KR20100044736A - 눈과 중앙 신경조직의 세균성, 균성, 기생성 및 바이러스성 감염을 동시에 검출 및 판별하기 위한 신규한 방법 - Google Patents

눈과 중앙 신경조직의 세균성, 균성, 기생성 및 바이러스성 감염을 동시에 검출 및 판별하기 위한 신규한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감염을 유발할 수 있는, 많은 가능한 병원체 중에서 눈과 신경계 감염의 단일 또는 하나 이상 원인이 되는 병원체의 확인을 위한 진단 방법에 관한 것이다. 눈 또는 신경계의 분리된 영역에 영향을 주는 병원체는 일반적으로 동일한 임상 징후 또는 증후군을 유발한다. 본 발명은 하나의 병원체의 검출에 관한 각 많은 테스트에 의지하지 않고 단일 테스트에서 가능한 일련의 병원체 사이에서 병원체의 검출 및 판별하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 개별적인 병원체의 검출에 근거를 둔 진단을 대체하는 증후군에 근거한 진단을 목적으로 한다.

Description

눈과 중앙 신경조직의 세균성, 균성, 기생성 및 바이러스성 감염을 동시에 검출 및 판별하기 위한 신규한 방법{A NOVEL METHOD FOR SIMULTANEOUS DETECTION AND DISCRIMINATION OF BACTERIAL, FUNGAL, PARASITIC AND VIRAL INFECTIONS OF EYE AND CENTRAL NERVOUS SYSTEM}
본 발명은 감염의 원인이 될 수 있는, 많은 가능한 병원체 중에서 눈과 신경계 감염의 단일 원인이 되는 병원체 또는 하나 이상의 원인이 되는 병원체를 식별하기 위한 진단 방법에 관련된다. 눈 또는 신경계의 분리된 영역에 일반적으로 영향을 미치는 모든 병원체는 동일한 임상 징후(manifestation) 또는 증후군을 일으킨다. 본 발명은 하나의 병원체를 검출하기 위한 많은 테스트에 의지하지 않고 단일 테스트에서 가능한 병원체의 세트 중에서 병원체를 검출 및 판별하는 방법에 관련된다. 본 발명은 각 병원체의 검출에 근거를 둔 진단을 대체하는 증후군에 근거한 진단을 목적으로 한다.
번식하고 결과적으로 감염에 의해 영향받는 해부 구획((anatomical compartment)에 따라 눈의 감염을 임상적으로 분류할 수 있다. 눈 감염을 유발하는 많은 유기체가 존재하며 이는 여기에 참조로서 통합되는 "Principles and Practice of Infectious Diseases, 6th Edition, Gerald Mandell et al (Eds) Elsevier Churchill Livingston, pp 1387-1418 (2005)"에 상세히 기술되어 있다.
눈 감염은 임상의(clinician)의 초기 진단에 근거하여 다음의 종류로 분류될 수 있다;
1. 각막염(Keratitis)과 결막염(Conjunctivitis)과 같은 외부 눈 감염
2. 전염성 안구내염(endophthalmitis)
3. 포도막염(uveitis)
4. 망막염(retinitis)
일부 박테리아 및 균류에 의한 많은 외부 눈 감염이 있다. 환경에의 노출에 기인하여 패신저(passenger)로서 결막(conjunctiva) 및 각막(cornea)에 많은 비-병원성(non-pathogenic) 박테리아 및 균류가 번식하기 때문에 결막 또는 각막에서 취한 스크랩핑(scraping) 또는 면봉(swab)에서의 특정한 병원체(박테리아와 균류)의 검출이 어렵다. 고름(pus)과 함께 화농(suppuration) 또는 궤양(ulceration)이 존재하면, 임상의는 세균성 감염으로 임시로 진단하고 국소적으로 적용되는 광역 항균 스펙트럼의(broad-spectrum) 항생제로 환자를 치료한다. 그러나 진단하기 어렵지만 저명하게 치료할 수 있는 중요한 감염이 다음과 같다:
(각막염의 원인인) 단순 포진(Herpes simplex)
● (일부 만연적으로 발생하는) 아데노바이러스성(Adenoviral) 각결막염(keratoconjunctivitis)
● (트라코마(trachoma)와 성인 봉입체 결막염(adult inclusion conjunctivitis)을 유발하는 여포성 결막염(follicular conjunctivitis)의 원인 인) 클라미디아 트라코마티스( chlamydia trachomatis )
● (대상 포진성 결막염(Herpes zoster conjunctivitis)이라고도 불리는) 수두 결막염(Varicella conjunctivitis)
● (굴절률 오차(refractive error)를 줄이기 위해 수행된 수술인, 라식(LASIK) 후의 감염) M. chelonae와 M. fortuitum와 같은 신속 발육 항산균(rapidly growing mycobacteria)
전염성 안구내염(endophthalmitis)은 일반적으로 다음에 의해 유발될 수 있다
● 그램 양성 박테리아
● 그램 음성 박테리아
● 혐기성 유기체, 즉 프로피오니박테리움 아크네스( Propionibacterium acnes)
● 균류.
일반적으로 감염은 수술 후에 발생하며 아주 빨리 퍼져서 환자는 장님이 될 수 있다. 치료시 요구되는 가장 중요한 정보는 원인균이 박테리아인지 균류인지, 박테리아이면 호기성인지 혐기성인지 여부이다. 혈행 확산(hematogenous spread)에 기인한 내인성 감염은 희박하다.
포도막염(uveitis)은 일반적으로 다음에 의해 유발된다:
● 결핵균( Mycobacterium tuberculosis ),
● 거북결핵균(M. chelonae ),
● 폐렴균(M. fortuitum ),
● 톡소플라즈마 곤디이( toxoplasma gondll )
망막염(retinitis)은 면역기능이 약한 사람(immune compromised individual)에게서 나타나고 다음에 의해 유발된다:
● 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)
● 단순포진 바이러스(Herpes simplex virus)
● 수두 대상포진 바이러스(Varicella zoster virus)
모든 이런 환자는 시력을 상당히 상실하므로 이런 유기체를 조기에 시의적절하게 진단하면 전세계에 걸쳐 시각장애인을 예방할 수 있다. 실제로 개발도상국에서 이런 질병이 상대적으로 더 빈번히 발생할지도 모른다. 종래 기술에서 상술한 대로 눈 감염의 진단을 위해 많은 진단 기술이 있다.
중앙 신경 조직 감염은 다음의 종류로 분류될 수 있다:
급성 화농성 뇌수막염( acute pyogenic meningitis ): 일반적으로 아이들에게서 관찰되고 다음과 같은 유기체에 의해 유발된다;
● 헤모필러스 인플루엔자균( Haemophilus influenza ),
● 수막구균 ( Neisseria meningitides ) 및
● 폐렴구균( Streptococcus pneumoniae ).
뇌척수액(Cerebro-Spinal Fluid; CSF) 침전물의 세균성 배양 또는 도말표본 현미경검사법(smear microscopy)은 감도가 부족하다. 추가적인 복합요인은 항생제 로 환자를 사전에 치료하면 그램 양성과 음성에서, 또한 CSF의 배양에서 부정적 결과를 이끌어 낼 수 있다. 이런 이유로, 의사는 배양 결과에 의지하는 것을 주저하고 대부분의 케이스에서 필요하지 않은, 정맥 항생제를 10-14일 과정 동안 투여하는 것을 선택할 것이다. 일단 부분적으로 치료되면, 케이스는 다음에 의해 유발된 만성 뇌수막염과 구별할 수 없다;
● 결핵균( Mycobacterium tuberculosis )
● 다양한 균류(fungi)
● 일련의 치료에 순종적인 바이러스, 즉 HSV, CMV 및 VZV에 의해 유발된 바이러스성 뇌염(encephalitis).
뇌염(encephalitis)은 풍토병 및 전염병의 다양한 바이러스에 의해 일반적으로 유발되었다. 그러나 단순 포진(Herpes simplex), 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 및 수두 대상포진(Varicella zoster)은 특정한 항바이러스 치료가 필요한 바이러스이다. 다른 치료할 수 있는 뇌염(encephalitis) 병원체는 톡 소플라즈마 곤디이(toxoplasma gondii)이다.
종래 기술:
임상 샘플에서 병원체(박테리아, 효모 및 다른 균류, 기생충 및 바이러스) 검출을 위한 전통적 방법은 표준 실험실 테스트에 의해 확인되고 열거된 후에 관찰할 수 있는 클로니 성장으로 존재하는 병원체의 수를 증폭하기 위하여 샘플을 배양하는 것을 포함한다. 필요하다면, 약물 치료에 대한 병원체의 민감도를 결정하기 위한 추가적 테스트를 위해 배양을 실시할 수 있다. 감염 종을 정확하게 확인하기 위해 임상의는 (신속 발육 항산균(rapidly growing mycobacteria)을 포함한 대부분의 박테리아의 경우에서와 같이) 3일 내지 (결핵균( Mycobacterium tuberculosis )의 경우와 같이) 8주가 요구되는 배양 결과에 의지해야 한다. 정확하게 박테리아의 종을 확인하기 위하여 배양한 후, 추가로 수일 또는 수주가 걸릴 수도 있는 광대한 생화학 테스트가 실시된다. 질병의 정도 및 즉각적인 약 간섭(immediate drug intervention)의 필요성에 의해 빨리 결정되는 것이 중요한 경우도 있다. 여기에서 참조된 배양 기술은 세균성 감염 및 균류 감염의 진단에 대부분 유익하지만 임상 샘플에서 배양하여 바이러스를 분리하는 빈도가 15% 미만이기 때문에 바이러스 감염의 경우 진단의 목적을 위해 배양 기술이 채택되지 않는다.
눈 감염과 신경계의 감염과 같은 감염을 진단을 위한 적합한 샘플은 각결막염(kerato-conjunctivitis), 안구내염(endophthalmitis), 포도막염(uveitis), 망막염(retinitis), 뇌수막염(meningitis) 및 뇌염(encephalitis)과 같은 잠재적인 증후군(underlying syndrome)의 원인론적 병원체(aetiological agent)를 검출하는 진단의 성공에 있어서 추가로 중요한 문제점이다. 이러한 경우에 감염은 눈 또는 CNS에 높게 국소화되고 제한된다. 혈액, 혈장 또는 혈청과 같은 체액은 전염 병원체를 포함하지 않는다. 외부 눈 감염은 각막 스크랩핑(scraping) 또는 결막 면봉(conjunctival swab)과 같은 샘플을 요구되며 반면에 전염성 안구내염(endophthalmitis)은 안과에서의 유리체흡인술(vitreous aspiration) 또는 Hank's Balanced Salt solution으로 유리체(vitreous)를 세척하여 20ml를 수술실에 서 취한 유리체절제술(vitrectomy)이 필요하다. 유리체(vitreous)의 간단한 흡인술(aspirate)은 도말 표본 검사(smear examination)와 배양에 의하여 균성 및 세균성 안구내염(endophthalmitis)을 진단하기에 불충분하다. 포도막염(uveitis)과 망막염(retinitis)의 경우에 바람직한 샘플은 27-게이지 바늘로 모은 유리액 0.2 내지 0.3mL이다. 중앙 신경 조직 감염의 진단에 사용되는 최고의 생물학적 액체는 뇌척수액이다. 본 발명의 일 구체화에서, 안구내염(endophthalmitis)의 경우의 수양액(aqueous humor) 또는 유리액은 전염 병원체를 검출하고 판별하는데 충분할 것이다. 이것은 수술실에서 수행될 유리체절제술(vitrectomy)과 같은 외과적 치료의 필요성을 제거한다.
병원체를 확인하기 위한 DNA 기반 방법은 시간이 걸리고 훈련된 기술을 가진 인력을 요구하는, 고전적 방식에 대한 간편하고, 튼튼하고, 아주 간단한 대안을 제공한다. 고전적 방식을 수행하면서 때때로 병원체의 애매한 확인 및 그로 인한 잘못된 진단/치료를 이끌어 내는 과실이 있을 수 있다. 반면에 DNA 기반 병원체 확인은 매우 초기에, 때때로 임상 증후가 보이기 전(무증상 단계(sub-clinical stage))에 병원체를 확인하는 이점을 제공한다. 일단 조건이 표준화되면, 병원체 확인은 아주 간단하며, 반숙련된 사람에 의해서도 행해질 수 있다. DNA 기반 절차는 또한 의학 간섭의 결과(예후 가치)를 평가하기 위해 이용될 수 있다. PCR과 같은 DNA 기반 방법을 사용하여 인간의 병원체를 위한 임상 샘플의 스크리닝은 민감하며 정의적인 진단을 제공하며 샘플당 몇몇 (약 20-50) 병원성 유기체를 포함하는 임상 샘플(수양액(aqueous humor), 유리액, 눈물, 침, 혈액, 뇌척수액(Cerebro-Spinal Fluid), 각막 스크랩핑(corneal scraping), 결막 면봉(conjunctival swab), 조직표본(tissue specimen) 등과 같은 점막(mucosal) 또는 상피(epithelial) 스크랩핑(scraping))의 적은 양에서, 효과적인 치료를 시작할 수 있다. PCR(polymerase chain reaction) 기술 채택의 잠재적인 이득은 상대적으로 단기간에 특정한 세균성 또는 바이러스성 병원체를 확인하는 것이다. 실행가능한 PCR-기반 분석실험은 환자가 응급실에 있는 동안 치료를 어떻게 시작할지 임상의의 결정에 영향을 줄 수 있다. PCR-기반의 검출 방법은 실행가능한 유기체의 존재가 아닌 유전 물질에 의지하기 때문에, PCR-기반 기술은 임상 샘플을 수집하기 전에 항생제가 투여된 경우에도, 모든 환자의 경우에 적용 가능하다. 그러나 PCR-기반 방법에도 핵산 오염에 기인한 거짓-양성 결과 및 복잡한 샘플에 기인한 PCR 반응의 저해 등과 같은 일부 어려움이 있다. 다음의 PCR 분석실험은 눈과 CNS 감염의 원인이 되는 유기체를 위해 기술되었다.
단순 포진( Herpes simplex ) 1 & 2: HSV의 PCR 기반 DNA 검출은 Wald A. 등에 의한 "Polymerase chain reaction for detection of Herpes simplex virus (HSV) on mucosal surface: Comparison with HSV isolation in cell culture"(J. Inf. Dis.188: 1345-1351 (2003년))에서 기술한 바이러스 배양보다 4 내지 5배 더 민감하고 수송 상태에서 덜 민감하다. Madhavan HN 등에 의한 "Detection of herpes simplex virus (HSV) using polymerase chain reaction (PCR) in clinical samples: Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV". (J. Clin. Virol. 14:145-151 (1999))에서 수양액(aqueous humor), 각막 스크랩핑, 렌즈 흡입물(Lens aspirate), 렌즈 캡슐 물질(lens capsular material) 및 유리액과 같은 눈 샘플 및 CSF, 생식기(genital) 면봉 및 자궁 경관(cervical) 면봉 등과 같은 다른 임상 표본에서 HSV를 검출하는데 PCR이 이용되었다. 여기에서 PCR은 임상 샘플에서 HSV의 1 내지 3 입자를 검출할 수 있었다. 참조로서 여기에 통합된 Madhavan HN 등에 의한 "Phenotypic and Genotypic methods for the detection of herpes simplex virus serotypes". (J. Virol. Methods, 108: 97-102 (2003)) 간행물에 언급된 것과 같이 amplicon의 제한효소에 의한 길이 다형성(Restriction length polymorphisms)과 PCR을 통합하는 포진성 바이러스(Herpes virus) 혈청형(serotype)을 확인하기 위하여 효과적으로 이용하였다.
수두 대상포진( Varicella zoster ) 바이러스: 수두 감염을 검출하기 위해 PCR을 적용하였다(Burke DG, et al. "Polymerase chain reaction detection and clinical significance of varicella zoster in cerebrospinal fluid in human immunodeficiency virus infected patients". J.Inf. Dis, 176: 1080 (1996)). 또한 여기에 참조로서 통합된, PCR을 이용하여 중앙 신경 조직의 HSV 및 VZV 둘 다를 검출하였고(Sauerbrei A and Wutzler P. "Laboratory diagnosis of central nervous system infection caused by herpes viruses". J. Clin. Virol, 25 s45-s51, (2002)), PCR은 VZV의 검출을 위한 중요한 표준이 되었다.
