CN110684740A

CN110684740A - 一种抗人泛素羧基末端水解酶-1(uch-l1)的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN110684740A
Application number: CN201910719120.XA
Authority: CN
Inventors: 唐雨德; 付伟; 扈晓敏; 任琪; 钮倩; 王成林; 沈腾腾; 何为无
Original assignee: WUXI ORIGENE BIO-TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: Beijing Sino fir Jinqiao Biological Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-08-09
Filing date: 2019-08-09
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2039-08-09
Also published as: CN110684740B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种鼠抗人泛素羧基末端水解酶‑1(UCH‑L1)的单克隆抗体,所述的抗体是由保藏号为:CGMCC No.18188的杂交瘤细胞株UMAB244分泌产生。所述抗体的免疫原为真核细胞293T表达的UCH‑L1全长蛋白，其轻链(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,其重链(VH)的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。所述抗体的VL包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.3‑5所示，所述抗体的VH区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.6‑8所示。本发明的抗UCH‑L1单克隆抗体可应用于检测UCH‑L1的各种免疫检测试剂盒的制备，包括但不限于双抗体夹心ELISA或化学发光法试剂盒的制备，为与UCH‑L1相关的疾病诊断提供辅助手段，也为下一步工程抗体的制备提供基础。

Description

一种抗人泛素羧基末端水解酶-1(UCH-L1)的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗人泛素羧基末端水解酶-1(UCH-L1)的单克隆抗体及其在免疫检测方面应用。

背景技术

UCH-L1又称为蛋白基因产物9.5(protein gene product，PGP9.5)，是去泛素化酶UCHs家族中的一员，它是由单基因编码的半胱氨酸蛋白水解酶。UCH-L1由223个氨基酸组成，分子量为27kDa。UCH-L1是在神经元分化的各个阶段广泛表达于神经元组织中的泛素水解酶，并特异性地表达于神经元和弥散神经内分泌系统的细胞及其肿瘤中。UCHL1在大脑的大多数部分表达，在中脑的黑质表达尤其高。UCH-L1的三维结构显示，UCH-L1由7个α-螺旋和6个β折叠组成，且β折叠被α螺旋所包围。体外诱导研究发现，移除UCH-L1氨基端或羧基端少量的氨基酸均可破坏其三级结构，暴露出疏水核心，导致UCH-L1与泛素的亲和力降低，最终导致不溶性聚集体形成。同时UCH-L1的晶体结构显示，UCH-L1中存在一个交叉环结构，当UCH-L1与泛素连接时，交叉环的直径变宽进而暴露出活性位点，UCH-L1处于活化状态；而当UCH-L1未连接泛素时，该交叉环能够阻碍活化位点的暴露，UCH-LI处于失活状态。

UCH-L1作为UPS系统重要的组成部分，通过调节蛋白质的泛素化修饰而参与蛋白质的降解。UCH-L1具有泛素水解酶和泛素连接酶活性，以及不依赖于自身酶活性的稳定单体的功能。UCH-L1可以通过其泛素水解酶活性特异性切割泛素和蛋白底物之间的异肽键产生泛素单体，在胞内底物蛋白质经UPS降解和泛素单体的循环利用过程中发挥重要作用。此外，当UCH-L1二聚体的形式存在时，具有不依赖于ATP酶活性的泛素连接酶活性，能够形成K63连接的多聚泛素链。

