KR101521409B1 - 진균성 및 아메바성 각막염의 원인체를 동시에 검출할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트 및 이를 이용한 각막염 유발균 검출 방법 - Google Patents

진균성 및 아메바성 각막염의 원인체를 동시에 검출할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트 및 이를 이용한 각막염 유발균 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 각막염 환자의 각막찰과검체 (corneal scraping)로 부터 진균성 각막염을 유발하는 주요 진균인 아스퍼질러스(Aspergillus sp.), 푸사리움(Fusarium sp.), 칸디다(Candida sp.)와 함께 아메바성 각막염을 유발하는 가시아메바(Acanthamoeba sp.)를 동시에 감별하여 검출할 수 있는 프라이머 세트와 프라이머 키트 및 이를 이용한 각막염 유발균 검출 방법을 제공한다. 지금까지의 진균성 및 아메바성 각막염 진단에 장시간 소요되었으나 본 발명은 신속하게 감염여부를 확인할 수 있으며, 여러 균을 동시에 검출할 수 있고, 진단의 정확성이 높아 조기에 적절한 치료를 가능하게 한다.

Description

진균성 및 아메바성 각막염의 원인체를 동시에 검출할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트 및 이를 이용한 각막염 유발균 검출 방법{Multiplex PCR primers to simultaneously detect the causal body of fungal and amoebic keratitis and method of use thereof}
본 발명은 각막염 환자의 신속하고 정확한 치료와 진단을 위해 각막염 원인체를 검출하기 위한 것으로, 진균성 및 아메바성 각막염의 원인체를 동시에 검출할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 프라이머에 관한 것이다. 더욱 자세하게는 아스퍼질러스(Aspergillus sp.)속(genus), 푸사리움(Fusarium sp.)속, 칸디다(Candida sp.)속 진균 (fungi) 및 가시아메바(Acanthamoeba sp.)속 원충(protozoa)을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 다중중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 프라이머 세트와 프라이머 키트 및 이를 이용한 각막염 유발균 검출 방법에 대한 것이다.
최근 전 세계적으로 바이러스성 및 의원성 (iatrogenic) 면역 결핍, 인체 삽입 장치의 발달, 콘택트렌즈의 광범위한 사용, 고령화로 인한 노인 인구의 증가 등으로 인해 진균성 (fungal keratitis, keratomycosis) 및 아메바성 각막염 (amoebic keratitis)의 발생이 증가하고 있는 추세이다.
진균성 각막염은 조기에 적절한 치료가 이루어지지 않으면 염증반응과 각막 기질괴사가 진행되어 각막천공이나 안내염 등의 심각한 합병증을 남길 수 있고 각막염후 초래된 각막반흔은 치유 후에도 실명과 시력저하의 주요한 원인이 되고 있다.
각막에 진균이 감염된 경우 대개는 염증을 동반한 진균성 각막염이 생기지만 경우에 따라서 염증반응을 전혀 동반하지 않는 경우도 있으며 진균은 형태학적으로 사상균과 효모균의 2 가지로 분류된다. 사상균(아스퍼질러스, 푸사리움)의 경우 각막 병소는 경계가 분명하지 않은 깃털모양으로 주로 농촌지역에서 농업에 종사하는 사람에게서 많이 발생하고 효모균 (칸디다)에 의한 감염은 각막병소의 경계가 비교적 선명하고 둥근 모양을 하고 있으며 주로 도시에 있는 사람에서 감염이 발생한다(도 1 참조).
아메바성 각막염은 도 2와 같이 가시아메바의 감염에 의한 것으로 대부분 시력교정용 콘택트렌즈 착용자에게서 호발하지만 최근 시력교정을 위한 드림렌즈 착용으로 인해 어린이들과 미용 목적으로 컬러렌즈를 사용하는 여성에서도 감염이 발생하고 있다. 또한 라식, 라섹과 같은 시력교정수술시 감염도 보고되고 있다.
진균 및 가시아메바 감염의 치료는 빠른 조치를 위해 신속한 진단을 필요로 하지만 초진시 스테로이드 점안제 및 항생제의 부적절한 노출 등으로 인해 감염 초기에 잘못된 진단으로 치료를 하다가 악화되는 경우가 많으며, 또한 진균성 및 아메바성 각막염의 진단은 임상적으로 확립하기가 어려워 각막찰과물(corneal scraping)을 수산화 칼륨 (KOH) 용액으로 처리하여 조직을 녹인 후 현미경으로 직접 검사하거나 병원체의 숫자가 적어 현미경으로 관찰되지 않는 경우, 배양법을 실시하여 병원체의 수를 증가시킨 다음 현미경으로 확인하는 방법을 사용하고 있어 감도가 낮으며, 진단을 내리기까지 대개 1-2주 정도 많은 시간이 소요되기 때문에 조기 진단이 어려워 치료시기를 놓치기 쉬운 실정이다. 따라서 초진시 정확한 감별진단이 매우 중요하지만 국내외적으로 배양 양성률이 매우 낮아 거의 절반의 시료가 음성으로 나타나는 것으로 보고되고 있다.
즉, 진균성 및 아메바성 각막염의 치료는 빠른 조치를 위해 신속한 진단을 필요로 하지만 각막염을 유발할 수 있는 진균이 다양하여 한번에, 그리고 신속 정확하게 감염 진균 및 아메바를 감별할 수 있는 분자생물학적 연구는 현재까지 국내외에서 그 사례를 찾기 어려운 실정이다.
이에 본 발명자들은 여러 각막염 원인체를 짧은 시간내에 동시에 검출할 수 있는 프라이머를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 각막염 원인체 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 각막염 원인체 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 각막염 원인체를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 각막염 원인체 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 각막염 원인체 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 각막염 원인체를 검출하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
달리 규정되지 않는 한, 본 발명에 사용된 기술적 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하는 바와 동일한 의미를 갖고, 다음 문헌에 기재된 바와 부합된다(문헌 : Singleton et al, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed., J. Wiley & Sons, 1994; and Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, 2001).
