CN107383200B

CN107383200B - 鼠源抗人IgE单克隆抗体的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN107383200B
Application number: CN201610326780.8A
Authority: CN
Inventors: 万晓春; 崔璐璐; 毕嘉成; 鄢德洪
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2016-05-17
Filing date: 2016-05-17
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2036-05-17
Also published as: CN107383200A

Abstract

本发明提供鼠源抗人IgE单克隆抗体的制备方法及其应用，该方法包括应用原核表达系统表达的含IgE Fcε3‑4蛋白片段的融合蛋白免疫小鼠，随后通过杂交瘤方法制备鼠源抗人IgE单克隆抗体；其中，所述IgE Fcε3‑4蛋白片段为由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在所述原核表达系统中表达的蛋白。所以方法与现有技术中所用的IgE Fcε2‑4或IgE Fcε3‑4的蛋白相比较，降低了抗原蛋白的纯化难度，从而提高了效率；原核表达抗原降低了抗体制备的成本。

Description

鼠源抗人IgE单克隆抗体的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及抗人IgE抗体技术领域，具体涉及一种鼠源抗人IgE单克隆抗体的制备方法及其应用。

背景技术

近年来随着社会工业化的进程，环境污染越来越严重。与此同时，IgE介导的过敏性疾病的发病率也迅速增长，严重影响了人类的生存质量。据报道，约占世界人口的40％的人群处于超敏状态，世界卫生组织已将这类疾病列为21世纪重点防治的疾病之一。

IgE最早在1968年由世界卫生组织免疫球蛋白参考实验室正式提出，属于人类第五种免疫球蛋白。IgE是由B细胞分泌，并通过与嗜酸性粒细胞和肥大细胞表面的Fc受体结合，导致其脱颗粒释放炎性介质，从而引起过敏症状。IgE敏感可导致典型的过敏性疾病：哮喘、鼻炎、食物过敏、药物过敏和过敏性休克等。

目前国内检测人血清中IgE的产品较少，而且特异性较低，可重复性差。加之，国内科研所用检测人IgE及相关细胞免疫学实验所用的试剂大多购自国外，而且价格也昂贵，从而在某种程度上限制了该蛋白相关实验的进展。因此，需要一种特异性更强、重复性更高、生产成本更低的可检侧IgE的试剂。

生产检测抗IgE单克隆抗体的方法通常有杂交瘤技术、噬菌体抗体库技术及核糖体展示技术等。但作为检测试剂的研发使用最传统的杂交瘤技术即可，不仅可以降低生产成本，而且还可以降低单抗制备的技术难度。现有技术生产抗IgE单克隆抗体是采用IgE Fcε2-4或IgE Fcε3-4的全长抗原蛋白来免疫小鼠，但IgE Fcε2-4或IgE Fcε3-4的全长抗原蛋白纯化十分困难，并且这些抗原蛋白不亦在原核细胞中表达，无法有效降低抗体制备的成本。因此，本领域亟需一种纯化简便、成本的方法来生产特异性强，重复性高的抗人IgE单克隆抗体。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的之一在于提供一种鼠源抗人IgE单克隆抗体的制备方法，所述方法可降低了抗原蛋白的纯化难度，从而提高了效率，并且可采用原核系统表达抗原蛋白，降低了成本。

本发明的另一目的在于提供一种鼠源抗人IgE单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合人IgE的生物活性片段，使其具有特异性强，可重复性好的特点。

本发明的另一目的在于提供编码所述鼠源抗人IgE单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合人IgE的生物活性片段的基因及含该基因的载体或细胞。

本发明的另一目在于提供产生所述鼠源抗人IgE单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合人IgE的生物活性片段的方法。

本发明的另一目的在于提供一种检测H7N9病毒的试剂盒。

为此，一方面，本发明提供一种鼠源抗人IgE单克隆抗体的制备方法，所述方法包括应用原核表达系统表达的含IgE Fcε3-4蛋白片段的融合蛋白免疫小鼠，随后通过杂交瘤方法制备鼠源抗人IgE单克隆抗体；其中，所述IgE Fcε3-4蛋白片段为由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在所述原核表达系统中表达的蛋白。

