KR102241558B1

KR102241558B1 - Bag2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편

Info

Publication number: KR102241558B1
Application number: KR1020190016359A
Authority: KR
Inventors: 김성진; 강동우
Original assignee: 주식회사 메드팩토
Priority date: 2019-02-12
Filing date: 2019-02-12
Publication date: 2021-04-20
Also published as: KR20200098338A

Abstract

BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

Description

BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 {An antibody or antigen-binding fragment thereof specifically binding to BAG2 polypeptide or fragment thereof}

코-샤페론 Bcl-2-결합 아타노겐(co-chaperone Bcl-2-associated athanogene: BAG) 단백질 패밀리는 세포 내 단백질 폴딩, 스트레스 반응, 신경 분화, 세포 사멸, 세포 증식 등을 포함하는 다양한 생리학적 과정을 매개하고 다양한 협력 단백질들과 기능적으로 결합한다. 이들 중 항-세포 사멸 활성을 갖는 BAG 도메인 패밀리 구성원 중 하나인 BAG2는 샤페론-관련 유비퀴틴 리가제인 Hsc70-상호작용 단백질의 C-말단(C-terminus of Hsc70-interacting protein: CHIP)의 음성 조절자로서 알려져 있다. CHIP 활성을 억제하는 것을 통한 단백질의 조절에서 BAG2의 주 역할은 PINK1 및 CFTR과 같은 샤페론 관련 단백질의 안정화를 통해 신경퇴행성 질환 및 상염생체 열성 장애와 관련되어 있다. BAG2의 발현은 프로테아좀 억제자-유도된 세포사멸을 증가시키고, BAG2 녹다운은 갑상선 암종 세포를 프로테아좀 억제자인 MG132에 노출시키는 경우, 세포 사멸을 부분적으로 억제함으로써, BAG2가 향-세포사멸(pro-apoptotic) 활성을 가질 수 있음이 제시된바 있다. BAG2-Hsp70 복합체의 형성과는 별도로, BAG 단백질은 다양한 결합 파트너와 기능적으로 상호 작용하고 스트레스 신호, 세포 분열, 세포 사멸 및 세포 분화와 같은 다양한 세포 과정을 조정한다. 한편, 다양한 돌연변이 K-Ras-유도된 종양에서, BAG2의 과발현이 강력한 종양 유전자인 STK33 단백질의 안정화를 촉진시켜 종양 발생을 촉진시킬 수 있음이 제시된 바 있다. 또한, 유방암의 진행 또는 전이 과정에서 암세포가 가지는 조직병리적 및 분자유전학적 병리적 특성에 따라 BAG2 단백질의 발현 및 위치가 달라질 수 있음이 제시된 바 있다. BAG2 단백질이 암화 과정에서 단백질 분해 효소인 카뎁신 B와의 상호작용을 통해 세포 밖으로 분비되는 것이 발견되었으며, 유방암 동물모델에서 BAG2 단백질의 손실이 암 형성 및 폐로의 전이가 완벽하게 억제되는 것이 확인된다. 이와 같은 결과로 BAG2 저해제의 개발은 암 환자의 치료와 생존율 증가에 기여할 것이다.

이러한 발견들에도 불구하고, 다양한 암 진행 및 전이에서의 BAG2 역할은 분명하게 밝혀진 바 없다. 또한, BAG2 단일클론성 항체에 대한 구체적인 연구가 진행된 바 없다. 이에, BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 대한 개발이 요구된다.

일 양상은 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

또 다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 BAG2 폴리펩티드는 각각 포유 동물로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 포유동물은 인간(Homo sapiens), 마우스(Mus musculus), 원숭이, 소 또는 말일 수 있다. BAG2는 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 서열번호 69 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열번호 NM_004282.4에 해당하는 서열이다. 상기 BAG2 단백질은 서열번호 69의 아미노산 서열이 일치하지 않지만, 상기 BAG2 단백질과 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 변이체도 포함한다. 상기 BAG2 폴리펩티드는 서열번호 69의 서열과 60% 이상, 예를 들면, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 BAG2 단백질은 각각 상기 서열번호 69의 서열에서 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 본 명세서에서 상기 '폴리펩티드'는 '단백질'과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

상기 항체는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 조합을 의미한다. 상기 항체의 형태는 다중클론성 항체, 단일클론성 항체, 또는 재조합 항체, 예를 들어, ScFv 단편, 디아바디, 단쇄 항체 등을 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함될 수 있다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위 즉 결합 도메인을 가져 항원 결합 기능을 보유하고 있는, 항체 분자의 기능적 단편 또한 포함할 수 있다.

상기 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들어, 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, Fv, Fab, Fab', Fv F(ab')2, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 중쇄(heavay chain)는 γ, δ, α, μ, ε 5가지 종류가 있으며 중쇄가 항체의 종류를 결정짓는다. α와 γ는 450개, μ 와 ε는 550개의 아미노산으로 구성될 수 있다. 중쇄는 두 영역 즉 가변 영역과 불변 영역을 가질 수 있다.

