CN111647083B - 一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用 - Google Patents

一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其中轻链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区编码基因序列依次如SEQ ID NO.1‑3所示，且轻链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4‑6所示，所述重链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区编码基因序列依次如SEQ ID NO.7‑9，重链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQ ID NO.10‑12所示，本发明涉及基因工程方面单克隆抗体的制备技术领域。该重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用，该重组单抗结构明确、特异性强、稳定性更好，在多种检测方法中表现出高灵敏度，适合体外诊断试剂中的应用，批间差异小，抗体效价高，单位生产成本低。

Description

一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程方面单克隆抗体的制备技术领域，具体为一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用。
背景技术
抗体是生命科学领域最重要的科研工具之一，传统的抗体生产是通过免疫动物获得单克隆或多克隆抗体，如抗人血幼素（HJV）抗体的生产，多克隆抗体是通过向动物体内注射人血幼素（HJV）蛋白作为免疫原，获取免疫后的血清制得，理论上，只要该动物不死亡，抗体可以持续获取，单克隆抗体是用人血幼素（HJV）蛋白免疫宿主动物后，提取能识别该免疫原的B细胞，使其与骨髓瘤细胞融合，经过筛选培育出能永久增殖产生抗体的杂交瘤细胞。
与之对比的是，重组抗体的生产只需要前期免疫动物，或者甚至不需要免疫动物，仅通过一定的途径获取到抗人血幼素（HJV）抗体的序列（可进行杂交瘤细胞中目的基因的钓取或者人为设定基因序列，后期再通过检测手段验证表达的蛋白是否识别目标蛋白），再将目标序列插入到克隆载体中，进行大量扩增后，转入真核或原核细胞中培养表达，产生抗体，因为该抗体基因明确，即使细胞中途死亡，也可以通过重新转入基因序列，再次获得性能稳定的重组抗体。
因此，基于以上原理和生产工艺的不同，重组抗人血幼素（HJV）抗体相较于传统方式获取的抗体，在特异性、敏感性、批间差异性方面优势明显，这在很大程度上提高了科研实验的成功率，且重复性好，总言之，极大的节省了科研项目的人力、物力。
发明内容
（一）解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用，该重组单抗结构明确、特异性强、稳定性更好，在多种检测方法中表现出高灵敏度，适合体外诊断试剂中的应用。
（二）技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其中轻链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区编码基因序列依次如SEQ ID NO.1-3所示，且轻链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4-6所示，所述重链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，所述重链可变区编码基因序列依次如SEQ ID NO.7-9，且重链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQ ID NO.10-12所示。
本发明还公开了一种含有如权利要求1所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3编码基因的表达载体。
本发明还公开了一种含有如权利要求1所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3编码基因的表达载体。
本发明还公开了一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、用人血幼素抗原免疫小鼠，获得小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与SP20细胞进行融合制得杂交瘤细胞，提取总RNA，逆转录获得cDNA；
S2、以cDNA为模板，进行引物设计，扩增出对应抗体的重链可变区和轻链可变区的编码基因；
S3、将重链可变区编码基因转入含有重链恒定区基因的表达载体中，将轻链可变区编码基因转入含有轻链恒定区基因的表达载体中，完成质粒重组，重组后的质粒转入感受态细胞中，进行PCR扩增鉴定，然后安排测序；
S4、将鉴定及测序正确的质粒对应的菌液扩大培养并提取质粒，将携带重链和轻链基因的质粒共转染到哺乳动物细胞，收集所培养的细胞上清进行蛋白纯化，得到的即为重组小鼠抗人血幼素抗体。
优选的，所述步骤S2中以cDNA为模板，小鼠内参基因GAPDH为引物进行PCR扩增，扩增出长度为320bp的目的条带，则说明逆转录cDNA能够用于后续实验。