据报道，UCH-L1是脑损伤(脑震荡)的一个重要血清学靶标，也是AD和PD患着血清中主要生物靶标，通过对脑脊液或血液中UCH-L1的检测判断疾病的严重程度(J Biolchem.204,Mar 26；279(13):13256-64,Oxidative modifications and down-regulationof ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase LI associated with idiopathicParkinson's and alzheimer's diseases)。此外还有报道UCH-LI是一种在各种癌症(例如肺癌、结直肠癌和胰腺癌、骨髓瘤)中高度表达的生物标记物(Otsuki t,etal,Expressionof protein gene product 9.5(UCH-L1)in human myeloma cells",Br J Heamatol,Nov127(3):292-8,2004；Guoan Chen et al.,"Proteomic analysis of lungadenocarcinoma:Identification of highly expressed set of proteins in tumorClinical Cancer Research,Vol.8,2298-2305,2002；Taiji Yamazaki et al PGP95as amarker for invasive colorectal cancer",Clinical Cancer Research vo1.8,192-195,2002Hidefumi Sasaki,et al.,"Expression of the protein gene product 9.5,PGP95,is correlated with T-status in non-small cell lung cancer Jpn J ClinOncol.,31(11),532-535,2001)。

中国专利关于UCH-L1的条目很少，申请公布号CN 106461645 A涉及UCH-L1作为外伤性脑损伤和神经退行性生物标记物，没有提及抗体；公开号CN 101316605A泛素C末端水解酶L1的新用途在权利要求书提及UCHL1的抑制剂是UCHL1的单克隆抗体，没有任何具体抗体制备与序列信息。国际专利申请号PCT/US2017/058881(ANTIBODIES TO UBIQUITIN C-TERMINAL HYDROLASE L1(UCH-L1)AND GLIAL FIBRILLARY ACIDIC PROTEIN(GFAP)ANDRELATED METHODS)公布了13株抗UCH-L1单克隆抗体以及它们的可变区氨基酸残基序列，制备这13株抗体使用的免疫原是UCH-L1全长蛋白的原核重组抗原或片段，本发明所述抗体的免疫原为UCH-L1全长真核抗原；国际专利申请号PCT/US2017/058881涉及的13株抗体与本发明所述抗体亚型IgG1相同的只有4株，这4株抗体的氨基酸序列与本发明所述抗体的氨基酸序列不同。查询中国市场监督管理总局(原国家药品监督管理局)网站，还没有与UCH-L1相关的检测试剂注册。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好、亲和力高的抗UCH-L1单克隆抗体及其在双抗体夹心ELISA或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中的应用，为与UCH-L1相关的疾病提供辅助诊断，也为下一步工程抗体的制备提供基础。

所述的抗UCH-L1单克隆抗体UMAB244，是由保藏号为CGMCC No.18188的杂交瘤细胞株UMAB244分泌产生。

所述的杂交瘤细胞株UMAB244是以真核细胞293T表达的UCH-L1全长1-223aa为免疫源，通过免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏制备悬液，并使之与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得。

所述的单克隆抗体UMAB244，其轻链含111aa，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；其重链(VH)含115aa，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

所述的抗体UMAB244，其VL区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为27aa-37aa，55aa-57aa和94aa-101aa。其氨基酸残基序列分别:QSIVHSNGNTY、LVS、GSHVPYTQ。

所述的抗体UMAB244，其VH区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为26aa-33aa，51aa-58aa和97aa-104aa。其氨基酸残基序列分别为GYTFTSYW、SSPGSGST、AALTREDY。

所述的抗体UMAB244可以与UCH-L1高特异性结合，可通过本领域技术人员所公知的的方法，制备成检测UCH-L1的各种免疫检测试剂盒。尤其是，应用于双抗体夹心ELISA或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中。双抗体夹心ELISA检测UCH-L1标准品，检测灵敏度能达到5ng/ml，剂量-反应曲线的线性R²＝0.9941以上；板式化学发光法检测UCH-L1标准品，检测灵敏度能达到12.5pg/ml。

保藏信息

用于保藏的杂交瘤细胞株UMAB244的分类命名为：鼠抗人泛素羧基末端水解酶-1(UCH-L1)单克隆杂交瘤细胞株；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2019年7月11日；

