CN109180814A - 一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法 - Google Patents

一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，包括动物免疫、饲养层细胞的制备、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选及其克隆、单克隆抗体腹水制备及纯化等方法，本发明AMH单克隆抗体的制备方法通过将制备过程中所用的材料及步骤进行优化，最终能得到高纯度的AMH单克隆抗体，本发明所制备的AMH单克隆抗体具有效价高、亲和力好，与AMH抗原结合力强等优点，可用于免疫组化、免疫荧光、放射自显影或其他方法来定性定位或定量监测卵巢储备力、预测体外受精联合胚胎移植技术(IVF)的卵巢反应性、预防卵巢过度刺激综合征(OHSS)、男性生殖功能的评估等以辅助临床诊断。

Description

一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法。
背景技术
缪勒氏管激素(MIS)，也叫做抗缪勒氏管激素(AMH)，是由二硫化物桥连接两个72kDa单体组成的140kU的糖蛋白二聚物,MIS/AMH属于β-转化生长因子(TGF-β)家族总科。AMH由睾丸未成熟的Sertoli细胞及出生后卵巢生长卵泡的颗粒细胞分泌,具有调节细胞发育及分化,使雄性胚胎缪勒氏管退化的作用。在男性，最初表达在8周胎儿睾丸支持细胞中，始于胚胎形成，并贯穿生命始终。在胚胎发育期间，AMH会引起缪勒氏管退化，形成正常的男性生殖管道，对于女性而言，AMH是在36周胎儿期的卵泡颗粒细胞生成的，直至女性更年期，AMH逐渐下降至无法检测的水平。
在临床上可用于真假两性畸形的诊断，肿瘤的特异性标记，精子形成的标记等,AMH已应用于主要用于监测卵巢储备力、预测体外受精联合胚胎移植技术(IVF)的卵巢反应性、预防卵巢过度刺激综合征(OHSS)、男性生殖功能的评估等。在多囊卵巢综合征(PCOS)的诊断中也以此来代替窦卵泡数(AFC)指标。
妇女卵巢功能与年龄、基础卵泡刺激素、基础抑制素B、基础雌二醇、氯米芬激发试验、促性腺激素释放激素激动剂激发试验、窦卵泡数、卵巢体积和卵巢血流丰度以及抗缪勒氏管激素水平等多种因素相关，AMH为其中最敏感的指标。
传统的AMH的检测方法主要采用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法，而采用这些方法最关键的是获得好用的抗缪勒氏管激素抗体。由于缪勒氏管激素在正常人血清中含量很低，因此对诊断用的抗缪勒氏管激素抗体，除了特异性高外，对亲和力要求也非常高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，制备的抗体特异性好，亲和力高，能够用于AMH免疫荧光检测试剂盒，对人体内AMH蛋白做出快速、准确的检测，辅助确定妇女卵巢功能。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，包括如下步骤：
(1)动物免疫
免疫小鼠为6周龄体重18-20g的BALB/c雌性小鼠，免疫原为AMH重组蛋白，将免疫原与福氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射100ul/只，后间隔2周，将免疫原和福氏不完全佐剂充分乳化后，经背腹部皮下多点注射100ul/只，后间隔2周，小鼠进行眼球取血，检测血清效价，取效价达到1:105的小鼠进行脾脏加强免疫，腹腔注射免疫原100uL/只，3天后取小鼠脾细胞进行细胞融合；
(2)饲养层细胞的制备
取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞和胸腺细胞作为饲养细胞，将BALB/c小鼠眼球放血致死，75％酒精体表消毒后，用消毒后的剪刀和镊子从后腹剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器取4ml DMEM培养基至腹腔，用手指轻轻挤压腹部，并进行反复冲洗，回收冲洗液，取出小鼠的胸腺，将其碾碎后用DMEM培养基冲洗，回收洗液，将两次回收液混合后，1200rpm/min离心3min，弃上清，即得到饲养层细胞；
(3)细胞融合
取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例在无血清的DMEM培养基中混匀，1300rpm离心3min，去除上清，37℃水浴中加入1mL 50％PEG-1500并融合1min，用无血清的DMEM培养基终止融合后1300rpm离心3min，弃去上清，得到融合细胞，融合细胞用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，置于37℃，含5％CO2的细胞培养箱中培养。
(4)杂交瘤细胞的筛选及其克隆
