CN110218252A - 一种抗amh特异性抗体的制备方法以及该抗体在检测amh试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗AMH特异性抗体的制备方法,首先构建包含AMH编码序列的pCMV3表达质粒，转染CHO细胞，收集细胞培养上清，通过Ni柱纯化得到纯化后的AMH重组蛋白备用；用制备的AMH重组蛋白作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，ELISA间接法检测小鼠血清效价超过1/8K后，取免疫小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞NS1融合，杂交瘤细胞通过ELISA间接法进行3次亚克隆筛选，得到分泌抗AMH的单克隆杂交瘤细胞；将杂交瘤细胞注射小鼠腹腔，收集腹水经过纯化后得到抗AMH的特异性单克隆抗体。本发明制备方法简单，制备得到的抗体特异性强，应用在检测人AMH含量的试剂盒中，检测结果几乎不受动物血清的影响，可为医生的临床诊断和治疗提供可靠的依据。

Description

一种抗AMH特异性抗体的制备方法以及该抗体在检测AMH试剂 盒中的应用

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，尤其是涉及一种抗AMH特异性抗体的制备方法，本发明还涉及制备出的抗体在检测AMH试剂盒中的应用。

背景技术

抗缪勒氏管激素（anti-Mullerian hormone, AMH）是转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员之一，最早由Profess Alfred Jost 于1947年发现。AMH由两个相同的72kD亚基通过二硫键连接组成为分子量为144kD的二聚糖蛋白，在体内会从靠近C-末端的地方水解为2个55kD的N-端前肽和2个12.5kD的C-端成熟激素。男性的AMH激素由睾丸支持细胞生成，在生命开始时就参与抑制缪勒氏管发育，引起缪勒氏管退化，形成正常的男性生殖管道；女性的AMH由生长的小卵泡颗粒细胞产生，贯穿生命始终，其浓度随着年龄增加逐渐降低，直至女性更年期，AMH激素水平下降至几乎无法检测的水平。

目前对女性的生育能力评估是通过评估卵巢储备功能来确定的，卵巢储备功能是指卵泡库质量和卵泡数量，育龄期女性的卵巢储备功能随着年龄增加而下降。而临床上用来评估卵巢储备功能的指标包括年龄、卵泡刺激素（FSH）、促黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、窦卵泡激素（AFC）、抗缪勒氏管激素（AMH）、抑制素B（INHB）等指标。年龄也是最常用的卵巢储备功能的评估指标，高龄女性卵母细胞数量减少、质量下降，导致自然妊娠率低，自然流产、胎儿畸形等各种出生缺陷风险增高。然而对于一些特殊人群，年龄并不能代表卵巢功能的真实状态，例如多囊卵巢综合征（PCOS）和卵巢早衰（POF/POI），PCOS患者的基础窦卵泡数量较多，卵巢储备较好；而POF/POI患者由于卵母细胞先天储备不足或提前耗竭，其生育期显著缩短。

近年来，对AMH在体内含量的研究显示了其在生育相关领域良好的应用前景。通过检测血液中的AMH浓度可以用来评估卵巢中存在的窦状卵泡和窦前期卵泡的数目；AMH的浓度还可以作为卵巢储量自然衰减的重要指示并作为低能育性的风险提示，有助于帮助女性管理受孕计划；AMH还可以应用于辅助生殖技术，通过测定AMH的浓度有助于优化卵巢刺激步骤，制定理想的个体化治疗方案，避免过度刺激。所以AMH是目前评估卵巢储备功能的最理想的生物标志物。

