CN116286667A - 抗人il-17a蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗人il-17a蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及本发明涉及抗人IL‑17A蛋白的单克隆抗体、包含该抗体的试剂盒及其在检测人IL‑17A中的应用。将包含所述抗人IL‑17A蛋白的单克隆抗体检测试剂盒用于检测人血清中的IL‑17A，灵敏度高，特异性强。

Description

抗人IL-17A蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及抗人IL-17A蛋白的单克隆抗体、包含该抗体的试剂盒以及在检测人IL-17A蛋白中的应用。
背景技术
细胞因子是由多种免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而产生的一类小分子蛋白质，其种类繁多，并参与人体多种重要生理机能，如机体免疫反应和炎症反应。细胞因子中的白介素17(IL-17)家族主要有6种亚型(IL-17A至IL-17F)，其中IL-17A与IL-17F的氨基酸序列同源性最高，两者保持着约50％的同源性，我们通常说的IL-17是指IL-17A。IL-17A在各种感染性疾病、炎症和自身免疫性疾病以及癌症中均发挥着关键作用，在接触性皮炎、哮喘和类风湿性关节炎患者血清中均检测到IL-17含量的增加。
研究表明，在疾病的发展过程中对病人体内的细胞因子水平进行监测，可诊断早期感染、预警细胞因子风暴、及时发现疾病转重倾向，及时治疗，避免或降低病情恶化风险等，提高临床治疗的有效率。而IL-17A作为细胞因子中的一名重要成员，其血清检测结果可辅助多种疾病的临床诊断和预后。目前IL-17A的检测方法主要有酶联免疫吸附法、化学发光技术、流式检测技术等，因此优良的IL-17A配对抗体对于患者血液及细胞样品的准确检测至关重要。
发明内容
为满足患者血液及细胞样品的IL-17A含量检测的需求，作为关键原料的IL-17A配对抗体的灵敏度及特异性越高越好，因此本发明制备并筛选了大量抗人IL-17A单克隆抗体，最终获得高灵敏度及高特异性的最佳配对检测抗体。
本发明获得的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体，能与另一杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体配对并识别IL-17A，同时可应用于酶联免疫吸附、化学发光、流式检测等平台进行IL-17A的检测与筛查，灵敏度及特异性高。
本发明的第一方面提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62981。
所述杂交瘤细胞株的分类命名为杂交瘤细胞株，其保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC No:62981，保藏日期为2022年11月16日。
在一些实施方式中，所述杂交瘤细胞株能产生结合人IL-17A蛋白的单克隆抗体。
本发明的第二方面提供了抗人IL-17A蛋白的单克隆抗体。该抗体由所述的杂交瘤细胞株分泌。
本发明的第三方面提供了第二方面的单克隆抗体的生产方法，包括以下步骤：
(1)用IL-17A抗原免疫动物，取免疫动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并用HAT筛选获得杂交瘤细胞株；
(2)使用获得的杂交瘤细胞株，通过腹水诱生法获得腹水，再采用亲和层析法纯化腹水获得单克隆抗体。
在一些实施方式中，所述IL-17A抗原具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列和/或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面提供了一种试剂盒，其包含第一单克隆抗体，所述第一单克隆抗体由保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62981的杂交瘤细胞株分泌。
在一些实施方式中，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒化学发光试剂盒、流式检测试剂盒、胶体金免疫试剂盒、放射免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体由保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62980的杂交瘤细胞株分泌。
在一些化学发光试剂盒中，所述第一单克隆抗体作为包被抗体，所述第二单克隆抗体作为标记抗体。
本发明的第五方面提供了所述杂交瘤细胞株或所述单克隆抗体在制备检测人IL-17A的试剂盒中的应用。
本发明的第六方面提供了所述杂交瘤细胞株、所述单克隆抗体或所述试剂盒在检测血清中人IL-17A蛋白中的应用。