保藏编号：CGMCC No.18188。

附图说明

图1为5’RACE扩增产物的电泳图,其中1为轻链基因，2为重链基因，M为DNA分子量Marker。

图2为双抗体夹心ELISA法检测UCH-L1标准曲线，横坐标为UCH-L1蛋白浓度，纵坐标为检测的OD值。标准曲线的R²＝0.9941，线性检测范围5-100ng/mL，推出样品浓度计算公式：y＝0.0381x+0.0711。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1:抗UCH-L1单克隆抗体的制备

一、UCH-L1重组蛋白的生产

从Genebank中选调UCH-L1基因NM_004181.5(NP_004172.2)，该基因编码UCH-L1全长223个氨基酸(aa)，位于50-721nt。以从美国傲锐东源生物科技有限公司获得的质粒RC201803(含UCH-L1ORF721bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI和MluI，克隆入表达载体pCMV6，建立UCH-L1重组表达质粒。采用本领域技术人员所知的技术方法将该基因转染HEK293T细胞，转染48小时后，进行细胞裂解，收集所有培养皿中的裂解液，4℃离心，DDK亲和层析柱纯化，SDS-PAGE电泳鉴定纯度。电泳后从凝胶上观察到分子量为26kDa左右的目的蛋白条带，纯度在85％以上，达到了制备单抗的纯度要求。

二、动物免疫

上述纯化的UCH-L1重组蛋白以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为80μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为60μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；依据ELISA效价12800时的OD450大于2.0为标准，根据结果判定是否加强免疫或是继续三免，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

三、细胞融合、克隆筛选取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,脾细胞与SP2/0细胞以10:1混合，以50％PEG4,000介导融合，离心后重悬于HAT选择性培养基中，接种于含有饲养细胞的96孔微孔板中，置37℃、5％CO2培养箱培养，融合后第4d、第7d用HAT培养液半量换液，10d后换用HT培养液。观察杂交瘤细胞的生长情况，等克隆长至孔底面积的1/4～1/3，取培养上清液，用ELISA法进行抗体检测,筛选阳性克隆。以有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养，直到克隆化细胞抗体阳性率为100％，选岀高分泌特异性细胞株UMAB244(即ELISA效价在1:10⁴以上的阳性克隆)，此时可将阳性克隆细胞进一步扩大培养，直至细胞系能稳定分泌单克隆抗体。

四、单克隆抗体的制备和纯化以无血清培养基悬浮培养杂交瘤细胞，1周左右当细胞上清体积扩培到任务量及细胞死亡率达到60％-70％时，收取细胞悬液，离心取上清，亲和层析法进行抗体纯化，根据抗体亚型选择相应柱料进行纯化。以BCA法测定纯化后的单抗浓度，再分装、冻存。

实施例2:抗UCH-L1单克隆抗体UMAB244的鉴定

一、单克隆抗体的特异性鉴定

采用间接ELSA法检测。以UCH-L1、NEFM、NEFH、GFAP、UCH-L1、BSA、PET23a空质粒转大肠杆菌的裂解液、PCMV6质粒转293细胞裂解液等蛋白包被酶标板，浓度为5μg/ml，4℃过夜，以含1％BSA的PBST封闭酶标板，加10⁴倍稀释的纯化抗体，37℃反应50min，PBST洗板3次，加HRP-羊抗鼠Ig二抗，37℃反应50min，PBST洗板5次，加TMB显色10min，加终止液，酶标仪测A450。

结果显示，NEFL、NEFM、NEFH、GFAP、BSA、PET23a空质粒转大肠杆菌的裂解液、PCMV6质粒转293细胞裂解液与UMAB244抗体反应均为阴性，OD450均小于0.1；UCH-L1与UMAB244抗体反应呈阳性，OD450均值1.85，说明本发明的抗UCH-L1单克隆抗体UMAB244对UCH-L1具有高度特异性。

二、单克隆抗体的效价与亚型

采用商品试剂盒，检测纯化前细胞培养上清，测IgG亚型，以倍比稀释法稀释纯化的抗体，用间接ELISA测抗体效价，结果显示本发明涉及的抗体UMAB244的亚型为IgG1型，其抗体效价为5.16×10⁶。

