)]、第21組[(SEQ ID No.41)及(SEQ ID No.42)]、及第22組[(SEQ ID No.43)及(SEQ ID No.44)]，用以偵測格蘭氏陽性菌/格蘭氏陰性菌；或引子組：第10組[(SEQ ID No.19)及(SEQ ID No.20)]、第11組[(SEQ ID No.21)及(SEQ ID No.22)]、第12組[(SEQ ID No.23)及(SEQ ID No.24)]、第13組[(SEQ ID No.25)及(SEQ ID No.26)]、第18組[(SEQ ID No.35)及(SEQ ID No.36)]、第20組[(SEQ ID No.39)及(SEQ ID No.40)]、第21組[(SEQ ID No.41)及(SEQ ID No.42)]、及第22組[(SEQ ID No.43)及(SEQ ID No.44)]，用以偵測急性及慢性腦炎。
- 一種基質，包含選自SEQ ID No.67至88之至少兩種經固定之DNA靶序列之組合，其係專一性地偵測及區別兩種以上之病原體。
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