사이토메갈로바이러스 ( Cytomegalovirus ) A: COBAS Amplicor CMV Monitor of Roche Molecular diagnostics(Pleasanton, CA, USA)라고 불리는 상업적으로 이용가능한 PCR 테스트는 증폭하여 검출하기 위해 CMV의 DNA 폴리머라아제 유전자의 365 염기쌍 영역을 이용한다. 참조에 의해 여기에 통합되는, 다양한 체액에서 CMV의 존재를 검출하기 위해 immediate early antigen 및 DNA 폴리머라아제의 유전자를 이용하여 많은 분석실험이 기술되었다(Stanier P, et al. "Detection of human cytomegalovirus in peripheral mononuclear cells and urine samples using PCR". MoI. Cell Probes, 6: 51 - 58 (1992) and Gerna G, et al. "Monitoring human cytomegalovirus infection and gancyclovir treatment in heart transplant recipients by determination of viraemia, antigenemia and DNAemia". J. Inf. Dis., 164, 488-498 (1991)). 환자의 CMV 감염은 또한 혈액, 양수(amniotic fluid), 비 흡인물(nasal aspirate), 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage), 소변, 태반물질(placental material) 및 기관지 흡인물(bronchial aspirates)과 같은 다양한 샘플에서 이중 중합연쇄효소반응(nested PCR)에 의해 검출할 수 있다.
모든 3가지 포진성 바이러스, HSV, VZV 및 CMV에 기인한 눈병은 여기서 참고로서 통합된 Priya K 등의 "Association of herpes viruses in aqueous humour of patients with serpigenous choroiditis: a polymerase chain reaction based study". (Ocular Immunology and Inflammation 9: 1-9 (2003))에 개시된 발명자 중 1인에 의해 기술된 것처럼 PCR에 의해 검출된다. 필요한 감도를 얻기 위하여 이 분야에서 VZV를 검출하도록 nested PCR를 실행하였다. 그러나 nested PCR에는 증폭의 첫 번째 라운드의 PCR 생성물이 PCR의 첫 번째 라운드에서 증폭되는 유전자의 작은 영역을 증폭하는 프라이머의 두 번째 세트를 포함하는 두 번째 PCR 튜브로 전달되 어야 하기 때문에 실험실 내의 amplicon이 오염될 수 있는 수행상의 문제를 가진다.
PCR에 의한 결핵균( Mycobacterium tuberculosis )의 검출은 2개의 FDA에 의하여 승인된 테스트의 계획이다. 이들은 The Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct test Gen- Probe San Deigo, USA 및 Amplicor M. tuberculosis test of Roche Diagnostic Systems, Basel, Switzerland이다. 다른 많은 테스트는 기술분야에서 알려져 있다. 그러나 PCR를 사용한 눈 결핵은 Madhavan HN 등에 의한 "Polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in epiretinal membrane in Eales'". (Disease. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41: 822-825 (2000))에서 검출되었다.
핵산 증폭에 의한 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis) 검출은 임상 세트에서 사용되고 Black CM에 의한 "Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infection". (Clin. Microbiol. Rev.10: 160-184 (1997))에서 상세히 기술된다. 클라미디아 결막염은 결막 면봉(conjunctival swab)에 PCR를 사용하여 검출되고 30 유기체만큼 적은 유기체가 Malathi. Jet 등에 의한 "A hospital based study on prevalence of conjunctivitis due to Chlamydia trachomatis". (Ind. J. Med. Res., 117:71-75 (2003))에서 상술된 대로 임상 샘플에서 검출되었다.
아데노바이러스 결막염은 Dalapathy S 등에 의한 "Development and use of nested polymerase chain reaction (PCR) for the detection of Adenoviruses from conjunctivitis specimen." (J. Clin. Virol. 11:77-84 (1998))에서 상술한 것처럼 결막 면봉(conjunctival swab)의 nested PCR에 의해 진단되었다.
톡소플라즈마 곤디이(toxoplasma gondii)는 면역부전(immunodeficiency) 환자의 경우에 심한 뇌염(encephalitis) 및 포도막염(uveitis)을 유발한다. 많은 PCR 테스트 프로토콜은 다양한 체액 및 조직을 연구하게 위해 사용되었고, 모든 PCR 테스트는 B1 유전자의 증폭에 의존한다(Danise A, et al. "Use of polymerase chain reaction assays of aqueous humor in diagnosis of in the differential diagnosis of retinitis in patients infected with human immunodeficiency virus". Clin. Infect. Dis 24: 1100- 1106 (1997), Montoyo. et al. "Use of polymerase chain reaction in diagnosis of ocular toxoplasmosis. Ophthalmology", 106: 1554-1563 (1999)).
Anand AR 등에 의한 "Use of polymerase chain reaction (PCR) and DNA probe hybridization to determine the gram reaction of the interacting bacterium in the intraocular fluids of patients with endophthalmitis". (J. Infection, 41:221-226 (2000))에서 상세히 개시된 것처럼, 눈 수술 후의 감염에서 유래하는 전염성 안구내염(endophthalmitis)은 진정세균(eubacterial) 유전자의 PCR 반응을 이용하여 조사되었고, 그램 + ve 및 그램 - ve로 프로브에 의해 판별되었다. 이 연구는 임상 샘플에서 6마리의 박테리아 정도의 낮은 비율로도 검출할 수 있었다. 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)와 같은 혐기성 유기체에 기인한 눈 감염은 Therese KL 등에 의한 "Polymerase chain reaction in the diagnosis of bacterial endophthalmitis", (Brit. J. Opthal. 82:1078-1082 (1998))에서 상세히 기술한 것처럼 PCR을 이용하여 신속하게 검출되었다. 균성 안구내염(endophthalmitis)은 또한 Anand AR 등에 의한 "Polymerase chain reaction in the diagnosis of Asperigillus endophthalmitis". (Ind. J. Med. Res. 114: 133-140 (2001)) 및 "Use of polymerase chain reaction in fungal endophthalmitis". (Ophthalmology 108: 326-330 (2001))에서 상세히 개시되는 것과 같이 PCR를 사용하여 신속하게 진단될 수 있었다. 양 연구에서 균류의 DNA의 ~0.4 pgs가 검출될 수 있었다.
여기에서 기술된 각종 PCR 분석실험은 프라이머 세트와 각 PCR에서 검출될 유전자가 다르기 때문에 다른 반응의 열(thermal) 프로파일을 채택한다. 게다가, 거기에 기술된 반응물의 세트에 대한 가장 높은 민감도를 위한 PCR를 최적화하기 위하여 상술된 PCR의 각 시약 농도가 조정되었다. 최적 반응 상태는 그것의 사이즈로 증폭되어야 할 뉴클레오티드 사슬의 서열 및 검출될 유기체 또는 병원체의 전체 표적 DNA의 복잡성(complexity)에 따라 변화한다.
그러나 신속하고, 눈 및 중앙 신경 조직의 세균성, 균성, 기생성과 바이러스성 감염을 일으키는 병원체 사이에서 동시에 검출하고 판별할 수 있으며, 또한 오염이 되지 않고 다른 방법보다 향상된 민감도 및 특이성을 가지는, PCR-기반 분석실험에 대한 요청이 남아 있다. 24 내지 48시간 안에 감염 병원체를 확인하는 것이 생명을 구하는데 있어서 중요한 임상 세팅에서 사용하기 편해야 한다. 눈과 두뇌 감염의 정확한 진단에 있어 긴요한 문제점은 다음과 같이 요약될 수 있다:
● 눈과 두뇌의 감염은 매우 국소화된다. 쉽게 얻을 수 있는 혈액, 혈청, 형장, 침과 같은 생물학적 액체 또는 외부 부상 또는 궤양의 고름(pus) 또는 화농(purulent discharge)에서 원인 병원체의 자취를 찾을 수 없다.
● C 반응성 단백질(C-reactive protein)과 같은 심각한 감염의 추정되는 바이오마커(biomarker)가 일반적이고 인체를 괴롭히는 모든 감염에 일반적이다. 따라서 비특이적이다.
● 특정한 원인 병원체를 확인하기 위하여 눈 또는 CSF에서의 샘플이 요구된다. 획득 가능한 샘플은 각막 감염을 위한 각막 스크랩핑(scraping); 결막염을 위한 결막 면봉; 안구내염(endophthalmitis)을 위한 수양액(aqueous humor); 포도막염(uveitis)과 망막염(retinitis)을 위한 유리액이 있다. 두뇌 감염의 경우의 바람직한 샘플은 항상 CSF이다. 이들 샘플 전부에 한번에 환자에게서 얻을 수 있는 샘플 양에 제한이 있다. 일반적으로 당신은 몇천 개의 세포 또는 각막 스크랩핑 또는 면봉에서 2 내지 3밀리그램의 샘플을 얻을 것이다. 환자의 눈에서 얻을 수 있는 수양액(aqueous humor)은 약 100μL이고 반면에 유리체절제술(vitrectomy) 샘플은 200μL까지 가능하다. CSF 샘플의 5ml까지 얻을 수 있으나 PCR를 위해 요구되는 CSF 샘플의 양은 0.5ml 이하일 것이다.
● 샘플의 양의 제한에 따라 샘플에 존재하는 박테리아/바이러스/기생충의 수도 한정된다. 게다가 전염 병원체의 복용량은 혈액과 같은 다른 많은 신체 구획에서 관찰되는 노출량보다 적다.
● 샘플에 존재하는 전염성 입자의 총계는 검출의 성공에 정비례한다. 임계 질량의 미만에서, 전염 병원체 박테리아 및 균류는 배양에 실패하여 진단하기 어렵다. 눈 표본에 존재하는 바이러스 입자의 수는 배양뿐만 아니라 형광성 항체 검출 테스트에서 검출 한계보다 낮고 따라서 25% 미만이 검출 감도를 나타낸다. 톡소플 라즈마 곤디이(toxoplasma gondii)와 같은 기생충을 위한 쉬운 검출 시스템이 없고 기생충의 수는 또한 검출하기에 너무 적다. HSV CMV, VZV, 아데노바이러스, 클라미디아 및 톡소플라스마(toxoplasma)를 위한 IgM 또는 IgG 검출과 같은 테스트는 비특이적이고 진단적 중요성이 없다.
● 진단에 있어 또 다른 주요 어려움은 상술한 눈의 모든 고통이 심각하고 적합한 치료의 시작을 위한 즉각적이고 정확한 진단이 요구된다는 것이다. 첫 증상 발현 후 96시간 안에 치료되어야 하는 바이러스성 감염에 기인한 전염성 안구내염(endophthalmitis) 및 괴사성 망막염(necrotising retinitis)의 경우에는 48 시간 이상 지연되면 시력을 상실한다.
주어진 임상 상황에서 몇 병원체를 위해 멀티플렉스 PCR가 실행되고 증폭되는 생성물은 PCR 생성물의 염기 조성물의 질량 분석 결정에 의해 병원체를 검출 및 확인에서 상술한 대로 질량 분석에 의한 분자량 결정에 의해 확인되었다.
(Ecker, David J.: Griffey Richard 11.: Sampath, Rangarajan; Hofstandler, Steven A.: Meneil, John; Crooke, Sstanley T. (USA). U.S. Pat. Appl. Publ. (2004), 168 pp. Cont.-in-part of U.S. Ser. No. 323,233. Application:US 2003-660122 20030911. Priority.US 2001-798007 20010302; US 2002-431319 20021206; US 2002-323233 20021218; US 2002-326051 20021218; US 2002-325526 20021218; US 2002-325527 20021218; US 2003-443443 20030129; US 2003-443788 20030130; US 2003-447529 20030214).
Read, SJ. 및 Kurtz, JB에 의한 "Laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system by using a single multiplex PCR screening assay". (J. Clin. Microbiol. 37: 1352-1355 (1999))에서 기술된 것처럼, 중앙 신경조직의 감염을 확인하기 위해 멀티플렉스 PCR 분석실험 후에 생성물 확인을 위한 젤 전기영동법이 시도되었다.
병원체를 검출하기 위해 멀티플렉스 PCR 후에 microarray를 실행하는 것이 호흡병을 유발하는 병원체를 검출하기 위해 기술되었다(Wang D et al. "Microarray based detection and genotyping of viral pathogens". Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 15687-15692 (2002)). 비색 마이크로타이터 플레이트 분석 시스템(colorimetric microtitre plate assay system)을 사용한 amplicon의 검출이 시도되었고, 이때 amplicon가 디곡시제닌(digoxigenin) 11-dUTP로 표지되고 바이오티닐화된(biotinylated) 프로브가 마이크로타이터 플레이트에서 amplicon을 붙잡는다. 효소로 표지된 안티디곡시제닌(antidigoxigenin)을 이용하여 생성물이 드러났다(Smalling TW et al. "Molecular approaches to detecting herpes simplex virus and enteroviruses in the central nervous system". J. Clin. Microbiol. 40:2317-2322 (2002)).
동일한 유기체의 3 다른 유전자, 즉 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)의 morphological transforming region Ⅱ, UL 83 및 당단백질 O 유전자의 멀티플 렉스 PCR 분석실험은 Madhavan HN 등에 의한 "Development and application of a novel multiplex polymerase chain reaction for semiquantitation of human cytomegalovirus in clinical specimen", (J Virol Methods. 141:166-72 (2007))에서 상술한 대로 임상 샘플의 바이러스의 양을 정하기 위하여 성공적으로 시도되었다.
모든 19의 고위험도 유전자형의 L1 영역을 증폭하는 멀티플렉스 PCR 분석 후에 여성의 자궁 경관 샘플에서 유두종 바이러스(papilloma virus)의 유전자형을 검출하고 판별하기 위해 라인 프로브 분석실험(line probe assay)을 이용하였다(Bauer HM et al. "Detection of human papilloma viruses by polymerase chain reaction" US Patent No 5639871).
질량 분석과 같은 방법은 진보된 제3 치료 센터에서조차 실행할 수 없으며 비싼 스캐너에 근거를 둔 microarrays 검출은 임상 세팅에서 사용할 수 없다. 라인 프로브 분석실험은 amplicon을 오염시킬 수 있다.
Ⅰ. 정의
"뉴클레오티드(nucleotide)"는 1개의 질소성 염기(nitrogenous base), 1개의 인산 분자 및 1개의 당 분자(DNA에서는 디옥시리보오스(deoxyribose), RNA에서는 리보오스(ribose))로 이루어진 DNA 또는 RNA의 구성원을 의미한다.
"올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 뉴클레오티드의 짧은 서열을 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA의 합치하는 서열을 찾아내기 위한 프로브로 자주 사용되고 방사성 동위원소(radioisotopes), 형광성과 화학발광(chemiluminescent) 모이어티와 같은 다양한 라벨로 표지될 수 있다.
"프라이머(primer)"는 DNA 합성을 준비하기 위해 사용되는, DNA의 특정 표적 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 짧은 가닥을 의미한다.
"유니플렉스(uniplex)"는 단일 병원체 특이 DNA 서열을 증폭하는 각 반응의 프라이머의 단일 세트를 이용하는 PCR-기반 분석실험을 의미한다.
"멀티플렉스(multiplex)"는 단일 반응에 다수의 프라이머 세트를 이용하는 PCR-기반 분석실험을 의미하며, 각 프라이머가 단일 병원체 특이 DNA 서열을 증폭할 수 있다.
용어 "프로브(probe)"는 표적 DNA의 PCR-기반 증폭에서 유래하는 DNA 생성물(amplicon)을 의미한다.
용어 "표적(target)"은 나일론과 같은 비활성 매트릭스에 고정되는, 각 병원체에 특이한, DNA 서열을 의미한다.
"혼성화(hybridization)"는 이중가닥(double-stranded) 분자를 형성하기 위하여 2개의 상보적인 DNA 가닥이 결합하는 과정을 의미한다; 특히 여기서는 '프로브'와 '표적' DNA 서열 사이의 결합과정을 의미한다.