三、抗体配对

从美国傲锐东源生物科技有限公司进口一株抗UCH-L1抗体2F11，将该抗体与本发明涉及的抗体UMAB244相互配对。基本步骤：2株单克隆抗体分别包被酶标板，4℃过夜。第二天取出酶标板，PBST洗涤一次，1％BSA溶液37℃封闭2小时，PBST洗涤3次；每孔加入UCH-L1真核重组抗原100μl，浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8和0ng/ml，37℃孵育1小时；孵育完成后取出酶标板，PBST洗涤3次，分别加入HRP标记的上述2株抗体作为检测抗体，37℃孵育1小时。PBST洗涤5次，加入TMB底物，37℃显色10min。取出后加终止液，在酶标仪上测定OD450读数。根据样品的OD值与阴性对照的背景值，选出最为理想的单克隆抗体对，配对筛选结果见表2。从表2可知，本发明涉及的抗体UMAB244无论是做包被抗体还是检测抗体，都可以与2F11进行配对，以UMAB244做包被，2F11做检测更佳。

表2抗体配对实验筛选结果

实施例3:单克隆抗体UMAB244可变区基因与氨基酸序列分析

从Takara Bio USA公司采购

RACE 5’/3’试剂盒，采用5’RACE(RapidAmplification of cDNA Ends，快速扩增cDNA末端)技术扩增杂交瘤细胞功能性抗体的可变区轻链与重链基因序列。具体实验过程参见Takara Bio USA公司

RACE 5’/3’Kit使用者手册。

根据所述的抗体UMAB244为IgG1亚型，设计针对其Ig和Kapa恒定区3’端的特异性基因引物pRace-H-GSP和pRace-K-GSP，引物序列如下：

pRace-H-GSP:CATCDGTCTATCCACTGGCCCCTG

pRace-K-GSP:CTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTT

从杂交瘤细胞UMAB244中提取mRNA，逆转录为cDNA，RACE扩增抗体重链和轻链的DNA片段，扩增产物如图1所示，基因大小符合鼠抗体特征。分别将扩增的轻链与重链通过酶切连于克隆载体PUC119，通过蓝白斑挑取阳性克隆，纯化阳性质粒进行测序，采用测序仪ABI 3730，测序引物为通用引物M13f和M13r。

利用互联网，在http://www.imgt.org上使用IMGT/V-QUEST分析软件，分别将轻链与重链的核苷酸序列进行测序结果数据分析，得到抗体序列的轻链氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。VL全长为111个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和10，CDR的3个结构域氨基酸数分别为11、3和8，CDR1、CDR2和CDR3的区域相应地分别为27aa-37aa，55aa-57aa和94aa-101aa，其氨基酸序列分别:QSIVHSNGNTY、LVS、GSHVPYTQ。

通过分析，所述的抗体UMAB244 VH全长为115个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为25、17、38和11，CDR的3个结构域氨基酸数分别为8、8和8，CDR1、CDR2和CDR3分别为26aa-33aa，51aa-58aa和97aa-104aa，其氨基酸序列分别为GYTFTSYW、SSPGSGST、AALTREDY。

实施例4:抗UCH-L1单克隆抗体UMAB244用于制备双抗体夹心ELISA检测试剂盒

采用本领域技术人员所公知的基于ELISA双抗体夹心法原理的检测技术，制作UCH-L1检测试剂盒，用于临床上与UCH-L1相关疾病辅助诊断。

一、试剂盒组成

1.包被UMAB244抗体的板条：用PBS缓冲液稀释抗体至5μg/ml，包被到微孔板上，每孔100μl，4℃孵育过夜，以PBST洗涤3次，甩干；加含有1％BSA、5％蔗糖、0.05％Proclin300的PBS进行封闭，37℃反应2h，弃去孔内封闭液，甩干；将包被板置于37℃烘箱2h，即完成包被，以铝箔袋密封，存放于4℃保存备用。