상기 경쇄(light chain)는 λ, κ 2가지 종류가 있으며 대략 211 내지 217개의 아미노산으로 구성될 수 있다. 경쇄는 불변 영역과 가변 영역을 가질 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어지는 상보성 결정 영역(VH-CDR)1, 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR2, 및 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 상보성 결정 영역(VL-CDR)1, 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR2, 서열번호 63의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것, 서열번호 34의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR1, 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR2, 및 서열번호 46의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 52의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR1, 서열번호 58의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR2, 서열번호 64의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것, 서열번호 35의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR1, 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR2, 및 서열번호 47의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 53의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR1, 서열번호 59의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR2, 서열번호 65의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것, 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR1, 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR2, 및 서열번호 48의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 54의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR1, 서열번호 60의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR2, 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것, 서열번호 37의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR1, 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR2, 및 서열번호 49의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 55의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR1, 서열번호 61의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR2, 서열번호 67의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR1, 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR2, 및 서열번호 50의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 56의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR1, 서열번호 62의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR2, 서열번호 68의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 서열번호 39에서 6 및 7번째 Xaa는 글리신(Gly) 또는 알라닌(Ala)일 수 있다. 상기 서열번호 35에서 2번째 Xaa는 티로신(Tyr) 또는 히스티딘(H)일 수 있다. 상기 서열번호 41에서 8번째 Xaa는 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr)일 수 있다. 상기 서열번호 47에서 12번째 Xaa는 티로신(Tyr) 또는 히스티딘(His)일 수 있다. 상기 서열번호 53에서 3번째 Xaa는 메티오닌(Met) 또는 이소류신(Ile)일 수 있다. 상기 서열번호 59에서 2번째 Xaa는 알라닌(Ala) 또는 세린(Ser)일 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 21 내지 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 21의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 경쇄 가변 영역; 서열번호 22의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 28의 경쇄 가변 영역; 서열번호 23의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 29의 경쇄 가변 영역; 서열번호 24의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변 영역; 서열번호 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 경쇄 가변 영역; 또는 서열번호 26의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 32의 경쇄 가변 영역 포함하는 것, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 서열번호 21에서 56번째 및 57번째 Xaa는 글리신(Gly) 또는 알라닌(Ala)일 수 있다. 상기 서열번호 23에서 1번째 Xaa는 글루타민(Gln) 또는 글루타메이트(Glu)일 수 있고, 7번째 Xaa는 세린(Ser) 또는 프롤린(Pro)일 수 있고, 12번째 Xaa는 발린(Val) 또는 알라닌(Ala)일 수 있고, 27번째 Xaa는 티로신(Tyr) 또는 히스티딘(His)일 수 있고, 58번째 Xaa는 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr)일 수 있고, 61번째 Xaa는 아스파라긴(Asn) 또는 세린(Ser)일 수 있고, 74번째 Xaa는 아르기닌(Arg) 또는 라이신(Lys)일 수 있고, 83번째 Xaa는 페닐알라닌(Phe) 또는 류신(Leu)일 수 있고, 92번째 Xaa는 글리신(Gly) 또는 알라닌(Ala)일 수 있고, 108번째 Xaa는 히스티딘(His) 또는 티로신(Tyr)일 수 있다. 상기 서열번호 27에서 53번째 Xaa는 이소류신(Ile) 또는 페닐알라닌(Phe)일 수 있다. 상기 서열번호 29에서 29번째 Xaa는 메티오닌(Met) 또는 이소류신(Ile)일 수 있고, 51번째 Xaa는 알라닌(Ala) 또는 세린(Ser)일 수 있고, 79번째 Xaa는 글루타메이트(Glu) 또는 아스파트산(Asp)일 수 있고, 106번째 Xaa는 메티오닌(Met) 또는 이소류신(Ile)일 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 복수 개의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것으로서, 1번 세트 중 하나 및 2번 세트 중 하나; 1번 세트 중 하나 및 3번 세트 중 하나; 및 2번 세트 중 하나 및 3번 세트 중 하나로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 조합일 수 있다. 상기 1번 세트는 서열번호 21의 VH 및 서열번호 27의 VL, 및 서열번호 22의 VH 및 서열번호 28의 VL을 포함하는 BAG2 단백질의 중간 영역에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 2번 세트는 서열번호 23의 VH 및 서열번호 29의 VL, 및 서열번호 24의 VH 및 서열번호 30의 VL을 포함하는 BAG2 단백질의 N-말단에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 3번 세트는 서열번호 25의 VH 및 서열번호 31의 VL, 및 서열번호 26의 VH 및 서열번호 32의 VL을 포함하는 BAG2 단백질의 C-말단에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단일클론성(monoclonal) 항체일 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 검출가능한 표지 또는 검출가능한 신호를 방출할 수 있는 표지로 표지된 것일 수 있다. 상기 표지는 표지된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생성하도록 항체에 직접 또는 간접적으로 콘쥬게이션된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 상기 표지는 그 자체로 검출가능할 수 있고, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매화할 수 있다. 상기 표지는 면역형광 표지, 화학발광 표지, 인광 표지, 방사선 표지, 에피토프 태그, 아비딘/비오틴, 콜로이드 금 입자, 착색 입자, 자석 입자, 발색단 표지, ECL 표지, 효소 등일 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 기탁번호 KCTC 13737BP, KCTC 13738BP, KCTC 13739BP, KCTC 13740BP, KCTC 13741BP, KCTC 13742BP, KCTC 13743BP, KCTC 13744BP, KCTC 13745BP 및 KCTC 13746BP으로 기탁된 하이브리도마 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 것일 수 있다. 상기 하이브리도마 세포(hybridoma cell)는 2종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 종양성을 갖는 잡종세포를 의미하며, 일반적으로 면역된 개체로부터 분리한 B 세포와 형질세포종 세포와 융합함으로써 항체를 배양에서 계속적으로 생산하기 위해 이용될 수 있다. 상기 하이브리도마 세포는 혼성세포 또는 융합세포와 혼용될 수 있다.

본 발명자는 서열번호 21의 VH 및 서열번호 27의 VL(2A11, 4C2, 8C4); 서열번호 22의 VH 및 서열번호 28의 VL(3B5); 서열번호 23의 VH 및 서열번호 29의 VL(9B3, 9B12, 3B10); 서열번호 24의 VH 및 서열번호 30의 VL(10H7); 서열번호 25의 VH 및 서열번호 31의 VL(3G8); 및 서열번호 26의 VH 및 서열번호 32의 VL(3F12)을 포함하는 항-BAG2 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정하였다. 상기 동정된 항-BAG2 항체가 유방암 세포에서 항원-항체 반응을 나타냄을 확인하였다.

상기 폴리뉴클레오티드는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열번호 11 내지 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 세포에서 상기　폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 것일 수 있다. 상기 세포는 진핵세포 또는 원핵세포일 수 있다. 상기 진핵세포는 포유류 세포, 식물 세포, 효모 세포, 또는 곤충 세포일 수 있다. 상기 포유류는 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터 또는 마우스일 수 있다. 상기 원핵세포는 박테리아 세포일 수 있다. 상기 박테리아는 대장균 일 수 있다. 상기 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 상기 발현 벡터는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 상기 폴리뉴클레오티드가 적절한 조절 영역에 작동 가능하도록 연결된 것일 수 있다. 상기 조절 영역은 프로모터, 인핸서, 또는 터미네이터일 수 있다. 상기 벡터는 또한 선별마커를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 상기　항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는　폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 것, 또는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는　폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 것일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 검출가능한 표지 또는 검출가능한 신호를 방출할 수 있는 표지가 컨쥬게이션된 것일 수 있다. 상기 표지는 형광 색소, 인광 색소, 방사선동위체, 발색단, 양자점, 소광체, 자성비드 나노입자, 금 나노입자, 나노인광체, 실리콘 나노입자, 발광성을 갖는 반도체 미립자 등일 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 색소는 시아닌(시아닌2), 아미도메틸 쿠마린, 플루오로세인, 인도 카르보시아닌(시아닌3), 시아닌3.5, 테트라메틸 로다민, 로다민 레드, 텍사스 레드, 인도 카르보시아닌(시아닌5), 시아닌5.5, 시아닌7, 오이스터 등일 수 있다. 예를 들어, 상기 반도체 미립자는 카드뮴 셀레늄(CdSe), 카드뮴 텔루륨(CdTe), 인듐 갈륨인(InGaP), 실버 인듐 황화아연(AgInZnS) 등일 수 있다. 상기 표지를 컨쥬게이션 하는 방법은 폴리뉴클레오티드 3'말단에 표지 물질을 결합시키는 방법, 5'말단에 표지 물질을 결합시키는 방법, 표지 물질이 결합한 뉴클레오티드를 상기 폴리뉴클레오티드에 포함시키는 방법일 수 있다. 3'말단 또는 5'말단에 표지를 컨쥬게이션 하는 방법에서는 효소 반응을 사용할 수 있으며, 상기 효소는 T4 RNA 리가아제, 말단전이효소, 폴리A중합효소 등일 수 있다. 상기 표지는 형광현미경, 주사전자현미경, 투과전자현미경, 컴퓨터 단층촬영, 자기공명영상 등으로 검출할 수 있다.