용어 "검출 시스템(detect system)"은 여기에 사용되는 것과 같이 PCR-증폭 DNA 생성물을 시각화를 가능하게 하는 방법을 의미한다. 적당한 검출 시스템의 예로서 색, 방사능, 형광 또는 화학발광의 검출에 의존하는 시스템을 포함한다.
pan fungal은 크리프토코쿠스속(Cryptococcus), 칸디다 속(Candida), 털곰팡이균(Mucormycosis), 아스퍼르길러스(Asperigillus) 및 리조퍼스 속(Rhizopus) 등과 같은 모든 병원성 균류에게서 발견되고 어떤/모든 균류를 확인하기 위해 이용되는 공동유전자 서열을 의미한다.
본 발명은 95℃의 변성 온도, 58 내지 65℃의 어닐링 온도 및 72℃에서의 증폭하는 멀티플렉스 PCR에서 병원체에서 표적 서열을 증폭하도록 디자인된 화학적으로 표를 붙인(tagged) 병원체 특이 정방향 및 역방향 프라이머의 세트를 제공한다. 본 발명은 또한 비활성 서포트에 고정되고 병원체 특이 정방향 및 역방향 PCR 프라이머를 이용하여 얻어진 PCR 증폭 생성물과 특이하게 혼성화하는 병원체 특이 유전에서 유래한 표적 DNA 서열의 세트를 제공한다.
본 발명 눈 및 중앙 신경 조직의 감염을 유발하는 병원체를 동시에 검출하는 신속 분석실험을 제공하며, 면역학적 매개변수는 활성 감염(active infection) 및 병원체에의 노출도 나타내며 세균 및 균 배양과 같은 고전적인 미생물학적 분석실험은 병원체를 검출하기에 충분히 민감하지 않고 48시간 안에 병원체를 확인하기에 빠르지 않다.
본 발명은 PCR 분석실험의 높은 감도와 색 검출 방법에 의한 혼성화 검출로 매크로-어레이(macro-array)에서의 혼성화를 확인하는 높은 특이성을 통합한 것으로, 최종 결과는 육안으로 감시될 수 있다. 양자 도트(quantum dots), Cy3, Cy5, FITC와 같은 형광성 표지가 또한 사용될 수 있고 생성물은 형광 현미경검사법에 의해 시각화될 수 있다.
본 발명은 다음을 포함하는 눈 및 CNS의 감염을 유발하는 병원체를 동시에 검출 및 판별하기 위한 멀티플렉스 분석실험을 특징으로 한다:
i) 표준 방법에 의해 DNA를 분리하기 위해, 각막 스크랩핑(corneal scraping), 결막 면봉(conjunctival swab) 또는 수양액(aqueous humor) 또는 유리액 또는 모인 유리체절제술(vitrectomy) 세척액 또는 뇌척수액 흡인물(cerebro-spinal fluid aspirate) 또는 두뇌 농양 물질에서 모은 고름(pus) 또는 눈 또는 CNS 감염 환자의 망막 전막(epiretinal membrane)과 같은 임상 샘플을 처리하는 것;
ⅱ) CNS와 눈병을 유발하는 것으로 알려진 각 병원체를 위한 표지된 증폭 프라이머를 사용하여 단일 튜브 PCR 기술에 의해 각 병원체에 특이한 유전자의 DNA 특이 부위 증폭하는 것;
ⅲ) DNA 혼성화를 이용하여 병원체를 검출 및 판별, 이때 각 병원체에 특이한 고정된 표적 서열과 PCR 반응에서 생성된 증폭되는 DNA 프로브가 반응하며 특이한 시약 세트를 이용하여 색 발현에 의해 혼성화를 감시한다.
눈병 환자의 임상 샘플에서 병원체 DNA 의 멀티플렉스 PCR 에 적당한 특이한 PCR 프라이머의 디자인.
문헌에서 이용가능한 정보에서 기초로 하여 눈병을 유발하는 다양한 공지된 병원체의 다음의 유전자를 선택하였다.
1. 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2 당단백질 D
2. 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2 UL 44 유전자
3. 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2 DNA 폴리머라아제 유전자
4. 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 당단백질 O 유전자
5. 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 형태학적 변이 유전자(Morphological transformation gene )
6. 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) UL 88 유전자
7. 수두 대상포진(Varicella zoster) ORF 29
8. 수두 대상포진(Varicella zoster) DNA 폴리머라아제 유전자
9. 아데노바이러스 Hexon 유전자
10. 진정세균(eubacterial) 16s 리보솜 RNA 유전자 I
11. 진정세균(eubacterial) 16s 리보솜 RNA 유전자 영역 Ⅱ
12. 그램 +ve 세균성 특이 부분의 16s 리보솜 RNA 유전자
13. 결핵균( Mycobacterium tuberculosis ) MPB 64 유전자,
14. 폐렴균( Mycobacterium fortuitum ) 16s - 23s RNA 유전자
15. 거북결핵균( Mycobacterium chelonaei ) 16s - 23s RNA 유전자
16. 톡소플라즈마 곤디이 ( toxoplasma gondii ) B1 유전자
17. 클라미디아 트라코마티스 ( chlamydia trachomatis ) 다형태성 단백질(polymorphic protein) Ⅱ
18. 균 특이 부분의 28s 리보솜 RNA 유전자
19. 프로피오니박테리움 아크네스( Propionibacterium acnes ) 특이 부분의 16s-23s 리보솜 RNA 유전자
20. gyr B 유전자의 그램 -ve 세균성 특이 부분
21. 그램 -ve 세균성 (아코니트산하이드라타제(aconitate hydratase) 유전자
22. 그램 -ve 리보뉴클레아제 1 유전자(ribonuclease 1 gene)
단순 포진(Herpes simplex) 1 & 2, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 수두 대상포진(Varicella zoster) 및 그램 음성 박테리아와 같은 일부 유기체의 검출의 확실성을 더 향상시키기 위해, 증폭을 목적으로 각 유기체의 하나 이상의 유전자를 선택하였다. 단순 포진(Herpes simplex) 1 & 2, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)의 경우, 각 유기체를 위해 3개의 다른 유전자를 선택하고, 수두 대상포진(Varicella zoster)를 위해 2개의 유전자를 선택하였다.
포진성 바이러스의 DNA 폴리머라아제 유전자는 PCR에 민감도를 주는 하나의 유전자로서 다른 연구에서 사용되었다. 첫 번째 연구에서 95℃에서 45초 동안 변성, 64℃에서 45초 동안 어닐링, 72℃에서 45초 동안 증폭이라는 열 사이클 조건을 이용하여 179bp 생성물을 증폭하였다(Madhavan HN et al, Detection of herpes simplex virus (HSV) using polymerase chain reaction (PCR) in clinical samples Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV, J. Clin. Virol. 14:145-151 (1999)). 반면 다른 연구에서 95℃에서 45초 동안 변성, 64℃에서 45초 동안 어닐링, 72℃에서 45초 동안 증폭하는 열 사이클 조건 및 다른 프라이머 세트를 이용하여 동일한 유전자의 469bp 및 391bp가 증폭되었다(Madhavan HN et al, Phenotypic and Genotypic methods for the detection of herpes simplex virus serotypes. J. Virol. Methods, 108: 97-102. (2003)). 눈 감염을 확인하기 위한 HSV, CMV 및 VZV에 대한 PCR의 경우 다른 열 조건으로 다른 바이러스를 검출하였다(Priya K et al, Association of herpes viruses in aqueous humour of patients with serpigenous choroiditis: a polymerase chain reaction based study, Ocular Immunology and Inflammation 9:1-9 (2003)). 이 연구에서 반응 조건 및 프라이머의 농도는 바이러스마다 다르다. 따라서 주어진 임상 샘플에서 하나 이상의 병원체를 신속하게 검출 및 판별하기 위해 단일 튜브 멀티플렉스 PCR 반응을 수행할 수 있기 위해서 프라이머 및 공지된 병원체의 세트를 위한 특이 표적 서열을 디자인하는 것이 어려운 것은 당업자에게 자명하다.
그러므로 공지된 생정보학적(bioinformatic) 방법을 사용하여 적당한 PCR 프라이머 및 PCR 증폭의 생성물에 상보적인 표적 DNA 서열을 디자인할 가능성을 탐구할 필요가 있는 것으로 여겨졌다.
이 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자는 먼저 HSV, CMV 및 VZV 검출을 위한 멀티플렉스 PCR 반응을 수행하는데 바람직한 다음의 조건, 즉 95℃에서의 변성, 58~65℃에서의 어닐링, 72℃에서의 증폭으로 고정하였다. 고체상 매트릭스에 고정된 각 병원체에 대한 특이 표적 DNA 서열과 얻어진 PCR 증폭 생성물의 혼성화의 최적 온도는 48 내지 55℃로 고정하였다. 특이한 PCR 증폭 생성물이 DNA 서열의 비특이 결합 없이 균일한 온도에서 상보적인 표적 DNA 서열과 혼성화되도록 문제의 각 병원체에 대한 표적 DNA 서열 세트를 디자인할 필요가 있다.
멀티플렉스 PCR 반응을 위한 프라이머를 디자인함에 있어 가장 어려운 요소는 동일한 열 사이클링 조건 하에서 모든 유전자를 증폭할 수 있도록 모든 프라이머가 동일한 녹는 온도를 가지도록 프라이머를 디자인하는 것이다.
모든 프라이머가 58~65℃에서 어닐링 온도를 가지도록 증폭을 위한 프라이머 세트는 상술하는 유전자 서열에서 선택하며 모든 23개의 유전자를 문제의 특이 병원균의 모든 종 또는 혈청형에 균일하게 존재하는 동일 튜브에서 PCR을 이용하여 증폭될 수 있다.
다른 크기의 amplicon의 PCR 방법에 의한 멀티플렉스 증폭의 효율을 방해할지도 모른다. 그러므로 프라이머를 선택하는 두 번째 기준은 66~90 뉴클레오티드 내의 균일한 크기의 amplicon로 고정하는 것이다. 상술한 모든 유전자는 (프라이머 서열을 포함하여) 66~90bp 길이를 포함하는 영역에서 선택된다.
녹는 온도를 균일하게 유지시키기 위해, 프라이머 길이를 17 내지 29bp 사이에서 변화시켰다.
또한, 멀티플렉스 반응에서, 상보적인 영역의 존재에 기인한 프라이머의 루프(loop) 형성 및 교차 혼성화(cross hybridization)는 PCR 증폭 자체를 방해할 수 있다. 그런 모든 문제를 피하기 위하여, 모든 프라이머는 자신들의 사이에서 프라이머의 루프 형성 또는 교차 혼성화를 없애도록 주의 깊게 디자인되었다. 프라이머 세트에 의한 비특이적 (교차-) 증폭을 피하기 위해 주의해야 하며, 즉 한 유기체/유전자의 프라이머는 다른 유기체의 유전자/반응 혼합물의 유전자와 반응하지 않아야 한다.
모든 프라이머가 병원체 유전자의 모든 뉴클레오티드 염기와 매치하도록 디자인되어야 한다. 그러나 그램 양성, 그램 음성 박테리아 및 균류를 증폭하기 위하여 디자인된 프라이머의 경우 일부 계통 또는 종에서 미스매치가 있다면, 미스매치는 프라이머의 가운데에 최대 2개의 뉴클레오티드로 제한된다. 그것은 각 프라이머의 3' 말단은 진단될 종의 모든 계통과 항상 완벽하게 매치되는 것을 보장한다.
또한, 기술된 기준은 참조로서 여기에 개시된 기술된 프라이머 서열을 선택하기 위한 기술분야에서 기술된 표준 기준이다(Molecular cloning: A laboratory manual, VoI 2, Sambrook. J, Russell DW (Eds) Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (2001)). 이 기준은 3' 말단이 G 또는 C이고 세로로 연결되는(tandem) GC 반복을 피하며 일반적으로 프라이머가 T 등등으로 종결하지 않는다.
디자인 후에, 프라이머는 개별적으로 사용되고 목록화된 모든 병원체의 표준 DNA 서열 (유전자)를 이용하여 민감도와 특이성을 확인하기 위해 멀티플렉스 포맷으로 사용되었다. 일부 유기체 또는 바이러스 입자를 인식하는 민감도가 종래 기술 (Madhavan HN, et al, Detection of herpes simplex virus (HSV) using polymerase chain reaction (PCR) in clinical samples Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV, J. Clin. Virol. 14:145-151 (1999); Malathi. Jet al. A hospital based study on prevalence of conjunctivitis due to Chlamydia trachomatis Ind. J. Medical research, 117:71-75 (2003); Anand ARet al Use of polymerase chain reaction (PCR) and DNA probe hybridization to determine the gram reaction of the interacting bacterium in the intraocular fluids of patients with endophthalmitis. Journal of Infection, 41:221-226 (2000); Anand AR et al. Use of polymerase Chain reaction in fungal endophthalmitis Ophthalmology 108: 326-330 (2001))에서 보고된 것처럼 부족한 경우, 동일한 기준을 사용하여, 다른 프라이머의 세트를 선택한다. 비록 일부 프라이머는 58℃에서 어닐링되어도, 모든 프라이머가 60℃에서 양호하게 증폭되는 것이 실험적으로 증명되었다. 주의 깊게 평가한 후에 본 구체화에서, 병원체를 검출 및 판별하기 위해 다음의 독특한 프라이머를 선택하고 사용하였다. 이 서열은 유일하며 기술분야에 공지되어 있지 않다.
1. 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2 당단백질 D 유전자는 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트 1에 의해 증폭했다.
FP: 5' cgcttggtttcggatgggag 3' (서열번호 l) 및
RP: 5' gcccccagagacttgttgtagg 3' (서열번호 2)
2. 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2 UL 44 유전자는 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트 2에 의하여 증폭했다.
FP: 5' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3' (서열번호 3) 및
RP: 5' cgggggggtcttgcgttac 3' (서열번호 4)
3. 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2 DNA 폴리머라아제 유전자는 서열번호 5와 6으로 이루어진 프라이머 세트 3으로 증폭했다.
FP: 5' caagctgacggacatttacaagg 3' (서열번호 5) 및
RP: 5' gtcccacacgcgaaacacg 3' (서열번호 6)
4. 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 당단백질 O 유전자는 서열번호 7과 8로 이루어진 프라이머 세트 4로 증폭했다.
FP: 5' ttccggctcatggcgttaacc 3' (서열번호 7) 및
RP: 5' cgccctgcttttacgttacgc 3' (서열번호 8)
5. 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 형태학적 변이 유전자는 서열번호 9와 10으로 이루어진 프라이머 세트 5로 증폭했다.
FP: 5' cggcgacgacgacgataaag 3' (서열번호 9) 및
RP: 5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3' (서열번호 10)
6. 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) UL 88 유전자는 서열번호 11과 12로 이루어진 프라이머 세트 6으로 증폭했다.
FP: 5' gggcacgtcctcgcagaag 3' (서열번호 11) 및
RP: 5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3' (서열번호 12)
7. 수두 대상포진(Varicella zoster) ORF 29는 서열번호 13과 14로 이루어진 프라이머 세트 7로 증폭했다.
FP: 5' ggtcttgccggagctggtattac 3' (서열번호 13) 및
RP: 5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3' (서열번호 l4)
8. 수두 대상포진(Varicella zoster) DNA 폴리머라아제 유전자는 서열번호 15와 16으로 이루어진 프라이머 세트 8로 증폭했다.
FP: 5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3' (서열번호 15) 및
RP: 5' acgttccggtagcgagttatctg 3' (서열번호 16)
9. 아데노바이러스 헥손(Hexon) 유전자는 서열번호 17과 18로 이루어진 프라이머 세트 9로 증폭했다.
FP: 5' cgccgccaacatgctctacc 3' (서열번호 17) 및
RP: 5' gttgcgggaggggatggata 3' (서열번호 18)
10. 진정세균(eubacterial) 16s 리보솜 RNA 유전자 영역 I은 서열번호 19와 20으로 이루어진 프라이머 세트 10으로 증폭했다.
FP: 5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3' (서열번호 19) 및
RP: 5' cggactacgatcggttttgtgaga 3' (서열번호 20).
11. 진정세균(eubacterial) 16s 리보솜 RNA 유전자 영역 Ⅱ은 서열번호 21 과 22로 이루어진 프라이머 세트 11로 증폭했다.
