CN107523552A - 分泌抗amh单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗amh单克隆抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株及抗AMH单克隆抗体。本发明还涉及抗AMH单克隆抗体的应用。所述分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株为两株，且保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.13849和CGMCC No.13850。这两株细胞株能稳定高效分泌特异性强的抗AMH单克隆抗体，将其进行配对，建立了DAS‑ELISA方法。该方法检验血清样本时，特异性好，灵敏度高，可达到0.1 ng/ml，可应用于体外诊断的多个分支领域。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株及抗 AMH单克隆抗体。本发明还涉及抗AMH单克隆抗体的应用。
背景技术
抗穆勒氏管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)是转化生长因子β超家族的成员之一，由Professor Alfred Jost于1974年首先发现。AMH是由两个相同的70KD亚基，通过二硫键连接组成的二聚糖蛋白，相对分子质量为140KD；人类AMH编码基因位于19号染色体短臂，大小2.4～2.8 kb，含有5个外显子。
抗穆勒氏管激素(AMH)在性腺器官发育过程中起着重要作用，是男女性腺功能的重要标记物之一。在男性AMH主要由睾丸间质细胞产生，始于胚胎形成并贯穿生命始终；在男性胎儿的发育过程中，AMH导致穆勒氏管退化，形成正常发育的男性生殖管道。在女性AMH主要由卵巢颗粒细胞产生，血清AMH保持相对于男性较低的一个水平，从青春期开始，血清AMH水平随时间慢慢降低，并在更年期降低到ELISA法检测不到的水平。
AMH的正常值界于2-6.8 ng/ml之间，AMH数值越高，代表卵子存量越丰沛，适合受孕的黄金期较长，AMH值越低则卵巢功能越差，35岁过后AMH值会开始急剧下降，当AMH 值低于0.7ng/ml时，表示卵子库存量已严重不足，几乎难以受孕。若AMH值大于6.8时，可考虑有多囊性卵巢症候群的体质，使用排卵针剂、药物时，卵巢也容易对反应过度而排出过多的卵子，造成卵巢过度刺激症候群。
发明内容
本发明第一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株为两株，分别命名为AMH-1和AMH-2，且保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.13849和CGMCC No.13850。
为了取得进一步的技术效果，本发明还可以采用以下进一步的技术方案：
优选地，所述分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株由免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到，细胞融合后加入饲养层细胞。
优选地，所述饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠胸腺细胞。
本发明第二个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种抗AMH单克隆抗体。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种抗AMH单克隆抗体，所述抗AMH单克隆抗体由前面所述的保藏编号为：CGMCCNo.13849和CGMCC No.13850的杂交瘤细胞株分泌产生，且分别命名为：单克隆抗体AMH-1和单克隆抗体AMH-2。
本发明的第三个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种天然血清检测方法。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种天然血清中AMH的检测方法，所述方法包括：以单克隆抗体AMH-1作为包被抗体，单克隆抗体AMH-2作为标记抗体，建立基于DAS-ELISA的天然血清中AMH的检测方法。
本发明的第四个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种抗AMH单克隆抗体在体外诊断试剂盒中的应用。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种抗AMH单克隆抗体在体外诊断试剂盒中的应用，化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、胶体金免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒中均采用配对的抗AMH的单克隆抗体AMH-1和单克隆抗体AMH-2，单克隆抗体AMH-1作为包被抗体，单克隆抗体AMH-2 作为标记抗体。
本发明提供分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株及抗AMH单克隆抗体，还提供涉及抗AMH单克隆抗体的应用。这两株细胞株能稳定高效分泌特异性强的抗AMH单克隆抗体，将其进行配对，建立了DAS-ELISA方法。该方法检验血清样本时，特异性好，灵敏度高，可达到0.1ng/ml，可应用于体外诊断的多个分支领域。