본 발명에서 프라이머는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 어닐링또는 프라이밍은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명에서 각막염은 우리 눈의 검은자 부위를 덮고 있는 볼록한 부위인 각막(cornea)에 염증이 생겨 통증, 충혈, 시력 감소, 각막 혼탁 등을 초래하는 질환이다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 진균 검출용 제 1프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 푸사리움 속(Fusarium sp.) 진균 검출용 제 2프라이머 쌍, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 칸디다 속(Candida sp.) 진균 검출용 제 3프라이머 쌍 및 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 가시아메바 속(Acanthamoeba sp.) 원충 검출용 제 4프라이머 쌍을 포함하는 각막염 원인체 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 진균은 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 및 아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 푸사리움 속(Fusarium sp.) 진균은 푸사리움 소라니(Fusarium solani) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 칸디다 속(Candida sp.) 진균은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 파라시로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 크루시(Candida krusei) 및 칸디다 그라브라타(Candida glabrata)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 가시아메바 속(Acanthamoeba sp.) 원충은 아칸타아메바 카스텔라니 (Acanthamoeba castellnii), 아칸타아메바 룩두넨시스(Acanthamoeba lugdunensis), 아칸타아메바 폴리파가(Acanthamoeba polypaga), 아칸타아메바 퀴나(Acanthamoeba quina), 아칸타아메바 리소데스(Acanthamoeba rhysodes), 아칸타아메바 트리앵귤라리스(Acanthamoeba triangularis) 및 아칸타아메바 컬버트소니(Acanthamoeba culbertsoni)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
이노신은 분자식 C10H12N4O5, 분자량은 268.23이며, 화학식 1로 표시된다. 히포크산틴을 염기부분에 포함하는 리보뉴클레오시드 tRNA에 포함되어 있다. 아데노신이 아데노신탈아미노효소에 의해 탈아미노화되면서 생성되며, 히포크산틴은 퓨린뉴클레오티드가 인산분해효소의 가인산분해 작용을 받아 생성된다.
[화학식 1]
Figure 112015004224754-pat00001
본 발명에서는 낮은 Tm 값을 가지는 이노신(Inosine)을 프라이머의 염기서열에 넣음으로서, 특정 온도에서 거품구조(bubble like structure)를 형성하게 되고, 그로 인해 프라이머가 비특이적으로 결합되는 것을 차단하여 PCR의 특이성 및 정확도를 극대화시키는 조절자의 역할을 한다.
상기 프라이머 세트는 다중중합효소연쇄반응(multiplex PCR)용인 것을 특징으로 한다.
상기 프라이머 세트는 당업계에 알려진 PCR 방법을 통해 각막염 원인체를 감별할 수 있으나, 바람직하게는 여러 프라이머 세트를 동시에 사용하여 다수의 표적 유전자를 하나의 반응액 안에서 증폭하는 방법인 다중중합효소 연쇄반응을 사용한다. 이 때, 프라이머의 상호작용을 계산하여 프라이머가 다이머를 형성하지 않는 프라이머 조합을 만들어야 하며, 여러 PCR 산물의 크기가 전기영동상에서 충분히 구별될 수 있도록 설계해야 한다.
상기 프라이머 세트는 속(genus)에 따라 특이적이면서 해당 속(genus)이 속하는 종(species)간에는 높은 유사성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 프라이머는 진균 (fungi) 또는 아메바(amoeba)의 게놈 또는 미토콘드리아 DNA 서열중에서 각 속(genus)간에 특이적이고 각 속에 속하는 종(species)간에 잘 보존되어 유사성이 높은 28S rDNA 또는 18S rDNA 부위를 찾아내었으며 이를 바탕으로 각 속(genus)간에는 구분이 되며 각 속에 속하는 다양한 종(species)을 한꺼번에 검출해 낼 수 있도록 프라이머 염기서열을 만들어서 한 번의 반응으로 다양한 종류의 진균과 아메바의 감별을 용이하게 하고자 하였다.
본 발명의 프라이머 세트는 추가적인 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)의 성공 유무를 확인하기 위한 표시자(marker)로서의 프라이머가 포함될 수 있다. 본 발명에서는 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머를 사용하였다. 증폭산물의 크기인 766 bp에 밴드가 나타나면 중합효소반응이 성공적으로 수행되었음을 의미하며 표시자가 나온 상태에서 다른 PCR 산물이 검출되지 않은 경우에는 음성으로 판정하는 것이 바람직하다.
상기 다중 중합효소연쇄반응의 성공 유무를 확인하기 위한 표시자의 경우 본 발명에서는 사람의 눈에서 감염을 일으키지 않으며 주로 여성 생식기에 존재하는 기생충으로 알려진 질편모충(Trichomonas vaginalis)의 DNA를 사용하였으나 사람의 눈에서 확인되지 않는 다른 미생물의 DNA를 사용할 수 있고, 다중 중합효소연쇄반응 자체의 성공 여부만을 확인하기 위한 목적으로 사용된 것이기 때문에 특별히 제한하지 않으며 당업계에 공지된 다양한 DNA를 통해 이루어질 수 있으나 다른 진균 및 가시아메바의 PCR 산물과 구분하기 위해 푸사리움 진균에 대한 PCR 증폭 산물의 크기인 255 bp 보다 작거나 가시아메바 PCR 증폭 산물인 517 bp보다 100 bp 이상 차이가 나도록 프라이머를 제작하는 것이 바람직하다. 상기의 방법으로 설계한 프라이머는 서열번호 9 및 10에 나타내었다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 진균 검출용 제 1프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 푸사리움 속(Fusarium sp.) 진균 검출용 제 2프라이머 쌍, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 칸디다 속(Candida sp.) 진균 검출용 제 3프라이머 쌍 및 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 가시아메바 속(Acanthamoeba sp.) 원충 검출용 제 4프라이머 쌍을 포함하는 각막염 원인체 검출용 키트를 제공한다.
상기 각막염 원인체는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans), 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 파라시로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 크루시(Candida krusei), 칸디다 그라브라타(Candida glabrata), 아칸타아메바 카스텔라니 (Acanthamoeba castellnii), 아칸타아메바 룩두넨시스(Acanthamoeba lugdunensis), 아칸타아메바 폴리파가(Acanthamoeba polypaga), 아칸타아메바 퀴나(Acanthamoeba quina), 아칸타아메바 리소데스(Acanthamoeba rhysodes), 아칸타아메바 트리앵귤라리스(Acanthamoeba triangularis) 및 아칸타아메바 컬버트소니(Acanthamoeba culbertsoni)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 키트는 다중중합효소연쇄반응(multiplex PCR)을 수행하여 각막염 원인체를 검출하는 것을 특징으로 한다.
상기 키트는 당업계에 알려진 PCR 방법을 통해 각막염 원인체를 감별할 수 있으나, 바람직하게는 여러 프라이머 세트를 동시에 사용하여 다수의 표적 유전자를 하나의 반응액 안에서 증폭하는 방법인 다중중합효소 연쇄반응을 사용한다.
상기 키트는 여러 각막염 원인체에 의해 중복 감염된 환자의 검체로부터 여러 각막염 원인체를 동시에 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예 3에서는 각막염 원인체와 프라이머를 모두 넣고 다중중합효소연쇄반응을 실시하였으며, 그 결과 여러 각막염 원인체를 동시에 검출하는 것이 가능한 것으로 나타났다.