2.试剂配制

1.酶结合物配制采用简易过碘酸钠法标记抗UCH-L1单克隆抗体2F11，滴定工作浓度，配制成1:20的浓缩液，稀释液为含1％BSA、5％甘油、0.05％Proclin300的PBS，过滤除菌。

2.洗涤缓冲液为常规的pH7.4的PBST，含0.05％Proclin300，配制成20倍浓缩液。

3.酶的底物液(显色液)单组分TMB(从市场采购)。

4.样本稀释液含1％BSA、0.05％Proclin 300的PBS,过滤除菌。

5.终止液用10mlHCl(36-38％)加入110ml蒸馏水中，混合过程需缓慢进行,配置成1N的HCl。

6、标准品真核细胞293T表达的UCH-L1蛋白，通过BCA法测定蛋白含量、通过SDS-PAGE测定蛋白纯度，计算UCH-L1蛋白实际含量。以含1％BSA、5％蔗糖、10％甘油、0.05％Proclin300的PBS为稀释液，将样品稀释为20μg/ml，过滤除菌，无菌分装。

二、检测操作要点

1、为保证检测结果的准确性，建议标准品及样本均设双孔测定。每次检测均需做标准曲线。

2、如标本中待测物质含量过高，请先用样本稀释液进行稀释，以使样本符合试剂盒的检测范围，最后计算时再乘以相应的稀释倍数。

3、加样：加样时，请使用一次性的洁净吸头，避免交叉污染。加样时应尽量轻缓，避免起泡，将样本加于酶标板孔底部，切勿沿孔壁加样。

4、温育：为防止样本蒸发或污染，温育过程中酶标板必须覆上板贴，实验过程中酶标板应避免处于干燥的状态。温育过程中应随时观察温箱温度是否恒定于37℃，及时调整。温育过程中，温箱不易开启太多次，以免影响温度平衡。

5、洗涤：洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

6、显色：为保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。可在加入底物溶液后每隔一段时间观察一下显色情况以控制反应时间(比如每隔10分钟)。当肉眼可见标准品前3-4孔有明显梯度蓝色，后3-4孔显色不明显时，即可加入终止液终止反应，此时蓝色立刻变为黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

7、底物溶液应为浅蓝色或无色，如果颜色严重变深则必须弃用。底物溶液易受污染，请避光妥善保存。

三、标准UCH-L1蛋白不同稀释度标准曲线的确定

上述制备的检测UCH-L1双抗体夹心ELISA检测试剂盒从4度冰箱取出，平衡到室温。将标准品用PBS从20μg/ml稀释到200ng/ml，制备成0、1、5、10、20、50、200ng/ml共7个系列浓度标准品，按照上述的检测方法在每孔中加入标准品100μl，进行温育，然后弃去液体，加入HRP标记的检测抗体工作液进行温育，弃去孔内液体，甩干后每孔加入底物溶液，避光显色后每孔加入终止溶液，在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度OD值做标准曲线，详见附图2，标准曲线的R²＝0.9941，线性检测范围5-100ng/mL，推出样品浓度计算公式：y＝0.0381x+0.0711。

实施例5：单克隆抗体UMAB244用于板式化学发光免疫检测

采用本领域技术人员所公知的基于双抗体夹心法原理的板式化学发光免疫检测技术，制作UCH-L1检测试剂盒，用于临床上与UCH-L1相关疾病辅助诊断。

一、检测原理与方法

采用基于双抗体夹心法原理的板式化学发光免疫检测技术。在不透光的白色微孔板内包被抗UCH-L1的单克隆抗体UMAB244，将标准品或待测标本加入微孔中进行温育，在温育过程中，标本中的UCH-L1与单克隆抗体结合形成复合物。洗涤除掉未结合的物质,再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体2F11进行温育，则酶标记单克隆抗体与微孔内的复合物形成抗体-抗原-抗体复合物。洗涤除去未结合的物质，加Thermo ScientificSuperSignal ELISA Pico化学发光底物，HARTA MicroLumi L2发光仪读数，依据信噪比大于2.0判读结果为阳性。发光值的大小反映了结合的酶标抗体的量，它与标本中的UCH-L1的浓度成正比。根据所测定的标准品的发光值绘制标准曲线,待测标本中的UCH-L1浓度值即可从标准曲线上获得。