5天后，等到融合细胞覆盖孔底10-30％时，用常规间接ELISA方法筛选分泌抗体的阳性孔，即以AMH重组蛋白为抗原，用CBS缓冲液(50mM,pH＝9.5)稀释到0.5ug/ml包被96孔酶标板，50ul/孔，4℃包被过夜，拍干后，用含1％BSA的PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)封闭(200ul/孔)，37℃封闭2小时，拍干备用；将待检细胞培养上清50ul/孔加入上述ELISA板中，于37℃反应30min后洗涤并拍干，洗涤液PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)，加入50ul/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃孵育30min后洗涤并拍干，加入50ul/孔的TMB显色液，于37℃避光显色10min,加入25ul/孔的2M H2SO4终止反应，并于OD450处读取数值,阳性孔的确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1,选择呈强阳性反应的细胞孔，采用有限稀释法克隆，克隆多次，待单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定杂交瘤细胞株，经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存；
(5)单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右KM雌性小鼠，腹腔注射300ul石蜡，7-10天后腹腔注入8×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，注射针头采取腹水，8000rpm离心3min，收集上清液即为单抗腹水,取1倍体积单抗腹水加2倍体积醋酸缓冲液(60mM，pH＝4.8)稀释，4℃静置1h，2000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀单抗，4℃放置2h，3000rpm离心20min，弃去上清，沉淀用2倍体积的PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)溶解，在4℃流动透析24h后即获纯化的AMH单克隆抗体，-70℃保存。
上述一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，其中，DMEM培养基包括DMEM培养基80份、小牛血清20份。
上述一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，其中，DMEM不完全培养基包括DMEM13.37g、去离子水980ml、NaHCO3 3.7g、青霉素0.1g、链霉素0.1g、L-谷氨酰胺0.2g。
本发明具有有益效果：本发明AMH单克隆抗体的制备方法通过将试验过程、试验材料进行优化，最终能得到高纯度的AMH单克隆抗体，本发明所制备的AMH单克隆抗体具有效价高、亲和力好，与AMH抗原结合力强等优点，可用于免疫组化、免疫荧光、放射自显影或其他方法来定性定位或定量监测卵巢储备力、预测体外受精联合胚胎移植技术(IVF)的卵巢反应性、预防卵巢过度刺激综合征(OHSS)、男性生殖功能的评估等以辅助临床诊断。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，包括如下步骤：
(1)动物免疫
免疫小鼠为6周龄体重18-20g的BALB/c雌性小鼠，免疫原为AMH重组蛋白，将免疫原与福氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射100ul/只，后间隔2周，将免疫原和福氏不完全佐剂充分乳化后，经背腹部皮下多点注射100ul/只，后间隔2周，小鼠进行眼球取血，检测血清效价，取效价达到1:105的小鼠进行脾脏加强免疫，腹腔注射免疫原100uL/只，3天后取小鼠脾细胞进行细胞融合；
(2)饲养层细胞的制备
取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞和胸腺细胞作为饲养细胞，将BALB/c小鼠眼球放血致死，75％酒精体表消毒后，用消毒后的剪刀和镊子从后腹剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器取4ml DMEM培养基至腹腔，用手指轻轻挤压腹部，并进行反复冲洗，回收冲洗液，取出小鼠的胸腺，将其碾碎后用DMEM培养基冲洗，回收洗液，将两次回收液混合后，1200rpm/min离心3min，弃上清，即得到饲养层细胞；
(3)细胞融合
取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例在无血清的DMEM培养基中混匀，1300rpm离心3min，去除上清，37℃水浴中加入1mL 50％PEG-1500并融合1min，用无血清的DMEM培养基终止融合后1300rpm离心3min，弃去上清，得到融合细胞，融合细胞用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，置于37℃，含5％CO2的细胞培养箱中培养。
(4)杂交瘤细胞的筛选及其克隆
5天后，等到融合细胞覆盖孔底10-30％时，用常规间接ELISA方法筛选分泌抗体的阳性孔，即以AMH重组蛋白为抗原，用CBS缓冲液(50mM,pH＝9.5)稀释到0.5ug/ml包被96孔酶标板，50ul/孔，4℃包被过夜，拍干后，用含1％BSA的PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)封闭(200ul/孔)，37℃封闭2小时，拍干备用；将待检细胞培养上清50ul/孔加入上述ELISA板中，于37℃反应30min后洗涤并拍干，洗涤液PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)，加入50ul/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃孵育30min后洗涤并拍干，加入50ul/孔的TMB显色液，于37℃避光显色10min,加入25ul/孔的2M H2SO4终止反应，并于OD450处读取数值,阳性孔的确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1,选择呈强阳性反应的细胞孔，采用有限稀释法克隆，克隆多次，待单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定杂交瘤细胞株，经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存；
