CN111196851B

CN111196851B - 针对人抗缪勒管激素的特异性抗体及其应用

Info

Publication number: CN111196851B
Application number: CN201811382047.3A
Authority: CN
Inventors: 熊君辉; 陈自敏; 徐伟玲; 王龙; 柯起沈; 李丽华; 宋浏伟; 孙旭东; 葛胜祥
Original assignee: Xiamen Innodx Biotech Co ltd; Xiamen University
Current assignee: Xiamen Innodx Biotech Co ltd; Xiamen University
Priority date: 2018-11-20
Filing date: 2018-11-20
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2038-11-20
Also published as: EP3885363A4; CN111196851A; AU2019384259A1; CA3120409A1; JP7200375B2; KR20210093961A; US20220146515A1; EP3885363A1; JP2022513102A; WO2020103691A1

Abstract

本发明涉及生物医学检验领域，提供了针对人抗缪勒管激素的特异性抗体及其应用。

Description

针对人抗缪勒管激素的特异性抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医学检验领域，主要涉及针对人抗缪勒管激素的特异性抗体及其应用。

背景技术

抗缪勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)，也称为抗苗勒管激素，是由睾丸未成熟支持细胞和卵巢生长卵泡的颗粒细胞分泌的一类单糖蛋白，属于转化生长因子β超家族，具有抑制雄性缪勒管发育、调节两性生殖细胞和性腺发育的重要功能。近年来，各国学者对其在女性生殖领域的作用进行了广泛的研究。在女性中，AMH可以调节卵泡发育、反映卵巢储备功能、预测卵巢对超排卵的反应性，对生殖内分泌疾病的研究有一定的价值。目前，关于免疫法检测AMH 的记载有许多。例如，美国专利7,897,350记载了检测样本中AMH的组合物和方法，其中抗体结合AMH的成熟区或C端区。欧洲专利 EP2161579A记载了用于检测或定量样本中至少一种AMH的生物活性形式，例如切断的AMH或C端AMH的方法以及与其结合的抗体。

另外，也有一些其他出版物中公开了抗AMH的N端区的抗体。例如，Hudson et al.(1990)J.Clin.Endocrin.Metab.70:16-22描述了一种免疫分析技术，其中两种单克隆抗体分别针对AMH的前体和N端区。Long et al.(2000)J.CIin.Endocrin.Metab.85:540-544描述了一种免疫分析技术，其也使用了两种单克隆抗体，一种结合AMH的N端表位，另一种结合AMH的C端区。此外，W02014204327A1中也公开了一种抗AMH的N端区的抗体，其中N端区指人前肽的1-451个残基或者在除去前导序列时为25-451个残基。然而，当利用上述抗AMH抗体检测抗原时，存在检测稳定性差且灵敏度低的问题。

因此，本领域需要开发针对人抗缪勒管激素的特异性抗体。

发明内容

本发明的第一个方面提供了针对人抗缪勒管激素的单克隆抗体抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人抗缪勒管激素的表位，所述表位选自包含在跨越抗缪勒管激素的第26至 85位氨基酸残基的序列中的表位，包含在跨越抗缪勒管激素的第38 至45位氨基酸的序列中的表位，包含在跨越抗缪勒管激素的第40至 46位氨基酸残基的序列中的表位，包含在跨越抗缪勒管激素的第37 至44位氨基酸残基的序列中的表位，包含在跨越抗缪勒管激素的第 39至45位氨基酸残基的序列中的表位，包含在跨越抗缪勒管激素的第36至47位氨基酸残基的序列中的表位，包含在跨越抗缪勒管激素的第37至46位氨基酸残基的序列中的表位。优选地，抗体或其抗原结合片段特异性结合包含在跨越抗缪勒管激素的第38至45位氨基酸残基的序列中的表位。

本发明的单克隆抗体特异性识别人抗缪勒管激素表位，不与其他物种来源的抗缪勒管激素产生交叉反应，包括山羊抗缪勒管激素，猫头鹰抗缪勒管激素，牛抗缪勒管激素，马抗缪勒管激素，猴子抗缪勒管激素，犬抗缪勒管激素，鹿抗缪勒管激素，小鼠抗缪勒管激素，豚鼠抗缪勒管激素等。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体是嵌合抗体或人源化抗体。在某些优选的实施方案中，本发明的抗原结合片段选自scFv、Fab、Fab’、(Fab’)₂、Fv片段、双抗体(diabody)。