本发明通过对细胞因子中的白介素17(IL-17)蛋白全长序列的分析，选择了IL-17A全长的基因序列即1-155aa的蛋白进行表达。用表达的IL-17A抗原制备杂交瘤细胞，进而获得针对IL-17A全长的抗原表位的单克隆抗体。本发明获得了一对抗人IL-17A鼠源单克隆抗体，其能配对检测人IL-17A，体外检测的准确性、灵敏度及特异性高。
附图说明
图1为实施例1中纯化后的IL-17A电泳图。
图2为实施例5的抗原评价线性关系图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，本发明实施例仅是用于说明本发明，而不是本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
本发明通过如下步骤的方法制备并筛选了大量抗人IL-17A单克隆抗体，筛选高灵敏度及高特异性的最佳配对检测抗体：
(1)抗原制备：获取IL-17A基因序列后，通过构建表达载体，转化大肠杆菌细胞，提质粒，转染293F细胞的方法表达抗原，并进行相应的纯化。
(2)免疫小鼠：抗原乳化后，对小鼠进行免疫，并采用间接ELISA法检测血清。
(3)获得杂交瘤细胞系：经细胞融合、筛选及克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。
(4)单克隆抗体制备：通过腹水诱生法获得相应细胞株的腹水，再采用亲和层析法纯化腹水获得单克隆抗体。
(5)配对抗体筛选：采用双抗夹心ELISA法对抗体进行初步筛选，再通过化学发光法对配对抗体进行再次筛选，获得最佳配对。
(6)单克隆抗体特性鉴定：通过对最佳配对抗体的亚型鉴定、交叉反应检测、化学发光检测及流式检测鉴定单克隆抗体性能。
实施例1 抗原制备
1、抗原表达载体的构建
IL-17A基因序列来源于Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)，基因对应的编号为Q16552。选定IL-17A全长基因序列作为表达基因(其编码155aa的蛋白序列)。为方便后期抗原纯化，在目的序列的C末端添加10×His的组氨酸标签进行融合表达，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。将目的基因合成后通过ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme，C214)同源重组连接到表达载体pcDNA3.1上。然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌感受态DH5α中，涂平板过夜培养，第二天挑取平板上的单克隆进行菌落PCR验证，取阳性克隆菌进行测序分析，验证序列正确后的菌液扩大培养，提质粒用于下一步转染表达实验。
IL-17A的核酸序列为：
ATGACTCCTGGGAAGACCTCATTGGTGTCACTGCTACTGCTGCTGAGCCTGGAGGCCATAGTGAAGGCAGGAATCACAATCCCACGAAATCCAGGATGCCCAAATTCTGAGGACAAGAACTTCCCCCGGACTGTGATGGTCAACCTGAACATCCATAACCGGAATACCAATACCAATCCCAAAAGGTCCTCAGATTACTACAACCGATCCACCTCACCTTGGAATCTCCACCGCAATGAGGACCCTGAGAGATATCCCTCTGTGATCTGGGAGGCAAAGTGCCGCCACTTGGGCTGCATCAACGCTGATGGGAACGTGGACTACCACATGAACTCTGTCCCCATCCAGCAAGAGATCCTGGTCCTGCGCAGGGAGCCTCCACACTGCCCCAACTCCTTCCGGCTGGAGAAGATACTGGTGTCCGTGGGCTGCACCTGTGTCACCCCGATTGTCCACCATGTGGCCGGG(SEQ ID NO:1)
IL-17A的氨基酸序列为：
MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA(SEQ ID NO:2)
2、抗原的诱导表达
使用OPM-293CD05培养基培养239F细胞，培养箱条件设置恒温37℃，8％CO2，摇床转速125rpm。转染前，将293F细胞传代至0.3～0.5×106个细胞/mL，三天后细胞密度到达3～4×106个细胞/mL。转染当天取293F细胞计数，取150*106个细胞用150mL Wayne293TM转染培养基重悬细胞，置于500mL摇瓶中待用。分别配制转染试剂A(3mL转染培养基+0.45mgPEI)和B(3mL转染培养基+0.15mg DNA)，然后将管B置于涡旋振荡器上边涡旋边将管A中PEI混合液缓慢滴加入管B中，室温放置15min。将转染混合液(DNA和PEI聚合物)缓慢滴加到预先准备的细胞中，边摇晃边加入。调整摇床转速至90rpm，培养4小时后，调回转速至125rpm，培养5天后收集细胞上清。
3、抗原的分离纯化
