CN111004326A - 一种抗amh单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗amh单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗AMH单克隆抗体的制备方法，包括AMH蛋白的制备、动物免疫、杂交瘤细胞的制备和单克隆抗体的制备，选择特定的AMH基因片段，优化了原核表达系统的条件，提高了蛋白的表达量和重组蛋白的纯度，筛选的杂交瘤细胞株可持久、高效分泌高性能的抗AMH单克隆抗体。本发明还公开了一种抗AMH单克隆抗体，均为IgG1亚型，抗体的一致性好，效价可达7.8ng/mL，免疫活性高、亲和力强、稳定性强。本发明还公开了一种上述单克隆抗体在免疫检测AMH产品中的应用，检测特异性强、灵敏度高、准确性好，可促进国产诊断试剂的发展，推动AMH检测的普及。

Description

一种抗AMH单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗AMH单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
抗苗勒管激素(anti-Mμllerian hormone,AMH)作为女性卵巢储备功能的评价以及辅助生殖技术中卵巢反应性评估的激素，是由睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞分泌。随着国内“二孩”政策的开放，评估高龄女性卵巢储备功能成为了辅助生殖技术中至关重要的一环。与其他临床常用卵巢功能的生物学指标相比AMH浓度相对稳定，研究表明抗苗勒管激素是评价卵巢储备功能的稳定指标，不受月经周期、口服避孕药、促性腺激素释放激素的影响，是评价卵巢储备功能最直接、准确的指标。血清AMH的水平与年龄呈负相关，其水平低于相应年龄段正常参考范围，则可认为卵巢早衰；高水平的AMH为多囊卵巢综合症的诊断提供依据。
AMH检测在临床上的应用具有广泛意义，是目前预测卵巢反应、评估卵巢刺激治疗效果的最理想生物标志物。早期建立的AMH检测方法是免疫细胞化学检测及RIA，无法应用于临床检测诊断。第一代AMHELISA检测技术已开始满足临床检测的需求，但没有统一的检测标准，其结果易受样品储存及反复冻融的影响，稳定性较差。Beckman的第二代AMH ELISA检测技术统一了AMH的检测标准。发展到今天，罗氏诊断及Beckman的全自动AMH ELISA检测技术，为AMH提供了相对准确、灵敏、快速、方便的检测方法。但国内AMH商品化检测系统发展较为落后，基本被国外顶级体外诊断试剂厂家所垄断；且AMH检测系统配置较高、普及率低，检测价格昂贵，不利于AMH检测的推广。进一步开发出高性能的抗体，将其应用于全自动免疫分析仪的试剂，甚至将其应用于免疫层析试纸条检测AMH，把AMH检测纳入常规临床检验，为中国女性及不孕症患者提供全方位的生殖健康管理势在必行。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种抗AMH单克隆抗体的制备方法，选取特定的AMH基因片段，优化了原核表达系统的条件，提高了蛋白的表达量和重组蛋白的纯度；同时优化了动物免疫处理及杂交瘤细胞等环节的参数，可以产生更高效价的抗体，制备的杂交瘤细胞株可持久、高效分泌高性能的抗AMH单克隆抗体。
本发明的目的之二在于提供一种上述方法制备的抗AMH单克隆抗体，均为IgG1亚型，抗体的一致性好，效价可达7.8ng/mL，免疫活性高、亲和力强。
本发明的目的之三在于提供一种上述AMH单克隆抗体在免疫检测AMH产品中的应用，抗体的稳定性强，检测特异性强、灵敏度高、准确性好，可促进国产诊断试剂的发展，摆脱昂贵进口试剂的束缚，并推动AMH检测的普及，让科学的评价手段惠及更多的人群。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种抗AMH单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
AMH蛋白的制备：将AMH基因片段插入pET-28a(+)质粒中，获得重组质粒表达载体；将所述重组质粒表达载体转入大肠杆菌中，然后在含有IPTG的LB液体培养基中25-37℃诱导培养4-6h，提取、纯化即得高纯度的AMH蛋白；所述AMH基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；