FP: 5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3 (서열번호 21) 및
RP: 5' ggcagattcctaggcattactcacc 3 (서열번호 22)
12. 그램 +ve 세균성 특이 부분의 16s 리보솜 RNA 유전자는 서열번호 23과 24로 이루어진 프라이머 세트 12로 증폭했다.
FP: 5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3' (서열번호 23) 및
RP: 5' tgcagccctttgtaccgtccat 3' (서열번호 24)
13. 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) MPB 64 유전자는 서열번호 25와 26으로 이루어진 프라이머 세트 13으로 증폭했다.
FP: 5' gcggaacgtgggaccaatac 3' (서열번호 25) 및
RP: 5' cgacggggtgattttcttcttc 3' (서열번호 26)
14. 폐렴균(Mycobacterium fortuitum) 16s- 23s RNA 유전자는 서열번호 27과 28로 이루어진 프라이머 세트 14로 증폭했다.
FP: 5' aacrtttttgactgccagacacactattg 3' (서열번호 27) 및
RP: 5' ggatgccaccccccaaaag 3' (서열번호 28)
15. 거북결핵균(Mycobacterium chelonae) 16s - 23s RNA 유전자는 서열번호 29와 30으로 이루어진 프라이머 세트 15로 증폭했다.
FP: 5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3' (서열번호 29) 및
RP: 5' gacgtrttgccgactacctatcc 3 (서열번호 30)
16. 톡소플라즈마 곤디이(toxoplasma gondii) B 1 유전자는 서열번호 31과 32로 이루어진 프라이머 세트 17로 증폭했다.
FP: 5' cccctctgctggcgaaaagtg 3' (서열번호 31) 및
RP: 5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3' (서열번호 32)
17. 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis) 다형태성 단백질 Ⅱ는 서열번호 33과 34로 이루어진 프라이머 세트 18로 증폭했다.
FP: 5' aatcgtatctcgggttaatgttgc 3' (서열번호 33) 및
RP: 5' tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3' (서열번호 34)
18. 균성 특이 부분의 28s 리보솜 RNA 유전자는 서열번호 35와 36으로 이루어진 프라이머 세트 19로 증폭했다.
FP: 5' gctgggactgaggactgcgac 3' (서열번호 35) 및
RP: 5' ttcaagacgggcggcatataac 3 (서열번호 36)
19. 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 특이 부분의 16s-23s 리보솜 RNA 유전자는 서열번호 37과 38로 이루어진 프라이머 세트 20으로 증폭했다.
FP: 5' tggcgaacgggtgagtaaca 3' (서열번호 37) 및
RP: 5' ccggtattagccccagtttcc 3' (서열번호 38)
20. 그램 -ve 세균성 특이 부분의 gyr B 유전자는 서열번호 39와 40으로 이루어진 프라이머 세트 21로 증폭했다.
FP: 5' cggcggcaagttcgacgac 3' (서열번호 39) 및
RP: 5' ccaccgagacgcccacacc 3' (서열번호 40)
21. 그램 - ve 세균성 아코니트산하이드라타제(aconitate hydratase) 유전자는 서열번호 41과 42로 이루어진 프라이머 세트 22로 증폭했다.
FP: 5' ccaggtcggcggagaagc 3' (서열번호 41) 및
RP: 5' ccaccggcccgatgacc 3' (서열번호 42)
22. 그램 - ve 리보뉴클레아제 1 유전자는 서열번호 43과 44로 이루어진 프라이머 세트 23으로 증폭했다.
FP: 5' gccgccctgaccaccttc 3' (서열번호 43) 및
RP: 5 gcgggttgttcggcatcag 3' (서열번호 44)
본 발명의 다른 구체화에서 서열번호 45~67의 프로브 서열은 상술된 병원체에 유일한 특이 유전자 세그먼트의 확인을 위한 프라이머를 디자인하기 위하여 이용된 컴퓨터 프로그램에 의해 얻어졌다. 프로브 서열은 66-90 뉴클레오티드의 길이로 다양하다. 프로브는 자신 내에서 헤어핀 루프를 형성하지 않는다. 그들은 어떤 다른 amplicons와 상동성을 공유하지 않는다. 프로브는 병원체 DNA의 어느 가닥에서든지 증폭될 수 있다.
프로브 서열은 아래와 같다:
1. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' cgcttggtttcggatgggag 3' (서열번호 1) 및 RP: 5' gcccccagagacttgttgtagg 3' (서열번호 2)으로 이루어진 프라이머 세트 1로 증폭되는) 단순 포진 바이러스(Herpes simplex virus) 1 & 2 당단백질 D 유전자의 "cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctggg ggc" (서열번호 45)
2. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3' (서열번호 3) & RP: 5' cgggggggtcttgcgttac 3' (서열번호 4)으로 이루어진 프라이머 세트 2로 증폭되는) 단순포진 바이러스 1 & 2 UL 44 유전자의 "ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacgcaagacccccccg" (서열번호 46)
3. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' caagctgacggacatttacaagg 3' (서열번호 5) 및 RP: 5' gtcccacacgcgaaacacg 3' (서열번호 6)으로 이루어진 프라이머 세트 3으로 증폭되는) 단순포진 바이러스 1 & 2 DNA 폴리머라아제 유전자의"caagctgacggacatttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccggggcgtgtttcgcgtgtgggac" (서열번호 47)
4. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' ttccggctcatggcgttaacc 3' (서열번호 7) 및 RP: 5' cgccctgcttttacgttacgc 3' (서열번호 8)로 이루어진 프라이머 세트 4로 증폭되는) 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 당단백질 O 유전자의 "ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacgtaaaagcagggcg" (서열번호 48)
5. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' cggcgacgacgacgataaag 3' (서열번호 9) 및 RP: 5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3' (서열번호 10)으로 이루어진 프라이머 세트 5로 증폭되는) 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 형태학적 변이 영역(Morphological transforming region) Ⅱ 유전자의 "cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcgtccagaggattacgcgaccagattg" (서열번호 49)
6. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' gggcacgtcctcgcagaag 3' (서열번호 11) & RP: 5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3' (서열번호 12)로 이루어진 프라이머 세트 6으로 증폭되는) 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) UL 88의 "gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccttgacgtactggtcacctatcacctgcatcttgg" (서열번호 50)
7. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' ggtcttgccggagctggtattac 3' (서열번호 13) 및 RP: 5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3' (서열번호 14)로 이루어진 프라이머 세트 7로 증폭되는) 수두 대상포진(Varicella zoster) ORF 29의 "ggtcttgccggagctggtattaccttaaaactcactaccagtcatttctatccatctgtctttgtctttcacggaggca" (서열번호 51)
8. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3' (서열번호 15) 및 RP: 5' acgttccggtagcgagttatctg 3' (서열번호 16)으로 이루어진 프라이머 세트 8로 증폭되는) 수두 대상포진(Varicella zoster) DNA 폴리머라아제 유전자의 "tccatttaacgttgcatcattttgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaatacagataactcgctaccggaacgt" (서열번호 52)
9. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' cgccgccaacatgctctacc 3' (서열번호 17) 및 RP: 5' gttgcgggaggggatggata 3' (서열번호 18)로 이루어진 프라이머 세트 9로 증폭되는) 아데노바이러스 헥손 유전자(Adenoviruses Hexon Gene)의 "cgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaac" (서열번호 53)
10. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3' (서열번호 19) 및 RP: 5' cggactacgatcggttttgtgaga 3'(서열번호 20)으로 이루어진 프라이머 세트 10으로 증폭되는) 진정세균(eubacterial) 16s 리보솜 RNA 유전자 영역 I의"tgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgta gtccg" (서열번호 54)
11. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3' (서열번호 21) 및 RP: 5' ggcagattcctaggcattactcacc 3' (서열번호 22)로 이루어진 프라이머 세트 11로 증폭되는) 진정세균(eubacterial) 16s 리보솜 RNA 유전자 영역 Ⅱ의 "ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaat ctgcc" (서열번호 55)
12. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3' (서열번호 23) 및 RP: 5' tgcagccctttgtaccgtccat 3' (서열번호 24)로 이루어진 프라이머 세트 12로 증폭되는) 그램 + ve 세균성 특이 부분의 16s 리보솜 RNA 유전자의 "acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagggctgca" (서열번호 56)
13. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' gcggaacgtgggaccaatac 3' (서열번호 25) 및 RP: 5' cgacggggtgattttcttcttc 3' (서열번호 26)으로 이루어진 프라이머 세트 13으로 증폭되는) 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) MPB 64 유전자의 "gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggttgaagaagaaaatcacccc gtcg" (서열번호 57)
14. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' aacttttttgactgccagacacactattg 3' (서열번호 27) 및 RP: 5' ggatgccaccccccaaaag 3' (서열번호 28)으로 이루어진 프라이머 세트 14로 증폭되는) 폐렴균(Mycobacterium fortuitum) 16s - 23s RNA 유전자의 "aacttttttgactgccagacacactattgggctttgagacaacaggcccgtgccccttttggggggtggcatcc" (서열번호 58)
15. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3' (서열번호 29) 및 RP: 5' gacgttttgccgactacctatcc 3' (서열번호 30)으로 이루어진 프라이머 세트 15로 증폭되는) 거북결핵균(Mycobacterium chelonae) 16s-23s RNA 유전자의 "tggttactcgcttggtgaatatgttttataaatcctgtccaccccgtggataggtagtcggcaaaacgtc" (서열번호 59)
16. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' cccctctgctggcgaaaagtg 3' (서열번호 31) 및 RP: 5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3' (서열번호 32)으로 이루어진 프라이머 세트 16으로 증폭되는) 톡소플라즈마 곤디이(toxoplasma gondii) B 1 유전자의 "cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattcgcagattggtcgcc" (서열번호 60)
17. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' aatcgtatctcgggttaatgttgc 3'(서열번호 33) 및 RP: 5' tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3' (서열번호 34)으로 이루어진 프라이머 세트 17로 증폭되는) 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis) 다형태성 단백질 Ⅱ의 "aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgctttatcaaatgacaagcttagatccgtttctcatacggttttcctcga" (서열번호 61)
18. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' gctgggactgaggactgcgac 3' (서열번호 35) 및 RP: 5' ttcaagacgggcggcatataac 3' (서열번호 36)으로 이루어진 프라이머 세트 18로 증폭되는) 균류 특이 부분의 28s 리보솜 RNA 유전자의"gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaa" (서열번호 62)
19. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' tggcgaacgggtgagtaaca 3' (서열번호 37) 및 RP: 5' ccggtattagccccagtttcc 3' (서열번호 38)으로 이루어진 프라이머 세트 19로 증폭되는) 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 특이 부분의 16s-23s 리보솜 RNA 유전자의 "tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataacttcaggaaactggggctaataccgg" (서열번호 63)
20. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' cggcggcaagttcgacgac 3' (서열번호 39) & RP: 5' ccaccgagacgcccacacc 3' (서열번호 40)으로 이루어진 프라이머 세트 20으로 증폭되는) 그램 -ve 세균성 특이 부분의 gyr B 유전자의 "cggcggcaagttcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgggcgtctcggtgg" (서열번호 64)
21. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' ccaggtcggcggagaagc 3' (서열번호 41) 및 RP: 5' ccaccggcccgatgacc 3' (서열번호 42)으로 이루어진 프라이머 세트 21로 증폭되는) 그램 -ve 세균성 아코니트산하이드라타제(aconitate hydratase) 유전자의"ccaggtcggcggagaagccgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcgggtcatcgggccggtgg" (서열번호 65)
22. 프로브 DNA 서열
(FP: 5' gccgccctgaccaccttc 3' (서열번호 43) 및 RP: 5' gcgggttgttcggcatcag 3' (서열번호 44)로 이루어진 프라이머 세트 22로 증폭되는) 그램 -ve 리보뉴클라아제 I 유전자의 "gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgttacctggtgctgatgccgaacaacccgc" (서열번호 66)
그것은 반복되는 것으로 보인다.
본 발명의 다른 구체화에서 서열번호 67-88의 표적 서열을 컴퓨터 프로그램을 이용하여 프로브 서열에서 생성하였다. 이 표적은 나일론과 같은 비활성 매트릭스에 고정하는데 또한 UV-방사선 또는 화학적 고정(fixation)을 사용하여 교차 결합한다. 표적은 다음의 기준에 따라 선택되었다:
1. 모든 표적 서열은 병원체에 특이하며 다른 병원체의 어떤 다른 서열과도 오버랩되지 않는다.
2. 모든 표적 서열의 크기는 23 내지 38bp이다.
3. 모든 표적은 58.9℃- 88℃ 범위의 균일한 녹는 온도를 가진다.
4. 표적 서열은 amplicon 영역에 있으며 정방향 또는 역방향 프라이머 서열을 포함하지 않아서 (서열번호 67-91의) 표지된 프로브가 이들 표적에 비특이적으로 결합하지 않는다.
5. 모든 표적은 모든 뉴클레오티드와 매치하는 방식으로 모든 표적이 디자인된다. 그러나 일부 프로브에 미스매치가 있는 경우에 혼성화를 보장하기 위해 미스매치는 프로브의 가운데에 최대 2개의 뉴클레오티드로 제한된다.
표적 서열은 아래에서 상세히 기술된다:
1. 프라이머 세트 1로 증폭되는 HSV 당단백질 D를 위한 표적
5' gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3' (서열번호 67)
2. 프라이머 세트 2로 증폭되는 HSV UL 44를 위한 표적
5' cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3' (서열번호 68)
3. 프라이머 세트 3으로 증폭되는 HSV 폴리머라아제 유전자를 위한 표적
5' tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3' (서열번호 69)
4. 프라이머 세트 4로 증폭되는 CMV의 당단백질 O를 위한 표적
5' aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3' (서열번호 70)
5. 프라이머 세트 5로 증폭되는 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)의 형태학상 변이 유전자 Ⅱ를 위한 표적
5' aatacaaagccgcagtgtcgtc 3' (서열번호 71)
6. 프라이머 세트 6으로 증폭되는 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)의 UL 88 유전자를 위한 표적
5' gactccaggtacaccttgacgtactg 3' (서열번호 72)
7. 프라이머 세트 7로 증폭되는 수두 대상포진(Varicella zoster) 바이러스의 ORF 29 유전자를 위한 표적
5' cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3' (서열번호 73)
8. 프라이머 세트 8로 증폭되는 수두 대상포진(Varicella zoster) 바이러스의 DNA 폴리머라아제 유전자를 위한 표적
5' ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3' (서열번호 74)
9. 프라이머 세트 9로 증폭되는 아데노바이러스의 헥손 유전자를 위한 표적
5' ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3' (서열번호 75)
10. 프라이머 세트 10으로 증폭되는 진정세균(eubacterial) 16s 리보솜 유전자 영역 I를 위한 표적
5' tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3' (서열번호 76)
11. 프라이머 세트 11로 증폭되는 진정세균(eubacterial) 16s 리보솜 유전자 영역 Ⅱ를 위한 표적
5' ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3' (서열번호 77)
12. 프라이머 세트 12로 증폭되는 그램 양성 유기체의 16s 리보솜 유전자를 위한 표적
5' gacctgggctacacacgtgctaca 3' (서열번호 78)
13. 프라이머 세트 13으로 증폭되는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 MPB 64 유전자를 위한 표적
5' ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3' (서열번호 79)
14. 프라이머 세트 14로 증폭되는 폐렴균(Mycobacterium fortuitum)의 16s-23s RNA 유전자를 위한 표적
5' ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3' (서열번호 80)
15. 프라미어 세트 15로 증폭되는 거북결핵균(Mycobacterium chelonae)의 16s-23s RNA 유전자를 위한 표적
5' tttataaatcctgtccaccccgt 3' (서열번호 81)
16. 프라이머 세트 16으로 증폭되는 톡소플라즈마 곤디이(toxoplasma gondii)의 Bl 유전자를 위한 표적
5' aaattcatgagtatctgtgcaactttg 3' (서열번호 82)
17. 프라이머 세트 17로 증폭되는 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis)의 다형태성 단백질 Ⅱ를 위한 표적
5' atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc 3' (서열번호 83)
18. 프라이머 세트 18로 증폭되는 모든 균류의 28s 리보솜 RNA 유전자를 위한 표적
5' gtaagtcaaggatgctggcataatg 3' (서열번호 84)
19. 프라이머 세트 19로 증폭되는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 의 16s 리보솜 RNA 유전자를 위한 표적
5' gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3' (서열번호 85)
20. 프라이머 세트 20으로 증폭되는 그램 -ve 유기체의 자이레이스(gyrase) 유전자를 위한 표적
5' aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3' (서열번호 86)
21. 프라이머 세트 21로 증폭되는 그램 -ve 유기체의 아코니트산하이드라타제(aconitate hydratase) 유전자를 위한 표적
5' cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3'(서열번호 87)
22. 프라이머 세트 22로 증폭되는 그램 -ve 유기체의 리보뉴클레아제 유전자를 위한 표적
5' atcagcctggccggccgttacctggtg 3'(서열번호 88)
상기에서 보고되고 비활성 매트릭스에 고정하기 위해 사용되는 이들 올리고뉴클레오티드는 임상 샘플뿐만 아니라 표준 DNA에서 생성된 생성물을 이용하여 (서열 분석에 의하여) 확인되었다. 이 서열은 유일하며 멀티플렉스 또는 유니플렉스 PCR에서 공지되거나 기재되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체화에서 멀티플렉스 PCR 분석실험은 상술한 모든 또는 일부 프라이머 세트를 이용하며, 모든 프라이머는 94℃, 5분의 변성 단계, 60~64℃, 45초, 72℃에서 45초, 94℃ 45초의 40 사이클 및 72℃, 10분의 증폭을 포함하는 균일 열 사이클링 조건을 이용하여 단일 튜브에서 함께 사용될 수 있다.