在本发明一具体实施方式中，所述含IgE Fcε3-4蛋白片段的融合蛋白还含有载体pET32(+)表达的蛋白。该载体pET32(+)用于携带SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在本发明一具体实施方式中，其中，所述由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列是以SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7为引物，及以CRL8033cDNA为模板扩增所得。

发明人研究意外发现Genebank中ID号为AK130825.1序列中第903-1718碱基(即SEQ ID NO:1)所表达的蛋白可使小鼠成功免疫，容易在原核细胞中表达，并且很容易纯化分离。与现有技术中所用的IgE Fcε2-4或IgE Fcε3-4的蛋白相比较，降低了抗原蛋白的纯化难度，从而提高了效率；原核表达抗原降低了抗体制备的成本。

另一方面，本发明提供鼠源抗人IgE单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合人IgE的生物活性片段，其中，该抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；和/或

该抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明采用免疫荧光法检测一可分泌含SEQ ID NO:4所示轻链可变区氨基酸及SEQ ID NO:5重链可变区氨基酸的抗IgE单克隆抗体的特异性，实验结果表明该单克隆抗体特异性高。

另一方面，本发明提供编码本发明所述的鼠源抗人IgE单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合人IgE的生物活性片段的基因。优选地，所述基因包含编码具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸的核苷酸序列，更优选地，该核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或

所述基因包含编码具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸的核苷酸序列，优选地，该核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明一具体实施方式中，所述基因包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列及如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供含如上所述基因的载体。优选地，所述载体为原核表达载体。

再一方面，本发明提供含如上所述基因或如上所述载体的细胞。

再一方面，本发明提供一种产生本发明所述鼠源抗人IgE单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合人IgE的生物活性片段的方法，该方法包括如下步骤：

(a)提供一本发明所述载体；

(b)用步骤(a)所述的载体转化原核细胞；

(c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤(b)所得的原核细胞；和

(d)分离纯化获得所述单克隆抗体。

另一方面，本发明提供一种检测IgE水平的试剂盒，其含有本发明所述的鼠源抗人IgE单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合人IgE的生物活性片段。优选所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液；优选所述第二抗体为抗本发明所述鼠源抗人IgE单克隆抗体的抗抗体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明用于免疫小鼠的蛋白为IgE Fcε3-4蛋白中的部分片段，并非是全长蛋白，与现有技术中所用的IgE Fcε2-4或IgE Fcε3-4的蛋白相比较，这降低了抗原蛋白的纯化难度，从而提高了效率。

(2)本发明采用原核系统表达抗原，降低了抗体的制备成本。

(3)本发明中的抗人IgE抗体与人全长IgE蛋白反应灵敏，具有良好的特异性。

附图说明

图1为以CRL8033cDNA为模板，通过上下游引物成功扩增出IgEFcε3-4基因的片段，其长度为816bp。其中M为DNA标记(D2000plus)，1为克隆出的IgE Fcε3-4基因的片段。

图2为将克隆出的IgEFcε3-4基因的片段与pET32a(+)载体链接后转化BL21(DE3)后，菌液PCR鉴定的阳性克隆结果。其中M为DNA标记(D2000plus)，1～6分别为IgE Fcε3-4基因的片段不同的转化子。

图3为融合蛋白的表达后SDS-PAGE(12％)鉴定结果。其中M：蛋白分子量标；1：IPTG诱导重组载体沉淀；2：IPTG诱导空载体沉淀；3：IPTG诱导重组载体上清；4：IPTG诱导空载体上清。

图4为融合蛋白的纯化后SDS-PAGE(12％)鉴定结果。其中M：蛋白分子量标；1：融合蛋白。

图5为融合蛋白纯化后Western blot结果。其中M：蛋白分子量标；1：空载对照；2：融合蛋白。

图6为小鼠第三次免疫后血清效价测定结果。其中#1-#6：免疫后血清；对照小鼠血清为免疫前小鼠血清)。

图7为用抗人IgE杂交瘤细胞株6A10、3H4分泌的单克隆抗体通过Elisa法测定商品化的全长人IgE蛋白的实验结果图。

图8为用Western blot验证抗人IgE杂交瘤细胞株6A10和3H4分泌的单克隆抗体识别人全长IgE的特异性实验结果图。为了鉴定杂交瘤细胞株6A10和3H4分泌的单克隆抗体识别人IgE的特异性，以小鼠抗人IgE抗体(B3102E8)抗体作阳性对照，观察它们通过Westernblot检测人IgE及人IgG的信号强弱。结果显示，杂交瘤细胞株6A10和3H4分泌的单克隆抗体对人全长IgE的识别有很好的特异性，使用的蛋白为商品化的全长人IgE蛋白和IgG蛋白。