动物免疫：将45-55μg所述AMH蛋白与相同体积的福氏佐剂充分乳化后，于BALB/c小鼠背部皮下多点注射免疫三次，每次免疫时间间隔为14d，筛选体内抗体效价为1：(100000-128000)的小鼠作为免疫小鼠；
杂交瘤细胞的制备：对所述免疫小鼠腹腔注射不加佐剂的AMH重组蛋白95-105μg，提取脾细胞悬浮液与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，经选择性培养后，再进行3次亚克隆，即得能稳定分泌特异性抗AMH抗体的杂交瘤细胞；
单克隆抗体的制备：选取8-10周龄的BALB/c小鼠腹腔注射降酯烷，7d后接种所述杂交瘤细胞(0.8-1.2)×106个/只，抽取腹水，经提取、纯化后得到抗AMH单克隆抗体。
进一步地，所述IPTG在所述LB液体培养基中的终浓度为0.4-0.6mM；所述诱导培养的温度为37℃，所述诱导培养的时间为4h。
所述大肠杆菌为BL21(DE3)大肠杆菌。
所述小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞悬浮液的体积比为1:5。
所述AMH蛋白的纯化方法为NI-NTA亲和层析柱纯化。
优选地，所述免疫小鼠的效价为1:128000。
进一步地，所述选择性培养采用的培养基为添加有胎牛血清、次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶的DMEM培养基。
所述抗AMH单克隆抗体的纯化方法为Protein G亲和层析法。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现:
一种抗AMH单克隆抗体，由上述的抗AMH单克隆抗体的制备方法制备而成，所述抗AMH单克隆抗体为IgG1亚型。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
一种上述抗AMH单克隆抗体在免疫检测AMH产品中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明的抗AMH单克隆抗体，均为IgG1亚型，抗体的一致性好，效价可达7.8ng/mL，免疫能力强，具有稳定性好，活性高、亲和力强等优点，检测特异性强、灵敏度高、准确性好，可以用于全自动免疫分析仪的试剂盒中，也应用于免疫层析试纸条检测AMH，能够有效推动AMH检测的推广与应用，促进AMH检测纳入常规临床检验。
2、本发明利用大肠杆菌作为原核表达的表达系统，可构建出AMH基因的原核表达载体并诱导表达出AMH蛋白。大肠杆菌在37℃下易生成包涵体蛋白，蛋白表达量高；重组蛋白诱导培养时降低了IPTG浓度并延长了诱导时间，可以获得更多可溶蛋白，有益于后续提取纯化出更高纯度的AMH蛋白，减少动物免疫过程中免疫抗原AMH蛋白的纯度带来的影响。
3、本发明动物免疫时采用背部皮下多次多点注射的方法以提高小鼠血清的免疫效价，经过3次免疫的小鼠产生的抗体效价达1:128000，可认为此时小鼠体内产生抗AMH重组蛋白的抗体的能力较为活跃，可以制备得到产生抗AMH抗体性能优异的杂交瘤细胞；通过对杂交瘤细胞进行3次亚克隆，筛选到了2株能持久分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株分别为克隆细胞株3F6和4E7。本发明在小鼠腹腔注射杂交瘤细胞前，还注入了降植烷，可加速瘤细胞的生长。
附图说明
图1为实施例1中诱导AMH蛋白的SDS-PAGE分析图；M、蛋白Maker；
图2为实施例2中免疫小鼠血清中抗AMH蛋白抗体的效价图；
图3为实施例4中单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图；
图4为实施例5中单克隆抗体的效价检测图；
图5为实施例6中单克隆抗体亚型鉴定图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
一种抗AMH单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
AMH蛋白的制备：AMH基因序列插入pET-28a(+)质粒中，得到AMH-pET-28a(+)重组质粒表达载体，将重组质粒表达载体转入大肠杆菌中，然后在含有0.4-0.6mM IPTG的LB液体培养基中25-37℃诱导培养4-6h，提取、NI-NTA亲和层析柱纯化即得高纯度的AMH蛋白；
动物免疫：将45-55μg AMH蛋白与等体积的福氏佐剂充分乳化后，于BALB/c小鼠背部皮下多点注射免疫三次，每次免疫时间间隔为14d，筛选体内抗体效价为:1:(100000-128000)的小鼠作为免疫小鼠；