본 발명의 각막염 원인체 검출용 키트는 추가적으로 눈에서 발견되지 않는 DNA 및 이를 검출하기 위한 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시예에서는 다중 중합효소연쇄반응의 성공 유무를 확인하기 위한 표시자의 경우 본 발명에서는 사람의 눈에서 감염을 일으키지 않으며 주로 여성 생식기에 존재하는 기생충으로 알려진 질편모충(Trichomonasvaginalis)의 DNA를 사용하였으나 사람의 눈에서 확인되지 않는 다른 미생물의 DNA를 사용할 수 있고, 다중 중합효소연쇄반응 자체의 성공 여부만을 확인하기 위한 목적으로 사용된 것이기 때문에 특별히 제한하지 않으며 당업계에 공지된 다양한 DNA를 통해 이루어질 수 있으나 다른 진균 및 가시아메바의 PCR 산물과 구분하기 위해 푸사리움 진균에 대한 PCR 증폭 산물의 크기인 255 bp 보다 작거나 가시아메바 PCR 증폭 산물인 517 bp보다 100 bp 이상 차이가 나도록 프라이머를 제작하는 것이 바람직하다. 상기의 방법으로 설계한 프라이머는 서열번호 9 및 10에 나타내었다.
본 발명은 a) 각막염 원인체에 감염된 환자의 시료를 준비하는 단계 ; b) a)단계에서 준비한 시료를 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응을 실시하는 단계; c) b)단계에서 수득된 PCR 산물로 전기영동을 실시하는 단계; 및 d) c)단계의 전기영동에서 나타난 PCR 산물의 크기에 따라 각막염 원인체를 판별하는 단계로 이루어지는 각막염 원인체 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 다중중합효소연쇄반응을 이용한 핵산증폭방법을 통해 하기의 진균 또는 아메바에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 병원체 검출 방법으로서, 먼저 (i) 환자의 안구 세척액, 각막찰과검체로부터 DNA를 추출하는 단계, (ii) 상기 추출한 시료의 DNA와 서열번호1에서 서열번호8까지 8개의 프라이머를 한꺼번에 첨가하여 다중 중합효소연쇄반응 (multiplex PCR)을 수행하여 핵산 증폭반응을 행하는 단계; (iii) 상기 PCR 산물을 전기영동하여 각각의 병원체에 해당되는 증폭 산물의 크기를 확인함으로써 각막찰과검체에 존재하는 진균 및 아메바를 동시에 감별하는 단계를 거친다.
본 발명의 검출방법은 진균 (fungi) 또는 아메바 (amoeba)에 감염되었을 것으로 의심되는 검체(specimens)에 적용할 수 있다. 본 발명의 검체는 예를 들어 각막찰과표본(corneal scrapings), 안구를 세척한 식염수 용액, 콘택트렌즈 보관용기의 보존액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.
상기 검체로부터 DNA를 추출하는 것은 다양한 방법에 의해 DNA를 추출할 수 있고, 이는 추출한 DNA를 분석하여 감염 진균 및 아메바의 종을 판별하기 위한 것이기 때문에 상기 검체에서 어떠한 방법으로 추출하는지는 특별히 제한하지 않으며 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응은 다중중합효소연쇄반응(multiplex PCR)인 것을 특징으로 한다.
상기 검출 방법에는 당업계에 알려진 PCR 방법을 통해 각막염 원인체를 감별할 수 있으나, 바람직하게는 여러 프라이머 세트를 동시에 사용하여 다수의 표적 유전자를 하나의 반응액 안에서 증폭하는 방법인 다중중합효소 연쇄반응을 사용한다.
상기 각막염 원인체 검출 방법의 b)단계에서 눈에서 발견되지 않는 DNA와 이를 검출하기 위한 프라이머를 추가적으로 포함할 수 있다. 이는 다중 중합효소연쇄반응 자체의 성공 여부만을 확인하기 위한 목적으로 사용된 것이기 때문에 특별히 제한하지 않으며 당업계에 공지된 다양한 DNA를 통해 이루어질 수 있다.
상기 검출하고자 하는 각막염 원인체는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans), 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 파라시로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 크루시(Candida krusei), 칸디다 그라브라타(Candida glabrata), 아칸타아메바 카스텔라니 (Acanthamoeba castellnii), 아칸타아메바 룩두넨시스(Acanthamoeba lugdunensis), 아칸타아메바 폴리파가(Acanthamoeba polypaga), 아칸타아메바 퀴나(Acanthamoeba quina), 아칸타아메바 리소데스(Acanthamoeba rhysodes), 아칸타아메바 트리앵귤라리스(Acanthamoeba triangularis) 및 아칸타아메바 컬버트소니(Acanthamoeba culbertsoni)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 각막염의 원인체는 하기 방법으로 판별하는 것을 특징으로 한다;
a) PCR 산물이 335 bp(base pair) 크기이면, 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 진균으로 판별하고, b) PCR 산물이 252 bp 크기이면, 푸사리움 속(Fusarium sp.) 진균으로 판별하고, c) PCR 산물이 414 bp 크기이면, 칸디다 속(Candida sp.) 진균으로 판별하고, d) PCR 산물이 517 bp 크기이면, 가시아메바 속(Acanthamoeba sp.) 균으로 판별한다.
상기 각막염 원인체 검출 방법은 높은 민감도를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예 4에서는 균을 일정 비율로 희석하여 검출 민감도를 측정하였다. 그 결과, 푸사리움(Fusarium sp.) 진균의 DNA는 5 pg (5 × 10-12 g), 아스퍼질러스 (Aspergillus sp.)는 10 pg (1 × 10-11 g),칸디다 (Candida sp.)는 25 pg (2.5 × 10-11 g),가시아메바(Acanthamoeba sp.)는 10 pg (1 × 10-11 g)의 DNA만 반응액 안에 들어 있어도 검출이 될 정도로 적은 양에서도 검출이 가능하였다.
상기 각막염 환자의 시료는 환자의 안구 세척액 또는 각막찰과검체인 것을 특징으로 한다.
지금까지의 진균성 및 아메바성 각막염 진단에 2주 정도 시간이 소요되었으나 본 발명의 상기 각막염 원인체 검출 방법은 진단 시간이 약 4-5 시간 정도 소요되어 신속하게 감염여부를 확인할 수 있으며, 진단의 정확성이 높아 조기에 적절한 치료를 가능하게 하는 특징이 있다.
따라서 본 발명은 진균성 및 아메바성 각막염의 원인체를 동시에 검출할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트와 프라이머 키트 및 이를 이용한 각막염 유발 진균 및 원충의 검출 방법을 제공한다. 지금까지의 진균성 및 아메바성 각막염 진단에 장시간 소요되었으나 본 발명은 신속하게 감염여부를 확인할 수 있으며, 여러 균을 동시에 검출할 수 있고, 진단의 정확성이 높아 조기에 적절한 치료를 가능하게 하는 효과가 있다. 또한, 불필요한 항생제, 스테로이드제 처치에 따른 의료비용과 부적절한 치료에 의한 환자의 고통을 줄일 수 있으며, 세포 독성이 강한 약제의 사용을 줄일 수 있어 각막 실질 손상 및 시력저하와 같은 합병증을 막는 효과가 있다.
도 1은 진균성 각막염에 감염된 안구를 나타낸 사진이다.
도 2는 아메바성 각막염에 감염된 안구를 나타낸 사진이다.