目前市场上检测AMH的主流厂家如罗氏、贝克曼等，均是使用针对成熟区的鼠单克隆抗体夹心法进行检测（参见专利文献US 7897350），该专利文献认为AMH成熟区含有半胱氨酸数量较多，在体内结构更稳定，因而试剂盒的检测结果再现性更好，可以克服AMH蛋白稳定性差导致的检测结果因保存条件变化而引起的变化。然而在临床实际使用过程中，许多研究（Xan et al.,2014；Lukaszuk et al.,2014）表明使用针对成熟区抗体的试剂盒性能表现并没有达到厂家宣称的效果，认为根据专利文献US 7897350报道的方法，AMH的检测浓度被低估，且检测方法灵敏度低。专利文献WO 2014074835中报道了针对AMH前区或成熟区线性位点的多株抗体，并提供了不同的抗体组合用于测定AMH的浓度，但是缺乏数据证明该专利文献中的抗体配对可以应用于临床检验。专利文献WO 2017216334中报道了利用针对AMH前区157-255区间的非构象表位的抗体，与针对成熟区线性位点的抗体夹心法检测血清中AMH的浓度，其检测结果不受样本储存条件的影响，但未进一步提供抗体应用于临床检验的评价结果。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种新的抗AMH特异性抗体的制备方法，本发明还公开了采用制备出的抗体在检测AMH试剂盒中的应用，该试剂盒可以快速准确的检测样本中的AMH含量，且检测结果不受牛、马等动物AMH的干扰。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的抗AMH特异性抗体的制备方法包括下述步骤：

第一步，制备AMH重组蛋白

构建包含AMH编码序列的pCMV3表达质粒，转染CHO细胞，收集细胞培养上清，通过Ni柱纯化得到纯化后的AMH重组蛋白备用；

第二步，制备抗AMH特异性抗体

用第一步制备的AMH重组蛋白作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，ELISA间接法检测小鼠血清效价超过1/8K后，取免疫小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞NS1融合，杂交瘤细胞通过ELISA间接法进行3次亚克隆筛选，得到分泌抗AMH的单克隆杂交瘤细胞；将杂交瘤细胞注射小鼠腹腔，收集腹水经过纯化后得到抗AMH的特异性单克隆抗体。

本发明所述免疫原为包含序列SEQ ID No.1的全长人AMH重组蛋白。

本发明制备的抗AMH特异性抗体为识别序列SEQ ID No.2区域的线性表位的抗体。

本发明制备的抗AMH特异性抗体为识别序列SEQ ID No.3区域的非线性位点的抗体。

本发明制备的抗AMH特异性抗体在检测AMH试剂盒中的应用，采用该抗体，用双抗夹心法可准确检测样本中的AMH蛋白含量，检测样本可以是血清、血浆或尿液，且该检测方法不受牛、马、绵羊、山羊、猪、猕猴、兔子、猫、鼠、鸡AMH的干扰，是一种特异性检测人AMH的方法。

本发明的优点在于制备方法简单，制备得到的抗体特异性强，将其应用在检测人AMH含量的试剂盒中，检测结果几乎不受动物血清的影响，与常规检测试剂盒（如罗氏AMH试剂盒）相比，特异性高，检测结果准确，可为医生的临床诊断和治疗提供可靠的依据。

附图说明

图1是AMH融合质粒双酶切鉴定结果。

图2是AMH全长重组蛋白用SDS-PAGE分析结果

图3是AMH成熟区452-560aa（SEQ ID No.3）片段重组蛋白用SDS-PAGE分析结果。

图4是AMH-1#和AMH-2#鼠单克隆抗体的Western blot鉴定结果。

图5是本发明试剂盒与Roche试剂盒的相关性。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。在以下实施例中，如无特殊说明，所用的方法为本领域常规方法，所用的试剂和检测仪器也为本领域常规产品。

实施例1 AMH全长蛋白和成熟区片段制备

1、AMH编码序列全基因合成

从NCBI(National Center for Biotechnology Information)查询AMH的mRNA序列（NM_000479.4），其表达序列为（SEQ ID NO.1）。

