CN111793131A - 一种用于检测血清中pf4含量的抗体对及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种用于检测血清中PF4含量的抗体对及其用途，包括与PF4的N端表位即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiPF4_N和与PF4的C端表位即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiPF4_C，所述单克隆抗体AntiPF4_N包括SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区，所述AntiPF4_C包括SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区。本申请将PF4抗原分成N端(SEQ ID NO:2)和C端(SEQ ID NO:3)两段序列，并用这两段序列分别免疫小鼠，筛选到高特异性和高灵敏性的抗体对AntiPF4_N和AntiPF4_C，通过该抗体对可以有效的测定肝素使用后血清中PF4的含量，进而便于指导肝素的使用。

Description

一种用于检测血清中PF4含量的抗体对及其用途
技术领域
本申请涉及医药领域，尤其涉及一种用于检测血清中PF4含量的抗体对及其用途。
背景技术
肝素是治疗和预防血栓性疾病的常用药物,在肾脏内科广泛应用于血液透析治疗。随着肝素在临床上的广泛应用,其所引起的不良反应亦日益引起人们的重视,主要包括肝素抵抗、出血、血栓形成和过敏反应,其中肝素诱导的血小板减少症(heparininducedthrom-bocytopenia,HIT)是较为严重并发症之一。HIT是由肝素类药物引起的一种以血小板减少为特征的并发症,多发于患者接受肝素治疗后的5～10d,其发生的原因是患者体内产生了针对血小板因子4(plateletfactor4,PF4)和肝素(heparin)形成的复合物的抗体(H-PF4抗体)[WARKENTINTE,CHONGBH,GREINACHERA.Heparin-inducedthrombocytopenia：towardconsensus[J].ThrombHaem-ost,1998,79：1-7.]。有研究显示,H-PF4抗体与动静脉血栓的发生有关,血液透析患者长期应用肝素进行抗凝治疗,处于形成H-PF4抗体的危险中[PENADELAVEGAL,MILLERRS,BENDAMM,etal.As-sociationofheparin-dependentantibodiesandadverseoutcomesInhemodialysispatients：apopulation-basedstudy[J].Mayo ClinProc,2005,80(8):995-1 000.]。肝素是当前血液透析中常用的抗凝剂,其不良反应主要是由于体内产生了H-PF4抗体,该抗体的出现对患者透析过程中血小板下降、血栓栓塞并发症以及心脑血管事件的发生具有提示作用,并对指导透析患者肝素的合理应用和判断透析患者的远期预后具有一定的临床价值。然而，截止目前，还没有针对PF4临床检测的配对抗体序列报道。
发明内容
本申请为解决上述技术问题而提供一种用于检测血清中PF4含量的抗体对及其用途。
本申请所采取的技术方案是：本申请第一方面提供一种用于检测血清中PF4含量的抗体对，其特征在于：包括与PF4的N端表位即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiPF4_N和与PF4的C端表位即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiPF4_C，所述单克隆抗体AntiPF4_N包括SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区，所述AntiPF4_C包括SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区。
进一步的，所述单克隆抗体AntiPF4_N轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:4所示的LCDR1或与其至少90％同源的氨基酸序列，SEQ ID NO:5所示的LCDR2或与其至少90％同源的氨基酸序列，以及SEQ ID NO:6所示的LCDR3或与其至少90％同源的氨基酸序列；所述单克隆抗体AntiPF4_N重链氨基酸序列包括SEQ ID NO:8所示的HCDR1或与其至少90％同源的氨基酸序列，SEQ ID NO:9所示的HCDR2或与其至少90％同源的氨基酸序列，以及SEQ IDNO:10所示的HCDR3或与其至少90％同源的氨基酸序列。
进一步的，所述单克隆抗体AntiPF4_C轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:14所示的LCDR1或与其至少90％同源的氨基酸序列，SEQ ID NO:15所示的LCDR2或与其至少90％同源的氨基酸序列，以及SEQ ID NO:16所示的LCDR3或与其至少90％同源的氨基酸序列；所述单克隆抗体AntiPF4_N重链氨基酸序列包括SEQ ID NO:18所示的HCDR1或与其至少90％同源的氨基酸序列，SEQ ID NO:19所示的HCDR2或与其至少90％同源的氨基酸序列，以及SEQ IDNO:20所示的HCDR3或与其至少90％同源的氨基酸序列。