다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 숙주세포는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 박테리아 세포, 효모 세포, 균류 세포, 곤충 세포, 동물 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 상기 박테리아 세포는 대장균, 스트렙토미세스 또는 살모넬라 티피뮤리움일 수 있다. 상기 효모 세포는 피치아 파스토리스일 수 있다. 상기 곤충 세포는 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포일 수 있다. 상기 동물 세포는 중국 햄스터 난소 세포(chinese hamster ovary cells: CHO), 마우스 골수종(SP2/0), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, 마우스 골수종(NSO), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, 베이비 햄스터 신장세포(baby hamster kidney cells: BHK), 인간 배아신장 세포(human embryonic kidney cells: HEK), PERC.6(인간망막세포)일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 숙주세포 내로 도입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 상기　항체를 코딩하는　폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 형질전환과 혼용될 수 있다.

다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 숙주세포를 배양하는 단계; 및 얻어진 배양물로부터 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 숙주세포에 대해서는 상기한 바와 같다.

상기 배양하는 단계는 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양 조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함할 수 있다.

상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.

상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산 글리렐롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 질소원은, 예를 들면 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 태두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 및 상응하는 소듐-함유 염, 항산마그네슘 또는 항산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 도는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 숙주세포의 배양 중에서 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 숙주세포의 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 잇다.

상기 세포는 호기, 미호기, 또는 혐기 조건에서 배양될 수 있다. 상기 미호기 조건은 대기 중 산소의 수준보다 낮은 수준의 산소가 배지 중으로 용해되는 배양 조건을 의미한다. 상기 낮은 수준의 산소는 예를 들면, 0.1% 내지 10%, 1% 내지 9%, 2% 내지 8%, 3% 내지 7%, 또는 4% 내지 6%일 수 있다. 또한, 미호기 조건은 예를 들면, 배지 중의 용존 산소 농도가 0.9 ppm에서 3.6ppm인 것일 수 있다. 배양 온도는 예를 들면, 20℃ 내지 45℃ 또는 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양 기간은 원하는 목적의 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 원하는 만큼 얻어질 때까지 지속될 수 있다.

상기 분리하는 단계는 항체의 분리에 대하여 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 분리하는 단계는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해, 및 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 수행하는 것을 포함할 수 있다.

상기 방법은 분리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 표지하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 표지는 면역형광 표지, 화학발광 표지, 인광 표지, 방사선 표지, 에피토프 태그, 아비딘/비오틴, 콜로이드 금 입자, 착색 입자, 자석 입자, 발색단 표지, ECL 표지, 효소 등일 수 있다.

일 양상에 따른 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다양한 길이의 BAG2 폴리펩티드 또는 그의 단편과 항원-항체 반응을 일으킬 수 있다.

다른 양상에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그를 포함하는 숙주세포는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생산하는데 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 항체 또는 그의 항원 결합을 생산하는 방법에 의하면, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 10종의 마우스 하이브리도마 세포로부터 생산된 항-BAG2 항체의 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 항-BAG2 항체의 전장 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대한 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 각각의 항-BAG2 항체가 반응하는 BAG2 도메인을 나타낸 도면이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 항-BAG2 항체의 선발, 서열 분석 및 이의 항원-항체 반응 확인

1. BAG2를 표적으로 하는 단일클론성 항체의 선발 및 아미노산 서열의 분석

본 발명자들은 BAG2를 표적으로 하는 항체를 선발하고, 그의 아미노산 서열을 분석하고, 각 항체의 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)을 결정하였다.

구체적으로, 서열번호 69의 아미노산 서열로 이루어진 인간 BAG2 단백질을 코딩하는 서열번호 70의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 유전자를 pCAGGS 플라스미드에 클로닝하여 선형화한 후, 상기 선형화된 컨스트럭트(construct)를 전기충격을 가하여 5마리의 6주령 암컷 BALB/c 마우스의 근육으로 접종하였다. 컨스트럭트를 3주 간격으로 3회 근육 내로 접종하였으며, PBS 100ul 내의 DNA 100ug으로 구성되었다. 이때, 대조군의 플라스미드 역시 동일한 방법으로 상기 과정을 수행하였다. 치료용 및 진단용 항체를 제작하기 위해, 단백질을 이용한 항원 주입법 보다 효율적인 DNA 백신 기반 면역화 전략을 수행했다. 마우스의 안저정맥총 또는 미정맥으로부터 채혈하여, 그 혈청 항체가를 나타내는 효소 면역 측정법으로 조사하고, 충분한 항체가를 나타낸 마우스로부터 최종면역 3일 후에 비장을 적출하였다. 비장에서 B 림프구를 분리한 다음, 분리된 B림프구를 배양한 골수종 세포 즉 ATCC의 SP2/0-Ag14 세포주와 융합시켜 융합된 세포를 얻었다. 융합된 세포를 히포잔틴(hypoxanthin), 아미노프테린(aminopterine) 및 티미딘(thymidine)이 첨가되어 있는 HAT 배지에서 배양한 후, 골수종과 B 림프구만이 융합된 하이브리도마 세포를 약 130 클론을 선별하여 얻었다. 면역 블로팅을 이용한 선발과정을 통해 얻어진 하이브리도마 세포 중에서, 인간 BAG2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 10개의 하이브리도마 세포를 얻었다.

상기 5x10⁶개의 하이브리도마 세포로부터 항-BAG2 항체의 총 RNA를 제조하고, 제조자의 지시에 따라 스마트 레이스(SMART RACE) cDNA 증폭 키트(Clontech)를 사용하여 100 ng 총 RNA로부터 5'-RACE-cDNA를 제조하였다. 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL) 코딩 영역을 PCR에 의해 증폭시키고, 상기에서 증폭된 유전자는 pGEM-T 벡터(Promega, USA)에 삽입하여 클로닝하고, 자동유전자분석기(ABI 프리즘 310, Applied Biosystem Co.)를 이용하여 뉴클레오티드 서열을 분석하였다. 분석된 유전자의 뉴클레오티드 서열은 기보고된 뉴클레오티드 서열과 비교하여 확인하였고, 확인된 뉴클레오티드 서열을 인위적으로 번역하여 상보성 결정 영역(VH-CDR1, -CDR2, -CDR3 및 VL-CDR1, -CDR2, -CDR3)의 서열 결정에 이용하였다. 상보성 결정 영역의 서열 결정은 Kabat's 데이터 베이스를 이용하였다 (http://www.bioinf.org.uk/abs/).