在一个具体实施方式中，本发明提供了针对人抗缪勒管激素的单克隆抗体抗体，其特异性结合包含在跨越抗缪勒管激素的第38至45 位氨基酸残基的序列中的表位。

优选地，所述抗体包含分别如SEQ ID NO:1-3所示的重链CDR 序列CDR1GFAFSTYD，CDR2 ISPGGGAT，CDR3 AGRRDYYGMDY；和SEQ ID NO:4-6所示的轻链CDR序列CDR1QSLVHSNGNTY，CDR2 KVS，CDR3 SQSTHVPWT。

更优选地，所述抗体包含如SEQ ID NO:7所示的重链可变区序列

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSTYDMSWVRQT PEKRLEWVAYISPGGGATYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQM TSLKSEDTAMYYCAGRRDYYGMDYWGQGTSVTVSS和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区序列

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWY LQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK。

在优选的实施方式中，本发明的单克隆抗体是于2018年8月19 日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)的杂交瘤细胞株C9F2-2分泌的单克隆抗体，该杂交瘤细胞株的保藏编号为 CCTCC NO:C2018183。

在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。

在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。在某些优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。在某些优选的实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子或本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞。

本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人抗缪勒管激素，从而可用于检测人抗缪勒管激素在样品中的存在或其水平。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。在本发明中，所述可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。这类标记是本领域熟知的，包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C 或³²P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，

)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。教导该标记物的使用的专利包括，但不限于，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350； 3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241(全部通过引用并入本文)。本发明中涵盖的标记物可通过本领域已知的方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。

在另一个方面，本发明提供了检测人抗缪勒管激素在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还带有可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用带有可检测的标记的试剂来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。

在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测人抗缪勒管激素在样品中的存在或其水平。

在具体的实施方案中，本发明提供了一种用于在源自人体液的生物样品中检测AMH其片段的方法，该方法包括：

将样品与针对抗缪勒管激素不同表位的至少两种抗体或其抗原结合片段相接触，以及定性或定量检测所述至少两种抗体与抗缪勒管激素或所述片段的结合，其中结合指示所述样品中抗缪勒管激素或所述片段存在或浓度；

其中至少一种抗体或其抗原结合片段针对包含在抗缪勒管激素的第37至46位氨基酸残基的序列中的表位。

在优选的实施方式中，其中一种抗体或其抗原结合片段针对包含在抗缪勒管激素的第38至45位氨基酸残基的序列中的表位，另一种抗体或其抗原结合片段针对包含在抗缪勒管激素的第358至369位氨基酸残基的序列中的表位，或包含在抗缪勒管激素的第491至502位氨基酸残基的序列中的表位，或包含在抗缪勒管激素的第260至271 位氨基酸残基的序列中的表位，或包含在抗缪勒管激素的第330至 343位氨基酸残基的序列中的表位。

在本发明的方法的优选实施方案中，所述至少两种抗体或其抗原结合片段中的至少一种被固定化在固相表面上。优选情况下，另一种或另一些抗体中的至少一种被标记，优选通过共价连接化学发光或荧光染料进行标记。

在本发明的方法的具体实施方案中，针对包含在跨越抗缪勒管激素的第38至45位氨基酸残基的序列中的表位的抗体或其抗原结合片段被固定化在固相表面上。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学实验室等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和 IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域 (CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区 (CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各V_H和V_L由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR 和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol. Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。

如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol. 196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol. 27:55-77,2003)。

在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT 编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat编号系统确定。

如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1， IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed., 第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括 Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、结构域抗体 (技术来自Ablynx)、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”、“单抗”、“mAb”具有相同的含义且可互换使用可互换，其是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。此外，修饰语“单克隆”仅表明该抗体的特征为从高度同源的抗体群中获得，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。

本发明的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，例如杂交瘤技术(参见，例如Kohler等人.Nature,256:495,1975)，重组DNA技术(参见，例如美国专利申请4,816,567)，或噬菌体抗体库技术(参见，例如Clackson等.Nature352：624-628,1991，或Marks等.J.Mol.Biol.222：581-597,1991)。

抗体可通过公知的技术，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析进行纯化。随后或作为替代，可将特异性抗原(该抗体识别的靶分子) 或其抗原表位固定在柱上，并通过免疫亲合层析法来纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化可参考例如D.Wilkinson(TheScientist, published by The Scientist,Inc.,Philadelphia Pa.,Vol.14, No.8(Apr.17,2000),pp.25-28)。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(K_D)表示。在本发明中，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于约10^-9M，例如小于约10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在 BIACORE仪中测定。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。