进一步的，所述单克隆抗体AntiPF4_N和AntiPF4_C均为IgG型单克隆抗体，且一个为捕获抗体，一个为检测抗体。
进一步的，所述AntiPF4_N为捕获抗体，所示AntiPF4_C为检测抗体。
进一步的，所述检测抗体的检测标记物为检测标记蛋白、荧光基团、放射性同位素中的一种。
进一步的，所述检测抗体的检测标记蛋白包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和β-半乳糖苷酶，且检测抗体与检测标记蛋白重组表达。
进一步的，所述检测抗体的检测方法包括酶联免疫(ELISA)检测法、化学发光检测检测法、蛋白质印迹检测检测法、免疫组化(IHC)检测法和免疫层析检测检测法。
进一步的，所述抗体对选自与PF4结合的Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和di-scFv的抗体片段。
本申请的第二方面提供一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1或2或3所述的抗体。
本申请的第三方面提供一种上述任一一种抗体对在制备检测血清中PF4含量的试剂盒中的应用。
本申请具有的优点和积极效果是：本申请将PF4抗原分成N端(SEQ ID NO:2)和C端(SEQ ID NO:3)两段序列，并用这两段序列分别免疫小鼠，筛选到高特异性和高灵敏性的抗体对AntiPF4_N和AntiPF4_C，通过该抗体对可以有效的测定肝素使用后血清中PF4的含量，进而便于指导肝素的使用。
除了上面所描述的本申请解决的技术问题、构成技术方案的技术特征以及由这些技术方案的技术特征所带来的优点之外，本申请所能解决的其他技术问题、技术方案中包含的其他技术特征以及这些技术特征所带来的优点，将在下文中作进一步详细的说明。
附图说明
图1是本申请实施例提供的AntiPF4_N和AntiPF4_C抗体对检测示意图；
图2是本申请实施例提供的构建的pcDNA3.1-NL-LFc载体电泳图；
图3是本申请实施例提供的构建的pcDNA3.1-NH-HFc载体电泳图；
图4是本申请实施例提供的重组AntiPF4_N蛋白纯化电泳图；
图5是本申请实施例提供的构建的pcDNA3.1-CL-LFc载体电泳图；
图6是本申请实施例提供的构建的pcDNA3.1-CL-HFc载体电泳图；
图7是本申请实施例提供的重组AntiPF4_C蛋白纯化电泳图；
图8是本申请实施例提供的AntiPF4_N和AntiPF4_C抗体对制备的试剂盒验证流程示意图；
图9是本申请实施例四提供的剂量-反应曲线线性测试中的第一次测定曲线；
图10是本申请实施例四提供的剂量-反应曲线线性测试中的第二次测定曲线；
图11是本申请实施例四提供的剂量-反应曲线线性测试中的第三次测定曲线；
图12是本申请实施例提供的临床诊断中本申请抗体制成试剂盒与对照试剂盒检测PF4的剂量-反应曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例一：单克隆抗体AntiPF4_N和AntiPF4_C的制备
1、对PF4(SEQ ID NO:1)蛋白抗原性分析，将PF4抗原分成N端(SEQ ID NO:2)和C端(SEQ ID NO:3)两段序列，分别合成PF4的N端表位(SEQ ID NO:2)和PF4的C端表位(SEQ IDNO:3)，分别偶联KLH，获得N端免疫原和C端免疫原；后免疫小鼠，小鼠为8周龄的雌性Balb/c小鼠。
2、动物免疫：采用N端免疫原和C端免疫原分别免疫8周龄的雌性Balb/c小鼠，100ug的抗原免疫小鼠4次，每次间隔4周。
3、细胞融合：断颈处死小鼠，置于75％乙醇溶液中5-10min，在无菌条件下取出脾脏，用已灭菌处理的毛玻璃片挤压并轻轻研磨脾脏细胞，脾脏细胞计数，将免疫后的小鼠脾细胞和小鼠的骨髓瘤细胞按1:1的比例混合，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，1000rpm/min离心10分钟，弃去上清，用吸管吸净残留液体(为了避免影响PEG的浓度)，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。
4、用吸管在60s内加预热至40℃的50％PEG(PH 8.0)1ml，边加边轻轻搅拌。
5、用10ml吸管在90s内加20-30ml预热的不完全培养基(终止PEG作用)；20-27℃静置10分钟。
6、1000r/min离心5分钟，弃上清
7、加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。
8、分装96孔细胞培养板(孔板内有饲养细胞层)，每孔0.1-0.15ml(或分装24孔板，每孔1.0-1.5ml)，然后将培养板置37℃，6％CO2培养箱内培养。
9、5天后用HAT培养基换出1/2培养基
10、7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；
11、经常观察杂交瘤细胞的生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清通过ELISA检测其活性(阳性克隆)，筛选抗体效价高的杂交瘤细胞，经过3-4次亚克隆，确保形成单克隆时扩大培养，并进行腹水细胞注射，抗体纯化。