委托上海生工生物工程有限公司进行全基因合成。

2、 重组人AMH表达载体构建及鉴定

以合成的AMH基因为模板，设计分别包含KpnI和XbaI限制酶酶切位点的扩增引物，同时在上游引物中引入His标签序列以便后期纯化。使用扩增引物对目的基因进行扩增，扩增出结构为“KpnI酶切位点-His标签-AMH序列-XbaI酶切位点”的融合片段。随后，分别使用KpnI和XbaI对目的基因片段和pCMV3载体进行双酶切，酶切后使用1%的琼脂糖凝胶进行胶回收。随后用连接酶将将酶切得到的AMH片段连接到前述切开的pCMV3上。将连接产物转入大肠杆菌Top10感受态进行表达，挑取菌落进行菌液PCR筛选，筛选出的阳性菌落进行摇菌培养，提取质粒后进行测序与KpnI/XbaI双酶切鉴定。双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶鉴定，在预期位置有特异性条带（见图1）。将鉴定的正确的质粒送上海生工进行测序，测序结果与模板AMH序列完全一致，说明目的基因片段成功插入载体序列，已成功构建出含有目的基因AMH全长序列的pCMV3-AMH载体质粒。

3、制备重组人AMH蛋白

在细胞培养瓶中用CHO培养基（Gibco）培养CHO细胞，培养体积为200ml。转染当天将CHO细胞密度调整为6×10⁶ cells/mL，活率不低于90%。将200ug质粒和640ul转染试剂混匀，缓慢滴加到摇瓶中，37℃、8% CO₂的培养箱中培养。转染后间隔24h取样统计细胞活率，当细胞活率低于40%时，2000rpm离心收集培养上清。

将细胞培养上清在20mmol/ml pH8.0的Tris缓冲液中透析过夜，用 20mmol/mlpH8.0的Tris缓冲液平衡Ni柱后，将透析过的细胞上清缓慢上样。用含200mmol/ml咪唑的20mmol/ml pH8.0的Tris缓冲液将杂蛋白洗脱干净后，用含500mmol/ml咪唑的20mmol/mlpH8.0的Tris缓冲液进行解离。收集的解离液即为重组人AMH蛋白，4℃保存。图2显示的即是纯化收集到的纯度较高的AMH重组蛋白。

参考上述方法，制备AMH成熟区452-560aa（SEQ ID No.3）片段。

图3显示的是纯化后分别收集到的纯度较高的成熟区重组蛋白。

实施例2 制备抗AMH的鼠单克隆抗体

1、小鼠免疫

将实施例1中得到AMH重组蛋白用弗氏完全佐剂充分乳化后，腹腔免疫5周龄的雌性Balb/c小鼠，初免剂量为100ug/只小鼠；第一次免疫后间隔21天、42天分别进行第二次和第三次免疫，免疫剂量均为50ug/只小鼠。第三次免疫后10天左右尾部采血，用包被有AMH的96孔板间接法检测血清效价。

2、杂交瘤细胞制备

选择间接法检测血清效价大于10⁴的小鼠进行脾内加强免疫，免疫剂量为100ug/只小鼠。加强免疫后3天取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞NS1按照10:1的比例融合，融合后的细胞在含HAT的DMEM培养基（Gibco）上进行培养。

融合后6-7天左右，用包被有AMH不同片段的96孔板间接法检测细胞培养上清中的特异性抗体含量，选择OD值不低于0.5的阳性孔用有限稀释法进行3轮亚克隆，最终分别得到能稳定分泌抗AMH的杂交瘤细胞株。

3、识别AMH氨基酸序列26-451aa（SEQ ID No.2）区间的杂交瘤细胞株的筛选

选择细胞上清与AMH全长片段反应、而与片段452-560aa（SEQ ID No.3）片段不反应的杂交瘤细胞株，确定为可以分泌特异性识别AMH片段26-451aa（SEQ ID No.2）的抗体的细胞株。将筛选到的1株细胞株命名为AMH-1#。

4、识别AMH氨基酸序列452-560aa（SEQ ID No.3）区间的杂交瘤细胞株的筛选

选择细胞上清与AMH全长片段、452-560aa片段反应的杂交瘤细胞株，确定为可以分泌特异性识别AMH片段452-560aa的抗体的细胞株。将筛选到的1株细胞株命名为AMH-2#。

5、抗AMH的鼠单克隆抗体纯化

将得到的能稳定分泌抗AMH的鼠杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔内，收集腹水通过SPA纯化即可得到纯度超过90%的抗AMH的鼠单克隆抗体。