(5)单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右KM雌性小鼠，腹腔注射300ul石蜡，7-10天后腹腔注入8×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，注射针头采取腹水，8000rpm离心3min，收集上清液即为单抗腹水,取1倍体积单抗腹水加2倍体积醋酸缓冲液(60mM，pH＝4.8)稀释，4℃静置1h，2000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀单抗，4℃放置2h，3000rpm离心20min，弃去上清，沉淀用2倍体积的PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)溶解，在4℃流动透析24h后即获纯化的AMH单克隆抗体，-70℃保存。
实施例2
一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，包括如下步骤：
(1)动物免疫
免疫小鼠为6周龄体重18-20g的BALB/c雌性小鼠，免疫原为AMH重组蛋白，将免疫原与福氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射100ul/只，后间隔2周，将免疫原和福氏不完全佐剂充分乳化后，经背腹部皮下多点注射100ul/只，后间隔2周，小鼠进行眼球取血，检测血清效价，取效价达到1:105的小鼠进行脾脏加强免疫，腹腔注射免疫原100uL/只，3天后取小鼠脾细胞进行细胞融合；
(2)饲养层细胞的制备
取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞和胸腺细胞作为饲养细胞，将BALB/c小鼠眼球放血致死，75％酒精体表消毒后，用消毒后的剪刀和镊子从后腹剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器取10ml DMEM培养基至腹腔，用手指轻轻挤压腹部，并进行反复冲洗，回收冲洗液，取出小鼠的胸腺，将其碾碎后用DMEM培养基冲洗，回收洗液，将两次回收液混合后，1200rpm/min离心3min，弃上清，即得到饲养层细胞；
(3)细胞融合
取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(购自市场)按10:1的比例在无血清的DMEM培养基中混匀，1300rpm离心3min，去除上清，37℃水浴中加入1mL 50％PEG-1500并融合1min，用无血清的DMEM培养基终止融合后1500rpm离心5min，弃去上清，得到融合细胞，融合细胞用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，置于37℃，含5％CO2的细胞培养箱中培养。
(4)杂交瘤细胞的筛选及其克隆
5天后，等到融合细胞覆盖孔底10-30％时，用常规间接ELISA方法筛选分泌抗体的阳性孔，即以AMH重组蛋白为抗原，用CBS缓冲液(50mM,pH＝9.5)稀释到0.5ug/ml包被96孔酶标板，50ul/孔，4℃包被过夜，拍干后，用含1％BSA的PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)封闭(200ul/孔)，37℃封闭2小时，拍干备用；将待检细胞培养上清50ul/孔加入上述ELISA板中，于37℃反应30min后洗涤并拍干，洗涤液PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)，加入50ul/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃孵育30min后洗涤并拍干，加入50ul/孔的TMB显色液，于37℃避光显色10min,加入25ul/孔的2M H2SO4终止反应，并于OD450处读取数值,阳性孔的确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1,选择呈强阳性反应的细胞孔，采用有限稀释法克隆，克隆多次，待单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定杂交瘤细胞株，经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存；
(5)单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右KM雌性小鼠，腹腔注射200ul石蜡，7-10天后腹腔注入8×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，注射针头采取腹水，2000rpm离心3min，收集上清液即为单抗腹水,取1倍体积单抗腹水加2倍体积醋酸缓冲液(50mM，pH＝4.8)稀释，4℃静置1h，2000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀单抗，4℃放置2h，3000rpm离心20min，弃去上清，沉淀用2倍体积的PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)溶解，在4℃流动透析24h后即获纯化的AMH单克隆抗体，-70℃保存。