实施例1.针对人抗缪勒管激素的特异性抗体的产生

1.选择6只雌性BALB/c小鼠以AMH抗原乳化完全弗氏佐剂 (CFA)(Sigma，St.Louis，MO)皮下免疫，两周后使用同样的抗原乳化不完全弗氏佐剂(IFA)(Sigma，St.Louis，MO)进行免疫，间隔2周继续免疫2针。

2.在最初免疫接种后6和8周以及在处死时从眼后毛细血管获得血样，所述处死是在9周后，并在同时取出脾脏。将脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞融合，CO₂培养箱培养7天，细胞上清换液，2天后，对产生杂交瘤细胞系检测。

3.间接法筛选，AMH抗原用碳酸缓冲液(20mmol/L CB pH 9.6)稀释后包被于聚氯乙烯板上，然后加入待检样品，最后加入HRP标记的羊抗鼠二抗(保存于20mmol/L PBS pH7.4)中，筛选细胞系分泌与固定化的重组人类AMH(Anti-MüllerianHormone)结合抗体的能力。

4.细胞经过三次稳定克隆化，得到稳定细胞株，大量培养，冻存细胞保种，诱导小鼠产生腹水，腹水亲和柱纯化，得到纯度大于90％的5个单抗C8H3-2、C9F2-2、7D11-1、C17B10、G8B11，保存在20 mmol PBS溶液中。单克隆抗体C9F2-2于2018年8月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，杂交瘤细胞株C9F2-2的保藏编号为CCTCC NO:C2018183。

实施例2：

单抗评价与截短抗原鉴定：

1.AMH抗原用碳酸缓冲液(20mmol/L CB，pH 9.6)稀释后包被于聚氯乙烯板上，预处理将蛋白A柱纯化的抗体与合成的AMH截短抗原序列进行比例(各自合成序列见最后补充)(100ng/ml抗体： 50ug/ml截短抗原)温育30min，即为检测样品；对照样品是 100ng/ml抗体：PBS，温育30min，再将温育后的检测样品和对照样品加入到AMH抗原板内温育30min，清洗板5次，加入GAM- HRP(1/5000稀释)温育30min，清洗板5次，加入底物温育15min。酶标仪波长450/620下读值，最后将检测出来的OD值进行计算分析，计算公式为(对照样品OD值－检测样品OD值)/对照样品 OD值，判定标准为：大于90％以上显示有良好的竞争效果，显示抗体应该识别该表位，数据如下表1所示。

各截短抗原序列如下所示：

26-85aa： RAEEPAVGTSGLIFREDLDWPPGSPQEPLCLVALGGDSNGSSSPLRVVGALSAYEQAFLG

86-185aa

AVQRARWGPRDLATFGVCNTGDRQAALPSLRRLGAWLRD PGGQRLVVLHLEEVTWEPTPSLRFQEPPPGGAGPPELALLVLYP GPGPEVTVTRAGLPGAQ

171-270aa

GPEVTVTRAGLPGAQSLCPSRDTRYLVLAVDRPAGAWRGS GLALTLQPRGEDSRLSTARLQALLFGDDHRCFTRMTPALLLLP RSEPAPLPAHGQLDTVP

256-355aa

EPAPLPAHGQLDTVPFPPPRPSAELEESPPSADPFLETLTRL VRALRVPPARASAPRLALDPDALAGFPQGLVNLSDPAALERLLD GEEPLLLLLRPTAA

341-440aa

DGEEPLLLLLRPTAATTGDPAPLHDPTSAPWATALARRVAA ELQAAAAELRSLPGLPPATAPLLARLLALCPGGPGGLGDPLRAL LLLKALQGLRVEWRG

426-525aa

LLLKALQGLRVEWRGRDPRGPGRAQRSAGATAADGPCAL RELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHV VLLLKMQARGAALARPPC

461-560aa

PCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNP RYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERIS AHHVPNMVATECGCR

2.经鉴定5个单抗在全长AMH反应性强，在26-85截短抗原反应性强。

实施例3：

单抗表位鉴定：

1.AMH抗原用碳酸缓冲液(20mmol/L CB，pH 9.6)稀释后包被于聚氯乙烯板上，预处理将蛋白A柱纯化的抗体与合成的AMH截短抗原序列进行比例(各自合成序列见表3)(100ng/ml抗体：50ug/ml 截短抗原)温育30min，即为检测样品；对照样品是100ng/ml抗体：PBS，温育30min，再将温育后的检测样品和对照样品加入到AMH 抗原板内温育30min，清洗板5次，加入GAM-HRP(1/5000稀释)温育30min，清洗板5次，加入底物温育15min。酶标仪波长450/620 下读值，最后将检测出来的OD值进行计算分析，计算公式为(对照样品OD值－检测样品OD值)/对照样品OD值，判定标准为：大于90％以上显示有良好的竞争效果，显示抗体应该识别该表位，数据分析见下表2。