具体实施方式
参照具体实施例对本发明作进一步详细地描述。
生物保藏
杂交瘤细胞株AMH-1和AMH-2均于2017年6月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号分别为CGMCC No.13849和CGMCC No.13850。
一、杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备
1.动物免疫
免疫原为人HEK293细胞重组表达蛋白(59KD)，编码序列为NP_000470(Arg26–Arg560)，购自北京傲锐东源(OriGene Technologies)生物科技有限公司，货号为TP700250。用此重组蛋白免疫6周龄体重18-20g的BALB/c雌性小鼠。即AMH重组蛋白100μg/只与福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.3mL/只，后每间隔2周，取80μg/ 只抗原和福氏不完全佐剂充分乳化后，腹腔注射0.3mL/只，免疫第4次的一周后，对小鼠进行眼球取血，检测血清效价，取效价达到1:105及以上的小鼠进行脾脏加强免疫，脾脏免疫时，重组抗原量为30μg/只，3天后取脾细胞进行细胞融合。
2.饲养层细胞的制备
取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞和胸腺细胞作为饲养细胞，具体操作方法如下：取BALB/c 小鼠，眼球放血致死，75％酒精体表消毒后，用消毒后的剪刀和镊子从后腹剪开腹部皮肤，暴露腹膜。用注射器取4ml IMDM培养基至腹腔，用手指轻轻挤压腹部，并进行反复冲洗，回收冲洗液。取出小鼠的胸腺，将其碾碎后用IMDM培养基冲洗，回收洗液。将两次回收液混合后，1200rpm/min离心3min，弃上清，即得到饲养层细胞。
3.细胞融合
取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按7:1的比例在无血清的IMDM培养基中混匀，1,300rpm离心3min，去除培养基，在37℃水浴中加入1mL 50％PEG(分子量1500)并融合2min，用无血清的IMDM培养基终止融合后1,300rpm离心3min，沉淀用HAT培养基悬浮，并加入饲养层细胞，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，并置于37℃，含5％CO2的细胞培养箱中培养。
4.杂交瘤细胞的筛选及其克隆
细胞培养箱中培养5天后，等到融合细胞覆盖孔底10-30％时，用常规间接ELISA方法筛选分泌抗体的阳性孔，即以AMH重组蛋白为抗原，用CB稀释到0.5μg/ml包被96孔酶标板，50μl/孔，4℃包被过夜，拍干后，用含1％BSA的PBS缓冲液封闭(200μl/孔)，37℃封闭2小时，拍干备用；将待检细胞培养上清50μl/孔加入上述ELISA板中，于37℃反应30min 后洗涤并拍干，加入50μl/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃孵育30min后洗涤并拍干，加入50μl/孔的TMB显色液，于37℃避光显色10min,加入25μl/孔的2M H2SO4终止反应，并于OD450处读取数值。阳性孔的确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选择呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆。经过三至四次的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
5.单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右F1小鼠，腹腔注射0.3-0.5mL石蜡，7-10天后腹腔注入8×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，注射针头采取腹水，8,000rpm离心3min，收集上清液即为单抗腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M pH 4.8醋酸缓冲液稀释，室温下边搅拌边加辛酸(30μL/mL腹水)，4℃澄清1h，12,000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2h，3,000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS 溶液溶解，在4℃流动透析24h后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。
二、配对抗体的筛选制备
1.抗体的HRP标记
取1mg HRP溶于0.5ml的蒸馏水中，再加入0.2ml NaIO4溶液(0.06mol/L)，混匀后置于4℃避光条件下30min。加入0.2ml乙二醇溶液(0.16mol/L)，室温(20℃左右)避光条件下下轻微搅拌30min。加入1mg的抗体溶液，混合均匀后装入透析袋中，置于CBS溶液中避光条件下透析6h(或4℃过夜)。从透析袋中取出反应液，加入50μl NaBH4溶液(5 mg/ml)，混匀置于4℃避光条件下2h。缓慢加入等体积(约1.2ml)的饱和硫酸铵溶液，混匀并置于4℃避光条件下30min，10000rpm离心10min去上清，以200μl的PBS重溶沉淀，然后置于PBS中透析12-18h，期间换液一次。取出溶液并测量体积，加入等体积的甘油，充分混匀后于-20℃保存备用。