杂交瘤细胞的制备：对免疫小鼠腹腔注射不加佐剂的AMH重组蛋白95-105μg，提取脾细胞悬浮液与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，经选择性培养后，得到脾细胞-瘤细胞融合细胞，将脾细胞-瘤细胞融合细胞进行3次亚克隆，制得能稳定分泌特异性抗AMH抗体的杂交瘤细胞；
单克隆抗体的制备：选取8-10周龄的BALB/c小鼠腹腔注射降酯烷，7d后接种杂交瘤细胞1×106个/只，抽取腹水，经提取、Protein G亲和层析法纯化后得到抗AMH单克隆抗体。
作为进一步地优选方案，大肠杆菌为BL21(DE3)大肠杆菌，采用化学法使其成BL21分子伴侣感受态细胞。制备杂交瘤细胞时小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞悬浮液的体积比为1:5。
作为进一步地优选方案，上述选择性培养采用的培养基为添加20％胎牛血清、次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶的DMEM培养基。
一种抗AMH单克隆抗体，具体为IgG1亚型，包括重链和轻链。
一种上述抗AMH单克隆抗体在检测AMH试剂盒或免疫试纸条中的应用。
实施例1
AMH蛋白的制备与纯化
1)根据NCBI获取人源AMH全长序列，选取合适的AMH基因(抗苗勒管激素基因)片段，AMH基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
这里，AMH基因用于编码AMH蛋白，可以通过人工合成或者购买得到。
2)采用本领域常规的重组质粒构建方法，在表达载体pET-28a(+)质粒中接入步骤1)中的AMH基因片段，构建重组质粒表达载体；利用化学诱导法使大肠杆菌成为BL21分子伴侣感受态细胞，然后将构建的质粒表达载体转化于BL21分子伴侣感受态细胞中，得到穿刺菌。将穿刺菌置于含Kan(卡那霉素)的LB液体培养基中37℃培养12～16h，取菌液于含Kan的LB(Luria-Bertani)细菌培养基上划线，37℃过夜培养。挑选出平板中淡黄色菌落(内含重组质粒的大肠杆菌)，置于含Kan的LB液体培养基中培养4～6h。完成后将菌液分成两份，分别用于制备菌种和PCR扩增、电泳(SDS-PAGE)分析。经PCR鉴定和测序正确的菌液加入甘油，然后添加甘油并保存在-80℃，得到甘油菌。
上述Kan在LB培养基中的浓度为70mg/ml。
3)诱导制备AMH蛋白与纯化
AMH蛋白的诱导：
取步骤2)得到的甘油菌置于LB液体培养基中培养过夜，37℃、220rmp振摇至OD＝0.6，加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为0.5mM，继续诱导表达4h。收取菌体，制备电泳样品，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其AMH蛋白的表达情况，结果如图1泳道3所示；将收取的菌体经破碎、离心处理后保留上清(图1中泳道4)与沉淀(图1中泳道5)，经SDS-PAGE检测AMH蛋白的表达情况，结果如图1泳道4-5所示。
取甘油菌置于LB液体培养基中培养过夜，25℃、220rmp振摇至OD＝0.6，加入IPTG至终浓度为0.5mM，继续诱导表达4h。收取菌体，制备电泳样品，SDS-PAGE检测其AMH蛋白的表达情况，结果如图1泳道6所示；将收取的菌体经破碎、离心处理后保留上清(图1中泳道7)与沉淀(图1中泳道8)，经SDS-PAGE检测AMH蛋白的表达情况，结果如图1泳道7-8所示。
取500μl菌液作为负对照，37℃、220rmp振摇至OD＝0.6后，收取菌体，制备电泳样品，SDS-PAGE检测AMH重组蛋白的表达，结果如图1泳道1(诱导前)所示。
由图1可以看出，IPTG诱导后在约40kD处有一条明显的蛋白条带，负对照没有该条带。AMH蛋白诱导表达的最佳温度为37℃，该温度下包涵体条带更清晰，且杂质条带较少，说明该温度下易生成包涵体蛋白，蛋白表达量高。
AMH蛋白的纯化：
按照甘油菌在37℃下IPTG诱导表达4h后，收集菌体，将菌体破碎、离心处理，将得到的沉淀(包涵体)采用NI-NTA亲和层析柱进行纯化，制备高纯度的AMH蛋白。
实施例2
动物免疫实验