그 결과, 상기 하이브리도마 세포로부터 BAG2에 특이적으로 결합하는 10 종의 항-BAG2 항체 즉, 2A11, 4C2, 8C4, 3B5, 9B3, 9B12, 3B10, 10H7, 3G8 및 3F12 항체를 얻었다. 또한, 표 1 내지 3에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 이들의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열 및 상기 항체를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다.

2A11, 4C2, 및 8C4 항체는 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 2A11 항체는 서열번호 21에서 56번째 및 57번째 Xaa는 Gly이고, 서열번호 27에서 53번째 Xaa는 Ile이다. 4C2 항체는 서열번호 21에서 56번째 Xaa는 Gly이고, 57번째 Xaa는 Ala이고, 서열번호 27에서 53번째 Xaa는 Phe이다. 8C4 항체는 서열번호 21에서 56번째 Xaa는 Ala이고, 57번째 Xaa는 Gly이고, 서열번호 27에서 53번째 Xaa는 Phe이다.

또한, 2A11, 4C2, 및 8C4 항체의 VH-CDR1, -CDR2 및 -CDR3은 각각 서열번호 33, 39 및 45의 아미노산 서열로 이루어지고, VL-CDR1, -CDR2 및 -CDR3은 각각 서열번호 51, 57 및 63의 아미노산 서열로 이루어진다. 2A11 항체는 서열번호 21에서 56번째 및 57번째 Xaa는 Gly이다. 4C2 항체는 서열번호 21에서 56번째 Xaa는 Gly이고, 57번째 Xaa는 Ala이다. 8C4 항체는 서열번호 21에서 56번째 Xaa는 Ala이고, 57번째 Xaa는 Gly이다.

9B3, 9B12 및 3B10 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가 영역 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 9B3 항체는 서열번호 23에서 1번째 Xaa는 Glu이고, 7번째 Xaa는 Ser이고, 12번째 Xaa는 Val이고, 27번째 Xaa는 Tyr이고, 58번째 Xaa는 Ser이고, 61번째 Xaa는 Asn이고, 74번째 Xaa는 Lys이고, 83번째 Xaa는 Phe이고, 92번째 Xaa는 Ala이고, 108번째 Xaa는 Tyr이다. 9B3 항체는 서열번호 29에서 29번째 Xaa는 Ile이고, 51번째 Xaa는 Ala 이고, 79번째 Xaa는 Glu이고, 106번째 Xaa는 Ile이다. 9B12 항체는 서열번호 23에서 1번째 Xaa는 Gln이고, 7번째 Xaa는 Ser이고, 12번째 Xaa는 Val이고, 27번째 Xaa는 Tyr이고, 58번째 Xaa는 Ser이고, 61번째 Xaa는 Asn이고, 74번째 Xaa는 Arg이고, 83번째 Xaa는 Phe이고, 92번째 Xaa는 Gly이고, 108번째 Xaa는 His이다. 9B12 항체는 서열번호 29에서 29번째 Xaa는 Met이고, 51번째 Xaa는 Ala이고, 79번째 Xaa는 Glu이고, 106번째 Xaa는 Met이다. 3B10 항체는 서열번호 23에서 1번째 Xaa는 Gln이고, 7번째 Xaa는 Pro이고, 12번째 Xaa는 Ala이고, 27번째 Xaa는 His이고, 58번째 Xaa는 Thr이고, 61번째 Xaa는 Ser이고, 74번째 Xaa는 Arg이고, 83번째 Xaa는 Leu이고, 92번째 Xaa는 Gly이고, 108번째 Xaa는 His이다. 3B10 항체는 서열번호 29에서 29번째 Xaa는 Met이고, 51번째 Xaa는 Ser이고, 79번째 Xaa는 Asp이고, 106번째 Xaa는 Ile이다.

또한, 9B3, 9B12 및 3B10 항체의 VH-CDR1, -CDR2 및 -CDR3은 각각 서열번호 35, 41 및 47의 아미노산 서열로 이루어지고, VL-CDR1, -CDR2 및 -CDR3은 각각 서열번호 53, 59 및 65의 아미노산 서열로 이루어진다. 9B3 항체는 서열번호 35에서 2번째 Xaa는 Tyr이고, 서열번호 41에서 8번째 Xaa는 Ser이고, 서열번호 47에서 12번째 Xaa는 Tyr이고, 서열번호 53에서 3번째 Xaa는 Ile이고, 서열번호 59에서 2번째 Xaa는 Ala이다. 9B12 항체는 서열번호 35에서 2번째 Xaa는 Tyr이고, 서열번호 41에서 8번째 Xaa는 Ser이고, 서열번호 47에서 12번째 Xaa는 His이고, 서열번호 53에서 3번째 Xaa는 Met이고, 서열번호 59에서 2번째 Xaa는 Ala이다. 3B10 항체는 서열번호 35에서 2번째 Xaa는 His이고, 서열번호 41에서 8번째 Xaa는 Thr이고, 서열번호 47에서 12번째 Xaa는 His이고, 서열번호 53에서 3번째 Xaa는 Met이고, 서열번호 59에서 2번째 Xaa는 Ser이다.

항체명	VH 유전자의 뉴클레오티드 서열	VL 유전자의 뉴클레오티드 서열
2A11	서열번호 1	서열번호 11
4C2	서열번호 2	서열번호 12
8C4	서열번호 3	서열번호 13
3B5	서열번호 4	서열번호 14
9B3	서열번호 5	서열번호 15
9B12	서열번호 6	서열번호 16
3B10	서열번호 7	서열번호 17
10H7	서열번호 8	서열번호 18
3G8	서열번호 9	서열번호 19
3F12	서열번호 10	서열번호 20

항체명	VH 영역의 아미노산 서열	VL 영역의 아미노산 서열
2A11	서열번호 21	서열번호 27
4C2	서열번호 21	서열번호 27
8C4	서열번호 21	서열번호 27
3B5	서열번호 22	서열번호 28
9B3	서열번호 23	서열번호 29
9B12	서열번호 23	서열번호 29
3B10	서열번호 23	서열번호 29
10H7	서열번호 24	서열번호 30
3G8	서열번호 25	서열번호 31
3F12	서열번호 26	서열번호 32

