KR20210097507A - Ipnh 단백질 항체를 포함하는 가시아메바성 각막염의 감별 진단용 조성물 및 이를 이용한 가시아메바성 각막염 진단 키트 - Google Patents

Ipnh 단백질 항체를 포함하는 가시아메바성 각막염의 감별 진단용 조성물 및 이를 이용한 가시아메바성 각막염 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 항체를 포함하는 가시아메바성 각막염의 감별을 진단용 조성물, 및 이를 이용한 가시아메바성 각막염 진단 키트에 관한 것으로, 본 발명의 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질의 항체를 포함하는 조성물은 가시아메바에서 분비되는 IPNH에서만 특이적으로 항원-항체반응을 일으켜 기존의 가시아메바성 각막염 진단방법에 비해 신속하고 정확한 진단 및 각막염의 원인 감별이 가능하고, 상기 조성물을 이용하여 가시아메바성 각막염 진단 키트, 치료제 및 콘텍트렌즈 소독제 제조 등에 활용도가 높을 것으로 기대된다.

Description

IPNH 단백질 항체를 포함하는 가시아메바성 각막염의 감별 진단용 조성물 및 이를 이용한 가시아메바성 각막염 진단 키트{Composition comprising antibody of IPNH protein for diagnosing Acanthamoeba keratitis and diagnosis kit of Acanthamoeba keratitis using the same}
본 발명은 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 항체를 포함하는 가시아메바성 각막염의 감별 진단용 조성물, 및 이를 이용한 가시아메바성 각막염 진단 키트에 관한 것이다.
각막(Cornea)이란 안구 외막의 약 1/6을 차지하며 빛을 굴절시켜주는 주된 막 중의 하나인 안구의 가장 바깥쪽 표면으로서 눈에서 제일 먼저 빛이 통과하고 혈관이 없는 것이 특징이며, 조직학적으로 5~6개의 세포층으로 이루어진 각막상피(corneal epithelium), 세포가 없는 아교질 섬유로 이루어진 보우만층(Bowman's layer), 각막의 90%의 두께를 차지하는 각막기질(Corneal stroma), 두아층(Dua's layer), 3~4층의 세포로 이루어진 데스메막(Descemet's membrane) 및 세포의 수가 정해져 있으며 재생이 극히 제한적인 각막내피(Corneal endothelium) 6개의 층으로 구별된다.
각막은 눈의 맨 앞에 위치함으로써 외상, 감염 및 기타 면역반응에 의한 손상을 많이 입을 수 있고 그 결과 투명한 각막의 특성을 잃게 되어 혼탁이 남게 되거나 신생혈관 등이 생겨서 심각한 시력 상실을 초래할 수 있다. 가장 흔한 각막 질병으로는 각막 찰과상, 각막 이상증, 각막궤양, 각막 신혈관 형성, 후치쓰시 근육이영양증, 각막염, 원추각막 등이 있으며, 각막 질환중 90% 이상을 차지하는 것이 각막에 염증이 발생하는 각막염이다.
인체 각막염은 각막에 세균이나 바이러스가 침임해 염증이 생기는 질환으로 포도상구균 (Staphylococcus sp.), 녹농균 (Pseudomonas sp.), 진균 (Fusarium) 및 가시아메바 (Acanthamoeba sp.) 등에 의해 유발될 수 있는데, 염증 발생 이후 제대로 치료하지 않으면 통증성 궤양을 야기하고 심한 경우 안구 천공이 발생하거나 이로 인해 실명에 이를 수도 있다. 이러한 증상을 막으려면 빠른 시간 내에 각막염의 원인을 찾아내는 것이 중요하다. 각막염 중에서도 가시아메바 감염에 의한 각막염은 충혈, 과잉눈물생성, 이물감, 빛에 노출될 경우 통증 유발 등의 증상을 나타내고 콘텍트렌즈를 착용하는 사람들에게서 보통 발생되지만 세균 및 곰팡이에 의한 각막염과 감별진단이 쉽지 않다.
아메바성 각막염의 진단은 각막염이 발생된 환자의 각막에서 조직검체를 채취하여 검사하는데, 현재 진단방법으로는 현미경 관찰 및 PCR 등의 방법을 통해 진단이 이뤄지기 때문에, 확진을 위해서는 조직 배양이 필요하므로 약 1주일의 진단시간이 필요하다. 이로 인해 조기진단이 어렵고 치료시간도 더욱 길어지고 있는 실정이다. 따라서 신속한 조기 치료를 위하여, 신규한 가시아메바성 각막염 감별진단법이 절실히 필요한 상황이다.
한편, 가시아메바 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 각막염 유발 가시아메바 검출방법(한국 등록특허 제 10-1308516호) 등이 연구되고 있으나 이는 프라이머 세트를 이용하여 가시아메바를 검출 하는 방법일 뿐, 가시아메바가 분비하는 특정 단백질에 대한 항체를 이용하여 가시아메바성 각막염을 감별 진단하는 기술은 전무한 실정이다.
상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 가시아메바성 각막염 감별 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 가시아메바성 각막염 감별 진단용 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 피검자 유래의 생물학적 시료에 대하여, IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질에 특이적인 항체의 항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 가시아메바성 각막염 환자의 각막염 감별 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
이에, IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 가시아메바성 각막염 감별 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서 상기 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질은 병원성 가시아메바에서 분비된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 가시아메바성 각막염 감별 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 피검자 유래의 생물학적 시료에 대하여, IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질에 특이적인 항체의 항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 가시아메바성 각막염 환자의 각막염 감별 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질 항체를 포함하는 조성물은 가시아메바에서 분비되는 IPNH에서만 특이적으로 항원-항체반응을 일으켜 기존의 가시아메바성 각막염 진단방법에 비해 신속하고 정확한 진단 및 각막염의 원인 감별이 가능하고, 상기 조성물을 이용하여 가시아메바성 각막염 진단 키트, 치료제 및 콘텍트렌즈 소독제 제조 등에 활용도가 높을 것으로 기대된다.
도 1은 가시아메바 분비 단백질 중 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)의 ORF를 나타낸 것으로, 도 1a는 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)의 뉴클레오티드를 나타낸 것이고, 도 1b는 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)의 아미노산을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 항체를 확보 후 배양하여 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 항체 제조의 개략도를 나타낸 것이다.