6、抗AMH鼠单克隆抗体位点类型的鉴定

将实施例1中制备的AMH全长蛋白、AMH片段452-560aa用0.05mmol/L、pH=9.6的CB缓冲液稀释至0.1mg/ml，取20ul稀释后的重组蛋白进行10%的SDS-PAGE电泳，电泳结束后将凝胶置于转膜缓冲液中平衡10分钟，200mA电转膜30分钟。将膜置于封闭液中，室温封闭过夜，弃去封闭液，加入浓度为5ug/ml的纯化后的AMH-1#和AMH-2#单克隆抗体，4℃温育2小时。用TBST洗膜3次，每次3min。加入1/4000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37℃温育2小时，用TBST洗膜4次，每次3分钟。加入等比例混匀的DAB试剂盒的A液、B液进行显色。从图4可以看出，AMH-1#抗体在分子量为60-75kD之间可见清晰条带，而在20--25kD之间未见条带，证明AMH-1#是识别AMH片段26-451aa的线性位点；AMH-2#未见明显印迹条带，表明其为针对片段452-560aa的构象位点。

实施例3 建立双抗夹心法检测AMH的ELISA方法

1、磁微粒包被

取30 μl混匀后的磁微粒原液用300 μl的PBS缓冲液洗涤5次，然后用10%的戊二醛对磁微粒活化1小时，接着用pH 7～8 PBS缓冲液将活化后的磁微粒洗涤2次。将抗AMH的鼠单克隆抗体AMH-2#按照0.3 μg/人份的量加入磁珠中，4℃包被2小时，最后用含BSA的封闭液封闭2小时。

2、HRP标记抗AMH鼠单克隆抗体AMH-1#

将抗AMH鼠单克隆抗体AMH-1#与HRP（罗氏）按照质量比=1.5:1的比例进行标记。HRP标记后的抗AMH鼠单克隆抗体AMH-1#用稀释液稀释至1:4000。

3、临床样本检测

收集来自医院的罗氏AMH定值的患者样本551例，用本发明的双抗夹心法进行检测，与罗氏试剂盒（Elecsys^® AMH）检测结果相关性如图5所示，本发明试剂盒与罗氏试剂盒整体相关性R²=0.97。

实施例4 检测动物血清对AMH检测方法的干扰

将采集自雄性动物幼体的血清样本，分别用本发明的双抗夹心法和罗氏AMH试剂盒（Elecsys^® AMH）进行检测，检测结果如下表1：

表1

从表1可以看出，罗氏AMH试剂盒（Elecsys^® AMH）检测结果受部分动物血清（小牛、绵羊、小鼠、猕猴、猫）干扰明显，说明其试剂盒中所用的抗体无法区分这些动物AMH蛋白与人的AHM蛋白。本发明的AMH检测方法检测结果几乎不受上述动物血清中AMH的影响，是一种特异性检测人AMH的方法。

Application Project

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Claims (5)

1.一种抗AMH特异性抗体的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：

第一步，制备AMH重组蛋白

构建包含AMH编码序列的pCMV3表达质粒，转染CHO细胞，收集细胞培养上清，通过Ni柱纯化得到纯化后的AMH重组蛋白备用；

第二步，制备抗AMH特异性抗体

用第一步制备的AMH重组蛋白作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，ELISA间接法检测小鼠血清效价超过1/8K后，取免疫小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞NS1融合，杂交瘤细胞通过ELISA间接法进行3次亚克隆筛选，得到分泌抗AMH的单克隆杂交瘤细胞；将杂交瘤细胞注射小鼠腹腔，收集腹水经过纯化后得到抗AMH的特异性单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的抗AMH特异性抗体的制备方法，其特征在于：所述免疫原为包含序列SEQ ID No.1的全长人AMH重组蛋白。

3.根据权利要求1所述的抗AMH特异性抗体的制备方法，其特征在于：所述制备的抗AMH特异性抗体为识别序列SEQ ID No.2区域的线性表位的抗体。

4.根据权利要求1所述的抗AMH特异性抗体的制备方法，其特征在于：所述制备的抗AMH特异性抗体为识别序列SEQ ID No.3区域的非线性位点的抗体。

5.权利要求1制备的抗AMH特异性抗体在检测AMH试剂盒中的应用。