图9为用免疫荧光测定杂交瘤细胞株6A10及3H4分泌的单克隆抗体；其中：A：PBS；B：小鼠抗人IgE单克隆抗体(Abcam，B3102E8)；C：小鼠抗人IgE单克隆抗体6A10；D：小鼠抗人IgE单克隆抗体3H4。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

(1)含IgE Fcε3-4蛋白片段的融合蛋白(亦可称为重组蛋白)的制备

(a)Fcε3-4基因的片段/pET-32a(+)重组载体构建

根据Genebank提供ID号为AK130825.1序列，针对序列的第903-1718碱基设计上下游引物：上游引物CCGGAATTCTCTGGGTACACCCCAGGGACT(SEQ ID NO:6)，下游引物CCGCTCGAGATGGACTGCACGGCAGATGAACT(SEQ ID NO:7)其中，灰色阴影区为酶切位点EcoRI和XhOI)。以CRL8033mRNA反转录的cDNA为模板，最终成功扩增的目的序列长度为816bp。DNA电泳结果如图1，其中M为DNAmaker(D2000plus)，1为克隆出的IgE的Fcε3-4基因的片段。

将上述扩增的目的Fcε3-4基因的片段与pET-32a(+)载体链接后转化BL21(DE3)大肠杆菌，经菌液PCR鉴定后，挑取阳性克隆送去测序验证。图2为克隆转化子的菌液PCR鉴定(M：D2000plus分子量标准；1～6：IgE Fcε3-4转化子)。测序所得序列如SEQ ID NO:1所示，结果表明重组质粒成功插入的IgE Fcε3-4基因的片段与设计片段一致。

(b)含IgE Fcε3-4蛋白片段的融合蛋白的表达

将测序正确菌液进行大量培养约900ml的LB培养基(含有的氨苄青霉素终浓度为50μg/ml)。220rpm，37℃，220r震荡培养至A600＝0.6～0.8，加入IPTG使其终浓度为0.2mM/L，继续诱导培养3小时后收菌。图3为人IgE的Fc结构域蛋白的诱导表达，结果表明含IgE Fcε3-4蛋白片段的融合蛋白主要以包涵体的形式存在(M：蛋白分子量标；1：IPTG诱导重组载体沉淀；2：IPTG诱导空载体沉淀；3：IPTG诱导重组载体上清；4：IPTG诱导空载体上清)。超声破碎菌体后4℃，12000rpm离心30分钟，向离心所得沉淀中加入20ml包涵体裂解液(2M尿素，0.1M Na₂HPO₄，100mM Tris-HCl(PH 8.0)，1mM EDTA，0.5％Triton-100)并将其置入4℃冰箱中旋转过夜裂解。次日取出后4℃，12000rpm离心30分钟并将上清液转移到透析袋内，从8M、4M、2M(过夜)、1M、0M进行尿素透析，除2M过夜透析外其余梯度均是每4小时更换。每次更换梯度时均向透析液内加入0.1mM/L的PMSF 5ml，1M/L的DTT 1ml。透析结束后将蛋白从透析袋内转移至离心管中，4℃，12000rpm离心30分钟。上清即为含IgEFcε3-4蛋白片段的融合蛋白，通过Bradford法测蛋白浓度，取适量用12％的SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot验证纯化效果，所得结果分别如图4和图5所示；其中图4中M：蛋白分子量标；1：所得融合蛋白。从图4中可以看出纯化的含IgE Fcε3-4蛋白片段的融合蛋白纯度较高；图5中M：蛋白分子量标；1：空载对照；2：所得融合蛋白，从图5中可以看出所得融合蛋白(本发明之所以将所得蛋白称为融合蛋白，主要是由于pET-32a(+)载体中有His标签和Trx蛋白，表达出来的蛋白含有Trx和His)已成功纯化。