도 4는 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)의 단백질 구조 중 항원성이 높은 부분에 대해 각막염 원인균들의 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)와 유사성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 가시아메바 및 가시아메바 배양액에서 검출되는 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)를 나타낸 것이다.
도 6은 가시아메바 종류에 대한 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 항체의 특이적 검출 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 병원성 가시아메바가 분비하는 단백질 중 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)에 대해 예의 연구하여 이에 대응하는 항체를 제작하고, 상기 항체가 인체 각막세포와 각막염의 원인이 될 수 있는 Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Fusarium solani, Acanthamoeba castellanii 및 임상분리주 Acanthamoeba spp.의 세포 용해액 및 배양액 중에서 가시아메바에만 특이적으로 항원-항체반응을 일으키는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 가시아메바성 각막염 감별 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)"는 일반적으로 발생하는 모든 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오시드를 리보오스 및 관련 염기로 가수분해하는 효소로서, 본 발명의 IPNH는 다양한 미생물에서 분비되는 IPNH에 제한되지 않으나, Fusarium solani, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosaAcanthamoeba castellanii에서 분비되는 IPNH 인 것이 바람직하고, 구체적으로 병원성 가시아메바 Acanthamoeba castellanii에서 분비되는 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 서열번호 1과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명자들은 상기 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 이용하여 각막염 환자의 감별 및 진단에 대한 유효성을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 가시아메바 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 항체를 이용하여 인체 각막세포(Human corneal epithelial cell, HCE), 비병원성 가시아메바(Acanthamoeba castellanii #30011-nonpathogenic) 및 병원성 가시아메바(Acanthamoeba castellanii #30868-pathogenic)의 세포 배양물에 대해 웨스턴블랏을 수행한 결과 가시아메바에서만 특이적으로 IPNH가 검출되는 것을 확인하였으며(실시예 3 참조), 또한 인체 각막세포(Human corneal epithelial cell, HCE), 비병원성 가시아메바(Acanthamoeba castellanii #30011-nonpathogenic), 병원성 가시아메바(Acanthamoeba castellanii #30868-pathogenic), 임상분리주 가시아메바(Clinical isolate, Acanthamoebas spp.), F.solani, P.aeruginosaS.aureus에서 웨스턴블랏을 수행한 결과 가시아메바 종류에서만 특이적으로 IPNH 항체가 검출되는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
상기 결과를 통해 본 발명의 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 항체를 포함하는 조성물을 이용할 경우 가시아메바성 각막염 환자의 각막염 감별진단에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 각막염 감별 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 가시아메바성 각막염 감별 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 피검자 유래의 생물학적 시료에 대하여, IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질에 특이적인 항체의 항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 가시아메바성 각막염 환자의 각막염 감별 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "각막염 환자의 각막염 감별 진단을 위한 정보제공방법"이란 진단 또는 감별 단계로써 각막염 질환 진단을 위하여 필요한 객관적인 정보를 제공하는 것이며, 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다. 상기 피검자 유래의 생물학적 시료는 이에 제한 되는 것은 아니지만, 예를 들면 조직, 세포 등일 수 있고, 각막염 환자 유래 조직 또는 세포인 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
실시예 1. 가시아메바 분비 단백질 중 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 확보
1-1.IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) ORF 확보
병원성 가시아메바(ATCC#30868)의 분비단백질 중 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) ORF를 확보하여 도 1a에 나타낸 바와 같이 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)의 1,107bp 뉴클레오티드를 도 1b에 나타낸 바와 같이 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)의 369 아미노산을 확인하였다.
1-2. IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)의 발현 확인 및 정제