다른 구체화에서, 바이오틴(biotin) 모이어티를 이용하여 5' 말단에 표지된 프라이머의 세트는 착색된 생성물의 검출을 가능하게 한다.
또 다른 구체화에서, 상기 프라이머는 형광 스캐닝 장치(fluorescent scanning device) 또는 현미경으로 검출할 수 있는 Fluorescene isothiocyanate FITC 등과 같은 유기 형광성 표지 또는 양자 도트(Quantum Dots)™ 또는 Cy3 또는 Cy5 등과 같은 무기 형광성 나노 입자와 같은 형광 표지에 의해 표지하였다.
다른 구체화에서 본 발명은 상기 프라이머의 풀 및 프로브의 사용을 제공하며 분석실험은 병원체의 검출을 위한 리얼 타임 PCR이다.
다른 구체화에서 본 발명은 상기 프라이머의 풀 및 프로브의 사용을 제공하며, 분석실험은 질병의 예후(prognosis) 또는 치료를 감시하기 위해 임상 샘플에서 병원체를 정량화하는 리얼 타임 PCR이다.
또 다른 구체화는 본 발명은 상기 프라이머 풀의 사용을 제공하며, 증폭된 생성물을 매크로 어레이(macroarray) 또는 슬롯 블랏(slot blot) 또는 라인 프로브 어레이의 형태로 검출할 수 있다.
다른 구체화에서는 본 발명은 니트로셀룰로오스, 나일론, 하전된(charged) 나일론, 유리, 또는 폴리스티렌을 포함하는 고체상에 고정된 상기 프로브를 포함하는 매크로어레이(macroarray)를 제공한다.
다른 구체화에서 본 발명은 전염성 안구내염(endophthalmitis) 또는 각막염 또는 포도막염(uveitis) 또는 망막염(retinitis) 또는 뇌수막염(meningitis)과 같은 증후를 유발하는 병원체의 검출 및 판별하는 방법을 제공하며, 검출될 병원체는 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 수두 대상포진(Varicella zoster) 바이러스, 아데노바이러스, 진정세균(Eubacteria), 그램 양성 유기체, 그램 음성 박테리아, 균류, 결핵균( Mycobacterium tuberculosis ), 거북결핵균( Mycobacterium chelonei ), 폐렴균( Mycobacterium fortuitum ), 톡소플라즈마 곤디이 ( toxoplasma gondii ), 클라미디아 트라코마티스( chlamydia trachomatis)이다.
또 다른 구체화에서 본 발명은 유사한 징후(manifestations)를 가지는 눈 또는 신경계 질병을 유발하는 가능한 병원체의 그룹 중에서 각 병원체를 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체화에서는 본 발명은 상술한 프라이머의 일부 또는 전부를 선택하여 이용한 멀티플렉스 PCR 분석실험을 제공하며, 상기 유기체의 일부 또는 전부에 의해 유발된 모든 임상 징후는 임상 표본에 존재하는 어느 하나의 각 병원체 또는 병원체 그룹을 검출하기 위해 조사된다.
다른 구체화에서 본 발명은 다음을 포함하는 외부 눈 감염, 안구내염(endophthalmitis) 또는 포도막염(uveitis) 또는 망막염(retinitis) 또는 뇌염(meningoencephalitis)을 유발하는 모든 병원체를 동시에 검출하는 방법을 제공한다:
[a] 상기 질병을 가진 환자에게서 임상 샘플을 얻는 것;
[b] [a] 단계에서 얻어진 전체 샘플 도는 일부에서 DNA를 추출하는 것;
[c] 바이오틴(biotin) 또는 형광 트레이서로 표지된 청구항 제1항의 프라이머 풀 및 PCR의 표준 시약을 이용하여 [b] 단계에서 얻은 DNA로 멀티플렉스 PCR을 수행하는 것;
[d] [c] 단계에서 얻어진 PCR 생성물을 변성하는 것;
[e] [d] 단계에서 얻어진 PCR 생성물을 고체 매트릭스에 고정된 표적과 혼성화시키는 것;
[f] [e] 단계에서 얻어진 고체 매트릭스의 DNA 하이브리드를 효소 또는 형광 방법으로 검출하는 것.
다른 구체화에서 본 발명은 다음을 포함하는 외부 눈 감염, 안구내염(endophthalmitis) 또는 포도막염(uveitis) 또는 망막염(retinitis) 또는 뇌염(meningoencephalitis)을 유발하는 모든 병원체를 동시에 검출하는 키트를 제공한다:
a) 상술한 정방향 및 역방향 프라이머의 풀;
b) 적당한 고상 지지체에 고정된 상술한 DNA 표적의 매트릭스;
c) PCR로 DNA를 증폭시키는데 필요한 표준 시약;
d) PCR 증폭 생성물을 DNA 프로브의 고정된 매트릭스에 혼성화시키는데 필요한 표준 시약;
e) 특이 원인 병원체를 검출 및 판별을 위한 최종 혼성화된 생성물을 검출하는데 필요한 표준 시약.
다른 구체화에서 본 발명은 다음을 포함하는 외부 눈 감염, 안구내염(endophthalmitis) 또는 포도막염(uveitis) 또는 망막염(retinitis) 또는 뇌염(meningoencephalitis)을 유발하는 모든 병원체를 동시에 검출하는 방법을 제공한다:
[a] 상기 질병의 환자에게서 임상 샘플을 얻는 것;
[b] [a] 단계에서 얻은 총 샘플 또는 일부에서 DNA를 추출하는 것;
[c] 바이오틴 또는 형광성 트레이서로 표지된, 상술한 프라이머 풀 및 PCR 표준 시약을 이용하여 [b] 단계에서 얻은 DNA의 멀티플렉스 PCR를 수행하는 것;
[d] 단계 [c]에서 얻은 PCR 생성물을 변성하는 것;
[e] [d] 단계에서 얻은 PCR 생성물을 고체 매트릭스에 고정된 상술한 표적과 혼성화시키는 것;
[f] [e] 단계에서 얻어진 고체 매트릭스의 DNA 하이브리드를 효소 또는 형광 방법으로 검출하는 것.
도 1은 아데노바이러스의 헥손(Hexon) 유전자 및 C. trachomatis 게놈을 위한 유니플렉스 및 멀티플렉스의 증폭된 유전자를 나타내는 6% Agarose 젤 전기영동 결과(electrophoretogram)이다.
도 2는 당단백질 D, DNA 폴리머라아제, 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 (HSV)의 UL-44 영역의 증폭된 생성물을 나타내는 4% Agarose 젤 전기영동 결과(electrophoretogram)이다.
도 3은 외부 눈 감염을 위한 멀티플렉스 PCR의 증폭된 생성물을 나타내는 6% Agarose 젤 전기영동 결과(electrophoretogram)이다.
도 4는 HSV, C. trachomatis, 아데노바이러스의 게놈을 특이하게 식별하는 외부 눈 감염의 식별을 위한 멀티플렉스 PCR에서 amplicon으로 혼성화시킨 나일론 막에 반점이 생긴 매크로-어레이의 사진이다.
도 5는 포도막염(uveitis) 및 T. gondii, M. tuberculosis, M. fortuitum 및 M. chelonae의 게놈을 특이하게 확인하는 다른 의심되는 진균 감염을 검출하기 위한 멀티플렉스 PCR의 amplicon과 혼성화된 나일론 막에 반점이 생긴 매크로-어레이의 사진이다.
도 6은 HSV, CMV 및 VZV의 게놈을 특이하게 확인하는 바이러스성 망막염(retinitis)의 확인을 위한 멀티플렉스 PCR의 amplicons과 혼성화된 나일론 막에 반점이 생긴 매크로-어레이의 사진이다.
도 7은 진정세균(eubacteria), 그램 +ve, 그램 - ve, P. acnes 및 균류의 게놈을 특히 확인하는 전염성 안구내염(endophthalmitis)의 확인을 위한 멀티플렉스 PCR의 amplicons로 혼성화시킨 나일론 막에 반점을 생성한 매크로-어레이의 사진이다.
다음의 실시예는 본 발명의 설명을 위한 것이고 그러므로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되면 안 된다.
실시예 1:
각각 아데노바이러스의 헥손(hexon) 유전자 및 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis)의 다형태성 단백질 Ⅱ 유전자를 증폭할 수 있는, 프라이머 세트 9 및 18로 멀티플렉스 PCR를 실행하였다. PCR 믹스는 각 10 내지 20pmoles의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 각 200μM의 d-ATP, d-UTP, d-CTP 및 d-GTP, 10 mM Tris HCl pH 9.0에의 2 유닛의 Taq polymeare, 1.5mM MgCl2, 5mM KCl, 0.01% 젤라틴, 1mM EDTA 및 amplicon 오염을 방지하기 위한 1 유닛의 UDP glycosylase를 포함한다. 사이클링 조건은 amplicon 오염물을 완전히 분해하기 위해 30분간 37℃에서 배양(incubation), 50℃에서 2분, 94℃에서 5분간 변성 단계, 60℃에서 45초; 72℃에서 45초; 94℃에서 45초의 40 사이클, 72℃에서 10분간 증폭 반응이다. 생성물을 6% agarose 젤에 의해 분석하였다. 도 1에 도시한 것처럼, 두 유전자 모두 증폭되었다. 아데노바이러스의 1 pg의 표준 DNA 및 클라미디아 DNA의 10 fg를 증폭을 위해 이용하였다.
실시예 2:
각각 당단백질 D, UL 44 및 DNA 폴리머라아제 유전자를 증폭할 수 있는, 프라이머 세트 1, 2 및 3으로 멀티플렉스 PCR를 실행하였다. PCR 믹스는 각 10pmoles의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 각 200μM의 d-ATP, d-UTP, d-CTP 및 d-GTP, 10 mM Tris HCl pH 7.5에의 2 유닛의 Taq polymeare, 1.5mM MgCl2, 5mM KCl, 0.01% 젤라틴, 1mM EDTA 및 amplicon 오염을 방지하기 위한 1 유닛의 UDP glycosylase를 포함한다. 사이클링 조건은 amplicon 오염물을 완전히 분해하기 위해 30분간 37℃에서 배양(incubation), 50℃에서 2분, 94℃에서 5분간 변성 단계, 60℃에서 45초; 72℃에서 45초; 94℃에서 45초의 40 사이클, 72℃에서 10분간 증폭 반응이다. 생성물을 6% agarose 젤에 의해 분석하였다. 도 2에 도시한 것처럼, 세 유전자 모두 증폭되었다.
실시예 3:
각 당단백질 D, UL 44 유전자, HSV의 DNA 폴리머라아제 유전자, 아데노바이러스의 헥손(hexon) 유전자 및 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis)의 다형태성 단백질 Ⅱ 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 1, 2, 3, 9 및 17로 멀티플렉스 PCR를 실행하였다. PCR 믹스는 각 10pmoles의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 각 200μM의 d-ATP, d-UTP, d-CTP 및 d-GTP, 10 mM Tris-HCl pH 9.0에의 2 유닛의 Taq polymeare, 1.5mM MgCl2, 5mM KCl, 0.01% 젤라틴, 1mM EDTA 및 amplicon 오염을 방지하기 위한 1 유닛의 UDP glycosylase를 포함한다. 사이클링 조건은 amplicon 오염물을 완전히 분해하기 위해 30분간 37℃에서 배양(incubation), 50℃에서 2분 및 94℃에서 5분간 변성 단계, 60℃에서 45초; 72℃에서 45초; 94℃에서 45초의 40 사이클, 72℃에서 10분간 증폭 반응이다. 어떤 DNA도 수용되지 않은 튜브 NC, HSV DNA 1picogram이 수용된 튜브 1, C. trachomatis의 4 femtograms이 수용된 튜브 2, 아데노바이러스 DNA 10 picograms이 수용된 튜브 3, 상술한 양의 3가지 DNA가 모두 수용된 튜브 4의 5개의 튜브의 상술한 PCR 믹스를 다음의 DNA 제조물로 배양시켰다. 생성물을 6% agarose 젤에 의해 분석하였다. 도 3에 도시된 것처럼, 모든 유전자가 증폭되었다.
0.26N NaOH에서 서열번호 67, 68, 69, 75 및 83의 표적의 100 pmoles로 나일론 막이 반점이 생겼다(도 4). 그러고 나서, 0.1% SDS 및 1% BSA를 포함하는 2X SSPE를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 막을 블록킹하였다. amplicons을 10분 동안 95℃에서 가열하고 0.1% SDS를 포함하는 2X SSPE에 혼합하고 52℃에 2시간 동안 혼성화하였다. 혼성화 후에 막을 0.1% SDS를 포함하는 1X SSPE에서 3분 동안 5번 세척하였다. 1% BSA, 15OmM NaCl 및 0.3% tween-20을 포함하는 0.1M Tris-HCl pH 7.4 에서 과산화효소가 부착된 스트렙트아비딘(Streptavidin peroxidase conjugate)으로 막을 배양하였다. 37℃에서 30분 후, 막을 동일한 버퍼로 각 3분간 5번 세척하였다. 색깔의 발현을 위해, 막을 PBS(Phosphate buffered Saline) ml당 0.5mg의 디아미노벤지딘 HCl(Diaminobenzidine HCl)로 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 갈색으로 착색된 반점이 발생하는 것은 특정한 병원체의 존재를 의미한다.