(2)鼠抗人IgE单克隆抗体的制备

(a)小鼠免疫

用上述所得的纯化的含IgE Fcε3-4蛋白片段的融合蛋白免疫BALB/c小鼠，共6只。第一次免疫用弗式完全佐剂和前述融合蛋白1:1等体乳化后，按100μg/只皮下多点注射。每间隔2周后分别进行第二次和第三次免疫，除用弗氏不完全佐剂来与前述融合蛋白乳化外，其余方法同第一次免疫。第三次免疫后剪尾采血，用间接Elisa方法测定血清效价。当小鼠血清中抗体滴度达到1:100000以上后，即可进行下一步细胞融合。在细胞融合前3天，对小鼠进行一次加强免疫，100μg融合蛋白腹腔注射；具体地，免疫后小鼠血清抗体效价测定可按如下方法测定：

用纯化的含IgE Fcε3-4蛋白片段的融合蛋白包被ELISA板，每孔12.5ng，4℃孵育过夜；PBST洗板3遍后加脱脂奶粉180μl/孔，37℃封闭3小时；PBST洗板3遍后加梯度稀释血清，37℃孵育1小时；用同样方法洗板后加HRP标记的山羊抗鼠二，100μl/孔，37℃孵育半小时；最后一次洗板后加TMB避光显色10分钟，用2mol/L的浓硫酸终止反应，在酶标仪上检测OD450值。实验中以免疫前小鼠的血清作阴性对照。以测定值与对照值的得≥2.1来判断小鼠血清滴度，所得结果如见图6所示，其中#1-#6为免疫后血清；对照小鼠血清为免疫前小鼠血清。从图6中可以看出本实施例含IgE Fcε3-4蛋白片段的融合蛋白可以在小鼠体内诱导出能识别人IgE的特异性抗体的B细胞克隆。

(b)细胞融合

将加强免疫后的#1和#2号小鼠于第三天无菌分离脾脏，并将其制备成单细胞悬液。收集对数生长期的SP2/0细胞，同过PEG法与脾细胞按照1:1的数目(约1×10⁸个)混合后加入预热的无血清DMEM培养基至45ml。1500rpm离心3min后弃去上清液，用手指轻叩管底，使底部的细胞沉淀松动并置于37℃的水浴中用胶头滴管在1min内滴加完50％的PEG(MV4000，Sigma)1ml。边晃动离心管，边加PEG。前30秒，按照1滴/秒的速度加，然后速度调整为1滴/4秒。然后将离心管在水浴中静置90秒，接着在4分钟内加入15ml预热无血清的DMEM不完全培养基溶液(前30秒按照每2秒一滴，接着在2分钟内加完5ml，最后调整速度在剩余时间将DMEM加完)。1500rpm离心3min后弃去上清液，加入HAT培养基轻轻混匀后将细胞分至96孔板中，200ul/孔。在37℃5％CO₂培养箱中培养7日后观察克隆形成，半量更换培养基。

(c)抗人IgE单克隆抗体杂交瘤的筛选

将融合后的杂交瘤细胞进行3次换液，挑取克隆形成的孔用间接Elisa法测的细胞上清中的抗体含量，以此来筛选阳性克隆。将效价高的克隆进行亚克隆，直至亚克隆后的孔全部为阳性。最后所的到的即为抗人IgE单克隆抗体杂交瘤，本发明筛选得到6A10及3H4杂交瘤细胞株。

(3)用Elisa法验证抗人IgE杂交瘤细胞株6A10和3H4分泌的单克隆抗体

用人全长IgE(Abcam)20ng/孔包被Elisa板(做复孔)，4℃包被过夜。PBST洗板三遍后加5％脱脂奶粉180μl/孔，37℃孵育1h。PBST洗板三遍后样品孔6A10和3H4分泌的杂交瘤上清液100μl/孔，对照孔加入免疫前血清(1:2000稀释)，100μl/孔，37℃孵育1h。洗板后加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗100μl/孔，37℃孵育30min。洗板三遍后加TMB 100μl/孔避光显色10min，最后加2mol/L的浓硫酸终止显色反应。在酶标仪上读取450nm波长下的OD值，所得结果如图7所示，从图7中可以看出杂交瘤细胞株6A10和3H4分泌的单克隆抗体对人全长IgE具有很高的特异性。