实施例二：对实施例1获得的单克隆抗体进行验证
(1)将PF4全抗原(SEQ ID NO:1)、PF4的N端抗原(SEQ ID NO:2)和PF4的C端抗原(SEQ ID NO:3)分别进行包被，包被浓度2ug/ml，4℃2小时，用0.9％NaCl洗涤液洗板3次，拍干，加封闭液(0.5mol PBS+1％BSA+2.5％蔗糖)200μl，37℃封闭2小时，之后倒尽板孔中液体，拍干；
(2)加入不同体积的实施例1获得的AntiPF4_N和AntiPF4_C(如表1所示)，37℃反应1小时；
(3)0.9％NaCl洗涤液洗板3次，拍干；
(4)加入HRP标记的羊抗小鼠IgG的二抗，37℃反应1小时；
(5)0.9％NaCl洗涤液洗板5次，拍干；
(6)最后加入底物液鲁米诺，测定其发光值，测定结果如表1所示：
表1
全抗原(SEQ ID NO:1) N端抗原(SEQ ID NO:2) C端抗原(SEQ ID NO:3)
空白组 3280 2928 3314
AntiPF4_N 2ul 62954 58619 3030
AntiPF4_N 10ul 256249 231572 2993
AntiPF4_N 50ul 993541 869421 3314
AntiPF4_C 10ul 64097 3051 59135
AntiPF4_C 20ul 260195 3291 249652
AntiPF4_C 50ul 1013945 3274 982415
由表1可知，AntiPF4_N能特异性的结合PF4的N端抗原(SEQ ID NO:2)，而不结合PF4的C端抗原(SEQ ID NO:3)；AntiPF4_C能特异性的结合PF4的C端抗原(SEQ ID NO:3)，而不结合PF4的N端抗原(SEQ ID NO:2)。实施例三：单克隆抗体AntiPF4_N和AntiPF4_C的测序及通过杂交瘤细胞制备相应抗体
1、提取实施例1中AntiPF4_N杂交瘤细胞的总RNA，采用cDNA合成逆转录试剂盒，以RNA为模板合成第一条链cDNA，再以cDNA为模板，扩增单克隆抗体AntiPF4_N可变区基因。对可变区PCR产物序列进行T/A克隆，后挑选阳性菌落进行测序，并对测序结果进行氨基酸翻译分析。
结果表明，AntiPF4_N单抗轻链可变区的LCDR1,LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO:4，5和6。此外，包含上述可变区的轻链可变区基因及编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：12和7所示。
AntiPF4_N单抗重链可变区的HCDR1,HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别于SEQ IDNO：8,9和10。此外，包含上述可变区的重链可变区基因及编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:13和11所示。
优化AntiPF4_N单抗轻链可变区基因和重链可变区基因，将轻链可变区基因克隆到pcDNA3.1-LFc载体中，构建pcDNA3.1-NL-LFc载体，如图2所示；将重链可变区基因克隆到pcDNA3.1-HFc载体中，构建pcDNA3.1-NH-HFc载体，如图3所示，本实施例中，pcDNA3.1-LFc和pcDNA3.1-HFc中已经含有人源的轻链恒定区和重链恒定区，将pcDNA3.1-NL-LFc和pcDNA3.1-NH-HFc按照1:1共转染到CHO-S细胞中，重组表达抗PF4的N端抗体AntiPF4_N，如图4所示，收集抗体AntiPF4_N。
2、提取实施例1中AntiPF4_C杂交瘤细胞的总RNA，采用cDNA合成逆转录试剂盒，以RNA为模板合成第一条链cDNA，再以cDNA为模板，扩增单克隆抗体AntiPF4_C可变区基因。对可变区PCR产物序列进行T/A克隆，后挑选阳性菌落进行测序，并对测序结果进行氨基酸翻译分析。
结果表明，AntiPF4_C单抗轻链可变区的LCDR1,LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO:14，15和16。此外，包含上述可变区的轻链可变区基因及编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：22和17所示。
AntiPF4_C单抗重链可变区的HCDR1,HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别于SEQ IDNO：18,19和20。此外，包含上述可变区的重链可变区基因及编码的氨基酸序列如SEQ IDN0:23和21所示。
优化AntiPF4_C单抗轻链可变区基因和重链可变区基因，将轻链可变区基因克隆到pcDNA3.1-LFc载体中，构建pcDNA3.1-CL-LFc载体，如图5所示；将重链可变区基因克隆到pcDNA3.1-HFc载体中，构建pcDNA3.1-CH-HFc载体，如图6所示，本实施例中，pcDNA3.1-LFc和pcDNA3.1-HFc中已经含有人源的轻链恒定区和重链恒定区，将pcDNA3.1-CL-LFc和pcDNA3.1-NH-CFc按照1:1共转染到CHO-S细胞中，重组表达抗PF4的C端抗体AntiPF4_C，如图7所示，收集抗体AntiPF4_C。