以实施例1纯化后的AMH蛋白为免疫原，首次免疫时，将50μg/只AMH蛋白与等体积的福氏佐剂充分乳化，于BALB/c小鼠背部皮下多点注射免疫。第二次、第三次免疫同样使用50μg AMH蛋白与等量不完全福氏佐剂，每次免疫的时间间隔为两周。在三次免疫的一周后，随机选择其中两只小鼠分别记为AMH-1#、AMH-2#，采血、分离血清进行间接ELISA以检测小鼠体内抗AMH蛋白抗体的效价，结果如图2所示。选免疫效价高的免疫小鼠取脾，准备杂交瘤细胞实验。
由图2可以看出，在1:128000处的OD值超过阴性对照(空白实验，未免疫AMH蛋白的小鼠血清)的OD值的2.1倍，而1:256000时，OD值小于阴性对照OD值的2.1倍，为阴性结果。即本发明经过3实施例1纯化后的AMH重组蛋白次免疫的小鼠产生的抗体效价达1:128000。
实施例3
细胞融合和杂交瘤细胞的筛选
在细胞融合前3d于小鼠腹腔注射不加佐剂的100μg AMH蛋白，以加强免疫。3d后，无菌环境下分离小鼠的脾脏，制备细胞悬液，将无血清、洗涤干净、状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞悬液以1:5比例混合，37℃，与PEG1450作用下进行融合。然后加入Dμlbecco改良Eagle(DMEM)培养基以终止融合，离心后加入20％胎牛血清-次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶-DMEM(FBS-HAT-DMEM)培养基选择性培养，并接种于96孔板中，置于培养箱中培养。在融合第11d，对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行上清检测，间接ELISA检测上清抗体效价。通过有限稀释法对阳性孔进行克隆化，以达到50～60个细胞/mL。经过3次亚克隆后，即得到两株能稳定分泌特异性抗AMH蛋白抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3F6、4E7。分别将杂交瘤细胞株3F6、4E7扩大培养，于液氮保存。使用前37℃水浴复苏杂交瘤细胞株。完全融化后离心，弃去上层液，转种于培养瓶中，置37℃、5％CO2温箱静置培养，观察生长情况。选取对数生长期的杂交瘤细胞，离心弃掉培养基，加入适量配制好的冻存液，将细胞分装到冻存管中。克隆增殖，细胞以梯度降温，然后转移到液氮中冻存。本实施例的杂交瘤细胞复苏后即可使用。
实施例4
单克隆抗体的制备
选取8-10周龄的BALB/c小鼠腹腔注射降酯烷，一周后分别接种复苏后的实施例3中的杂交瘤细胞3F6、4E7，接种量为1×106/只。待小鼠腹部明显膨大，处死小鼠后无菌抽取腹水，离心后收集中层腹水。利用饱和硫酸铵溶液沉淀粗提单克隆抗体，根据Protein G亲和层析操作说明对单克隆抗体进行纯化，收集纯化的抗AMH单克隆抗体。经SDS-PAGE电泳鉴定抗体纯度，结果如图3所示。图3中两个交瘤细胞株均可见55kD、25kD两条清晰的条带，其中位于55kD的为抗AMH重组蛋白抗体的重链，25kD为其轻链。
实施例5
使用间接法ELISA试剂盒检测实施例4中腹水中的单克隆抗体效价，具体步骤为：
A、包被：将实施例1中纯化的AMH蛋白以1μg/ml，100μl/孔包被酶标板，置于4℃孵育过夜。
B、封闭：用PBST洗净ELISA板，加入200μl/孔5％的脱脂奶粉，于37℃封闭2h，以占据固相中未被重组抗原包被的位点，减少非特异性反应。
C、反应：洗板后，加入倍比稀释浓度的实施例4中的单克隆抗体(分别为500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、15.6、7.8、0ng/ml)，100μl/孔，置于37℃孵育1h。
D、加入二抗：洗板后，加入适当稀释度的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，置于37℃孵育1h。
E、显色：加入TMB显色底物100μl/孔，反应10min。
F、终止：加入50μl 2mol/L硫酸终止液终止反应。
G、读数：酶标仪于450nm处，读取各孔OD值。
检测结果如图4所示，结果显示，小鼠腹水中抗体效价为7.8ng/ml，抗体免疫效果好。
实施例6
单克隆抗体的亚型鉴定
应用市售的小鼠单克隆抗体亚型检测试剂条对实施例4单克隆抗体的亚型进行检测，根据使用说明书操作，将70μl细胞培养上清加到试剂条的加样区，10min后，与参照卡比对，确定抗体亚型。结果如图5所示，可直观得出2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均为IgG1型。