2.配对抗体的筛选
用CB将包被抗体稀释到4μg/ml，以每孔100μl加入到酶标板孔中，4℃包被过夜。将酶标板拍干，每孔加入200μl封闭液(含1％BSA的PBS)，于37℃下封闭1-2h并拍干。将阳性血样用PBS稀释至2ng/ml，每孔加样100μl，以阴性血样为对照。37℃孵育1h后洗板 3次，洗液为0.05％的PBST。用含1％BSA的洗液将酶标抗体稀释成1000倍的工作液，每孔加100μl，37℃孵育1h，然后洗板4次并拍干。每孔加入100μl TMB显色液，37℃孵育10min。每孔加50μl加入终止液，在酶标仪上用450nm读取OD值。结果如表1所示，表1为单克隆抗体的配对筛选结果。
表1
三、配对抗体AMH-1/AMH-2的性能评估及相关参数
1.配对抗体的特异性检测
按上述9的方法，对AMH-1/AMH-2配对的特异性进行检测，共使用25份阳性血清和25份阴性血清，以P/N≥2为阳性，结果如表2所示，表2为抗体AMH-1/AMH-2夹心法ELISA 检测的特异性分析结果。
2.配对抗体的灵敏度检测
按上述10的方法，对AMH-1/AMH-2配对的灵敏度进行检测，使用1份混合的阳性血清 (AMH浓度为27ng/ml)，用胎牛血清进行3倍稀释。以P/N≥2为阳性，以该孔血清浓度值为该配对抗体的灵敏度，结果如表3所示，表3为抗体AMH-1/AMH-2夹心法ELISA检测的灵敏度分析结果。
3.单克隆抗体的分型鉴定
使用抗体分型鉴定试剂盒SBA Clonotyping System-HRP(Southern Biotech，cat: 5300-05)，按说明书方法进行鉴定，结果如表4和表5所示，表4为抗体AMH-1和AMH-2的分型鉴定结果；表5为抗体分型鉴定表，其中，C26为AMH-1，A16为AMH-2。
表2
表3
| 浓度(ng/ml) | 复孔1 | 复孔1 | 均值 |
| 27.00 | 3.173 | 3.146 | 3.1595 |
| 9.00 | 2.457 | 2.316 | 2.3865 |
| 3.00 | 1.202 | 1.107 | 1.1545 |
| 1.00 | 0.463 | 0.444 | 0.4535 |
| 0.33 | 0.208 | 0.209 | 0.2085 |
| 0.11 | 0.143 | 0.151 | 0.147 |
| 0.04 | 0.087 | 0.086 | 0.0865 |
| 胎牛血清 | 0.067 | 0.062 | 0.0645 |
表4
| AMH-1 | AMH-2 | |
| IgA | 0.116 | 0.167 |
| IgM | 0.101 | 0.18 |
| IgG1 | 0.146 | 0.199 |
| IgG2a | 1.14 | 0.101 |
| IgG2b | 0.185 | 2.696 |
| IgG3 | 0.118 | 0.184 |
| Ig-λ | 0.15 | 0.185 |
| Ig-κ | 0.964 | 1.679 |
表5
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株为两株，分别命名为AMH-1和AMH-2，且保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 13849和CGMCC No. 13850。
2.根据权利要求1所述的分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株由免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到，细胞融合后加入饲养层细胞。
3.根据权利要求2所述的分泌抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠胸腺细胞。
4.一种抗AMH单克隆抗体，其特征在于，所述抗AMH单克隆抗体由权利要求1所述的保藏编号为：CGMCC No. 13849和CGMCC No. 13850的杂交瘤细胞株分泌产生，且分别命名为：单克隆抗体AMH-1和单克隆抗体AMH-2。
5.一种天然血清中AMH的检测方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求4所述的单克隆抗体AMH-1作为包被抗体，单克隆抗体AMH-2作为标记抗体，建立基于DAS-ELISA的天然血清中AMH的检测方法。
6.一种抗AMH单克隆抗体在体外诊断试剂盒中的应用，其特征在于，化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、胶体金免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒中均采用配对的抗AMH单克隆抗体AMH-1和AMH-2，单克隆抗体AMH-1作为包被抗体，单克隆抗体AMH-2作为标记抗体。
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