实施例四：AntiPF4_N和AntiPF4_C抗体对在化学发光法诊断试剂盒中的应用
按照现有化学发光法诊断试剂生产工艺，将实施例3获得的AntiPF4_C作为捕获抗体进行包被配置成PF4包被板，将实施例3获得的AntiPF4_N标记作为结合抗体进行配置成PF4酶结合物，将PF4抗原配置成系列校准品(0ng/L、5ng/L、10ng/L、20ng/L、40ng/L、80ng/L)形成一套完整试剂盒，并对其进行一系列验证。
1、性能指标验证
参考市场上现有PF4试剂盒的技术要求，制定对PF4检测试剂的性能验证指标。
(1)最低检测限
应不高于3ng/L。
(2)剂量-反应曲线的线性
在线性区间0ng/L～80ng/L内，剂量-反应曲线线性相关系数应不小于0.9900。
(3)准确度
以试剂盒检测回收率，应在0.85-1.15范围内。
(4)精密度
精密度(CV)应不大于10％。
2、实验配置
(1)PF4包被板配置
将AntiPF4_C作为捕获抗体，加入到包被缓冲液(0.05mol PBS)，按照2.5ug/ml比例加入。每个空白发光板板孔加入100ul，4℃过夜，取出，用洗板洗涤液(0.9％NaCl)洗涤2次，加入每孔200ul封闭液(0.5mol PBS+1％BSA+2.5％蔗糖)，4℃过夜，取出，弃掉板中液体，干燥后制成PF4包被板。
(2)PF4酶结合物配置
A、与检测抗体结合的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和β-半乳糖苷酶中的一种，根据与检测抗体结合的酶选择相应的检测方法。
B、本实施例中，AntiPF4_N抗体标记HRP，取1mg/mlAntiPF4_N抗体，并用醋酸溶液活化1mgHRP备用，抗体和HRP按1：1混合后颠倒混匀，2h后加入硼氢化钠终止反应，得到AntiPF4_N-HRP结合抗体。
将AntiPF4_N-HRP作为检测抗体，加入到酶稀释液(50Mmol Tris+1％BSA)，按照1/1000比例加入。
(3)校准品配置
将PF4抗原用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释六个梯度(0ng/L、5ng/L、10ng/L、20ng/L、40ng/L、80ng/L)。
(4)回收率标准溶液配置
将PF4抗原用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释到60ng/L，作为标准溶液，选取3-4ng/L正常人血清作为低值样本。
(5)质控品配置
将PF4抗原用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释成Q1(7.5±10％ng/L)和Q2(65±10％ng/L)。
3、加样操作，如图8所示
(1)分别取上述配置的(3)-(5)PF4校准品、回收率标本和质控品各100μl加入上述配置的(1)相应包被板板孔内，振荡器振荡30秒钟，使其充分混合均匀；
(2)盖上封板膜，置37℃温育30分钟；
(3)取出，用应用洗涤液(0.5mol PBS+0.025％T-20)洗板3次；
(4)取上述配置的(2)PF4酶结合物100μL加入各孔，振荡器振荡30秒钟；
(5)盖上封板膜，置37℃温育30分钟；
(6)取出，用应用洗涤液(0.5mol PBS+0.025％T-20)洗板3次；
(7)每孔加入底物液100ul(购买自ThermoFisher T2142)；
(8)用中生百克BHP9504化学发光仪检测化学发光强度(RLU)。
4、性能指标考核
(1)最低检测限
平行测定20孔零校准品(0ng/L)的相对发光强度，计算发光值平均值和标准偏差SD，用剂量-反应曲线计算发光值为均值+2×SD时对应的浓度值即为最低检出限，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002664480050000091
由表2可知，最低检测限为1.126ng/l,不高于3ng/l，符合指标。
(2)剂量-反应曲线的线性
复孔测定试剂盒的参考品(S0ˉS5，浓度依次为0ng/L、5ng/L、10ng/L、20ng/L、40ng/L、80ng/L)，平行测定三次，采用双对数法拟合试剂盒的剂量-反应曲线，三次测定的剂量-反应曲线如图9、图10和图11所示。测定的剂量-反应曲线线性相关系数(R2)如表3所示。
表3
第一次测 第二次测 第三次测
线性相关系数R<sup>2</sup> 0.9993 0.9997 0.9995
由图9、图10和图11，以及表3可知，连续三次测定0-80ng/L浓度范围PF4抗原曲线，线性相关系数R2均大于0.9990，符合指标。
(3)准确度
将PF4抗原配制成标准溶液(60ng/L)按体积比为1：9加入到已知浓度的低值样本(3-4ng/L)中，在试剂盒上进行检测，根据下方公式计算回收率R，如表4所示。
Figure BDA0002664480050000092
式中：R——回收率；
V——加入标准溶液的体积；
V0——低值样本的体积；
C——低值样本加入标准溶液后的检测浓度；
C0——低值样本的检测浓度；
Cs——标准溶液的浓度。
表4