表3

1.通过实验数据分析单抗表位初步验证在C8H3-2(41-55)， C9F2-2(31-45),7D11-1(31-45),G8B11(31-45/41-55),C17B10(31-45)。

2.通过实验数据分析单抗表位验证在C8H3-2(40-46)，C9F2-2(38- 45),7D11-1(37-44),G8B11(40-46/41-48/39-45),C17B10(39-45)。

实施例4

1.AMH抗原用碳酸缓冲液(20mmol/L CB，pH 9.6)稀释后包被于聚氯乙烯板上，预处理将蛋白A柱纯化的抗体与合成的不同人的 AMH36-47各个氨基酸突变的短肽进行按比例(100ng/ml抗体： 50ug/ml截短抗原)温育30min，即为检测样品；对照样品是 (100ng/ml抗体：PBS)温育30min，再将温育后的检测样品和对照样品加入到AMH抗原板内温育30min，清洗板5次，加入GAM- HRP(1/5000稀释)温育30min，清洗板5次，加入底物温育15min。酶标仪波长450/620下读值，最后将检测出来的OD值进行计算分析，计算公式为(对照样品OD值－检测样品OD值)/对照样品 OD值，判定标准为：低于90％的值显示该氨基酸为关键氨基酸，突变对于抗体的反应影响很大。数据分析见下表4。

2.从分析的结果可知，

C8H3-2关键的影响位点是42.45位；

C9F2-2关键的影响位点是39.41.44位；

7D11-1关键的影响位点是38.42.45位；

C17B10关键的影响位点是42.45.46位；

G8B11关键的影响位点是39.45位；

与上面表位鉴定的结果相符合。

实施例5

单抗种属特异性评价：

1.AMH抗原用碳酸缓冲液(20mmol/L CB，pH 9.6)稀释后包被于聚氯乙烯板上，预处理将蛋白A柱纯化的抗体与合成的不同人的 AMH36-47各个氨基酸突变的短肽进行按比例(各自合成序列见表 6)(100ng/ml抗体：50ug/ml截短抗原)温育30min，即为检测样品；对照样品是(100ng/ml抗体：PBS)温育30min，再将温育后的检测样品和对照样品加入到AMH抗原板内温育30min，清洗板5 次，加入GAM-HRP(1/5000稀释)温育30min，清洗板5次，加入底物温育15min。酶标仪波长450/620下读值，最后将检测出来的OD 值进行计算分析，计算公式为(对照样品OD值－检测样品OD值) /对照样品OD值，判定标准为：大于90％以上代表有交叉反应。数据分析见下表5。

表6

2.通过实验数据分析，我们C9F2-2表位38-45的单抗在种属特异上与骆驼，猫头鹰，牛，猴子，，马，小鼠，以及犬、绵羊序列均无交叉。

实施例7

单抗配对酶免评价：

1.单克隆化抗体用磷酸盐缓冲液(20mmol/LPB，pH7.4)，稀释后包被于聚氯乙烯板上，一株单克隆抗体标记上辣根过氧化物酶(标记单抗为F10G7-2，厦门万泰凯瑞生物技术有限公司，货号M3382；其特异性结合AMH表位260至271位氨基酸)。AMH质控品用稀释液稀释值(20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，1.25ng/ml， 0.5ng/ml，0.1ng/ml，0.05ng/ml，0.01ng/ml)。样本血清，阳性对照，空白对照，分别加入相应孔中40ul，置37°温育40min，清洗板5 次加入F10G7-2-HRP(1/500稀释)温育40min，清洗板5次，加入底物温育15min。酶标仪波长450-620下读值，数据分析见下表7。