실시예 4:
결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 MPB 64 유전자, 폐렴균(Mycobacterium fortuitum)의 16s-23s RNA 유전자, 거북결핵균(Mycobacterium chelonae)의 16s-23 s RNA 유전자 및 톡소플라즈마 곤디이(toxoplasma gondii)의 Bl 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 13, 14, 15 및 16으로 멀티플렉스 PCR을 실행하였다. PCR 믹스는 각 10pmoles의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 각 200μM의 d-ATP, d-UTP, d-CTP 및 d-GTP, 50 mM Tris-HCl pH 9.0에의 2 유닛의 Taq polymeare, 1.5mM MgCl2, 5mM KCl, 0.01% 젤라틴, 1mM EDTA 및 amplicon 오염을 방지하기 위한 1 유닛의 UDP glycosylase를 포함한다. 사이클링 조건은 amplicon 오염물을 완전히 분해하기 위해 30분간 37℃에서 배양(incubation), 50℃에서 2분 및 94℃에서 5분간 변성 단계, 60℃에서 45초; 72℃에서 45초; 94℃에서 45초의 40 사이클, 72℃에서 10분간 증폭 반응이다. 어떤 DNA도 수용되지 않은 튜브 NC, M. tuberculosis DNA 1.femtograms이 수용된 튜브 1, M. fortuitum DNA의 100 femtograms이 수용된 튜브 2, M. chelonae DNA 100 femtograms이 수용된 튜브 3, toxoplasma gondii DNA 1fgs가 수용된 튜브 4의 5개의 튜브의 PCR 믹스를 DNA 제조물로 배양시켰다. 도 5는 0.26N NaOH에서 서열번호 79, 80, 81 및 82의 표적의 100 pmoles로 반점이 생긴 나일론 막을 도시한다. 그러고 나서, 0.1% SDS 및 1% BSA를 포함하는 2X SSPE를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 막을 블록킹하였다. amplicon을 10분 동안 95℃에서 가열하고 0.1% SDS를 포함하는 2X SSPE에 혼합하고 52℃에 2시간 동안 혼성화하였다. 혼성화 후에 막을 0.1% SDS를 포함하는 1X SSPE에서 3분 동안 5번 세척하였다. 1% BSA, 15OmM NaCl 및 0.3% tween-20을 포함하는 0.1M Tris-HCl pH 7.4에서 과산화효소가 부착된 스트렙트아비딘(Streptavidin peroxidase conjugate)으로 막을 배양하였다. 37℃에서 30분 후, 막을 동일한 버퍼로 각 3분간 5번 세척하였다. 색깔의 발현을 위해, 막을 PBS(Phosphate buffered Saline) ml당 0.5mg의 디아미노벤지딘 HCl(Diaminobenzidine HCl)로 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 갈색으로 착색된 반점이 발생하는 것은 특정한 병원체의 존재를 의미한다.
실시예 5
각각 HSV의 당단백질 D 유전자, UL 44 유전자 및 DNA 폴리머라아제 유전자, CMV의 당단백질 O 유전자, 형태상 변이 유전자 및 UL 88 유전자, VZV의 ORF 29 유전자 및 DNA 폴리머라아제 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 멀티플렉스 PCR을 실행하였다. PCR 믹스는 각 10pmoles의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 각 200μM의 d-ATP, d-UTP, d-CTP 및 d-GTP, 10 mM Tris-HCl pH 9.0에의 2 유닛의 Taq polymeare, 1.5mM MgCl2, 5mM KCl, 0.01% 젤라틴, 1mM EDTA 및 amplicon 오염을 방지하기 위한 1 유닛의 UDP glycosylase를 포함한다. 사이클링 조건은 amplicon 오염물을 완전히 분해하기 위해 30분간 37℃에서 배양(incubation), 50℃에서 2분 및 94℃에서 5분간 변성 단계, 60℃에서 45초; 72℃에서 45초; 94℃에서 45초의 40 사이클, 72℃에서 10분간 증폭 반응이다.
어떤 DNA도 수용되지 않은 튜브 NC, HSV DNA 1picograms이 수용된 튜브 1, CMV DNA의 10 picograms이 수용된 튜브 2, VZV DNA 1 pg이 수용된 튜브 3인 상술한 PCR 믹스의 4개의 튜브를 DNA 제조물과 배양시켰다. 도 6은 0.26N NaOH에서 서열번호 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 및 74의 표적의 100 pmoles로 반점이 생긴 4개의 나일론 막을 도시한다. 그러고 나서, 0.1% SDS 및 1% BSA를 포함하는 2X SSPE를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 막을 블록킹하였다. amplicon을 10분 동안 95℃에서 가열하고 0.1% SDS를 포함하는 2X SSPE에 혼합하고 52℃에 2시간 동안 혼성화하였다. 혼성화 후에 막을 0.1% SDS를 포함하는 1X SSPE에서 3분 동안 5번 세척하였다. 1% BSA, 15OmM NaCl 및 0.3% tween-20을 포함하는 0.1M Tris-HCl pH 7.4에서 과산화효소가 부착된 스트렙트아비딘(Streptavidin peroxidase conjugate)으로 막을 배양하였다. 37℃에서 30분 후, 막을 동일한 버퍼로 각 3분간 5번 세척하였다. 색깔의 발현을 위해, 막을 PBS(Phosphate buffered Saline) ml당 0.5mg의 디아미노벤지딘 HCl(Diaminobenzidine HCl)로 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 갈색으로 착색된 반점이 발생하는 것은 특정한 병원체의 존재를 의미한다.
도 6은 HSV, CMV 및 VZV의 게놈을 특이하게 확인하는 바이러스성 망막염(retinitis)의 확인을 위한 멀티플렉스 PCR의 amplicons과 혼성화된 나일론 막에 반점이 생긴 매크로-어레이의 사진이다.
실시예 6
진정세균(eubacterial) 게놈의 16s 리보솜 RNA 유전자 세트 Ⅰ 및 Ⅱ, 그램-양성의 16s 리보솜 RNA 유전자, 모든 균류의 28s RNA 유전자, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)의 16s 리보솜 RNA 유전자, 그램-음성 박테리아의 gyr B 유전자, 아코니트산 하이드라타제(aconitate hydratase) 유전자 및 리보뉴클레아제 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 10, 11, 12, 18, 19, 20, 21 및 22로 멀티플렉스 PCR을 실행하였다. PCR 믹스는 각 10 내지 20 pmoles의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 각 200μM의 d-ATP, d-UTP, d-CTP 및 d-GTP, 50 mM Tris-HCl pH 7.5에의 2 유닛의 Taq polymeare, 5mM MgCl2, 5mM KCl, 1% 우혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA), 1mM EDTA 및 amplicon 오염을 방지하기 위한 1 유닛의 UDP glycosylase를 포함한다. 사이클링 조건은 amplicon 오염물을 완전히 분해하기 위해 30분간 37℃에서 배양(incubation), 94℃에서 5분간 변성 단계, 60℃에서 45초; 72℃에서 45초; 94℃에서 45초의 40 사이클, 72℃에서 10분간 증폭 반응이다. 어떤 DNA도 수용되지 않은 튜브 NC, E.coli의 DNA 5fg이 수용된 튜브 1, S.aureus DNA의 10fg이 수용된 튜브 2, P. acnes DNA 10 fg이 수용된 튜브 3, C.albicans DNA 10fg가 수용된 튜브 4인 상술한 PCR 믹스의 5개의 튜브를 DNA 제조물과 배양시켰다. 도 7은 0.26N NaOH에서 서열번호 76, 77, 78, 84, 85, 86, 87 및 88의 표적의 100 pmoles로 반점이 생긴 5개의 나일론 막을 도시한다. 그러고 나서, 0.1% SDS 및 1% BSA를 포함하는 2X SSPE를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 막을 블록킹하였다. amplicon을 10분 동안 95℃에서 가열하고 0.1% SDS를 포함하는 2X SSPE에 혼합하고 52℃에 2시간 동안 혼성화하였다. 혼성화 후에 막을 0.1% SDS를 포함하는 1X SSPE에서 3분 동안 5번 세척하였다. 1% BSA, 15OmM NaCl 및 0.3% tween-20을 포함하는 0.1M Tris-HCl pH 7.4에서 과산화효소가 부착된 스트렙트아비딘(Streptavidin peroxidase conjugate)으로 막을 배양하였다. 37℃에서 30분 후, 막을 동일한 버퍼로 각 3분간 5번 세척하였다. 색깔의 발현을 위해, 막을 PBS(Phosphate buffered Saline) ml당 0.5mg의 디아미노벤지딘 HCl(Diaminobenzidine HCl)로 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 갈색으로 착색된 반점이 발생하는 것은 특정한 병원체의 존재를 의미한다.
도 7은 진정세균(eubacteria), 그램 +ve, 그램 - ve, P. acnes 및 균류의 게놈을 특히 확인하는 전염성 안구내염(endophthalmitis)의 확인을 위한 멀티플렉스 PCR의 amplicons로 혼성화시킨 나일론 막에 반점을 생성한 매크로-어레이의 사진이다.
실시예 7
사망 전 포도막염(uveitis)/망막염(retinitis)을 앓고 있었던 11명의 AIDS 환자의 부검시 수집한 유리액을 멀티플렉스 PCR에서 테스트를 하고 macroarray에서 amplicon를 확인하였다. 100㎕의 각 유리체 샘플에서 QIAGEN DNA 정제 키트를 이용하여 DNA를 추출하였다. DNA를 50㎕의 용출 버퍼로 재구성하였다. 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2 당단백질 D, 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2 UL 44 유전자, 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2 DNA 폴리머라아제 유전자, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 당단백질 O 유전자, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 형태학 변이 유전자, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) UL 88 유전자, 수두 대상포진(Varicella zoster) ORF 29, 수두 대상포진(Varicella zoster) DNA 폴리머라아제 유전자, 아데노바이러스 헥손 유전자, 진정세균(eubacterial) 16s 리보솜 RNA 유전자 I, 진정세균(eubacterial) 16s 리보솜 RNA 유전자 영역 Ⅱ, 그램 +ve 세균성 특이 부분의 16s 리보솜 RNA 유전자, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) MPB 64 유전자, 폐렴균(Mycobacterium fortuitum) 16s-23s RNA 유전자, 거북결핵균(Mycobacterium chelonae) 16s-23s RNA 유전자, 톡소플라즈마 곤디이(toxoplasma gondii) B 1 유전자, 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis) 다형태성 단백질 Ⅱ, 균 특이 부분의 28s 리보솜 RNA 유전자, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 특이 부분의 16s-23s 리보솜 RNA 유전자, 그램 -ve 세균성 특이 부분의 gyr B 유전자, 그램 -ve 세균성 아코니트산 하이드라타제(aconitate hydratase) 유전자, 그램 -ve 리보뉴클레아제 I 유전자의 모든 23개의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 1 내지 23으로 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.
PCR 믹스는 각 10 내지 20 pmoles의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 각 200μM의 d-ATP, d-UTP, d-CTP 및 d-GTP, 10 mM Tris-HCl pH 9.0에의 2 유닛의 Taq polymeare, 1.5mM MgCl2, 5mM KCl, 0.01% 젤라틴, 1mM EDTA 및 amplicon 오염을 방지하기 위한 1 유닛의 UDP glycosylase 및 샘플에서 추출한 10㎕의 DNA를 포함한다. 사이클링 조건은 amplicon 오염물을 완전히 분해하기 위해 30분간 37℃에서 배양(incubation), 94℃에서 5분간 변성 단계, 60℃에서 45초; 72℃에서 45초; 94℃에서 45초의 40 사이클, 72℃에서 10분간 증폭 반응이다.
농도 10~20p moles/50㎕ 반응 믹스의 서열번호 1 내지 46을 포함하는 23 프라이머 세트로 상술한 바와 같이 PCR을 수행하였다. 모든 샘플의 PCR 생성물은 서열번호 47 내지 71의 프로브로 반점이 생긴 나일론 막에 혼성화되었다. 나일론 막은 0.26N NaOH의 서열번호 67~88의 표적의 100pmoles로 각각 반점이 생성되었다. 그러고 나서, 0.1% SDS 및 1% BSA를 포함하는 2X SSPE를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 막을 블록킹하였다. amplicon을 10분 동안 95℃에서 가열하고 0.1% SDS를 포함하는 2X SSPE에 혼합하고 52℃에 2시간 동안 혼성화하였다. 혼성화 후에 막을 0.1% SDS를 포함하는 1X SSPE에서 3분 동안 5번 세척하였다. 1% BSA, 15OmM NaCl 및 0.3% tween-20을 포함하는 0.1M Tris-HCl pH 7.4에서 과산화효소가 부착된 스트렙트아비딘(Streptavidin peroxidase conjugate)으로 막을 배양하였다. 37℃에서 30분 후, 막을 동일한 버퍼로 각 3분간 5번 세척하였다. 색깔의 발현을 위해, 막을 PBS(Phosphate buffered Saline) ml당 0.5mg의 디아미노벤지딘 HCl(Diaminobenzidine HCl)로 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 갈색으로 착색된 반점이 발생하는 것은 특정한 병원체의 존재를 의미한다.
얻어진 결과를 표 1에 요약하였다. 모든 11개 샘플은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 의한 HSV 망막염(retinitis) 및 포도막염(uveitis)으로 확인되었고 반면에 그 중 10개는 추가로 유리체(vitreous)에 톡소플라즈마 곤디이(toxoplasma gondii)가 있었다. 멀티플렉스 PCR 및 DNA 매크로-어레이는 모든 샘플을 정확하게 확인하였다.
표 1: AIDS 환자에게서 수집한 11 부검 샘플 유리액에서 수행한 멀티플렉스 PCR 및 매크로-어레이에의 혼성화를 이용하여 병원체의 동시 검출 및 판별의 결과
Figure 112009081256803-PCT00001
실시예 8:
AIDS 환자의 부검에서 수집한 6개의 CSF 샘플을 멀티플렉스 PCR을 한 후 매크로 어레이에서 테스트하였다. 사인은 중앙 신경 조직 감염인 것으로 판명되었다. 상업적으로 이용가능한 QIAGEN DNA 추출 키트를 이용하여 200μL의 샘플에서 DNA를 추출하였다. DNA를 50μL의 용출 버퍼에서 재구성하였다. 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2 당단백질 D, 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2 UL 44 유전자, 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2 DNA 폴리머라아제 유전자, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 당단백질 O 유전자, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 형태학 변이 유전자, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) UL 88 유전자, 수두 대상포진(Varicella zoster) ORF 29, 수두 대상포진(Varicella zoster) DNA 폴리머라아제 유전자, 아데노바이러스 헥손 유전자, 진정세균(eubacterial) 16s 리보솜 RNA 유전자 I, 진정세균(eubacterial) 16s 리보솜 RNA 유전자 영역 Ⅱ, 그램 +ve 세균성 특이 부분의 16s 리보솜 RNA 유전자, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) MPB 64 유전자, 폐렴균(Mycobacterium fortuitum) 16s-23s RNA 유전자, 거북결핵균(Mycobacterium chelonae) 16s-23s RNA 유전자, 톡소플라즈마 곤디이(toxoplasma gondii) B 1 유전자, 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis) 다형태성 단백질 Ⅱ, 균 특이 부분의 28s 리보솜 RNA 유전자, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 특이 부분의 16s-23s 리보솜 RNA 유전자, 그램 -ve 세균성 특이 부분의 gyr B 유전자, 그램 -ve 세균성 아코니트산 하이드라타제(aconitate hydratase) 유전자, 그램 -ve 리보 뉴클레아제 I 유전자의 모든 23개의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 1 내지 23으로 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.
PCR 믹스는 각 10 내지 20 pmoles의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 각 200μM의 d-ATP, d-UTP, d-CTP 및 d-GTP, 10 mM Tris-HCl pH 9.0에의 2 유닛의 Taq polymeare, 1.5mM MgCl2, 5mM KCl, 0.01% 젤라틴, 1mM EDTA 및 amplicon 오염을 방지하기 위한 1 유닛의 UDP glycosylase 및 샘플에서 추출한 10㎕의 DNA를 포함한다. 사이클링 조건은 amplicon 오염물을 완전히 분해하기 위해 30분간 37℃에서 배양(incubation), 94℃에서 5분간 변성 단계, 60℃에서 45초; 72℃에서 45초; 94℃에서 45초의 40 사이클, 72℃에서 10분간 증폭 반응이다. 농도 10~20p moles/50㎕ 반응 믹스의 서열번호 1 내지 46을 포함하는 23 프라이머 세트로 상술한 바와 같이 PCR을 수행하였다. 모든 샘플의 PCR 생성물은 서열번호 47 내지 71의 프로브로 반점이 생긴 나일론 막에 혼성화되었다. 나일론 막은 0.26N NaOH의 서열번호 67~88의 표적의 100pmoles로 각각 반점이 생성되었다. 그러고 나서, 0.1% SDS 및 1% BSA를 포함하는 2X SSPE를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 막을 블록킹하였다. amplicon을 10분 동안 95℃에서 가열하고 0.1% SDS를 포함하는 2X SSPE에 혼합하고 52℃에 2시간 동안 혼성화하였다. 혼성화 후에 막을 0.1% SDS를 포함하는 1X SSPE에서 3분 동안 5번 세척하였다. 1% BSA, 15OmM NaCl 및 0.3% tween-20을 포함하는 0.1M Tris-HCl pH 7.4에서 과산화효소가 부착된 스트렙트아비딘(Streptavidin peroxidase conjugate)으로 막을 배양하였다. 37℃에서 30분 후, 막을 동일한 버퍼로 각 3분간 5번 세척하였다. 색깔의 발현을 위해, 막을 PBS(Phosphate buffered Saline) ml당 0.5mg의 디아미노벤지딘 HCl(Diaminobenzidine HCl)로 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 갈색으로 착색된 반점이 발생하는 것은 특정한 병원체의 존재를 의미한다.