本发明提供的AMH单克隆抗体制备方法所用试验动物、生物制剂、试剂、仪器均可由市场购得。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)动物免疫
将免疫原与福氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，在免疫小鼠背腹部皮下多点注射100ul/只，后间隔2周，将免疫原和福氏不完全佐剂充分乳化后，经背腹部皮下多点注射100ul/只，后间隔2周，小鼠进行眼球取血，检测血清效价，取效价达到1:105的小鼠进行脾脏加强免疫，腹腔注射免疫原100uL/只，3天后取小鼠脾细胞进行细胞融合；
(2)饲养层细胞的制备
取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞和胸腺细胞作为饲养细胞，将BALB/c小鼠眼球放血致死，75％酒精体表消毒后，用消毒后的剪刀和镊子从后腹剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器取DMEM培养基至腹腔，用手指轻轻挤压腹部，并进行反复冲洗，回收冲洗液，取出小鼠的胸腺，将其碾碎后用DMEM培养基冲洗，回收洗液，将两次回收液混合后，1200rpm/min离心3min，弃上清，即得到饲养层细胞；
(3)细胞融合
取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在无血清的DMEM培养基中混匀，1300rpm离心3min，去除上清，37℃水浴中加入1mL 50％PEG-1500并融合1min，用无血清的DMEM培养基终止融合后1300rpm离心3min，弃去上清，得到融合细胞，融合细胞用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，置于37℃，含5％CO2的细胞培养箱中培养。
(4)杂交瘤细胞的筛选及其克隆
5天后，等到融合细胞覆盖孔底10-30％时，用常规间接ELISA方法筛选分泌抗体的阳性孔，即以AMH重组蛋白为抗原，用CBS缓冲液(50mM,pH＝9.5)稀释到0.5ug/ml包被96孔酶标板，50ul/孔，4℃包被过夜，拍干后，用封闭液200ul/孔的量封闭，37℃封闭2小时，拍干备用；将待检细胞培养上清50ul/孔加入上述ELISA板中，于37℃反应30min后洗涤并拍干，洗涤液PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)，加入50ul/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃孵育30min后洗涤并拍干，加入50ul/孔的TMB显色液，于37℃避光显色10min,加入25ul/孔的2M H2SO4终止反应，并于OD450处读取数值,阳性孔的确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1,选择呈强阳性反应的细胞孔，采用有限稀释法克隆，克隆多次，待AMH单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定杂交瘤细胞株，经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存；
(5)单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右KM雌性小鼠，腹腔注射石蜡，7-10天后腹腔注入杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，注射针头采集腹水，2000rpm离心3min，收集上清液即为单抗腹水,取1倍体积单抗腹水加2倍体积醋酸缓冲液(60mM，pH＝4.8)稀释，4℃静置1h，2000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀单抗，4℃放置2h，3000rpm离心20min，弃去上清，沉淀用2倍体积的PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)溶解，在4℃流动透析24h后即获纯化的AMH单克隆抗体，-70℃保存。
2.如权利要求1所述的一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，其特征在于，步骤(1)中，免疫小鼠为6周龄的BALB/c雌性小鼠，免疫原为AMH重组蛋白。
3.如权利要求1所述的一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，其特征在于，步骤(2)中，以体积份数计，DMEM培养基包括DMEM培养基80份、小牛血清20份。
4.如权利要求1所述的一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，其特征在于，步骤(2)中，DMEM不完全培养基包括DMEM 13.37g、去离子水980ml、NaHCO3 3.7g、青霉素0.1g、链霉素0.1g、L-谷氨酰胺0.2g。
5.如权利要求1所述的一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，其特征在于，步骤(4)中，封闭液为含1％BSA的PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)。
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