실시예 1-1에 의해 확보된 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)를 pGEX 4T-3에 클로닝한 후, 1mM IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)를 첨가하고 25℃에서 4시간 동안 배양하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 대조군에서는 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질이 발현되지 않았으나, Total, soluble 및 insoluble에서는 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질이 발현된 것을 확인하였으며, 도 2b에 나타낸 바와 같이 3번 라인에 해당하는 용출 단백질을 분리 정제하여 대량 확보하였다.
이에 더하여, 도 3에 나타낸 바와 같이 상기 분리 정제된 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질을 50 μg 씩 adjuvant 50 μl와 혼합하여 마우스 2마리에 3주 간격으로 각 3회 접종하여 항체를 생성하였다.
실시예 2. 각막염 원인균에서 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)단백질의 유사성 확인
각막염의 원인이 될 수 있는 Fusarium solani, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosaAcanthamoeba castellanii의 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질에 대한 정보를 GenBank에서 얻고, 상기 단백질들의 유사성을 비교하여, 도 4와 같이 단백질에 차이를 나타내는 결과를 도출하였다.
실시예 3. 세포 배양액에서의 IPNH 항체 검출 확인
실시예 1에서 생성된 가시아메바 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)의 단백질 항체를 이용하여 인체 각막세포(Human corneal epithelial cell, HCE), 비병원성 가시아메바(Acanthamoeba castellanii #30011-nonpathogenic) 및 병원성 가시아메바(Acanthamoeba castellanii #30868-pathogenic) 배양액에서 웨스턴 블랏을 수행한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 IPNH의 항원은 인체 각막세포(1번 라인)에서는 검출되지 않았으며 가시아메바(2번 라인) 및 가시아메바 배양액(3번 라인)에서만 특이적으로 검출되는 것을 확인하였다.
실시예 4. 각막염 원인 균주에서 가시아메바의 IPNH 항체 검출 확인
실시예 1에서 생성된 가시아메바 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase)의 단백질 항체를 이용하여 각막염의 원인이 되는 P.aeruginosa, S.aureus, F.solaniA.castellanii에서 웨스턴 블랏을 수행한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 가시아메바(2, 3 및 4번 라인)에서만 특이적으로 IPNH 항체가 검출되는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 항체가 가시아메바에서만 특이적으로 결합한다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Composition comprising antibody of IPNH protein for diagnosing Acanthamoeba keratitis and diagnosis kit of Acanthamoeba keratitis using the same <130> PD19-305 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 368 <212> PRT <213> IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) protein <400> 1 Met Thr Ala Ser Lys Ser Phe Ile Val Val Val Ala Met Leu Cys Leu 1 5 10 15 Met Ala Thr Val Ala Leu Ala His Arg Pro Ser Pro Ser Pro Ser Pro 20 25 30 Ser Pro Lys Pro Thr Val Phe Val Phe Thr Asp Val Asn Thr Asp Asp 35 40 45 Phe Met Ala Leu Lys Leu Ile Leu Lys Tyr Ser Asn Val Lys Val Gly 50 55 60 Gly Phe Val Ala Gly Cys Ala Gly Phe Cys Asn Met Gly Pro Gly Ile 65 70 75 80 Gln Asn Leu Phe Gly Leu Leu Lys Phe Met Asp Arg Asp Asp Val Pro 85 90 95 Val Trp Ala Gly Glu Ala Tyr Ala Ser Thr Glu Ile Asp Ser Gly Asn 100 105 110 Tyr Ser Cys Thr Phe Gln Lys Thr Val Pro Leu Phe Pro Lys Gly Lys 115 120 125 Thr Trp Ala Asp Thr Ile Leu Gly Leu Asn Gln Arg Tyr Pro Arg Leu 130 135 140 Thr Asp Pro Gln Arg Asn Tyr Tyr Pro Gly Phe Pro Gln Val Tyr Glu 145 150 155 160 Pro Leu Arg Ala Ala Ile Ala Ala Leu Asp Gly Pro Val Glu Phe Leu 165 170 175 Ser Leu Gly Thr Leu Thr Glu Ile Asp Tyr Leu Phe Arg Arg Tyr Pro 180 185 190 Asp Leu Lys Gln Arg Val Arg Arg Ile Thr Ile Met Gly Gly Ala Val 195 200 205 His Val Pro Gly Asn Leu Phe Phe Pro Arg Gly Ser Ala Pro Asn Thr 210 215 220 Val Ala Glu Cys Asn Ile Tyr Leu Asp Pro His Ser Ala Arg Asn Val 225 230 235 240 Phe Val Ser Gly Val Pro Ile Arg Leu Val Pro Leu Asp Ala Thr Asn 245 250 255 Ala Phe Gln Leu Ser Trp Glu Phe Leu Asn Glu Phe Asp Asp Val Ala 260 265 270 Arg Thr Lys Glu Ala Lys Phe Val Lys Asp Leu Leu Ile Leu Ile Lys 275 280 285 Asn Asn Ser Ala Ala Thr Ser Met Tyr Ser Leu Trp Asp Pro Leu Thr 290 295 300 Ala Ala Ile Leu Ala Asp His Ser Ile Ile Phe Glu Glu Glu Thr Val 305 310 315 320 Asn Met Thr Val Val Thr Ser Gly Ser Gln Ala Gly Arg Thr Val Ile 325 330 335 Asp Asn Val Glu Gly Lys Pro Val Gln Val Val Leu Thr Ala Asp Pro 340 345 350 Asp Phe Tyr Asp Ile Phe Ile Asp Lys Leu Asn Arg Arg Arg Arg Trp 355 360 365