표 2: AIDS 환자에게서 수집한 CSF의 6개의 부검 샘플에서 수행한 멀티플렉스 PCR 및 매크로-어레이에의 혼성화를 이용하여 병원체의 동시 검출 및 판별의 결과
Figure 112009081256803-PCT00002
실시예 9:
수양액(aqueous humor) 또는 유리액의 일련의 19 눈 샘플을 각종 임상 진단에서 얻었다. 약 50-100μL 샘플에서 상업적으로 이용 가능한 DNA 추출 키트를 이용하여 DNA를 추출하고 DNA를 물 50μL에서 재구성하고 서열번호 1-46로 이루어진 프라이머 세트 1-23의 각 10~20pmloes을 포함하는 10μL를 멀티플렉스 PCR에 이용하였다. PCR 시약 조성물 및 열 사이클링 조건은 실시예 6 및 7에서 설명된 것과 동일하다. amplicon는 위 실시예에서 설명된 대로 서열번호 67-88의 표적과 혼성화 시켰다. 프라이머 세트 및 프로브의 임상 사용을 설명하는 결과를 하기와 같이 요약한다.
표 3: 환자에게서 수집한 수양액(aqueous humor)과 유리액의 눈 샘플에 실행한 멀티플렉스 PCR 및 매크로-어레이에서의 혼성화를 이용하여 병원체의 동시 검출 및 판별의 결과
샘플 번호 임상 진단 결과
1 바이러스성 망막염(viral retinitis) CMV
2 바이러스성 망막염 및 포도막염(uveitis) M. tuberculosis, M. chelonae 및 VZV
3 전염성 안구내염(endophthalmitis) 진정세균(eubacterial) 및 그램-양성
4 바이러스성 망막염 HSV
5 전염성 안구내염(endophthalmitis) 진정세균 및 그램-양성
6 전염성 안구내염(endophthalmitis) 진정세균 및 그램-양성
7 전염성 안구내염(endophthalmitis) 진정세균 및 그램-양성
8 전염성 안구내염(endophthalmitis) 진정세균 및 그램-양성
9 전염성 안구내염(endophthalmitis) 진정세균 및 그램-양성
10 전염성 안구내염(endophthalmitis) 진정세균 및 그램-양성
11 전염성 안구내염(endophthalmitis) 및 포도막염 균류 감염
12 전염성 안구내염(endophthalmitis) 및 포도막염 음성
13 전염성 안구내염(endophthalmitis) 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)
14 전염성 안구내염(endophthalmitis) 진정세균 및 그램-양성
15 전염성 안구내염(endophthalmitis) 진정세균 및 그램-양성
16 전염성 안구내염(endophthalmitis) 및 포도막염 진정세균 및 M. tuberculosis
17 전염성 안구내염(endophthalmitis) 진정세균 및 그램-양성
18 전염성 안구내염(endophthalmitis) 음성
19 전염성 안구내염(endophthalmitis) 진정세균 및 그램-양성
1. 매우 효율적이고 시간 절약 키트.
2. 감염의 아주 초기 단계에서의 특정한 병원체의 확인은 의사가 질병의 확산 및 그것의 치료에 적합한 치료방법을 선택하도록 도울 것이다.
3. 동일한 샘플에서의 다수 감염의 확인은 또한 효과적인 치료를 위한 약의 조합을 사용하여 치료를 유용할 것이다.
<110> COUNCIL OF SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH <120> A NOVEL METHOD FOR SIMULTANEOUS DETECTION AND DISCRIMINATION OF BACTERIAL, FUNGAL, PARASITIC AND VIRAL INFECTIONS OF EYE AND CENTRAL NERVOUS SYSTEM <150> IN1178/DEL/2007 <151> 2007-06-01 <160> 88 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 1 cgcttggttt cggatgggag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 2 gcccccagag acttgttgta gg 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 3 ggcaatcgtg tacgtcgtcc g 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 4 cgggggggtc ttgcgttac 19 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 5 caagctgacg gacatttaca agg 23 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 6 gtcccacacg cgaaacacg 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 7 ttccggctca tggcgttaac c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 8 cgccctgctt ttacgttacg c 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Cytomegalovirus Morphological transformation gene <400> 9 cggcgacgac gacgataaag 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 10 caatctggtc gcgtaatcct ctg 23 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 11 gggcacgtcc tcgcagaag 19 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 12 ccaagatgca ggtgataggt gac 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Varicella zoster ORF 29 <400> 13 ggtcttgccg gagctggtat tac 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Varicella zoster ORF 29 <400> 14 tgcctccgtg aaagacaaag aca 23 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Varicella zoster <400> 15 tccatttaac gttgcatcat tttgtg 26 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Varicella zoster <400> 16 acgttccggt agcgagttat ctg 23 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Adenoviruses <400> 17 cgccgccaac atgctctacc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Adenoviruses Hexon Gene <400> 18 gttgcgggag gggatggata 20 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Eubacterial 16s ribosomal RNA gene region I <400> 19 tgggctacac acgtgctaca atgg 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Eubacterial 16s ribosomal RNA gene region I <400> 20 cggactacga tcggttttgt gaga 24 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Eubacterial 16s ribosomal RNA gene region II <400> 21 ggcctaacac atgcaagtcg agc 23 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Eubacterial 16s ribosomal RNA gene region II <400> 22 ggcagattcc taggcattac tcacc 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Gram +ve bacterial specific portion of 16s ribosomal RNA gene <400> 23 acgtcaaatc atcatgcccc cttat 25 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Gram +ve bacterial specific portion of 16s ribosomal RNA gene <400> 24 tgcagccctt tgtaccgtcc at 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 25 gcggaacgtg ggaccaatac 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 26 cgacggggtg attttcttct tc 22 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Mycobacterium fortuitum <400> 27 aacttttttg actgccagac acactattg 29 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Mycobacterium fortuitum <400> 28 ggatgccacc ccccaaaag 19 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Mycobacterium chelonae <400> 29 tggttactcg cttggtgaat atgt 24 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Mycobacterium chelonae <400> 30 gacgttttgc cgactaccta tcc 23 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Toxoplasma gondii <400> 31 cccctctgct ggcgaaaagt g 21 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Toxoplasma gondii <400> 32 ggcgaccaat ctgcgaatac ac 22 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 33 aatcgtatct cgggttaatg ttgc 24 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 34 tcgaggaaaa ccgtatgaga aac 23 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> 28s ribosomal RNA gene <400> 35 gctgggactg aggactgcga c 21 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> 28s ribosomal RNA gene <400> 36 ttcaagacgg gcggcatata ac 22 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 37 tggcgaacgg gtgagtaaca 20 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 38 ccggtattag ccccagtttc c 21 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Gram -ve bacterial specific portion of gyr B gene <400> 39 cggcggcaag ttcgacgac 19 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Gram -ve bacterial specific portion of gyr B gene <400> 40 ccaccgagac gcccacacc 19 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Gram -ve bacterial aconitate hydratase gene <400> 41 ccaggtcggc ggagaagc 18 <210> 42 <211> 17 <212> DNA <213> Gram -ve bacterial aconitate hydratase gene <400> 42 ccaccggccc gatgacc 17 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Gram - ve ribonuclease 1 gene <400> 43 gccgccctga ccaccttc 18 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Gram - ve ribonuclease 1 gene <400> 44 gcgggttgtt cggcatcag 19 <210> 45 <211> 87 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 45 cgcttggttt cggatgggag gcaactgtgc tatccccatc acggtcatgg agtacaccga 60 atgctcctac aacaagtctc tgggggc 87 <210> 46 <211> 70 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 46 ggcaatcgtg tacgtcgtcc gcacatcaca gtcgcggcag cgtcatcggc ggtaacgcaa 60 gacccccccg 70 <210> 47 <211> 79 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 47 caagctgacg gacatttaca aggtccccct ggacgggtac ggccgcatga acggccgggg 60 cgtgtttcgc gtgtgggac 79 <210> 48 <211> 72 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 48 ttccggctca tggcgttaac caggtagaaa ctgtgtgtac agttgcgttg tgcgtaacgt 60 aaaagcaggg cg 72 <210> 49 <211> 65 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 49 cggcgacgac gacgataaag aatacaaagc cgcagtgtcg tccagaggat tacgcgacca 60 gattg 65 <210> 50 <211> 68 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 50 gggcacgtcc tcgcagaagg actccaggta caccttgacg tactggtcac ctatcacctg 60 catcttgg 68 <210> 51 <211> 79 <212> DNA <213> Varicella zoster <400> 51 ggtcttgccg gagctggtat taccttaaaa ctcactacca gtcatttcta tccatctgtc 60 tttgtctttc acggaggca 79 <210> 52 <211> 85 <212> DNA <213> Varicella zoster <400> 52 tccatttaac gttgcatcat tttgtgttat catagaactg cgtaaacact cggcaagtaa 60 tacagataac tcgctaccgg aacgt 85 <210> 53 <211> 70 <212> DNA <213> Adenovirus <400> 53 cgccgccaac atgctctacc ctatacccgc caacgctacc aacgtgccca tatccatccc 60 ctcccgcaac 70 <210> 54 <211> 86 <212> DNA <213> Eubacterial 16s ribosomal RNA gene region I <400> 54 tgggctacac acgtgctaca atggtcggta cagagggtcg ccaaaccgcg aggtggagct 60 aatctcacaa aaccgatcgt agtccg 86 <210> 55 <211> 86 <212> DNA <213> Eubacterial 16s ribosomal RNA gene region II <400> 55 ggcctaacac atgcaagtcg agcggatgaa aggagcttgc tcctggattc agcggcggac 60 gggtgagtaa tgcctaggaa tctgcc 86 <210> 56 <211> 71 <212> DNA <213> Gram + ve bacterial specific portion of 16s ribosomal RNA gene <400> 56 acgtcaaatc atcatgcccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac 60 aaagggctgc a 71 <210> 57 <211> 84 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 57 gcggaacgtg ggaccaatac ctgggttggg ccggctgctt cgggcagcaa ctcccccggg 60 ttgaagaaga aaatcacccc gtcg 84 <210> 58 <211> 74 <212> DNA <213> Mycobacterium fortuitum <400> 58 aacttttttg actgccagac acactattgg gctttgagac aacaggcccg tgcccctttt 60 ggggggtggc atcc 74 <210> 59 <211> 70 <212> DNA <213> Mycobacterium chelonae <400> 59 tggttactcg cttggtgaat atgttttata aatcctgtcc accccgtgga taggtagtcg 60 gcaaaacgtc 70 <210> 60 <211> 70 <212> DNA <213> Toxoplasma gondii <400> 60 cccctctgct ggcgaaaagt gaaattcatg agtatctgtg caactttggt gtattcgcag 60 attggtcgcc 70 <210> 61 <211> 79 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 61 aatcgtatct cgggttaatg ttgcatgatg ctttatcaaa tgacaagctt agatccgttt 60 ctcatacggt tttcctcga 79 <210> 62 <211> 68 <212> DNA <213> Fungal specific portion of 28s ribosomal RNA gene <400> 62 gctgggactg aggactgcga cgtaagtcaa ggatgctggc ataatggtta tatgccgccc 60 gtcttgaa 68 <210> 63 <211> 77 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 63 tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgagtaac ctgcccttga ctttgggata acttcaggaa 60 actggggcta ataccgg 77 <210> 64 <211> 68 <212> DNA <213> Gram -ve bacterial specific portion of gyr B gene <400> 64 cggcggcaag ttcgacgaca acacctacaa ggtgtccggc ggcttgcacg gtgtgggcgt 60 ctcggtgg 68 <210> 65 <211> 66 <212> DNA <213> Gram -ve bacterial aconitate hydratase gene <400> 65 ccaggtcggc ggagaagccg aggcaggcga ggtccttcag ttcgtcgcgg gtcatcgggc 60 cggtgg 66 <210> 66 <211> 64 <212> DNA <213> Gram -ve ribonuclease 1 <400> 66 gccgccctga ccaccttcat cagcctggcc ggccgttacc tggtgctgat gccgaacaac 60 ccgc 64 <210> 67 <211> 45 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 67 gcaactgtgc tatccccatc acggtcatgg agtacaccga atgct 45 <210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 68 cacatcacag tcgcggcagc gtcatcggcg 30 <210> 69 <211> 37 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 69 tccccctgga cgggtacggc cgcatgaacg gccgggg 37 <210> 70 <211> 31 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 70 aggtagaaac tgtgtgtaca gttgcgttgt g 31 <210> 71 <211> 22 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 71 aatacaaagc cgcagtgtcg tc 22 <210> 72 <211> 26 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 72 gactccaggt acaccttgac gtactg 26 <210> 73 <211> 33 <212> DNA <213> Varicella zoster <400> 73 cttaaaactc actaccagtc atttctatcc atc 33 <210> 74 <211> 36 <212> DNA <213> Varicella zoster <400> 74 ttatcataga actgcgtaaa cactcggcaa gtaata 36 <210> 75 <211> 30 <212> DNA <213> Adenovirus <400> 75 ctatacccgc caacgctacc aacgtgccca 30 <210> 76 <211> 38 <212> DNA <213> Eubacterial 16s ribosomal gene region I <400> 76 tcggtacaga gggtcgccaa accgcgaggt ggagctaa 38 <210> 77 <211> 39 <212> DNA <213> Eubacterial 16s ribosomal gene region II <400> 77 tggatgaaag gagcttgctc ctggattcag cggcggacg 39 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> 16s ribosomal gene of gram-positive organism <400> 78 gacctgggct acacacgtgc taca 24 <210> 79 <211> 42 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 79 ctgggttggg ccggctgctt cgggcagcaa ctcccccggg tt 42 <210> 80 <211> 26 <212> DNA <213> Mycobacterium fortuitum <400> 80 ggctttgaga caacaggccc gtgccc 26 <210> 81 <211> 23 <212> DNA <213> Mycobacterium chelonae <400> 81 tttataaatc ctgtccaccc cgt 23 <210> 82 <211> 27 <212> DNA <213> Toxoplasma gondii <400> 82 aaattcatga gtatctgtgc aactttg 27 <210> 83 <211> 32 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 83 atgatgcttt atcaaatgac aagcttagat cc 32 <210> 84 <211> 25 <212> DNA <213> 28s ribosomal RNA gene of fungi <400> 84 gtaagtcaag gatgctggca taatg 25 <210> 85 <211> 26 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 85 gcttcagcgc cgtcagcgag gataac 26 <210> 86 <211> 30 <212> DNA <213> gyrase gene of gram -ve organism <400> 86 aacacctaca aggtgtccgg cggcttgcac 30 <210> 87 <211> 31 <212> DNA <213> aconitate hydratase gene of gram -ve organism <400> 87 cgaggcaggc gaggtccttc agttcgtcgc g 31 <210> 88 <211> 27 <212> DNA <213> Ribonuclease gene of gram -ve organism <400> 88 atcagcctgg ccggccgtta cctggtg 27