항체명	VH-CDR1의 아미노산 서열	VH-CDR2의 아미노산 서열	VH-CDR3의 아미노산 서열	VL-CDR1의 아미노산 서열	VL-CDR2의 아미노산 서열	VL-CDR3의 아미노산 서열
2A11	서열번호 33	서열번호 39	서열번호 45	서열번호 51	서열번호 57	서열번호 63
4C2	서열번호 33	서열번호 39	서열번호 45	서열번호 51	서열번호 57	서열번호 63
8C4	서열번호 33	서열번호 39	서열번호 45	서열번호 51	서열번호 57	서열번호 63
3B5	서열번호 34	서열번호 40	서열번호 46	서열번호 52	서열번호 58	서열번호 64
9B3	서열번호 35	서열번호 41	서열번호 47	서열번호 53	서열번호 59	서열번호 65
9B12	서열번호 35	서열번호 41	서열번호 47	서열번호 53	서열번호 59	서열번호 65
3B10	서열번호 35	서열번호 41	서열번호 47	서열번호 53	서열번호 59	서열번호 65
10H7	서열번호 36	서열번호 42	서열번호 48	서열번호 54	서열번호 60	서열번호 66
3G8	서열번호 37	서열번호 43	서열번호 49	서열번호 55	서열번호 61	서열번호 67
3F12	서열번호 38	서열번호 44	서열번호 50	서열번호 56	서열번호 62	서열번호 68

2. 유방암 세포에서 항-BAG2 항체의 항원-항체 반응 확인

도 1은 10종의 마우스 하이브리도마 세포로부터 생산된 항-BAG2 항체의 면역 블로팅 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로, 인간 유방암 세포인 MDA-MB-231 세포는 37 ℃에서, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM(Welgene) 배지에서 배양하였다. 상기 세포를 웰로부터 수거하고 PBS로 세척하고, 1% Brij 97, 5mM EDTA, 0.02M HEPES pH 7.3, 0.15M NaCl, 1mM PMSF, 0.5mM NaF, 10 ㎍/㎖ 아프로티닌, 0.2mM 소듐 오르토바나데이트(sodium orthovanadate)가 함유된 용해 완충액에 용해시켰다. 얼음에서 15분 동안 배양한 후, 원심분리로 핵을 제거하고 상층액을 수거하였다. 20% 글리세롤, 4.6% SDS, 0.125M 트리스, pH 6.8, 0.1% 브로모페놀 블루로 구성되는 2X 시료 완충액을 적량의 상층액에 첨가하였다. 10 ug 단백질 시료는 mini-Protean Ⅱ 시스템(Bio-Rad Hercules, CA)을 이용하여 표준 조건 하에 12% 겔에서 SDS-PAGE 분석을 실시하였다. 면역 블로팅을 위하여, 단백질은 PVDF 막인 밀리포어로 이전시켰다. TBS에 넣은 0.1% Tween 20 및 5% 소혈청 알부민(Bovine serum albumin: BSA)으로 구성되는 차단 용액(blocking solution)을 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 1차 항체는 하이브리도마 세포 배양액에서 추출한 항-BAG2 항체를 1/2000 희석 농도로 사용하였고, 2차 항체로 사용된 염소 항-마우스 HRP 공액체(Dako)는 1/5000 희석 농도로 사용하였다. 기질로 ECL 시약(Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 암실에서 필름 감광하였다. 감광된 띠는 표준 분자 마커와 비교하여 BAG2의 사이즈에 해당하는 띠를 확인하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군으로 사용된 상업적 다클론성 항-BAG2 항체인 ab58682(Abcam)와 비교하여, 상기 항체 2A11, 3B5, 3B10, 3F12, 3G8, 4C2, 8C4, 9B3, 9B12 및 10H7은 BAG2를 표적으로 하여 항원-항체 반응을 나타내었다.

다음으로, 상기 1절에서 동정된 10종의 항체가 결합하는 BAG2 항원의 도메인 맵핑(domain mapping)을 위해, 약 26 kDa 분자량을 가지는 GST-Empty 벡터(pcDNA3.1+/GST vector, NovoPro Bioscience Inc. China)가 도입된 세포를 음성 대조군으로 이용하였다. 인간 BAG2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 BAG2 단백질의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 GST-Bag Full 벡터, GST-Bag F1 벡터, GST-Bag F2 벡터, GST-Bag F3 벡터, 및 GST-Bag F4 벡터를 세포에 도입하고, 상기 벡터가 도입된 세포를 배양하여 상기 유전자를 발현시킨 후, 세포 파쇄물을 얻었다. 세포 파쇄물에 대하여 상기 10종의 항체 각각을 사용하여 면역 블로팅을 수행하였다. 인간 BAG2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 70의 염기 서열을 갖는다. GST-Bag F1, -Bag F2, -Bag F3, -Bag F4 벡터는 각각 서열번호 71 내지 74의 염기 서열로 이루어진 것이다.

도 2는 항-BAG2 항체의 전장 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대한 면역 블로팅 결과를 나타낸 도면이다. 도 2에서 A는 벡터 및 BAG2 단백질 및 그의 단편을 도식적으로 나타낸 것이고, B 는 면역 블로팅 결과이다. 구체적으로, 상기 면역 블로팅은 상기 각 벡터를 HEK293T 세포에 리포펙타민 형질전환(lipofectamine transfection, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) 방법을 사용하여 도입하고, 얻어진 형질전환된 세포를 37 ℃에서, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM(Welgene) 배지에서 30시간 동안 배양한 후 세포를 분리하였다. 분리된 세포는 도 1과 동일한 방법을 사용하여 파쇄하고 12% 겔에서 SDS-PAGE 분석을 실시하였다. 면역 블로팅을 위하여, 도 1과 동일한 차단 용액(blocking solution)으로 1시간 동안 반응시킨 후, 1차 항체로 2 mg/ml 농도의 정제된 10종 각 항-BAG2 항체를 1/10000 희석하여 결합하였다. 2차 항체로 사용된 염소 항-마우스 HRP 공액체는 1/5000 희석 농도로 사용하였고, 기질로 ECL 시약(Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 암실에서 필름 감광하였다. BAG2의 사이즈를 확인하기 위해 표준 분자 마커 사이즈를 표현하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 각각의 항-BAG2 항체는 전장 BAG2 폴리펩티드 또는 그의 단편과 차별적으로 결합하였다. 특히, 10종의 항-BAG2 항체 모두 GST-Bag Full 벡터가 도입된 세포 파쇄물에서 약 50 KDa 위치에서 공통적으로 신호가 검출되고 있으며, 이는 이들 항체 모두가 전장 BAG2 폴리펩티드와 결합할 수 있음을 나타낸다. 최종적으로, 각각의 항-BAG2 항체가 반응하는 BAG2의 도메인 영역을 확인하였다.