采用镍填料亲和层析的方法进行纯化，纯化步骤参照Ni-NTA PurificationSystem(InvitrogenTM，R90115)，纯化后的目标蛋白进行超滤浓缩，然后通过PierceTMBCAProtein Assay Kit(Thermo scientific，23225)进行定量。通过SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，并通过Elisa检测分析，确认抗原的特异性。
以纯化后的蛋白为抗原包被(2μg/mL，100μL/孔)，商购的IL-17A抗体为一抗(2μg/mL，100μL/孔)，37℃孵育30min后加入适当的二抗，37℃再次孵育30min后显色，结果显示纯化后的蛋白与外购的IL-17A抗体反应强烈，说明该蛋白溶液中含有特异性的且具备一定生物学活性的IL-17A蛋白。纯化后的蛋白电泳图见图1，其中IL-17A蛋白电泳有两个条带，是因为在真核表达体系中部分IL-17A蛋白出现磷酸化、糖基化等修饰。
实施例2 杂交瘤细胞系的建立
1.免疫
首次免疫使用完全佐剂，之后的加强免疫均使用弗氏不完全佐剂。首次免疫时抗原使用剂量为100μg/只，加强免疫时抗原使用剂量为50μg/只，佐剂与抗原的体积比为1:1。乳化完成后进行小鼠颈背部皮下多点注射，每3-4周加强免疫一次。第三次免疫7天后采用间接ELISA法检测小鼠血清效价，免疫4-5次后，选择效价最高的小鼠以腹腔注射的方法进行冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为150μg/只。
2.细胞融合
取冲击免疫4天后的小鼠断颈处死，70％乙醇浸泡5min消毒，在生物安全柜内取出小鼠脾脏，研磨，制备无菌脾细胞悬液，与适当数量的SP2/0细胞混合，脾细胞与SP2/0细胞比例为1:1-5:1，之后在PEG的作用下进行细胞融合。
3.融合细胞筛选、克隆及建株
将融合好的细胞用HAT培养基混合均匀后铺板至20张96孔细胞板内，5天后取细胞上清进行检测。使用有限稀释法对阳性细胞孔进行第一次克隆，5天后再次取细胞上清进行检测。挑选显色为阳性的单团细胞孔进行第二次克隆，5天后再次取细胞上清进行检测，直到得到的克隆都为阳性时，可建立阳性细胞株，将阳性细胞株逐步转入24孔板、6孔板内进行扩大培养并冻存。最终获得28个杂交瘤细胞株。
实施例3 腹水诱生法制备单克隆抗体
1.腹水制备
提前一周在小鼠腹腔注射液体石蜡，取适量的实施例2中获得的杂交瘤细胞株细胞(1-5×105个/只)注射入小鼠腹腔，7天左右收集腹水，10000rpm离心5min，收集上清，-20℃保存。
2.单克隆抗体的纯化
采用亲和层析法，使用rProtein G Beads 4EF重力柱(Smart-Lifesciences公司)按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，紫外吸收法及BCA法测定抗体浓度。纯化的抗体保存于-20℃。
实施例4配对抗体筛选
1.双抗夹心ELISA法对抗体进行初步筛选
应用双抗夹心ELISA方法对制备得到的抗体进行筛选，筛选出可以配对的抗体对。具体方法如下：将包被抗体用碳酸盐包被液稀释成2μg/mL，加入酶标板中，每孔100μL，4℃过夜。5％的脱脂牛奶封闭，各取200μL加入酶标孔中，4℃过夜或37℃放置60分钟，弃去封闭液，PBST溶液洗涤一次。加入IL-17A蛋白稀释液(0.1μg/mL)，每孔100μL，37℃反应30min，弃去板内液体，拍干，PBST溶液洗涤两次。加入酶标抗体，每孔100μL，37℃反应30min，，弃去板内液体，拍干，PBST溶液洗涤四次。避光加入TMB底物溶液，每孔100μL，室温避光放置15min，加入2M硫酸终止反应，每孔50μL。将酶标板置于酶标仪上读板，并在450nm处测OD值。
将实施例2获得的28个杂交瘤细胞株分别作为包被抗体和标记抗体进行配对检测，最终初步筛选获得29对配对抗体。
2.化学发光法对配对抗体进行再次筛选
采用双抗夹心法，对初步筛选获得的29对配对抗体中显色值最高的5对配对抗体进行再次检测，用吖啶酯作为标记物，在化学发光平台测试抗体性能。结果显示最佳配对为细胞株14C10和3E2，其中14C10为包被抗体，3E2为标记抗体。5对配对抗体化学发光检测结果如表1所示。
表1
Figure SMS_1
Figure SMS_2
实施例5单克隆抗体特性鉴定
1.抗体亚型鉴定
将包被原用碳酸盐包被液稀释成2μg/mL，加入酶标板中，每孔100μL，4℃过夜。使用5％的脱脂牛奶封闭，各取200μL加入酶标孔中，4℃过夜或37℃放置60分钟，弃去封闭液，PBST溶液洗涤一次。纯化抗体稀释1000倍，每孔取100μL置于酶标板内，共加8孔，37℃反应30min，弃去板内液体，拍干，PBST溶液洗涤两次。每孔内加入1种二抗，共8种二抗(小鼠单克隆抗体IG类/亚类/亚型检测试剂盒，洛阳佰奥通实验材料中心)，每孔100μL，37℃反应30min，弃去板内液体，拍干，PBST溶液洗涤四次。避光加入TMB底物溶液，每孔100μL，室温避光放置15min，加入2M硫酸终止反应，每孔50μL。将酶标板置于酶标仪上读板，并在450nm处测OD值。