Claims (18)

  1. 증후를 유발하는 병원체의 검출 및 판별에 유용한 프라이머 세트로서,
    FP: 5' cgcttggtttcggatgggag 3' (서열번호 l) 및 RP: 5' gcccccagagacttgttgtagg 3' (서열번호 2) 의 프라이머 세트 1;
    FP: 5' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3' (서열번호 3) 및 RP: 5' cgggggggtcttgcgttac 3' (서열번호 4)의 프라이머 세트 2;
    FP: 5' caagctgacggacatttacaagg 3' (서열번호 5) 및 RP: 5' gtcccacacgcgaaacacg 3' (서열번호 6)의 프라이머 세트 3;
    FP: 5' ttccggctcatggcgttaacc 3' (서열번호 7) 및 RP: 5' cgccctgcttttacgttacgc 3' (서열번호 8)의 프라이머 세트 4;
    FP: 5' cggcgacgacgacgataaag 3' (서열번호 9) 및 RP: 5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3' (서열번호 10)의 프라이머 세트 5;
    FP: 5' gggcacgtcctcgcagaag 3' (서열번호 11) 및 RP: 5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3' (서열번호 12)의 프라이머 세트 6;
    FP: 5' ggtcttgccggagctggtattac 3' (서열번호 13) 및 RP: 5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3' (서열번호 l4)의 프라이머 세트 7;
    FP: 5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3' (서열번호 15) 및 RP: 5' acgttccggtagcgagttatctg 3' (서열번호 16)의 프라이머 세트 8;
    FP: 5' cgccgccaacatgctctacc 3' (서열번호 17) 및 RP: 5' gttgcgggaggggatggata 3' (서열번호 18)의 프라이머 세트 9;
    FP: 5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3' (서열번호 19) 및 RP: 5' cggactacgatcggttttgtgaga 3' (서열번호 20)의 프라이머 세트 10;
    FP: 5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3 (서열번호 21) 및 RP: 5' ggcagattcctaggcattactcacc 3 (서열번호 22)의 프라이머 세트 11;
    FP: 5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3' (서열번호 23) 및 RP: 5' tgcagccctttgtaccgtccat 3' (서열번호 24)의 프라이머 세트 12;
    FP: 5' gcggaacgtgggaccaatac 3' (서열번호 25) 및 RP: 5' cgacggggtgattttcttcttc 3' (서열번호 26)의 프라이머 세트 13;
    FP: 5' aacttttttgactgccagacacactattg 3' (서열번호 27) 및 RP: 5' ggatgccaccccccaaaag 3' (서열번호 28)의 프라이머 세트 14;
    FP: 5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3' (서열번호 29) 및 RP: 5' gacgtrttgccgactacctatcc 3 (서열번호 30)의 프라이머 세트 15;
    FP: 5' cccctctgctggcgaaaagtg 3' (서열번호 31) 및 RP: 5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3' (서열번호 32)의 프라이머 세트 16;
    FP: 5' aatcgtatctcgggttaatgttgc 3' (서열번호 33) 및 RP: 5' tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3' (서열번호 34)의 프라이머 세트 17;
    FP: 5' gctgggactgaggactgcgac 3' (서열번호 35) 및 RP: 5' ttcaagacgggcggcatataac 3 (서열번호 36)의 프라이머 세트 18;
    FP: 5' tggcgaacgggtgagtaaca 3' (서열번호 37) 및 RP: 5' ccggtattagccccagtttcc 3' (서열번호 38)의 프라이머 세트 19;
    FP: 5' cggcggcaagttcgacgac 3' (서열번호 39) 및 RP: 5' ccaccgagacgcccacacc 3' (서열번호 40)의 프라이머 세트 20;
    FP: 5' ccaggtcggcggagaagc 3' (서열번호 41) 및 RP: 5' ccaccggcccgatgacc 3' (서열번호 42)의 프라이머 세트 21; 및
    FP: 5' gccgccctgaccaccttc 3' (서열번호 43) 및 RP: 5 gcgggttgttcggcatcag 3' (서열번호 44)의 프라이머 세트 22; 를 포함하고,
    상기 프라이머 세트는 단독으로 또는 조합하여 사용되는, 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    임상 샘플을 멀티플렉스 PCR을 수행하여 상기 병원체의 표적 유전자를 증폭하여 전염성 안구내염(endophthalmitis), 각막염(Keratitis), 포도막염(uveitis), 망막염(retinitis) 또는 뇌수막염(meningitis)과 같은 증상을 유발하는 병원체의 검출 및 판별에 유용한 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서,
    58℃ 내지 65℃의 온도에서 17 내지 29bp 길이만큼 균일하게 어닐링되는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  4. 유니플렉스 또는 멀티플렉스 PCR 반응을 이용하여 표준 또는 임상 표준에서 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭되는 하기의 병원체 특이 DNA 프로브 서열 세트:
    1. 프로브 DNA 서열
    "cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggc" (서열번호 45)
    2. 프로브 DNA 서열
    "ggcaatcgtg tacgtcgtcc gcacatcaca gtcgcggcag cgtcatcggc ggtaacgcaa gacccccccg" (서열번호 46)
    3. 프로브 DNA 서열
    "caagctgacg gacatttaca aggtccccct ggacgggtac ggccgcatga acggccgggg cgtgtttcgc gtgtgggac" (서열번호 47)
    4. 프로브 DNA 서열
    "ttccggctca tggcgttaac caggtagaaa ctgtgtgtac agttgcgttg tgcgtaacgt aaaagcaggg cg" (서열번호 48)
    5. 프로브 DNA 서열
    "cggcgacgac gacgataaag aatacaaagc cgcagtgtcg tccagaggat tacgcgacca gattg" (서열번호 49)
    6. 프로브 DNA 서열
    "gggcacgtcc tcgcagaagg actccaggta caccttgacg tactggtcac ctatcacctg catcttgg" (서열번호 50)
    7. 프로브 DNA 서열
    "ggtcttgccg gagctggtat taccttaaaa ctcactacca gtcatttcta tccatctgtc tttgtctttc acggaggca" (서열번호 51)
    8. 프로브 DNA 서열
    "tccatttaac gttgcatcat tttgtgttat catagaactg cgtaaacact cggcaagtaa tacagataac tcgctaccgg aacgt" (서열번호 52)
    9. 프로브 DNA 서열
    "cgccgccaac atgctctacc ctatacccgc caacgctacc aacgtgccca tatccatccc ctcccgcaac"(서열번호 53)
    10. 프로브 DNA 서열
    "tgggctacac acgtgctaca atggtcggta cagagggtcg ccaaaccgcg aggtggagct aatctcacaa aaccgatcgt agtccg" (서열번호 54)
    11. 프로브 DNA 서열
    "ggcctaacac atgcaagtcg agcggatgaa aggagcttgc tcctggattc agcggcggac gggtgagtaa tgcctaggaa tctgcc" (서열번호 55)
    12. 프로브 DNA 서열
    "acgtcaaatc atcatgcccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac aaagggctgc a" (서열번호 56)
    13. 프로브 DNA 서열
    "gcggaacgtg ggaccaatac ctgggttggg ccggctgctt cgggcagcaa ctcccccggg ttgaagaaga aaatcacccc gtcg" (서열번호 57)
    14. 프로브 DNA 서열
    "aacttttttg actgccagac acactattgg gctttgagac aacaggcccg tgcccctttt ggggggtggc atcc" (서열번호 58)
    15. 프로브 DNA 서열
    "tggttactcg cttggtgaat atgttttata aatcctgtcc accccgtgga taggtagtcg gcaaaacgtc" (서열번호 59)
    16. 프로브 DNA 서열
    "cccctctgct ggcgaaaagt gaaattcatg agtatctgtg caactttggt gtattcgcag attggtcgcc" (서열번호 60)
    17. 프로브 DNA 서열
    "aatcgtatct cgggttaatg ttgcatgatg ctttatcaaa tgacaagctt agatccgttt ctcatacggt tttcctcga" (서열번호 61)
    18. 프로브 DNA 서열
    "gctgggactg aggactgcga cgtaagtcaa ggatgctggc ataatggtta tatgccgccc gtcttgaa" (서열번호 62)
    19. 프로브 DNA 서열
    "tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgagtaac ctgcccttga ctttgggata acttcaggaa actggggcta ataccgg" (서열번호 63)
    20. 프로브 DNA 서열
    "cggcggcaag ttcgacgaca acacctacaa ggtgtccggc ggcttgcacg gtgtgggcgt ctcggtgg" (서열번호 64)
    21. 프로브 DNA 서열
    "ccaggtcggc ggagaagccg aggcaggcga ggtccttcag ttcgtcgcgg gtcatcgggc cggtgg" (서열번호 65)
    22. 프로브 DNA 서열
    "gccgccctga ccaccttcat cagcctggcc ggccgttacc tggtgctgat gccgaacaac ccgc" (서열번호 66)
  5. 조사 중인 특이 병원체를 검출하고 판별하기 위한 혼성화 동안, 고체상 매트릭스에 고정된 후에 이용되는 증폭된 서열과 상보적이고, 58.9℃ 내지 83℃ 범위의 균일한 녹는 온도를 가지는, 하기에 기술한 DNA 표적 서열 세트:
    1. 5' gcaactgtgc tatccccatc acggtcatgg agtacaccga atgct 3' (서열번호 67)
    2. 5' cacatcacag tcgcggcagc gtcatcggcg 3' (서열번호 68)
    3. 5' tccccctgga cgggtacggc cgcatgaacg gccgggg 3' (서열번호 69)
    4. 5' aggtagaaac tgtgtgtaca gttgcgttgt g 3' (서열번호 70)
    5. 5' aatacaaagc cgcagtgtcg tc 3' (서열번호 71)
    6. 5' gactccaggt acaccttgac gtactg 3' (서열번호 72)
    7. 5' cttaaaactc actaccagtc atttctatcc atc 3' (서열번호 73)
    8. 5' ttatcataga actgcgtaaa cactcggcaa gtaata 3' (서열번호 74)
    9. 5' ctatacccgc caacgctacc aacgtgccca 3' (서열번호 75)
    10. 5' tcggtacaga gggtcgccaa accgcgaggt ggagctaa 3' (서열번호 76)
    11. 5' ggatgaaagg agcttgctcc tggattcagc ggcggacg 3' (서열번호 77)
    12. 5' gacctgggct acacacgtgc taca 3' (서열번호 78)
    13. 5' ctgggttggg ccggctgctt cgggcagcaa ctcccccggg tt 3' (서열번호 79)
    14. 5' ggctttgaga caacaggccc gtgccc 3' (서열번호 80)
    15. 5' tttataaatc ctgtccaccc cgt 3' (서열번호 81)
    16. 5' aaattcatga gtatctgtgc aactttg 3' (서열번호 82)
    17. 5' atgatgcttt atcaaatgac aagcttagat cc 3' (서열번호 83)
    18. 5' gtaagtcaag gatgctggca taatg 3' (서열번호 84)
    19. 5' gcttcagcgc cgtcagcgag gataac 3' (서열번호 85)
    20. 5' aacacctaca aggtgtccgg cggcttgcac 3' (서열번호 86)
    21. 5' cgaggcaggc gaggtccttc agttcgtcgc g 3'(서열번호 87)
    22. 5' atcagcctgg ccggccgtta cctggtg 3'(서열번호 88)
  6. 제1항의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 세트의 풀을 이용하여 임상 샘플에 멀티플렉스 PCR 분석시험을 수행하여 병원체의 표적 유전자를 증폭하여 전염성 안구내염(endophthalmitis), 각막염(Keratitis), 포도막염(uveitis), 망막염(retinitis) 또는 뇌수막염(meningitis)과 같은 증상을 유발하는 상기 병원체의 검출 및 판별 방법으로서,
    증폭된 생성물(프로브)가 공지된 방법으로 멀티플렉스 포맷에서 고체상 매트릭스에 고정된 상보적인 DNA 서열(표적)과 혼성화되고,
    상기 혼성화된 생성물은 조사중인 증후를 유발하는 특이 병원체를 검출 및 판별하기 위한 공지된 방법에 의해 검출되는, 병원체의 검출 및 판별방법.
  7. 제1항의 프라이머 세트의 전부 또는 일부를 이용한 멀티플렉스 PCR 분석실험으로서, 모든 프라이머는 94℃, 5분의 변성 단계, 60~64℃, 45초, 72℃에서 45초, 94℃ 45초의 40 사이클 및 72℃, 10분의 반응 증폭을 포함하는 균일한 열 사이클링 조건을 이용하여 단일 튜브에서 함께 사용되는 멀티플렉스 PCR 분석실험.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 착색된 생성물의 형성에 의해 검출되는 바이오틴(biotin) 모이어티를 이용하여 5' 말단에 표지되는, 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 프라이머는 형광 스캐닝 장치(fluorescent scanning device) 또는 현미경으로 검출할 수 있는 플루오레신 이소티오시아네이트(Fluorescene isothiocyanate; FITC) 등과 같은 유기 형광성 표지 또는 양자 도트(Quantum Dots)™ 또는 Cy3 또는 Cy5 등과 같은 무기 형광성 나노 입자와 같은 형광 표지에 의해 표지되는 방법.
  10. 제1항의 프라이머의 풀, 제4항의 프로브, 제5항의 표적의 사용으로서,
    분석실험은 병원체의 검출을 위한 리얼 타임 PCR인 사용.
  11. 제1항의 프라이머의 풀, 제4항의 프로브, 제5항의 표적의 사용으로서,
    분석실험은 질병의 예후(prognosis) 또는 치료를 감시하기 위해 임상 샘플에서 병원체를 정량화하는 리얼 타임 PCR인 사용.
  12. 제6항에 있어서,
    제4항의 특이 프로브를 이용하여 상기 증폭된 생성물을 매크로어레이(macroarray) 또는 슬롯 블랏(slot blot) 또는 라인 프로브 어레이의 형태로 검출하는 검출방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 매크로 어레이는 니트로셀룰로오스, 나일론, 하전된(charged) 나일론, 유리, 또는 폴리스티렌을 포함하는 고체상에 고정된 제5항의 표적을 포함하는 검출 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    검출될 병원체는 단순 포진(Herpes simplex) 바이러스 1 & 2, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 수두 대상포진(Varicella zoster) 바이러스, 아데노바이러스, 진정세균(Eubacteria), 그램 양성 유기체, 그램 음성 박테리아, 균류, 결핵균( Mycobacterium tuberculosis ), 거북결핵균( Mycobacterium chelonei ), 폐렴균( Mycobacterium fortuitum ), 톡소플라즈마 곤디이 ( toxoplasma gondii ), 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis)인 검출방법.
  15. 제6항에 있어서,
    유사한 징후(manifestations)를 가지는 눈 또는 신경계 질병을 유발하는 제14항의 가능한 병원체의 그룹 중에서 각 병원체를 검출할 수 있는 검출방법.
  16. 제1항의 프라이머의 일부 또는 전부를 선택하여 이용한 멀티플렉스 PCR 분석실험으로서,
    제14항의 유기체의 일부 또는 전부에 의해 유발된 모든 임상 징후를 임상 표본에 존재하는 어느 하나의 각 병원체 또는 병원체 그룹을 검출하기 위해 조사하는, 멀티플렉스 PCR 분석실험.
  17. 외부 눈 감염, 안구내염(endophthalmitis) 또는 포도막염(uveitis) 또는 망막염(retinitis) 또는 뇌염(meningoencephalitis)을 유발하는 모든 병원체의 동시 검출방법으로서,
    a) 상기 질병을 가진 환자에게서 임상 샘플을 얻는 것;
    b) 상기 a) 단계에서 얻어진 전체 샘플 도는 일부에서 DNA를 추출하는 것;
    c) 바이오틴(biotin) 또는 형광 트레이서로 표지된 제1항의 프라이머 풀 및 PCR의 표준 시약을 이용하여 상기 b) 단계에서 얻은 DNA로 멀티플렉스 PCR을 수행하는 것;
    d) 상기 c) 단계에서 얻어진 PCR 생성물을 변성하는 것;
    e) 상기 d) 단계에서 얻어진 PCR 생성물을 고체 매트릭스에 고정된 표적과 혼성화시키는 것; 및
    f) 상기 e) 단계에서 얻어진 고체 매트릭스의 DNA 하이브리드를 효소 또는 형광 방법으로 검출하는 것; 을 포함하는 병원체의 동시 검출방법.
  18. 외부 눈 감염, 안구내염(endophthalmitis) 또는 포도막염(uveitis) 또는 망막염(retinitis) 또는 뇌염(meningoencephalitis)을 유발하는 모든 병원체를 동시 검출하는 키트로서,
    a) 제1항의 정방향 및 역방향 프라이머의 풀;
    b) 적당한 고체상 지지체에 고정된 제5항의 DNA 서열의 매트릭스;
    c) PCR로 DNA를 증폭시키는데 필요한 표준 시약;
    d) PCR 증폭 생성물을 상기 고체상에 고정된 DNA 서열의 매트릭스에 혼성화시키는데 필요한 표준 시약; 및
    e) 최종 혼성화된 생성물을 검출 및 판별하는데 필요한 표준 시약.
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