도 3은 각각의 항-BAG2 항체가 반응하는 BAG2 도메인을 나타낸 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 9B3, 9B12, 3B10 및 10H7 항체는 BAG2 단백질의 N-말단에 결합하였고, 2A11, 3B5, 4C2 및 8C4 항체는 중간 영역, 3F12 및 3G8 항체는 C-말단에 결합하였다. 상기 N-말단은 21-60 아미노산의 코일드 코일 영역을 공통적으로 포함하고 있으며, 상기 중간 영역은 109-189 아미노산의 BNB 영역의 일부와 결합한다. 따라서, 서로 다른 부위에 결합하는 항체의 세트를 사용함으로써, 시료 중에 존재하는 BAG2 단백질 또는 그 단편을 높은 민감도, 및 특이도로 검출할 수 있다.

한국생명공학연구원

KCTC13737BP

20181128

한국생명공학연구원

KCTC13738BP

20181128

한국생명공학연구원

KCTC13739BP

20181128

한국생명공학연구원

KCTC13740BP

20181128

한국생명공학연구원

KCTC13741BP

20181128

한국생명공학연구원

KCTC13742BP

20181128

한국생명공학연구원

KCTC13743BP

20181128

한국생명공학연구원

KCTC13744BP

20181128

한국생명공학연구원

KCTC13745BP

20181128

한국생명공학연구원

KCTC13746BP

20181128

<110> Medpacto Inc. <120> A Composition comprising antibody specifically binding to BAG2 for the diagnosis of cancer and method using the same <130> PN125299KR <160> 74 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A11-VH <400> 1 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60 tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagact 120 cctgtgcatg gcctggaatg gattggagtt attgatcctg aaactggtgc tactgcctac 180 aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag tacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aagagggaaa 300 ttttattact ccggtcggga ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 2 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4C2-VH <400> 2 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60 tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagact 120 cctgtgcatg gcctggaatg gattggagtt attgatcctg aaactggtgc tactgcctac 180 aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag tacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aagagggaaa 300 ttttattact ccggtcggga ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 3 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8C4-VH <400> 3 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60 tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagact 120 cctgtgcatg gcctggaatg gattggagtt attgatcctg aaactgctgg tactgcctac 180 aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag tacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aagagggaaa 300 ttttattact ccggtcggga ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 4 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3B5-VH <400> 4 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagtta 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacacct tttactgggt gaggcagagc 120 catggagaga gccttgagtg gattggatat attgatcctt acaatggtgg taatacttat 180 aaccggaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagccttc 240 atgcatctca acagcctgac atctgaagac tctgcagtct attactgtgc gagagggtac 300 tataggtacg gggggggggg ggactttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360 tcctca 366 <210> 5 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9B3-VH <400> 5 gaggtccagc tgcaacaatc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aattacatga tagagtggat aaaacagagg 120 cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaagtggtgg tagttattac 180 aatgagaagg tcaagggcaa ggcaacactg accgcagaca aatcctccag cactgcctac 240 atgcagttca gcagcctgac agctgatgac tctgcggtct atttctgtcg gatctatggt 300 aactacaagg ggtactttga ctattggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357 <210> 6 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9B12-VH <400> 6 caggtccaac tgcagcagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aattacatga tagagtggat aaaacagagg 120 cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaagtggtgg tagttataac 180 aatgagaagg tcaagggcaa ggcaacactg accgcagaca gatcctccag cactgcctac 240 atgcagttca gcagcctgac agctgatgac tctggggtct atttctgtcg gatctatggt 300 aactacaagg ggtactttga ccattggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357 <210> 7 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3B10-VH <400> 7 caggtccaac tgcagcagcc tggagctgag ctggcaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcca cgccttcact aattacatga tagagtggat aaaacagagg 120 cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaagtggtgg tacttataac 180 agtgagaagg tcaagggcaa ggcaacactg accgcagaca gatcctccag cactgcctac 240 atgcagctca gcagcctgac agctgatgac tctggggtct atttctgtcg gatctatggt 300 aactacaagg ggtactttga ccattggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357 <210> 8 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10H7-VH <400> 8 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa ttcactgggt gaggcaggct 120 ccaggaaagg gttttaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180 gcagatgact tcaagggacg gtttgccctc tctttggaaa cctctgccag cactgcctac 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc tagatttgac 300 tacggtacta gttactggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 9 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G8-VH <400> 9 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctgggta tagcttcaca aagtatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg atatcaagtg gatggggtgg ataaacacca acactggaga ggcaacatat 180 ggtgaagagg tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagattggga 300 ttgaggtacc ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351 <210> 10 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F12-VH <400> 10 caggtgcaac tgcaggagtc aggacctgac ctggtgaaac cttctcagtc actttcactc 60 acctgcactg tcactgggta ctccatcacc agtggttata gctggcactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaattgga atggatgggc tacatatatt atagaggtag cactaactac 180 aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240 ctgctgttga aatctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagagaggct 300 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tcagca 336 <210> 11 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A11-VL <400> 11 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagtattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ttcaaggttc acaggttcct 300 ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 12 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4C2-VL <400> 12 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagtattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgttct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ttcaaggttc acaggttcct 300 ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 13 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8C4-VL <400> 13 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagtattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgttct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ttcaaggttc acaggttcct 300 ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 14 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3B5-VL <400> 14 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatccagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatcc acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt tatttctgct ctcaaaatac acatattcct 300 ccgacgttcg ctggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 15 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9B3-VL <400> 15 gaggtccagc tgcaacaatc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aattacatga tagagtggat aaaacagagg 120 cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaagtggtgg tagttattac 180 aatgagaagg tcaagggcaa ggcaacactg accgcagaca aatcctccag cactgcctac 240 atgcagttca gcagcctgac agctgatgac tctgcggtct atttctgtcg gatctatggt 300 aactacaagg ggtactttga ctattggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357 <210> 16 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9B12-VL <400> 16 gacattgtga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacatgaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240 gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag aatgatgagt ttccattcac gttcggctcg 300 gggacaaagc tggaaatgaa g 321 <210> 17 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3B10-VL <400> 17 gacattgtga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacatgaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt tcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggactat 240 gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag aatgatgagt ttccattcac gttcggctcg 300 gggacaaagc tggaaataaa a 321 <210> 18 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10H7-VL <400> 18 gatgtccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagccacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaaccc 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacacta ccccgctcac tttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgtggagga gccagcctcg tggaattcaa g 351 <210> 19 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G8-VL <400> 19 gacattgtga tgacccagtc tcctgcttcc ttagttgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctgact atagttatat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acaataggga gcttcctccc 300 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333 <210> 20 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F12-VL <400> 20 gatgttttga tgacccaaac tccactcact ttgtcggtta cctttgggca gccagcctcc 60 atctcttgca ggtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gagagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336 <210> 21 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A11,4C2,8C4-VH <220> <221> VARIANT <222> (56)..