도 3은 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 제작에 기반이 된 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.)에 속하는 진균들의 18S rDNA 상의 유전자 배열 및 종 상호간의 유사성을 나타내는 모식도이다.
도 4는 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 제작에 기반이 된 푸사리움 속(Fusarium sp.)에 속하는 진균들의 28S rDNA 상의 유전자 배열 및 종 상호간의 유사성을 나타내고 있는 DNA 부위의 모식도이다.
도 5는 서열번호 5과 서열번호 6의 프라이머 제작에 기반이 된 칸디다 속 (Candida sp.) 에 속하는 진균들의 18S rDNA 상의 유전자 배열 및 종 상호간의 유사성을 나타내고 있는 DNA 부위의 모식도이다.
도 6은 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머 제작에 기반이 된 가사아메바 속 (Acanthamoeba sp.)에 속하는 가시아메바들의 18S rDNA 상의 유전자 배열 및 종 상호간의 유사성을 나타내고 있는 DNA 부위의 모식도이다.
도 7은 아스퍼질러스 진균을 감별 할 수 있는 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 총 12 종의 진균 및 아메바 DNA에 대해 중합효소연쇄반응을 실시하고 PCR 증폭산물을 전기영동 방법으로 한천겔 상에서 확인한 것을 보여주는 사진이다(M;DNA marker(100bp ladder), Af;아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), Ani;아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans), An;아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), Fs;푸사리움 소라니(Fusarium solani), Fo;푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), Ca; (Candida albicans), Cp;칸디다 파라시로시스(Candida parapsilosis), Ck;칸디다 크루시(Candida krusei), Cg;칸디다 그라브라타(Candida glabrata), Ct;칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), C;PCR control 트리코모나스 바지날리스 (Trichomonas vaginalis), Ac;가시아메바 카스텔라니 (Acanthamoeba castellnii), N;negative control(증류수)).
도 8은 푸사리움 진균을 감별 할 수 있는 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 총 12 종의 진균 및 아메바 DNA에 대해 중합효소연쇄반응을 실시하고 PCR 증폭산물을 전기영동 방법으로 한천겔 상에서 확인한 것을 보여주는 사진이다(M;DNA marker(100bp ladder), Fs;푸사리움 소라니(Fusarium solani), Fo;푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), Ca; (Candida albicans), Af;아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), Ani;아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans), An;아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), Cp;칸디다 파라시로시스(Candida parapsilosis), Ck;칸디다 크루시(Candida krusei), Cg;칸디다 그라브라타(Candida glabrata), Ct;칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), C;PCR control 트리코모나스 바지날리스 (Trichomonas vaginalis), Ac;가시아메바 카스텔라니 (Acanthamoeba castellnii), N;negative control(증류수)).
도 9는 칸디다 진균을 감별 할 수 있는 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 총 12 종의 진균 및 아메바 DNA에 대해 중합효소연쇄반응을 실시하고 PCR 증폭산물을 전기영동 방법으로 한천겔 상에서 확인한 것을 보여주는 사진이다(M;DNA marker(100bp ladder), Ca; (Candida albicans), Cp;칸디다 파라시로시스(Candida parapsilosis), Ck;칸디다 크루시(Candida krusei), Cg;칸디다 그라브라타(Candida glabrata), Ct;칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), Fs;푸사리움 소라니(Fusarium solani), Fo;푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), Af;아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), Ani;아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans), An;아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), C;PCR control 트리코모나스 바지날리스 (Trichomonas vaginalis), Ac;가시아메바 카스텔라니 (Acanthamoeba castellnii), N;negative control(증류수)).
도 10은 가시아메바를 감별 할 수 있는 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 총 5 종의 진균 및 아메바 DNA에 대해 중합효소연쇄반응을 실시하고 PCR 증폭산물을 전기영동 방법으로 한천겔 상에서 확인한 것을 보여주는 사진이다(M;DNA marker(100bp ladder)).
도 11은 본 발명의 특이도 검사에 관한 도면이다.
도 12는 진균성 및 아메바성 각막염과 관계없는 사람의 각막 절편에서 추출한 인체 DNA (Cornea), 헤르페스 바이러스 유형 I(Herpes simplex virus type I), Chlamydia의 DNA에 대해 본 발명의 특이도를 확인한 도면이다(M;DNA marker(100bp ladder)).
도 13은 본 발명의 민감도를 연속적으로 희석한 각 진균과 아메바의 DNA를 이용하여 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 실제 환자의 검체를 가지고 본 발명의 유효성을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
안과 각막찰과 검체에서 감별이 가능한 진균 및 아메바 선별
표 1에 사람에게 각막염을 유발할 수 있는 진균과 아메바의 속(genus)과 종(species)을 구분하여 아메바를 나타내었다.
속 (genus) 종 (species) NCCP 번호 구입처
푸사리움
Fusarium sp.		 F. solani 20695 국가병원체자원은행
F. oxysporum 20414 국가병원체자원은행
아스퍼질러스Aspergillus sp. A. fumigatus 22455 국가병원체자원은행
A. niger 20529 국가병원체자원은행
A. nidulans 20430 국가병원체자원은행
칸디다
Candida sp.		 C. albicans 30673 국가병원체자원은행
C. parapsilosis 30732 국가병원체자원은행
C. tropicalis 30262 국가병원체자원은행
C. krusei 30755 국가병원체자원은행
C. glabrata 30939 국가병원체자원은행
속 (genus) 종 (species) ATCC 번호 구입처
가시아메바
Acanthamoeba		 A. castellnii 30011 The global bioresource center
A. lugdunensis 50240 The global bioresource center
A. polypaga 30871 The global bioresource center
A. quina 50241 The global bioresource center
A. rhysodes 30973 The global bioresource center
A. triangularis 50254 The global bioresource center
A. culbertsoni 30171 The global bioresource center
<실시예 1-1>
아스퍼질러스 속 진균을 검출할 수 있는 프라이머 제작
상기 표 1의 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)에 속하는 진균들을 검출할 수 있는 프라이머를 제작하기 위하여, 아스퍼질러스 속 진균들의 18S rRNA를 상호 비교하였다.
도 3은 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.)에 속하는 진균들의 18S rDNA 상의 유전자 배열 및 종(species) 상호간의 유사성을 나타내고 있는 DNA 부위의 모식도이고, 여기에서 도시된 바와 같이 같은 유전자 중에서도 종간에 잘 보존되어 유사성이 매우 높은 부위를 이용하였다. 특별히 그 중에서 다른 속(genus)에 속하는 진균(푸사리움 속의 경우 252 bp, 칸디다 속은 414 bp)들과 구분될 수 있는 335 bp 크기의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있는 부위에 속하는 염기서열(박스 및 화살표로 포시된 부위)을 찾아 서열번호 1과 2에 해당하는 프라이머를 제작하였다.