CS(ng/L) C0(ng/L) 样本C发光值 C(ng/L) 回收率(％)
60 3.38 118273 9.015 99.55
由表4可知，试剂盒检测回收率，在0.85-1.15范围内，符合指标
(4)精密度
平行测定质控品Q1和质控品Q2各10孔，分别按照下方公式计算CV，结果如表5所示。
Figure BDA0002664480050000101
式中：
Figure BDA0002664480050000102
—质控品测定浓度值的平均值
SD—质控品测定浓度值的标准差
表5
Figure BDA0002664480050000103
由表5可知，连续三次平行测定QC1和QC2，结果均不大于10％要求，符合指标。
本实施例中，PF4检测试剂的最低检测限、剂量-反应曲线、准确性和精密度性能指标均符合现有技术要求并优于市场现有方法学试剂。
实施例五：临床检测
随机选取40份人血清标本，用本申请抗体制成试剂盒及对照PF4试剂盒(购自北京康安泽成生物科技有限公司)进行检测，检测结果如表6所示。
表6
Figure BDA0002664480050000104
Figure BDA0002664480050000111
并根据表6绘制剂量-反应曲线，如图12所示。
对照PF4试剂盒(购自北京康安泽成生物科技有限公司)，正常参考值为12ng/ml，由表6所示，本申请抗体制成的试剂盒与对照PF4试剂盒临床诊断结果符合率100％。
如图12所示，基于本申请抗体制成试剂盒与对照试剂盒检测浓度结果相关性R2为0.9980。
本申请中，检测抗体可以与多种检测标记蛋白结合，检测抗体的检测方法包括酶联免疫(ELISA)检测法、化学发光检测检测法、蛋白质印迹检测检测法、免疫组化(IHC)检测法和免疫层析检测检测法，便于根据需要选择合适的检测标记蛋白，大大提高了本申请抗体对制成的试剂盒的便捷性。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明的申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 廊坊天光生物技术有限公司
<120> 一种用于检测血清中PF4含量的抗体对及其用途
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 101
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
Met Ser Ser Ala Ala Gly Phe Cys Ala Ser Arg Pro Gly Leu Leu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val Val Ala Phe Ala Ser Ala Glu
20 25 30
Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr Ser
35 40 45
Gln Val Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Val Ile Lys Ala Gly
50 55 60
Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg
65 70 75 80
Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys
85 90 95
Lys Leu Leu Glu Ser
100
<210> 2
<211> 39
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Met Ser Ser Ala Ala Gly Phe Cys Ala Ser Arg Pro Gly Leu Leu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val Val Ala Phe Ala Ser Ala Glu
20 25 30
Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu
35
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 3
Lys Asn Gly Arg Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys
1 5 10 15
Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser
20 25
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 4
Gln Ser Leu Val His Asn Tyr Gly Asn Thr Phe
1 5 10
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
Ser Thr Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 7
<211> 111
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 7
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn
20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 9
Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 10
Thr Gly Tyr Asp Phe Asp Tyr
1 5
<210> 11
<211> 116
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 11
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gly Tyr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 333
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 12
gacgttgtta tgacccagac accactctct ttgcccgtta gtctcggtga ccaagcaagc 60
atctcatgcc gcagctccca gagcctcgtg cataactacg ggaatacatt ccttcactgg 120
tacctccaga aacccgggca gagtcccaaa ttgctgatct attctacttc caatctgttc 180
agcggtgtac ccgatagatt cagcggttca gggtctggca cagactttac actgaagatc 240
tcccgggtgg aggctgaaga tctgggtgtt tacttctgtt cccaaagcac acacgtacca 300
cctaccttcg gtggagggac taagctcgaa att 333
<210> 13
<211> 348
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 13
gaggttaaat tggaagaatc tggcgggggg ctcgtacaac caggaggaag tatgaagctc 60
tcatgtgtgg cttccggctt tacattttcc aactactgga tgaattgggt taggcagagt 120
cctgaaaagg gcctggagtg ggtagctgaa atccgtctca aatccaataa ctacgccacc 180
cactatgccg agagcgtgaa ggggcggttc acaatcagtc gcgacgatag caagtcatct 240
gtttatcttc agatgaacaa tcttcgggct gaggatactg gaatctacta ttgcaccggt 300
tatgactttg attactgggg acagggtacc actttgactg tgtctagt 348
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 14
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 15
Leu Ala Ser
1
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 16
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly
1 5 10
<210> 17
<211> 111
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 17
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Ser Asn Val
100 105 110
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 18
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 19
Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ala Ile
1 5
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 20
Ala Arg Ala Gly Asn His Tyr Tyr Gly Gly Ala Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asn His Tyr Tyr Gly Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 22
<211> 333
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 22
gatattgtgc tgacacagtc tcctgcaagc ctggccgtat ctttggggca gagggcaacc 60
attagctacc gggcctctaa gagcgtaagc acttcaggtt actcctacat gcattggaat 120