(57) <223> Xaa is Gly or Ala <400> 21 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Pro Glu Thr Xaa Xaa Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Lys Phe Tyr Tyr Ser Gly Arg Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3B5-VH <400> 22 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Phe Tyr Trp Val Arg Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Asn Thr Tyr Asn Arg Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Asp Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9B3,9B12,3B10-VH <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa is Glu or Gln <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Xaa is Ser or Pro <220> <221> VARIANT <222> (12) <223> Xaa is Val or Ala <220> <221> VARIANT <222> (27) <223> Xaa is Tyr or His <220> <221> VARIANT <222> (58) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (61) <223> Xaa is Asn or Ser <220> <221> VARIANT <222> (74) <223> Xaa is Arg or Lys <220> <221> VARIANT <222> (83) <223> Xaa is Phe or Leu <220> <221> VARIANT <222> (92) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> VARIANT <222> (108) <223> Xaa is His or Tyr <400> 23 Xaa Val Gln Leu Gln Gln Xaa Gly Ala Glu Leu Xaa Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Xaa Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Met Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Xaa Tyr Tyr Xaa Glu Lys Val 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Xaa Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Xaa Ser Ser Leu Thr Ala Asp Asp Ser Xaa Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Arg Ile Tyr Gly Asn Tyr Lys Gly Tyr Phe Asp Xaa Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10H7-VH <400> 24 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Thr Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G8-VH <400> 25 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Lys Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Asp Ile Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Gly Glu Glu Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Leu Arg Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F12-VH <400> 26 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Leu Leu Lys Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 100 105 110 <210> 27 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A11,4C2,8C4-VL <220> <221> VARIANT <222> (53) <223> Xaa is Ile or Phe <400> 27 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Xaa Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser Gln Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3B5-VL <400> 28 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Phe Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Ile Pro Pro Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9B3,9B12,3B10-VL <220> <221> VARIANT <222> (29) <223> Xaa is Met or Ile <220> <221> VARIANT <222> (51) <223> Xaa is Ala or Ser <220> <221> VARIANT <222> (79) <223> Xaa is Glu or Asp <220> <221> VARIANT <222> (106) <223> Xaa is Met or Ile <400> 29 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Xaa Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Xaa Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Xaa Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Asp Glu Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Xaa Lys 100 105 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10H7-VL <400> 30 Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 31 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G8-VL <400> 31 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Val Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Asp Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Val Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Asn Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 32 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F12-VL <400> 32 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Phe Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A11,4C2,8C4-VHCDR1 <400> 33 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3B5-VHCDR1 <400> 34 Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Thr 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9B3,9B12,3B10-VHCDR1 <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa is Tyr or His <400> 35 Gly Xaa Ala Phe Thr Asn Tyr Met 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10H7-VHCDR1 <400> 36 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G8-VHCDR1 <400> 37 Gly Tyr Ser Phe Thr Lys Tyr Gly 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F12-VHCDR1 <400> 38 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Ser 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A11,4C2,8C4-VHCDR2 <220> <221> VARIANT <222> (6)..(7) <223> Xaa is Gly or Ala <400> 39 Ile Asp Pro Glu Thr Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3B5-VHCDR2 <400> 40 Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Asn 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9B3,9B12,3B5-VHCDR2 <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> Xaa is Ser or Thr <400> 41 Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Xaa 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10H7-VHCDR2 <400> 42 Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro 1 5 <210> 43 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G8-VHCDR2 <400> 43 Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ala 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F12-VHCDR2 <400> 44 Ile Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr 1 5 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A11,4C2,8C4-VHCDR3 <400> 45 Thr Arg Gly Lys Phe Tyr Tyr Ser Gly Arg Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3B5-VHCDR3 <400> 46 Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9B3,9B12,3B10-VHCDR3 <220> <221> VARIANT <222> (12) <223> Xaa is Tyr or His <400> 47 Arg Ile Tyr Gly Asn Tyr Lys Gly Tyr Phe Asp Xaa 1 5 10 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10H7-VHCDR3 <400> 48 Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Thr Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G8-VHCDR3 <400> 49 Ala Arg Leu Gly Leu Arg Tyr Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F12-VHCDR3 <400> 50 Ala Arg Glu Ala Tyr 1 5 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A11,4C2,8C4-VLCDR1 <400> 51 Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3B5-VLCDR1 <400> 52 Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 53 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9B3,9B12,3B10-VLCDR1 <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> Xaa is Ile or Met <400> 53 Gln Asp Xaa Asn Ser Tyr 1 5 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10H7-VLCDR1 <400> 54 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G8-VLCDR1 <400> 55 Lys Ser Val Ser Thr Ser Asp Tyr Ser Tyr 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F12-VLCDR1 <400> 56 Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Thr Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A11,4C2,8C4-VLCDR2 <400> 57 Lys Val Ser 1 <210> 58 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3B5-VLCDR2 <400> 58 Lys Val Ser 1 <210> 59 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9B3,9B12,3B10-VLCDR2 <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa is Ala or Ser <400> 59 Arg Xaa Asn 1 <210> 60 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10H7-VLCDR2 <400> 60 Ala Ala Ser 1 <210> 61 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G8-VLCDR2 <400> 61 Leu Ala Ser 1 <210> 62 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F12-VLCDR2 <400> 62 Leu Val Ser 1 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A11,4C2,8C4-VLCDR3 <400> 63 Phe Gln Gly Ser Gln Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3B5-VLCDR3 <400> 64 Ser Gln Asn Thr His Ile Pro Pro Thr 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9B3,9B12,3B10-VLCDR3 <400> 65 Leu Gln Asn Asp Glu Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10H7-VLCDR3 <400> 66 Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G8-VLCDR3 <400> 67 Gln His Asn Arg Glu Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F12-VLCDR3 <400> 68 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 69 <211> 211 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Met Ala Gln Ala Lys Ile Asn Ala Lys Ala Asn Glu Gly Arg Phe Cys 1 5 10 15 Arg Ser Ser Ser Met Ala Asp Arg Ser Ser Arg Leu Leu Glu Ser Leu 20 25 30 Asp Gln Leu Glu Leu Arg Val Glu Ala Leu Arg Glu Ala Ala Thr Ala 35 40 45 Val Glu Gln Glu Lys Glu Ile Leu Leu Glu Met Ile His Ser Ile Gln 50 55 60 Asn Ser Gln Asp Met Arg Gln Ile Ser Asp Gly Glu Arg Glu Glu Leu 65 70 75 80 Asn Leu Thr Ala Asn Arg Leu Met Gly Arg Thr Leu Thr Val Glu Val 85 90 95 Ser Val Glu Thr Ile Arg Asn Pro Gln Gln Gln Glu Ser Leu Lys His 100 105 110 Ala Thr Arg Ile Ile Asp Glu Val Val Asn Lys Phe Leu Asp Asp Leu 115 120 125 Gly Asn Ala Lys Ser His Leu Met Ser Leu Tyr Ser Ala Cys Ser Ser 130 135 140 Glu Val Pro His Gly Pro Val Asp Gln Lys Phe Gln Ser Ile Val Ile 145 150 155 160 Gly Cys Ala Leu Glu Asp Gln Lys Lys Ile Lys Arg Arg Leu Glu Thr 165 170 175 Leu Leu Arg Asn Ile Glu Asn Ser Asp Lys Ala Ile Lys Leu Leu Glu 180 185 190 His Ser Lys Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Gln Gln Asn Ala Glu Ser 195 200 205 Arg Phe Asn 210 <210> 70 <211> 636 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 atggctcagg cgaagatcaa cgctaaagcc aacgaggggc gcttctgccg ctcctcctcc 60 atggctgacc gctccagccg cctgctggag agcctggacc agctggagct cagggttgaa 120 gctttgagag aagcagcaac tgctgttgag caagagaaag aaatccttct ggaaatgatc 180 cacagtatcc aaaatagcca ggacatgagg cagatcagtg acggagaaag agaagaatta 240 aatctgactg caaaccgttt gatgggaaga actctcaccg ttgaagtgtc agtagaaaca 300 attagaaacc cccagcagca agaatcccta aagcatgcca caaggattat tgatgaggtg 360 gtcaataagt ttctggatga tttgggaaat gccaagagtc atttaatgtc gctctacagt 420 gcatgttcat ctgaggtgcc acatgggcca gttgatcaga agtttcaatc catagtaatt 480 ggctgtgctc ttgaagatca gaagaaaatt aagagaagat tagagactct gcttagaaat 540 attgaaaact ctgacaaggc catcaagcta ttagagcatt ctaaaggagc tggttccaaa 600 actctgcaac aaaatgctga aagcagattc aattag 636 <210> 71 <211> 270 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-Bag F1 vector <400> 71 atggctcagg cgaagatcaa cgctaaagcc aacgaggggc gcttctgccg ctcctcctcc 60 atggctgacc gctccagccg cctgctggag agcctggacc agctggagct cagggttgaa 120 gctttgagag aagcagcaac tgctgttgag caagagaaag aaatccttct ggaaatgatc 180 cacagtatcc aaaatagcca ggacatgagg cagatcagtg acggagaaag agaagaatta 240 aatctgactg caaaccgttt gatgggaaga 270 <210> 72 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-Bag F2 vector <400> 72 atggctcagg cgaagatcaa cgctaaagcc aacgaggggc gcttctgccg ctcctcctcc 60 atggctgacc gctccagccg cctgctggag agcctggacc agctggagct cagggttgaa 120 gctttgagag aagcagcaac tgctgttgag caagagaaag aaatccttct ggaaatgatc 180 cacagtatcc aaaatagcca ggacatgagg cagatcagtg acggagaaag agaagaatta 240 aatctgactg caaaccgttt gatgggaaga actctcaccg ttgaagtgtc agtagaaaca 300 attagaaacc cccagcagca agaatcccta aagcatgcca caaggattat tgatgaggtg 360 360 <210> 73 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-Bag F3 vector <400> 73 atggctcagg cgaagatcaa cgctaaagcc aacgaggggc gcttctgccg ctcctcctcc 60 atggctgacc gctccagccg cctgctggag agcctggacc agctggagct cagggttgaa 120 gctttgagag aagcagcaac tgctgttgag caagagaaag aaatccttct ggaaatgatc 180 cacagtatcc aaaatagcca ggacatgagg cagatcagtg acggagaaag agaagaatta 240 aatctgactg caaaccgttt gatgggaaga actctcaccg ttgaagtgtc agtagaaaca 300 attagaaacc cccagcagca agaatcccta aagcatgcca caaggattat tgatgaggtg 360 gtcaataagt ttctggatga tttgggaaat gccaagagtc atttaatgtc gctctacagt 420 gcatgttcat ctgaggtgcc acatgggcca 450 <210> 74 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-Bag F4 vector <400> 74 atggctcagg cgaagatcaa cgctaaagcc aacgaggggc gcttctgccg ctcctcctcc 60 atggctgacc gctccagccg cctgctggag agcctggacc agctggagct cagggttgaa 120 gctttgagag aagcagcaac tgctgttgag caagagaaag aaatccttct ggaaatgatc 180 cacagtatcc aaaatagcca ggacatgagg cagatcagtg acggagaaag agaagaatta 240 aatctgactg caaaccgttt gatgggaaga actctcaccg ttgaagtgtc agtagaaaca 300 attagaaacc cccagcagca agaatcccta aagcatgcca caaggattat tgatgaggtg 360 gtcaataagt ttctggatga tttgggaaat gccaagagtc atttaatgtc gctctacagt 420 gcatgttcat ctgaggtgcc acatgggcca gttgatcaga agtttcaatc catagtaatt 480 ggctgtgctc ttgaagatca gaagaaaatt aagagaagat tagagactct gcttagaaat 540 540