优选的，所述步骤S3中重组小鼠抗人血幼素抗体可变区扩增中引物设计的具体步骤为：通过多序列比对及简并引物设计，在前导肽和可变区的相对恒定区设计可扩增重组小鼠抗人血幼素抗体的可变区基因的引物。
优选的，所述步骤S3中重组小鼠抗人血幼素抗体可变区扩增中序列扩增的具体步骤为：通过以cDNA为模板，聚合酶链式反应扩增出可变区基因，然后通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。
本发明还公开了一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体在体外诊断试剂中的应用。
（三）有益效果
本发明提供了一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用。与现有技术相比具备以下有益效果：
（1）、该重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其中轻链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区编码基因序列依次如SEQ ID NO.1-3所示，且轻链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQ IDNO.4-6所示，重链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区编码基因序列依次如SEQ IDNO.7-9，且重链可变区翻译氨基酸序列依次如SEQ ID NO.10-12所示，本发明抗体蛋白质和基因结构明确，稳定性好，即使表达该抗体的细胞株不存在了，也可以重新制备能够表达该抗体的新细胞株，批间差异小，抗体效价高，抗体产量高，单位生产成本低；
（2）、该重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用，对人血幼素（HJV）抗原表位的识别率高，特异性好，对于组织中天然抗原和重组抗原均能够很好的识别。
附图说明
图1为本发明为小鼠脾脏细胞和SP20融合的杂交瘤细胞总RNA电泳示意图；
图2为本发明为小鼠脾脏细胞和SP20融合的杂交瘤细胞cDNA内参扩增电泳示意图；
图3为本发明轻链可变区扩增琼脂糖凝胶电泳示意图；
图4为本发明重链可变区扩增琼脂糖凝胶电泳示意图；
图5为本发明可变区基因片段的纯化琼脂糖凝胶电泳示意图；
图6为本发明纯化后的抗体SDS-PAGE电泳分析结果示意图；
图7为本发明小鼠抗人血幼素抗体活性检测结果示意图；
图8为本发明小鼠抗人血幼素抗体ELISA效价测定曲线拟合结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-8，本发明实施例提供一种技术方案：一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用，其生物材料来源：小鼠脾脏细胞（武汉百杰康生物科技有限公司）、SP2/0（武汉百杰康生物科技有限公司）、小鼠重链恒定区载体pBE27(武汉百杰康生物科技有限公司)、载体pET28a(+)(湖南丰晖生物科技有限公司)、小鼠轻链恒定区载体pBE28(武汉百杰康生物科技有限公司)，其他生物材料和试剂均为可直接购买的商品。
一．重组小鼠抗人白介素19（IL19）抗体可变区基因的钓取
1.杂交瘤细胞的RNA提取及逆转录得到cDNA
先通过人血幼素（HJV）抗原免疫小鼠，获得小鼠脾脏细胞，小鼠脾脏细胞与SP20融合获得杂交瘤细胞，Triz1法提取杂交瘤细胞RNA，经琼脂糖凝胶电泳可见清晰的28和18S条带，说明RNA完整性较好，RNA浓度和纯度测定结果为D(260nm)/D(280nm)=1.90，可以满足本实验要求，以RNA为模板反转录合成cDNA，以cDNA为模板，小鼠内参基因GAPDH为引物进行PCR扩增，扩增出长度为320bp的目的条带，说明逆转录cDNA可用于后续实验，参见图1-2，为小鼠脾脏细胞和SP20融合的杂交瘤细胞总RNA(图1)和cDNA内参扩增琼脂糖凝胶电泳(图2)。
2.重组小鼠抗人血幼素（HJV）抗体可变区扩增
引物设计：通过多序列比对及简并引物设计，在前导肽和可变区的相对恒定区设计可扩增重组小鼠抗人血幼素（HJV）抗体的可变区基因的引物。
序列扩增：以cDNA为模板，聚合酶链式反应扩增出可变区基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果参见图3-4：重链可变区基因长度为339bp，轻链可变区基因长度为615bp，与目的片段长度一致。
3.可变区基因片段的纯化及与pET28a(+)载体连接
通过胶回收试剂盒纯化PCR产物，将重链和轻链可变区基因片段分别与无缝载体进行连接，转化DH5α感受态，每一个连接物挑选4个单克隆，用特异性引物进行菌落PCR，目的片段大小339-600bp左右，如图5所示，挑取其中条带大小正确的3个阳性克隆菌送基因公司测序。
4.重组小鼠抗人血幼素（HJV）抗体的可变区序列测序结果
4.1轻链可变区测序结果如下所示：
GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGGTCAACTATAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGGCAGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCCACGGAGTAGTTACCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGATC
利用IMGT/QUEST在线分析软件，对轻链基因进行同源性比较，有效序列如下表1所示：
表1 轻链基因进行同源性比较的有效序列表
Figure 119518DEST_PATH_IMAGE001
重组小鼠抗人血幼素（HJV）抗体，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因依次如SEQ ID NO：1-3所示。
CDR1:tcaactataagttac
CDR2:gacacatcc
CDR3:cagccacggagtagttacccactcacg
轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因翻译成氨基酸序列依次如SEQ ID NO：4-6所示。
CDR1:STISY
CDR2:DTS
CDR3:QPRSSYPLT
4.2重链可变区测序结果如下所示：
Caggtcaaactgcaggagtctgggactgtgctggcagggcctggggctctggtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttgtcagctactggatgcactggataaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggcgctatttatcatggagatagtgatactagttacaaccagaagttcaagggcaaggtcaaactgactgcagtcacatccaccagcactgcctacatggagctcagcagcctgacaaatgaggacgctgcggtctattactgtacggatggtatggcttactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
利用IMGT/QUEST在线分析软件，对重链基因进行同源性比较，有效序列如下表2所示：
表2 重链基因进行同源性比较的有效序列表
Figure 692451DEST_PATH_IMAGE002
(a) Other possibilities: Musmus_IGHJ1*01 and Musmus_IGHJ1*03(highest number of consecutive identical nucleotides)。
重组小鼠抗人血幼素（HJV）抗体，重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因依次如SEQ ID NO：7-9所示。
CDR1:ggctacacctttgtcagctactgg
CDR2:atttatcatggagatagtgatact
CDR3:acggatggtatggcttac
重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因翻译成氨基酸序列依次如SEQ ID NO：10-12所示。
CDR1:GYTFVSYW
CDR2:IYHGDSDT
CDR3:TDGMAY
二．重组小鼠抗人血幼素（HJV）抗体真核表达纯化
将测序后的序列进行分析，挑选正确且有功能的重链和轻链可变区基因，根据测序结果设计第二套引物，以前面测序的基因为模板，进行2次PCR，使用限制性内切酶，酶切PCR产物，以及pBE27和pBE28，完成质粒重组，转入DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆并测序。将测序正确的质粒对应的菌液扩大培养并提取质粒。将携带重链和轻链基因的质粒以一定比例共转染哺乳动物细胞293F细胞或者CHO-S细胞，4-5天收集培养细胞上清进行 proteinA/G亲和层析纯化，纯化后的抗体SDS-PAGE电泳分析结果如图6，纯化后的抗体即为重组小鼠抗人血幼素（HJV）抗体。
三．重组小鼠抗人血幼素（HJV）抗体活性检测应用
3.1 western blot检测：以终浓度4ug/ml的重组小鼠抗人血幼素（HJV）抗体作为一抗，二抗为羊抗小鼠IgG（使用浓度0.1ug/ml），检测样本为人乳汁和重组人血幼素（HJV）蛋白，结果如图7所示，其中A泳道为人肝脏，B泳道为重组人血幼素（HJV）蛋白。结果显示，重组小鼠抗人血幼素（HJV）抗体可以很好的识别天然样本（45kd）和原核表达重组蛋白（20kd）。
3.2 ELISA效价测定：用重组人血幼素（HJV）（2μg/ml）包被酶标板，1%BSA封闭孵育后，重组小鼠抗人血幼素（HJV）单克隆抗体从1μg/ml按2倍梯度稀释共做13个梯度，将稀释后的重组抗体加入到包被的酶标板中，结果显示，重组小鼠抗人血幼素（HJV）单克隆抗体与重组人血幼素（HJV）可特异性结合，且有较好的量效关系，结果如表3所示，由图8进行曲线拟合可得到该重组小鼠抗人血幼素（HJV）单克隆抗体的EC50值为0.026μg/ml。
表3.ELISA检测重组小鼠抗人血幼素（HJV）单克隆抗体与重组人血幼素（HJV）的结合效价。
Figure 3347DEST_PATH_IMAGE003
序列表