上述实施方式仅为本发明专利的优选实施方式，不能以此来限定本发明专利保护的范围，本领域的技术人员在本发明专利的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明专利所要求保护的范围。
序列表
<110> 苏州博方生物技术有限公司
<120> 一种抗AMH单克隆抗体及其制备方法和应用
<130> 20191226
<141> 2019-12-27
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1680
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
atgcgggacc tgcctctcac cagcctggcc ctagtgctgt ctgccctggg ggctctgctg 60
gggactgagg ccctcagagc agaggagcca gctgtgggca ccagtggcct catcttccga 120
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gaggagcgca tcagcgcgca ccacgtgccc aacatggtgg ccaccgagtg tggctgccgg 1680

Claims (10)

1.一种抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
AMH蛋白的制备：将AMH基因片段插入pET-28a(+)质粒中，获得重组质粒表达载体；将所述重组质粒表达载体转入大肠杆菌中，然后在含有IPTG的LB液体培养基中25-37℃诱导培养4-6h，提取、纯化即得高纯度的AMH蛋白；所述AMH基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
动物免疫：将45-55μg所述AMH蛋白与相同体积的福氏佐剂充分乳化后，于BALB/c小鼠背部皮下多点注射免疫三次，每次免疫时间间隔为14d，筛选体内抗体效价为1：(100000-128000)的小鼠作为免疫小鼠；
杂交瘤细胞的制备：对所述免疫小鼠腹腔注射不加佐剂的AMH重组蛋白95-105μg，提取脾细胞悬浮液与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，经选择性培养后，再进行3次亚克隆，即得能稳定分泌特异性抗AMH抗体的杂交瘤细胞；
单克隆抗体的制备：选取8-10周龄的BALB/c小鼠腹腔注射降酯烷，7d后接种所述杂交瘤细胞(0.8-1.2)×106个/只，抽取腹水，经提取、纯化后得到抗AMH单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述IPTG在所述LB液体培养基中的终浓度为0.4-0.6mM；所述诱导培养的温度为37℃，所述诱导培养的时间为4h。
3.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21(DE3)大肠杆菌。
4.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞悬浮液的体积比为1:5。
5.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述AMH蛋白的纯化方法为NI-NTA亲和层析柱纯化。
6.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫小鼠的效价为1:128000。
7.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述选择性培养采用的培养基为添加有胎牛血清、次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶的DMEM培养基。
8.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗AMH单克隆抗体的纯化方法为Protein G亲和层析法。
9.一种抗AMH单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法制备而成,所述抗AMH单克隆抗体为IgG1亚型。
10.一种如权利要求9所述的抗AMH单克隆抗体在免疫检测AMH产品中的应用。
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