상기의 방법으로 설계한 서열번호 1과 2의 프라이머 염기서열과 프라이머 결합위치를 아래 표 2에 나타내었다. 또한 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger),아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans)진균의 서열번호 1과 2의 DNA 결합부위는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)를 기준으로 해당부위를 나타내었다.
진균 속 (genus) 서열번호 염기서열 결합위치
아스퍼질러스
Aspergillus sp.		 1 5'-GACTATCGGCTCAAGCCGATGIIIIIGCGCGGCA-3' 1347-1380
2 5'-TCCGGCTCTGGGGAGTCGIIIIIAACTCTCCTGAG-3' 1647-1681
* 상기 서열정보 1과 2에서 는 이노신(Inosine : I)을 의미하는 것으로 정의한다. 이는 낮은 Tm 값을 가지는 이노신(inosine)을 염기서열에 넣음으로서, 특정 온도에서 거품구조(bubble like structure)를 형성하게 되고, 그로 인해 프라이머가 비특이적으로 결합되는 것을 차단하여 PCR의 특이성(정확도)을 극대화시키는 조절자의 역할을 한다.
<실시예 1-2>
푸사리움 속 진균을 검출할 수 있는 프라이머 제작
상기 표 1의 푸사리움 속(Fusarium sp.)에 속하는 진균들을 검출할 수 있는 프라이머를 제작하기 위하여, 푸사리움 속 진균들의 28S rRNA를 상호 비교하였다.
도 4는 푸사리움 속(Fusarium sp.)에 속하는 진균들의 28S rDNA 상의 유전자 배열 및 종 상호간의 유사성을 나타내고 있는 DNA 부위의 모식도이고, 여기에서 도시된 바와 같이 같은 유전자 중에서도 종간에 잘 보존되어 유사성이 매우 높은 부위를 이용하였다. 특별히 그 중에서 다른 속(genus)에 속하는 진균 (아스퍼질러스의 경우 335 bp, 칸디다 속은 414 bp)들과 구분될 수 있는 252 bp 크기의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있는 부위에 속하는 염기서열(박스 및 화살표로 포시된 부위)을 찾아 서열번호 3과 4에 해당하는 프라이머를 제작하였다.
상기의 방법으로 설계한 서열번호 3과 4의 프라이머 염기서열과 프라이머 결합위치를 아래 표 3에 나타내었다. 또한 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)진균의 서열번호 3과 4의 프라이머 DNA 결합부위는 푸사리움 소라니(Fusarium solani)를 기준으로 해당부위를 나타내었다.
진균 속(genus) 서열번호 염기서열 결합위치
푸사리움
Fusarium sp.		 3 5AGAGCCCCGTCTGGTTGGACACIIIIICTCTGTAAA-3 147-182
4 5GGGGAGAACCCCGGATIIIIIACCAAGCCCAAG-3 366-398
* 상기 서열정보 1과 2에서 는 이노신(Inosine : I)을 의미하는 것으로 정의한다. 이는 낮은 Tm 값을 가지는 이노신(inosine)을 염기서열에 넣음으로서, 특정 온도에서 거품구조(bubble like structure)를 형성하게 되고, 그로 인해 프라이머가 비특이적으로 결합되는 것을 차단하여 PCR의 특이성(정확도)을 극대화시키는 조절자의 역할을 한다.
<실시예 1-3>
칸디다 속 진균을 검출할 수 있는 프라이머 제작
상기 표 1의 칸디다 속(Candida sp.)에 속하는 진균들을 검출할 수 있는 프라이머를 제작하기 위하여, 칸디다 속 진균들의 18S rRNA를 상호 비교하였다.
도 5는 칸디다 속 (Candida sp.) 에 속하는 진균들의 18S rDNA 상의 유전자 배열 및 종 상호간의 유사성을 나타내고 있는 DNA 부위의 모식도이고, 여기에서 도시된 바와 같이 같은 유전자 중에서도 종간에 잘 보존되어 유사성이 매우 높은 부위를 이용하였다. 특별히 그 중에서 다른 속(genus)에 속하는 진균 (푸사리움의 경우 252 bp, 아스퍼질러스의 경우 335 bp)들과 구분될 수 있는 414 bp 크기의 PCR 산물을 얻을 수 있는 부위에 속하는 염기서열(박스 및 화살표로 포시된 부위)을 찾아 서열번호 5와 6에 해당하는 프라이머를 제작하였다.
상기의 방법으로 설계한 서열번호 5과 6의 프라이머 염기서열과 프라이머 결합위치를 아래 표 4에 나타내었다. 또한 칸디다 파라시로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 크루시(Candida krusei), 칸디다 그라브라타(Candida glabrata)진균의 서열번호 5과 6의 프라이머 DNA 결합부위는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 기준으로 해당부위를 나타내었다.
진균 속 (genus) 서열번호 염기서열 결합위치
칸디다
Candida sp.		 5 5-GGACGTTTTCATTAATCAAGAAIIIIIGTTAGGGG-3 833-867
6 5-AGCAAATGCTAGCAGCAIIIIITAGTAGGTTAAGG-3 1212-1246
* 상기 서열정보 1과 2에서 는 이노신(Inosine : I)을 의미하는 것으로 정의한다. 이는 낮은 Tm 값을 가지는 이노신(inosine)을 염기서열에 넣음으로서, 특정 온도에서 거품구조(bubble like structure)를 형성하게 되고, 그로 인해 프라이머가 비특이적으로 결합되는 것을 차단하여 PCR의 특이성(정확도)을 극대화시키는 조절자의 역할을 한다.
<실시예 1-4>
가시아메바 속 진균을 검출할 수 있는 프라이머 제작
상기 표 1의 가시아메바 속(Acanthamoeaba sp.)에 속하는 진균들을 검출할 수 있는 프라이머를 제작하기 위하여, 가시아메바 속 진균들의 18S rRNA를 상호 비교하였다.
도 6은 가시아메바 속 (Acanthamoeba sp.)에 속하는 아메바들의 18S rDNA 상의 유전자 배열 및 종 상호간의 유사성을 나타내고 있는 DNA 부위의 모식도이고, 여기에서 도시된 바와 같이 같은 유전자 중에서도 종간에 잘 보존되어 유사성이 매우 높은 부위를 이용하였다. 특별히 그 중에서 다른 진균 (푸사리움의 경우 252 bp, 아스퍼질러스의 경우 335 bp, 칸디다 414 bp)들과 구분될 수 있는 517 bp 크기의 PCR 산물을 얻을 수 있는 부위에 속하는 염기서열(박스 및 화살표로 포시된 부위)을 찾아 서열번호 7와 8에 해당하는 프라이머를 제작하였다.