重链测序结果CGCATGGGGGGGCTTATAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGGACTCTAGAGGATCGAACCCTTTAATACGACTCACTATAGGGAGCTAGCGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGATATCGAATTCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATAACCTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTATCCTGGTAGTGGTACTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGATCAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCCGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATACCATTACTACGGTGGTAGCGAGGAGTACTTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGCGTGCACACCTTTCCCGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCTCCAGCGTGACCGTGCCTTCCAGCACCTGGTCTAGCGAGACAGTGACCTGTAATGTGGCCCACCCTGCCAGCAGCACAAAGGTGGACAAGAAGATCGTGCCCAGAGATTGTGGCTGTAAGCCCTGCATCTGTACCGTGCCTGAGTGTCCAGCGTGTTCATCTTTCCCCTAAGCCCAAGGACGTGCTGACCATCACCCTGACACCCAAGGTGACTGTGTGTGTGACATCAGCAGATGATCCTGAGTGCAGTTCAGCTGGTCGTGATGACGTGGAGTGCACACAGCTCAGACTCAGCCTAGAAGAGGGAGCAGTTCAATTCTATCT。
轻链测序结果
CCTAGAACGCTACATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACGATGGGTGAAGTTGATGTCTTGTGAGTGGCCTCACAGGTATAGCTGTTATGTCGTTCATACTCGTCCTTGGTCAACGTCCACGGAACATGTGATCCTTGAAAGCAGTAATAAACTCCCAGATCCTCAGCCTCCACTCTGCTGATCTTGAGTGTGAAATCTGTCCCTGATCCACTGCCACTGAACCTGTCTGGGACCCCAGAAAATCGGTTGGAAACTTTGTAGATCAGGAGCTTTGGAGACTGGCCTGGCCTCTGCAGGTACCATTCTAAATAGGTGTTTCCATTAGTATGTACAATGGTCTGACTAGATCTACAAGAGATGGAGGCTTGGTCTCCAAGAGTGACAGGCAGGGAGAGTGGAGTTTGGGTCATCAAAACATCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCACGTTCGCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCT。
综上，本发明相比于现有技术，抗体蛋白质和基因结构明确，稳定性好，即使表达该抗体的细胞株不存在了，也可以重新制备能够表达该抗体的新细胞株，批间差异小，抗体效价高，抗体产量高，单位生产成本低，同时本发明对人血幼素（HJV）抗原表位的识别率高，特异性好，对于组织中天然抗原和重组抗原均能够很好的识别。
同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 武汉百杰康生物科技有限公司
<120> 一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用
<141> 2020-07-27
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acggatggta tggcttac 18
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Gly Tyr Thr Phe Val Ser Tyr Trp
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Ile Tyr His Gly Asp Ser Asp Thr
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Thr Asp Gly Met Ala Tyr
1 5

Claims (1)

1.一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体，其特征在于：包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其中轻链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，所述重链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3，所述轻/重链CDR1-3的编码基因序列依次如SEQ ID NO.1-3和7-9所示，所述轻/重链CDR1-3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4-6和10-12所示。
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