Claims (5)

  1. IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 가시아메바성 각막염 감별 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질은 병원성 가시아메바에서 분비된 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 가시아메바성 각막염 감별 진단용 키트.
  5. 피검자 유래의 생물학적 시료에 대하여, IPNH(Inosineuridine preferring nucleoside hydrolase) 단백질에 특이적인 항체의 항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 가시아메바성 각막염 환자의 각막염 감별 진단을 위한 정보제공방법.
KR1020200011298A 2020-01-30 2020-01-30 Ipnh 단백질 항체를 포함하는 가시아메바성 각막염의 감별 진단용 조성물 및 이를 이용한 가시아메바성 각막염 진단 키트 KR102297546B1 (ko)

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KR20120117154A (ko) * 2011-04-14 2012-10-24 경북대학교 산학협력단 각막염 유발 가시아메바 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 각막염 유발 가시아메바 검출 방법
KR101521409B1 (ko) * 2015-01-15 2015-05-18 경북대학교 산학협력단 진균성 및 아메바성 각막염의 원인체를 동시에 검출할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트 및 이를 이용한 각막염 유발균 검출 방법
CN107501404A (zh) * 2017-09-05 2017-12-22 吉林医药学院 一种棘阿米巴特异性抗原肽、多克隆抗体及其用途

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