2.通过酶免配对验证38份血清比较相关性，如上特异性单抗 C9F2-2配对表现出较好相关性。

实施例8

单抗配对发光评价：

1.下述实施例中的AMH检测试剂盒，其特征在于：包括如下组分：M试剂，含有0.5～1mg/ml的包被了第一抗体的磁性微粒、其中第一抗体(C9F2-2)的包被量为20～80ug/ml磁性微粒，上述磁性微粒购自Thermo Fisher Scientific，该试剂制备方法为：将所述第一抗体与磁性微粒混合于pH＝5.0～6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液中，于25℃～37℃包被1～3h，再加入pH＝8.0～9.0的0.1％～0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液终止1～3h，将其中包被后的磁性微粒分离后分散于pH＝7.0～8.0 的磷酸盐缓冲液中，再加入酪蛋白和牛血清白蛋白。R1试剂，(目前加的体系)。R2试剂，含有包被了第二抗体(单克隆抗体F10G7-2，厦门万泰凯瑞生物技术有限公司，货号M3382)的吖啶酯、0.5～1％酪蛋白和0.5～1％牛血清白蛋白，溶剂为pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液，其中第二抗体的包被量为5～15ug/ml吖啶酯，该试剂的制备方法为：将所述第二抗体与吖啶酯混合于pH＝8.0～9.0的磷酸盐缓冲液中，于25℃～37℃包被1～3h，再加入pH＝8.0～9.0的含0.1％～0.5％牛血清白蛋白的Tris缓冲液终止1～3h。得母液，将该母液用pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液稀释至1～500倍使用。预激发液，为1％(w/v)过氧化氢溶液。激发液，为1mol/L氢氧化钠溶液。

2.上述AMH测定试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：按1： 1的体积比在反应孔中依次加入样本R1试剂各100ul，孵育 15～20min，孵育结束后，用含0.05～0.08％的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，再加入20～25ul R2试剂，孵育10～15min，孵育结束后，用含 0.05～0.08％的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，加入预激发液100～200ul，进行预激发。去除预激发液，加入激发液100～200ul，进行激发和检测。其中检测(100)份样本，相关性如下：

3.通过发光试剂盒检测100份血清样本，和对照试剂相关性R2可以达到0.93。

序列表

<110> 厦门万泰凯瑞生物技术有限公司

厦门大学

<120> 针对人抗缪勒管激素的特异性抗体及其应用

<130> IDC180157

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Phe Ala Phe Ser Thr Tyr Asp

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ile Ser Pro Gly Gly Gly Ala Thr

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ala Gly Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Lys Val Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Pro Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一种与人抗缪勒管激素特异性结合的单克隆抗体，其中所述抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含：氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的CDR3，所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的CDR3。

2.权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述抗体包含：具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变区。

3.权利要求1或2所述的单克隆抗体，其是抗原结合片段、单链抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或人抗体。

4.权利要求1或2所述的单克隆抗体，其是单价抗体或Fab片段。

5.权利要求1或2所述的单克隆抗体，其获自CCTCC保藏编号为CCTCC No:C2018183的杂交瘤。

6.权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特异性结合包含在跨越抗缪勒管激素的第38至45位氨基酸残基的序列中的表位。

7.CCTCC保藏编号为CCTCC No:C2018183的杂交瘤细胞株。

8.编码权利要求1-6中任一项所述的抗缪勒管激素抗体的重链可变区和/或轻链可变区的多核苷酸。

9.一种包括权利要求8所述的多核苷酸的载体。

10.一种包括权利要求8所述的多核苷酸或权利要求9的载体的宿主细胞。

11.权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测人抗缪勒管激素在样品中的存在或其水平。

12.权利要求11所述的用途，其中所述检测包括以下步骤：

其中至少一种抗体或其抗原结合片段为权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

13.权利要求12所述的用途，其中另一种抗体或其抗原结合片段针对包含在抗缪勒管激素的第260至271位氨基酸残基的序列中的表位。

14.权利要求12所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段中的至少一种被固定化在固相表面上。

15.权利要求14所述的用途，其中另一种或多种抗体中的至少一种被标记。

16.权利要求15所述的用途，其中通过共价连接化学发光或荧光染料进行标记。

17.权利要求12或13所述的用途，其中权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段被固定化在固相表面上，并且另一种抗体或其抗原结合片段针对包含在抗缪勒管激素的第260至271位氨基酸残基的序列中的表位。

18.用于检测抗缪勒管激素在样品中的存在或其水平的试剂盒，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其作为双抗夹心酶联免疫检测的第一单克隆抗体即包被抗体；和作为双抗夹心酶联免疫检测的第二单克隆抗体即酶标抗体，其中所述包被抗体和所述酶标抗体分别针对抗缪勒管激素不同的抗原决定簇。

19.权利要求18所述的试剂盒，其中所述酶标抗体针对包含在抗缪勒管激素的第260至271位氨基酸残基的序列中的表位。

20.根据权利要求18所述的试剂盒，其还包括以下中的一种或多种：酶联板、包被缓冲液、封闭液、显色底物、终止液、抗缪勒管激素标准品。