(4)用Western blot识别验证抗人IgE杂交瘤细胞株6A10和3H4分泌的单克隆抗体识别人全长IgE的特异性

以商品化的小鼠抗人IgE单克隆抗体(Abcam，B3102E8)作为阳性对照，将全长人IgE蛋白及人IgG蛋白煮沸电泳后转膜。分别用6A10和3H4的杂交瘤上清液作为一抗过夜孵育，二抗选用HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体。Western blot洗膜结束后加ECL发光液在暗室中进行胶片曝光。所得结果如图8所示，杂交瘤细胞株6A10和3H4分泌的单克隆抗体对人全长IgE的识别有很好的特异性。

(5)用免疫荧光法检测6A10和3H4杂交瘤细胞株分泌的抗IgE抗体的特异性

文献报道CRL8033细胞膜表面可以表达少量IgE。因此，可同过免疫荧光的方法来测定单克隆抗体6A10和3H4是否能够识别细胞系所表达的IgE。取CRL8033约1×10⁶个细胞，用PBS洗2遍。1500rpm×3min。加60μl PBS重悬细胞沉淀，取20μl滴加于预处理的载玻片上，组别设计：阴性对照组(PBS)，6A10及3H4纯化抗体组，阳性对照组(Abcam小鼠抗人IgE单克隆抗体B3102E8)。放入56℃烘箱中烘干1-2min。固定：4％多聚甲醛室温固定20min，PBS洗3遍，3min/次，用吸水纸吸干。穿膜：用0.2％Triton X-100(PBS配制)室温通透10min，PBS洗3遍。封闭：用1％BSA(PBS配制)室温封闭30min。PBS洗3遍。加一抗：按照1:50进行稀释。放入湿盒内，4℃冰箱过夜。加二抗(Cy5标记的兔抗鼠IgG(1:100)：PBS洗3遍。放在湿盒里37℃避光孵育1h。PBS洗3遍。DAPI染核：加60μl DAPI(碧云天)到片子上，避光室温孵育5min。PBS洗5遍。封片:甘油:PBS＝1:1进行封片，立即进行拍照。结果示，腹水纯化单克隆抗体6A10和3H4均能很好的识别细胞系表面的IgE，见图9(3H4和6A10免疫荧光测定结果。A：PBS；B：小鼠抗人IgE单克隆抗体(Abcam，B3102E8)；C：小鼠抗人IgE单克隆抗体6A10；D：小鼠抗人IgE单克隆抗体3H4)。从图9中可以看出，小鼠抗人IgE单克隆抗体6A10特异性高。

(6)鼠抗人IgE单克隆抗体杂交瘤可变区编码基因的克隆和测序

收集前述抗人IgE单克隆抗体杂交瘤细胞6A10约1×10⁷个提取RNA，用Takara RTPCR试剂盒将其反转录为cDNA。扩增抗人IgE单抗杂交瘤细胞株6A10的轻重链基因片段的引物(Cheng M,Chan S Y W,Zhao Q,et al.Construction and characterization ofsingle-chain variable fragment antibody library derived from germlinerearranged immunoglobulin variable genes[J].PloS one,2011,6(11):e27406.)如下：

A：轻链扩增引物

正向引物

FL1:5’-gAHRTYgTKMTSAc-3’

FL2:5’-gAHRTYgTKMTSAcMcARWcTMcA-3’

反向引物

RL1：5’-KATYTccARYYTKgT-3’

RL2：5’-KATYTccARYYTKgTSccHBcDccgAA-3’

B:重链扩增引物

正向引物

FH1：5’-gAggTgMWgcTTRT-3’

FH2:5’-gAggTgMWgcTKVWgSAgTcTggA-3’

反向引物

RH1：5’-gAcDgTgASHGWRGTYC-3’

RH2:5’-gAcDgTgASHRDRgTBccTKSRccccA-3’

其中，N＝A+G+C+T；R＝A+G；Y＝C+T；M＝A+C；K＝G+T；S＝G+C；W＝A+T；H＝A+C+T；B＝G+C+T；D＝A+G+T；V＝A+G+C。

克隆出的片段进行1％琼脂糖电泳后切胶回收。将回收的片段与pMD19T载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆送去测序。结果显示抗人IgE单克隆杂交瘤细胞株6A10的轻链可变区序核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；重链可变区序核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳先进技术研究院