상기의 방법으로 설계한 서열번호 7과 8의 프라이머 염기서열과 프라이머 결합위치를 아래 표 5에 나타내었다. 또한 아칸타아메바 카스텔라니 (Acanthamoeba castellnii), 아칸타아메바 룩두넨시스(Acanthamoeba lugdunensis), 아칸타아메바 폴리파가(Acanthamoeba polypaga), 아칸타아메바 퀴나(Acanthamoeba quina), 아칸타아메바 리소데스(Acanthamoeba rhysodes), 아칸타아메바 트리앵귤라리스(Acanthamoeba triangularis), 아칸타아메바 컬버트소니(Acanthamoeba culbertsoni)의 서열번호 7과 8의 프라이머 DNA 결합부위는 아칸타아메바 카스텔라니(Acanthamoeba castellnii)를 기준으로 해당부위를 나타내었다.
아메바 속 (genus) 서열번호 염기서열 결합위치
가시아메바
Acanthamoeba		 7 5'-TGCGGGGTGGTGTCGCTTIIIIICGACGTCAT-3' 1704-1735
8 5'-CAATCGACTTCGCCGCCAAAIIIIIAGACCTCAC-3' 2187-2220
* 상기 서열정보 1과 2에서 는 이노신(Inosine : I)을 의미하는 것으로 정의한다. 이는 낮은 Tm 값을 가지는 이노신(inosine)을 염기서열에 넣음으로서, 특정 온도에서 거품구조(bubble like structure)를 형성하게 되고, 그로 인해 프라이머가 비특이적으로 결합되는 것을 차단하여 PCR의 특이성(정확도)을 극대화시키는 조절자의 역할을 한다.
<실시예 1-5>
대조군 역할의 프라이머 제작
서열번호 9와 10은 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)의 성공 유무를 확인하기 위한 표시자(marker)로서 증폭산물의 크기가 766 bp 인 경우 중합효소반응이 성공적으로 수행되었음을 나타내며 표시자가 나온 상태에서 다른 PCR 산물이 검출되지 않은 경우에는 음성으로 판정하였다.
상기 다중 중합효소연쇄반응의 성공 유무를 확인하기 위한 표시자의 경우 본 발명에서는 사람의 눈에서 감염을 일으키지 않으며 주로 여성 생식기에 존재하는 기생충으로 알려진 질편모충(Trichomonas vaginalis)의 DNA를 사용하였다. 상기의 방법으로 설계한 서열번호 9과 10의 프라이머 염기서열과 프라이머 결합위치를 아래 표 6에 나타내었다.
원충 속(genus) 서열번호 염기서열 결합위치
트리코모나스
Trichomonas		 9 5'-CGTCAAATTGTATTGGAGAGIIIIIGAGTTAGGTCAG-3' 1152 - 1188
10 5'-GCCGTCTTCAAGTATGCCCCIIIIITTACGCTTGG-3' 1883 - 1917
* 상기 서열정보 1과 2에서 는 이노신(Inosine : I)을 의미하는 것으로 정의한다. 이는 낮은 Tm 값을 가지는 이노신(inosine)을 염기서열에 넣음으로서, 특정 온도에서 거품구조(bubble like structure)를 형성하게 되고, 그로 인해 프라이머가 비특이적으로 결합되는 것을 차단하여 PCR의 특이성(정확도)을 극대화시키는 조절자의 역할을 한다.
<실시예 2>
진균 및 가시아메바의 DNA 추출과 다중 중합효소연쇄반응 (multiplex PCR)
상기 표 1에 해당하는 진균과 가시아메바의 DNA는 독일 QIAGEN사의 DNeasy tissue kit를 사용하여 추출하였으며 시행에 사용한 PCR용 DNA 중합 효소(Taq DNA polymerase)는 Takara 사에서 판매하는 Takara rTaq DNA 중합효소(Takara, 일본)를 사용하였으며 다중 중합효소반응의 반응용액은 최종 부피가 20 가 되도록 하여 실시하였다.
상기 실시예 1에 따른 서열번호 1에서 10까지 10개의 프라이머를 동시에 사용하여 하기의 표 6과 같은 조건의 방법으로 다중 중합효소 반응 (multiplex PCR)을 DNA Engine (MJ Research사, 미국)에서 시행하였다.
다중 중합효소반응(multiplex PCR)이 완료되면 PCR 반응액의 DNA 염색을 위해 DNA 염색시약인 브롬화 에티디움(ethidium bromide)이 첨가된 1.5% 한천겔 (agarose gel)에서 전기영동을 실시하고, 해당 크기의 PCR산물의 유무를 확인하여 검체내 진균 및 아메바의 종 감별을 실시하였다.
반응 조성
(최종 부피가 20 인 경우)		 반응 조건
10 X buffer 2.0
2mM dNTP 1.6
Primer mixture 2.0
Taq polymerase 1.0
정제 DNA 2.0
(0.5 ng)
멸균 증류수 11.4 		온도, 시간 Cycle
94, 5 분 1
94, 30 초 35
60, 45 초
72, 45 초
72, 5 분
4, 무한대 1
상기 실시예 1-1에서 나타난 아스퍼질러스 속의 진균을 감별할 수 있는 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 쌍과 실시예 2에서 제시된 방법으로 각막염을 유발하는 상기 표 1의 진균과 아메바의 DNA를 추출한 후 다중 중합효소 반응을 실시하여 검출 특이성을 확인한 결과, 도 7 에서 나타난 바와 같이 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.)의 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans)에 대해서만 특이적으로 335 bp 의 PCR 산물이 증폭되는 것을 확인하였다.
또한, 상기 실시예 1-2에서 나타난 푸사리움 속의 진균을 감별할 수 있는 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머와 실시예 2에서 제시된 방법으로 각막염을 유발하는 상기 표 1의 진균과 아메바의 DNA를 추출한 후 다중 중합효소 반응을 실시하여 검출 특이성을 확인한 결과, 도 8 에서 나타난 바와 같이 푸사리움 속 (Fusarium sp.)에 속하는 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)에 대해서만 특이적으로 252 bp 의 PCR 산물이 증폭되는 것을 확인하였다.
또한, 상기 실시예 1-3에서 나타난 칸디다 속의 진균을 감별할 수 있는 서열번호 5과 서열번호 6의 프라이머와 실시예 2에서 제시된 방법으로 각막염을 유발하는 상기 표 1의 진균과 아메바의 DNA를 추출한 후 다중 중합효소 반응을 실시하여 검출 특이성을 확인한 결과, 도 9 에서 나타난 바와 같이 칸디다 속(Candida sp.)에 속하는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 파라시로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 크루시(Candida krusei),칸디다 그라브라타(Candida glabrata)에 대해서만 특이적으로 414 bp 의 PCR 산물이 증폭되는 것을 확인하였다.