cagcaaaaac ccggtcaacc cccacggctg ttgatatatc tggtgagcaa ccttgagagc 180
ggggtacccg ctcgattttc tggctctggc agtggcaccg actttaccct taacattcac 240
ccagtggaag aagaggatgc tgccacctac tattgccagc acattagaga gctcacacgt 300
tctgaagggg gcccttcttg gaagtcaaac gtg 333
<210> 23
<211> 357
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 23
gaagttcagc ttgtagagtc aggtggaggt ctggttcagc ctggaggttc tcgtaagctc 60
agctgcgctg cttctgggtt caccttttct tcttttggaa tgcactgggt gagacaagca 120
cctgaaaagg gcctggagtg ggtggccttc atttccagtg gtagcagcgc aatatattat 180
gccgacaccg tgcagggacg atttaccatt agtcgggaca acccaaagaa tacattgttt 240
cttcagatga caagcttgag aagtgaggac actgctatgt actattgcgc aagagccggc 300
aaccattatt atggcggagc atattggggt cagggtacac tggtcactgt ttctgcc 357

Claims (11)

1.一种用于检测血清中PF4含量的抗体对，其特征在于：包括与PF4的N端表位即SEQ IDNO:2所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiPF4_N和与PF4的C端表位即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiPF4_C，所述单克隆抗体AntiPF4_N包括SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区，所述AntiPF4_C包括SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区。
2.如权利要求1所述的一种用于检测血清中PF4含量的抗体对，其特征在于，所述单克隆抗体AntiPF4_N轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:4所示的LCDR1，SEQ ID NO:5所示的LCDR2，以及SEQ ID NO:6所示的LCDR3；所述单克隆抗体AntiPF4_N重链氨基酸序列包括SEQID NO:8所示的HCDR1，SEQ ID NO:9所示的HCDR2，以及SEQ ID NO:10所示的HCDR3。
3.如权利要求2所述的一种用于检测血清中PF4含量的抗体对，其特征在于，所述单克隆抗体AntiPF4_C轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:14所示的LCDR1，SEQ ID NO:15所示的LCDR2，以及SEQ ID NO:16所示的LCDR3；所述单克隆抗体AntiPF4_C重链氨基酸序列包括SEQ ID NO:18所示的HCDR1，SEQ ID NO:19所示的HCDR2，以及SEQ ID NO:20所示的HCDR3。
4.如权利要求3所述的一种用于检测血清中PF4含量的抗体对，其特征在于，所述单克隆抗体AntiPF4_N和AntiPF4_C均为IgG型单克隆抗体，且一个为捕获抗体，一个为检测抗体。
5.如权利要求4所述的一种用于检测血清中PF4含量的抗体对，其特征在于，所述AntiPF4_N为捕获抗体，所示AntiPF4_C为检测抗体。
6.如权利要求4所述的一种用于检测血清中PF4含量的抗体对，其特征在于，所述检测抗体的检测标记物为检测标记蛋白、荧光基团、放射性同位素中的一种。
7.如权利要求6所述的一种用于检测血清中PF4含量的抗体对，其特征在于，所述检测抗体的检测标记蛋白包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和β-半乳糖苷酶，且检测抗体与检测标记蛋白重组表达。
8.如权利要求7所述的一种用于检测血清中PF4含量的抗体对，其特征在于，所述检测抗体的检测方法包括酶联免疫(ELISA)检测法、化学发光检测检测法、蛋白质印迹检测检测法、免疫组化(IHC)检测法和免疫层析检测检测法。
9.如权利要求1所述的一种用于检测血清中PF4含量的抗体对，其特征在于，所述抗体对选自与PF4结合的Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和di-scFv的抗体片段。
10.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1或2或3所述的抗体。
11.如权利要求1-10所述的抗体对在制备检测血清中PF4含量的试剂盒中的应用。
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