<120> 鼠源抗人IgE单克隆抗体的制备方法及其应用

<130> CP11901666C

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctgggtaca ccccagggac tatcaacatc acctggctgg aggacgggca ggtcatggac 60

gtggacttgt ccaccgcctc taccacgcag gagggtgagc tggcctccac acaaagcgag 120

ctcaccctca gccagaagca ctggctgtca gaccgcacct acacctgcca ggtcacctat 180

caaggtcaca cctttgagga cagcaccaag aagtgtgcag attccaaccc gagaggggtg 240

agcgcctacc taagccggcc cagcccgttc gacctgttca tccgcaagtc gcccacgatc 300

acctgtctgg tggtggacct ggcacccagc aaggggaccg tgaacctgac ctggtcccgg 360

gccagtggga agcctgtgaa ccactccacc agaaaggagg agaagcagcg caatggcacg 420

ttaaccgtca cgtccaccct gccggtgggc acccgagact ggatcgaggg ggagacctac 480

cagtgcaggg tgacccaccc ccacctgccc agggccctca tgcggtccac gaccaagacc 540

agcggcccgc gtgctgcccc ggaagtctat gcgtttgcga cgccggagtg gccggggagc 600

cgggacaagc gcaccctcgc ctgcctgatc cagaacttca tgcctgagga catctcggtg 660

cagtggctgc acaacgaggt gcagctcccg gacgcccggc acagcacgac gcagccccgc 720

aagaccaagg gctccggctt cttcgtcttc agccgcctgg aggtgaccag ggccgaatgg 780

gagcagaaag atgagttcat ctgccgtgca gtccat 816

<210> 2

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatattgttc tcacacaatc tccagcctct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atttcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 120

cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctctc gtgcatccaa cctagaatct 180

gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240

cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300

acgttc 306

<210> 3

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaggtgaagc ttgtgcagtc tggacctagc ctcgtgaaac cttctcagac tctgtccctc 60

acttgttctg tcactggcga ctccatcacc agtggtttct ggaactggat ccggaaattc 120

ccagggaata aacttgagta catggggtac ataagctaca gtggtaacac ttactacaat 180

ccatctctca aaagtcgaat ctccatcact cgagacacat ccaagaacca gtactacctg 240

cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtacaag agccctctac 300

ggtatggcct ggtttgctta c 321

<210> 4

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Ser Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe

100

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Glu Val Lys Leu Val Gln Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Phe Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Arg Ala Leu Tyr Gly Met Ala Trp Phe Ala Tyr

100 105

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccggaattct ctgggtacac cccagggact 30

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgctcgaga tggactgcac ggcagatgaa ct 32

Claims

1.一种鼠源抗人IgE单克隆抗体的制备方法，所述方法包括应用原核表达系统表达的含IgE Fcε3-4蛋白片段的融合蛋白免疫小鼠，随后通过杂交瘤方法制备鼠源抗人IgE单克隆抗体；其中，所述IgE Fcε3-4蛋白片段为由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在所述原核表达系统中表达的蛋白；

所述融合蛋白为IgE Fcε3-4蛋白片段和载体表达的蛋白构成的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述载体表达的蛋白为载体pET32(+)表达的蛋白。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列是以SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7为引物，及以CRL8033cDNA为模板扩增所得。

4.一种鼠源抗人IgE单克隆抗体，其中，该抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，且该抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

5.编码权利要求4所述的鼠源抗人IgE单克隆抗体的基因。

6.权利要求5所述的基因，编码轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；编码重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.含权利要求5或6所述基因的载体。

8.权利要求7所述的载体，所述载体为原核表达载体。

9.权利要求8所述的载体，所述载体为pET32(+)。

10.含有权利要求5所述基因或含有权利要求7所述载体的细胞。

11.一种产生权利要求4所述鼠源抗人IgE单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合人IgE的生物活性片段的方法，该方法包括如下步骤：(a)提供权利要求7所述载体；(b)用步骤(a)所述的载体转化原核细胞；(c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤(b)所得的原核细胞；和(d)分离纯化获得所述单克隆抗体。

12.一种检测IgE水平的试剂盒，其含有权利要求4所述的鼠源抗人IgE单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合人IgE的生物活性片段。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，所述试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，所述第二抗体为抗权利要求4所述鼠源抗人IgE单克隆抗体的抗抗体。