또한, 상기 실시예 1-4에서 나타난 가시아메바 속의 아메바를 감별할 수 있는 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머와 실시예 2에서 설명된 방법으로 각막염을 유발하는 상기 표 1의 진균과 아메바의 DNA를 추출한 후 다중 중합효소 반응을 실시하여 검출 특이성을 확인한 결과, 도 10의 A와 B에서 나타난 바와 같이 아칸타아메바 카스텔라니(Acanthamoeba castellnii), 아칸타아메바 룩두넨시스(Acanthamoeba lugdunensis), 아칸타아메바 폴리파가(Acanthamoeba polypaga), 아칸타아메바 퀴나(Acanthamoeba quina), 아칸타아메바 리소데스(Acanthamoeba rhysodes), 아칸타아메바 트리앵귤라리스(Acanthamoeba triangularis), 아칸타아메바 컬버트소니(Acanthamoeba culbertsoni)에 대해서만 특이적으로 517 bp 의 PCR 산물이 증폭되는 것을 확인하였다.
<실시예 3>
각 프라이머쌍의 진균 검출 특이도 검사
실시예 2에서 실제 검체에서 서열번호 1에서 10까지의 프라이머가 모두 들어가 있을 경우의 다중 중합효소반응의 특이성 여부를 확인하기 위하여 아스퍼질러스 (Aspergillus sp.), 푸사리움 (Fusarium sp.), 칸디다 (Candida sp.) 및 가시아메바 (Acanthamoeba sp.)의 DNA와 반응 여부를 확인하기 위해 대조군으로 사용한 질편모충 DNA로 구성된 모두 5종의 DNA를 첨가한 후 푸사리움 진균을 검출할 수 있는 서열번호 3과 4의 프라이머 쌍 (panel A, lane 1), 아스퍼질러스 진균을 검출할 수 있는 서열번호 1과 2의 프라이머 쌍 (panel A, lane 2), 칸디다 진균을 검출할 수 있는 서열번호 5와 6의 프라이머 쌍 (panel A, lane 3), 가시아메바를 검출할 수 있는 서열번호 7과 8의 프라이머 쌍 (panel A, lane 4), PCR 반응 성공여부를 확인할 수 있는 대조군 DNA에 대한 서열번호 9와 10의 프라이머 쌍 (panel A, lane 5) 만을 각각 첨가하였다. 그 후 실시간 다중 중합효소반응을 실시하였고, 그 결과 도 11에 나타난 바와 같이, 서열번호 1에서 서열번호 10까지 10 개의 프라이머가 모두 혼합되어 있어도 각 진균과 아메바에 해당되는 PCR 산물이 특이적으로 증폭되는 것을 확인하였다 (panel B).
또한, 상기 실시예 1에서 나타낸 서열번호 1에서 서열번호 10까지 10 개의 프라이머 군을 모두 첨가한 후 진균성 및 아메바성 각막염과 관계없는 헤르페스 유형 I 바이러스 (Herpes simplex virus type I), 크라미디아(Chlamydia), 사람의 각막(cornea) 절편에서 추출한 인체 DNA에 대해 다중 중합효소연쇄반응을 실시하여 특이도를 확인한 결과 도 12에 나타난 바와 같이 상기 DNA에서는 중합효소 연쇄반응이 일어나지 않으며 진균 및 아메바 DNA에서만 특이적으로 반응이 일어나는 것을 확인하였다
<실시예 4>
각 프라이머쌍의 진균 검출 민감도 검사
다중 중합효소연쇄반응 (multiplex PCR)을 이용한 본 발명에 있어서 상기 아스퍼질러스 (Aspergillus sp.), 푸사리움 (Fusarium sp.),칸디다 (Candida sp.),가시아메바 (Acanthamoeba sp.)DNA에 대한 검출 민감도를 확인하기 위해 DNA를 추출한 후 각각의 DNA를 연속적으로 희석한 다음 상기 실시예 1에서 나타난 서열번호1에서 8까지 8종류의 프라이머를 모두 첨가하고 다중 중합효소연쇄반응을 실시한 결과 도 13에서 나타난 바와 같이 푸사리움(Fusarium sp.) 진균의 DNA는 5 pg (5 × 10-12 g), 아스퍼질러스 (Aspergillus sp.)는 10 pg (1 × 10-11 g),칸디다 (Candida sp.)는 25 pg (2.5 × 10-11 g),가시아메바(Acanthamoeba sp.)는 10 pg (1 × 10-11 g)의 DNA만 반응액 안에 들어 있어도 검출이 되는 것을 확인하였다.
<실시예 5>
실제 안과 내원 환자의 검체를 이용한 다중 중합효소반응의 유효성 검사
본 발명의 유효성을 실제 병원 안과에 내원한 진균성 각막염 의심 환자의 각막찰과 검체 (corneal scraping) 및 안구 세척액을 채취하여 DNA를 추출한 후 상기 실시예 1에서 나타낸 서열번호 1에 10 까지 10개의 프라이머를 모두 첨가한 다음 실시예 2에서 제시한 바와 같은 방법으로 다중 중합효소연쇄반응을 실시하고 PCR 증폭 산물을 전기영동 하였다. 검체는 환자에 대한 사전 정보가 차단된 상태에서 암맹테스트 (blind test) 형태로 실시되었다.
도 14의 A는 환자 1과 2의 각막찰과검체 및 눈 세척액 모두에서 아스퍼질러스 진균(Aspergillus sp.)이 존재하는 경우 검출될 수 있는 335 bp 크기의 PCR 증폭 산물을 확인 할 수 있었으며, 특히 환자1의 각막찰과검체에서 아스퍼질러스 진균과 함께 가시아메바가 중복감염되어 있는 것을 확인 할 수 있었다 (도 14의 패널 A, 3번째 레인). 동일한 환자 1과 환자 2의 검체를 병원 임상병리과에 의뢰하여 약 2 주 경과 후 배양법에 의해 아스퍼질러스 진균의 감염을 확인하였으며 환자1의 각막찰과 검체에 대한 원충배양검사 결과 가시아메바 감염을 확인하였다. 도14의 B는 환자 3의 검체에 대해 동일한 방법으로 실시한 결과로서 전기영동 상에서 다중 중합효소반응이 제대로 수행되었음을 나타내는 766 bp 크기의 PCR 산물만 확인되고 다른 PCR 산물이 확인되지 않아 음성으로 판정되었으며 약 2 주간에 걸친 진균 배양검사 결과에서도 음성임을 확인하였다.
진균성 및 아메바성 각막염 진단에 장시간 소요되었으나 본 발명은 신속하게 감염여부를 확인할 수 있으며, 여러 진균 또는 원충을 동시에 검출할 수 있고, 진단의 정확성이 높아 조기에 적절한 치료를 가능하게 하는 효과가 있어 산업상 이용가능성이 크다.