Claims

BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 표 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진,
상보성 결정 영역인 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 상보성 결정 영역인 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 이들의 조합인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
[표 4]

.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 21 내지 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 27 내지 32으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
청구항 1에 있어서, 서열번호 21의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 경쇄 가변 영역; 서열번호 22의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 28의 경쇄 가변 영역; 서열번호 23의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 29의 경쇄 가변 영역; 서열번호 24의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변 영역; 서열번호 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 경쇄 가변 영역; 서열번호 26의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 32의 경쇄 가변 영역 포함하는 것, 또는 이들의 조합인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
청구항 1에 있어서, 단일클론성 항체인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
청구항 1에 있어서, 검출가능한 표지 또는 검출가능한 신호를 방출할 수 있는 표지로 표지된 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
청구항 1에 있어서, 기탁번호 KCTC 13737BP, KCTC 13738BP, KCTC 13739BP, KCTC 13740BP, KCTC 13741BP, KCTC 13742BP, KCTC 13743BP, KCTC 13744BP, KCTC 13745BP 및 KCTC 13746BP로 기탁된 하이브리도마 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하이브리도마 세포에 의해 생산될 수 있는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
청구항 1에 있어서, 복수 개의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
청구항 1, 및 3 내지 8 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
청구항 9에 있어서, 벡터인 것인 폴리뉴클레오티드.
청구항 10에 있어서, 검출가능한 표지 또는 검출가능한 신호를 방출할 수 있는 표지가 컨쥬게이션된 것인 폴리뉴클레오티드
청구항 9의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포.
청구항 12의 숙주세포를 배양하는 단계; 및
얻어진 배양물로부터 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생산하는 방법.
청구항 13에 있어서, 생산된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 표지하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.