二、检测UCH-L1的板式化学发光检测试剂盒组成

1.包被UMAB244抗体的板条：同实施例4。

2.试剂配制

1.酶结合物配制同实施例4。

2.洗涤缓冲液同实施例4。。

3.化学发光显色液SuperSignal ELISA Pico，购于Thermo Scientific公司。

4.样本稀释液含1％BSA、0.05％Proclin 300的PBST，过滤除菌。

5.标准品真核细胞293T表达的UCH-L1蛋白，通过BCA法测定蛋白含量、通过SDS-PAGE测定蛋白纯度，计算UCH-L1蛋白实际含量。以含1％BSA、5％蔗糖、10％甘油、0.05％Proclin300的PBS为稀释液，将样品稀释为5μg/ml，过滤除菌，无菌分装。

三、对真核重组抗原的检测

把真核细胞293T表达的UCH-L1蛋白进行梯度稀释，分别为0pg/ml、0.75pg/ml、3.0pg/ml、12.5pg/ml、50pg/ml、200pg/ml、800pg/ml，以UMAB244抗体为包被抗体、2F11抗体为检测抗体，用上述检测方法检测7个梯度稀释的抗原，检测结果见表3。根据信噪比大于2.0判定，本发明所述的UMAB244单克隆抗体用于板式化学发光免疫检测试剂，最低灵敏度大于12.5pg/ml，线性范围为12.5-800pg/ml。

表3.板式化学发光法检测UCH-L1真核重组抗原

序列表

<110>

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> Mus musculus x Rattus norvegicus

<400> 1

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Ser His

85 90 95

Val Pro Tyr Thr Gln Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> Mus musculus x Rattus norvegicus

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ser Ser Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Leu Thr Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus x Rattus norvegicus

<400> 3

Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus x Rattus norvegicus

<400> 4

Leu Val Ser

1

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus x Rattus norvegicus

<400> 5

Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Gln

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus x Rattus norvegicus

<400> 6

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus x Rattus norvegicus

<400> 7

Ser Ser Pro Gly Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus x Rattus norvegicus

<400> 8

Ala Ala Leu Thr Arg Glu Asp Tyr

1 5

Claims

1.一株分泌抗人泛素羧基末端水解酶-1(UCH-L1)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株UMAB244，于2019年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18188。

2.由权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.18188的杂交瘤细胞株UMAB244分泌的抗人UCH-L1蛋白单克隆抗体UMAB244。

3.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株UMAB244，其特征在于：以真核细胞293T表达的UCH-L1全长蛋白为免疫源，通过免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏制备悬液，并使之与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得。

4.根据权利要求2所述的单克隆抗体UMAB244，其特征在于:其轻链可变区(VL)含112aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述抗体的重链(VH)含112aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求2所述的抗体，其中VL区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为27aa-37aa，55aa-57aa和94aa-101aa。其氨基酸序列分别如SEQ ID No.3-5所示。

6.根据权利要求2所述的抗体，其中VH区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为26aa-33aa，51aa-58aa和97aa-104aa。其氨基酸残基序列分别如SEQ ID No.6-8所示。

7.一种权利要求2所述的抗UCH-L1单克隆抗体的应用，其特征在于:用于UCH-L1免疫检测试剂盒的制备，包括但不限于双抗体夹心ELISA法和化学发光免疫检测试剂盒。