<110> D, d Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Multiplex PCR primers to simultaneously detect the causal body of fungal and amoebic keratitis and method of use thereof <130> NP14-0111 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer to detect Asperfillus sp. <220> <221> modified_base <222> (22)..(26) <223> n stands for inosine <400> 1 gactatcggc tcaagccgat gnnnnngcgc ggca 34 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer to detect Asperfillus sp. <220> <221> modified_base <222> (19)..(23) <223> n stands for inosine <400> 2 tccggctctg gggagtcgnn nnnaactctc ctgag 35 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer to detect Fusarium sp. <220> <221> modified_base <222> (23)..(27) <223> n stands for inosine <400> 3 agagccccgt ctggttggac acnnnnnctc tgtaaa 36 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer to detect Fusarium sp. <220> <221> modified_base <222> (17)..(21) <223> n stands for inosine <400> 4 ggggagaacc ccggatnnnn naccaagccc aag 33 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer to detect Candida sp. <220> <221> modified_base <222> (23)..(27) <223> n stands for inosine <400> 5 ggacgttttc attaatcaag aannnnngtt agggg 35 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer to detect Candida sp. <220> <221> modified_base <222> (18)..(22) <223> n stands for inosine <400> 6 agcaaatgct agcagcannn nntagtaggt taagg 35 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer to detect Acanthamoeba sp. <220> <221> modified_base <222> (18)..(23) <223> n stands for inosine <400> 7 tgcggggtgg tgtcgcttnn nnncgacgtc at 32 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer to detect Acanthamoeba sp. <220> <221> modified_base <222> (20)..(25) <223> n stands for inosine <400> 8 caatcgactt cgccgccaaa nnnnnagacc tcac 34 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer to detect Trichomonas sp. <220> <221> modified_base <222> (21)..(25) <223> n stands for inosine <400> 9 cgtcaaattg tattggagag nnnnngagtt aggtcag 37 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer to detect Trichomonas sp. <220> <221> modified_base <222> (21)..(25) <223> n stands for inosine <400> 10 gccgtcttca agtatgcccc nnnnnttacg cttgg 35

Claims (16)

  1. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 진균 검출용 제 1프라이머 쌍;
    서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 푸사리움 속(Fusarium sp.) 진균 검출용 제 2프라이머 쌍;
    서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 칸디다 속(Candida sp.) 진균 검출용 제 3프라이머 쌍; 및
    서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 가시아메바 속(Acanthamoeba sp.) 균 검출용 제 4프라이머 쌍을 포함하는 각막염 원인체 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 진균은 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 및 아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 각막염 원인체 검출용 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 푸사리움 속(Fusarium sp.) 진균은 푸사리움 소라니(Fusarium solani) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 각막염 원인체 검출용 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 칸디다 속(Candida sp.) 진균은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 파라시로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 크루시(Candida krusei) 및 칸디다 그라브라타(Candida glabrata)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 각막염 원인체 검출용 프라이머 세트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 가시아메바 속(Acanthamoeba sp.) 균은 아칸타아메바 카스텔라니 (Acanthamoeba castellnii), 아칸타아메바 룩두넨시스(Acanthamoeba lugdunensis), 아칸타아메바 폴리파가(Acanthamoeba polypaga), 아칸타아메바 퀴나(Acanthamoeba quina), 아칸타아메바 리소데스(Acanthamoeba rhysodes), 아칸타아메바 트리앵귤라리스(Acanthamoeba triangularis) 및 아칸타아메바 컬버트소니(Acanthamoeba culbertsoni)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 각막염 원인체 검출용 프라이머 세트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 다중중합효소연쇄반응(multiplex PCR)용인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  7. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 진균 검출용 제 1프라이머 쌍;
    서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 푸사리움 속(Fusarium sp.) 진균 검출용 제 2프라이머 쌍;
    서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 칸디다 속(Candida sp.) 진균 검출용 제 3프라이머 쌍; 및
    서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 가시아메바 속(Acanthamoeba sp.) 균 검출용 제 4프라이머 쌍을 포함하는 각막염 원인체 검출용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 각막염 원인체는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans), 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 파라시로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 크루시(Candida krusei), 칸디다 그라브라타(Candida glabrata), 아칸타아메바 카스텔라니 (Acanthamoeba castellnii), 아칸타아메바 룩두넨시스(Acanthamoeba lugdunensis), 아칸타아메바 폴리파가(Acanthamoeba polypaga), 아칸타아메바 퀴나(Acanthamoeba quina), 아칸타아메바 리소데스(Acanthamoeba rhysodes), 아칸타아메바 트리앵귤라리스(Acanthamoeba triangularis) 및 아칸타아메바 컬버트소니(Acanthamoeba culbertsoni)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 각막염 원인체 검출용 키트.
  9. 제7항에 있어서, 상기 키트는 다중중합효소연쇄반응(multiplex PCR)을 수행하여 각막염 원인체를 검출하는 것을 특징으로 하는 각막염 원인체 검출용 키트.
  10. 제7항에 있어서, 상기 키트는 여러 각막염 원인체에 의해 중복 감염된 환자의 검체로부터 여러 각막염 원인체를 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 각막염 원인체 검출용 키트.
  11. a) 인체에서 분리된, 각막염 원인체에 감염된 환자의 검체로부터 DNA를 추출하는 단계 ;
    b) a)단계에서 추출한 DNA를 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하는 단계;
    c) b)단계에서 수득된 PCR 산물로 전기영동을 실시하는 단계; 및
    d) c)단계의 전기영동에서 나타난 PCR 산물의 크기에 따라 각막염 원인체를 판별하는 단계를 포함하는 각막염 원인체 검출 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 다중중합효소연쇄반응(multiplex PCR)인 것을 특징으로 하는 각막염 원인체 검출 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 검출하고자 하는 각막염 원인체는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans), 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 파라시로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 크루시(Candida krusei), 칸디다 그라브라타(Candida glabrata), 아칸타아메바 카스텔라니 (Acanthamoeba castellnii), 아칸타아메바 룩두넨시스(Acanthamoeba lugdunensis), 아칸타아메바 폴리파가(Acanthamoeba polypaga), 아칸타아메바 퀴나(Acanthamoeba quina), 아칸타아메바 리소데스(Acanthamoeba rhysodes), 아칸타아메바 트리앵귤라리스(Acanthamoeba triangularis) 및 아칸타아메바 컬버트소니(Acanthamoeba culbertsoni)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 각막염 원인체 검출 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 각막염의 원인체는 하기 방법으로 판별하는 것을 특징으로 하는 각막염 원인체 검출 방법;
    a) PCR 산물이 335 bp(base pair) 크기이면, 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 진균으로 판별하고,
    b) PCR 산물이 252 bp 크기이면, 푸사리움 속(Fusarium sp.) 진균으로 판별하고,
    c) PCR 산물이 414 bp 크기이면, 칸디다 속(Candida sp.) 진균으로 판별하고,
    d) PCR 산물이 517 bp 크기이면, 가시아메바 속(Acanthamoeba sp.) 균으로 판별한다.
  15. 제11항에 있어서, 상기 각막염 원인체 검출 방법은 높은 민감도를 나타내는 것을 특징으로 하는 각막염 원인체 검출 방법.
  16. 제11항에 있어서, 인체에서 분리된, 상기 각막염 원인체에 감염된 환자의 검체는 환자의 안구 세척액 또는 각막찰과검체인 것을 특징으로 하는 각막염 원인체 검출 방법.
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