结果显示，本发明的两株最佳配对单克隆抗体(14C10、3E2)均为IgG1κ型鼠源单克隆抗体。同时，将筛选的两株杂交瘤细胞株14C10、3E2送至广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)(广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)进行保藏，其中杂交瘤细胞株3E2的保藏编号为GDMCC No:62980，杂交瘤细胞株14C10的保藏编号为GDMCC No:62981。
2.化学发光法检测配对抗体性能
采用双抗夹心法，包被抗体为14C10，标记抗体为3E2，用吖啶酯作为标记物，在化学发光平台测试抗体性能。使用仪器：科斯迈6500S，反应模式：100μL样本+50μL吖啶酯标记的抗体(抗体浓度为0.5μg/mL)+50μL抗体标记的磁珠溶液，浓度为0.04mg/mL，37℃反应10min，用清洗液洗涤4次，加入100μL吖啶酯底物，37℃反应1min。不同浓度抗原检测结果如下表2所示。
表2
Figure SMS_3
可见，本发明的IL-17A配对抗体灵敏度小于4.9pg/mL，检测抗原浓度为4.9pg/mL时，信噪比为4.94，说明该抗体对具有较高的灵敏度。且在抗原浓度4.9-5000pg/mL范围内，检测相关性可达0.9997，具有良好的线性相关性，抗原评价线性关系图见图2。
3.交叉反应检测
筛选出最佳抗体对后，在化学发光平台上分别对其他常见细胞因子如IL-1β、TNFα、IL-1α、IL-2R、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IFNα、IFNγ等进行交叉反应，各蛋白工作浓度为10000pg/mL，交叉反应率计算方式如下，结果显示该抗体对与其他常见细胞因子无交叉反应。
Figure SMS_4
4.流式检测技术检测配对抗体性能
在5μm直径、均一荧光强度的微球群上包被IL-17A特异性抗体14C10，与待测样本孵育，可与样本中IL-17A蛋白特异性结合，再加入生物素标记的检测抗体3E2，形成抗体包被微球-IL-17A-检测抗体的免疫复合物。最后加入链霉亲和素-PE，与生物素结合，之后流式细胞仪上检测相应荧光。再结合标准品的标准曲线，对同一份样本中IL-17A进行定量检测。同时采购了R&D生产的两株IL-17A抗体进行对照实验，具体实验数据如下表3所示。
表3
Figure SMS_5
可见，相比于现有抗IL-17A抗体，本发明的14C10-3E2抗体具有更优的灵敏度。
以上分析表明本发明提供的抗IL-17A抗体试剂盒(流式检测法)对人血清中IL-17A的测定结果有效。该试剂盒达到临床测定要求，可广泛用于临床检测，为医师提供诊断的辅助信息。
虽然已经说明和描述了本申请的一些示例性实施方式，然而本申请不限于所公开的实施方式。相反，本领域普通技术人员将认识到，在不脱离如所附权利要求中描述的本申请的精神和范围的情况下，可对所描述的实施方式进行一些修饰和改变。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:62981。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株能产生结合人IL-17A蛋白的单克隆抗体。
3.抗人IL-17A蛋白的单克隆抗体，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌。
4.一种权利要求3的单克隆抗体的生产方法，包括以下步骤：
(1)用IL-17A抗原免疫动物，取免疫动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并用HAT筛选获得杂交瘤细胞株；
(2)使用获得的杂交瘤细胞株，通过腹水诱生法获得腹水，再采用亲和层析法纯化腹水获得单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述IL-17A抗原具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列和/或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
6.一种试剂盒，其包含第一单克隆抗体，所述第一单克隆抗体由保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.62981的杂交瘤细胞株分泌。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒化学发光试剂盒、流式检测试剂盒、胶体金免疫试剂盒、放射免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体由保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62980的杂交瘤细胞株分泌。
9.权利要求1或2所述杂交瘤细胞株或权利要求3所述单克隆抗体在制备检测人IL-17A蛋白的试剂盒中的应用。
10.权利要求1或2所述杂交瘤细胞株、权利要求3所述单克隆抗体或权利要求6-8中任一项所述试剂盒在检测血清中人IL-17A蛋白中的应用。
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