CN104914251A - 一种胃泌素-17酶促化学发光检测试剂盒 - Google Patents

一种胃泌素-17酶促化学发光检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胃泌素-17酶促化学发光检测试剂盒。属于免疫检测分析技术领域。该试剂盒由酶标液、胃泌素-17标准品、包被抗胃泌素-17单克隆抗体的免疫磁珠、样本稀释液、化学发光底物液、洗涤液组成。其原理将抗胃泌素-17单克隆抗体连接在磁珠微球表面作为固相试剂，经捕捉样本中的胃泌素-17以及加入酶标抗胃泌素-17单克隆抗体试剂后，形成固相-抗体-抗原-酶标抗体夹心免疫复合物。本发明的优点在于：将化学发光技术与免疫磁珠技术相结合，制备的试剂盒具有灵敏度高、特异性好、线性范围广及稳定性好，能满足临床对胃功能检测的需求。

Description

一种胃泌素-17酶促化学发光检测试剂盒
技术领域
本发明属免疫检测分析技术领域，尤其涉及一种胃泌素-17酶促化学发光检测试剂盒。
背景技术
近来不断有研究证实血清胃泌素-17(Gastrin-17，G-17)含量是早期胃癌重要指标。G-17是由胃窦G细胞分泌的胃肠道激素，是胃酸分泌的刺激激素，其分泌主要受胃内pH值、G细胞数量和进食(蛋白质是最佳刺激物)的影响。它是反应胃窦分泌功能的敏感指标，在诊断和筛查萎缩性胃炎和胃癌方面有重要地位。G-17测定有助于判断萎缩是否存在及其分布部位和程度。胃体萎缩者，泌酸腺减少，胃内呈现低胃酸状态，导致血清胃泌素G17水平升高；胃窦萎缩者，G细胞的数量减少，血清胃泌素G-17水平下降；全胃萎缩者(多灶萎缩)则G-17降低。多数学者认为，空腹血清G-17小于1pmol/L可作为胃窦萎缩性胃炎的界限值。现有研究证实胃癌患者存在一定程度的高胃泌素血症，其对癌细胞的生长和恶性转化有一定影响，G-17可促进其他高危因素(如H.p感染)引起的胃癌，并在胃癌进展过程中起重要作用：可促进胃癌细胞增殖复制；可促进胃癌细胞浸润转移；可抑制胃癌细胞凋亡。因此G-17是早期胃癌筛查重要指标。但到目前为止，目前市场上检测G-17试剂盒主要以传统ELISA法为主，需要大量手工操作，过程较繁琐，误差较大，给临床胃癌筛查带来较大的困难。
化学发光技术兴起于上个世纪80年代是继酶联免疫技术和放免技术后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。化学发光的原理是在化学反应中生成的不稳定的激发态中间体，当其回到基态时，释放光子。在免疫检测分析中，使用化学发光技术，可以使检测范围达到6个数量级，而且灵敏度很高，加上标记物稳定，有效期长，使其受到越来越多的关注与应用。磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法，抗原，抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速，彻底。与传统ELISA相比具有自动化程度高、灵敏度高、检测用时少的优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种胃泌素-17酶促化学发光检测试剂盒，使对人胃泌素-17检测实现了自动化、高特异性和灵敏度。
一种胃泌素-17酶促化学发光检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括酶标液、胃泌素-17标准品、包被抗胃泌素-17单克隆抗体的免疫磁珠、样本稀释液、酶标稀释液、化学发光底物液、洗涤液。
所述的一种胃泌素-17酶促化学发光检测试剂盒，其特征在于，其将抗胃泌素-17单克隆抗体包被在磁珠微球表面，经捕捉样本中的胃泌素-17以及加入酶标胃泌素-17单克隆抗体试剂后，形成固相-抗体-抗原-酶标抗体夹心免疫复合物。
所述的一种胃泌素-17酶促化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的包被胃泌素-17单克隆抗体的免疫磁珠为含有标记有抗胃泌素-17单克隆抗体的磁性微球；
所述的酶标液中酶标抗体的酶是辣根过氧化物酶；
所述的洗涤液是含有吐温-20的缓冲液；
所述的化学发光底物液是酶促化学发光底物溶液。
所述的一种试剂盒，其特征在于，所述包被抗胃泌素-17单克隆抗体的免疫磁珠按如下方法制得：
(1)初洗缓冲液的配制：
称取0.1952g的MES hygrate于100ml的纯水中，调整pH至5.0；
加入50μl吐温-20，配成0.01mol/L MES缓冲液，调整pH至5.0；
(2)偶联缓冲液的配制：
称取0.38138g Na2B4O7·10H2O溶于40ml纯水中，得到0.05mol/L的硼砂溶液；称取0.1237g H3BO3溶于10ml纯水中，得到0.2mol/L的硼酸溶液；
取18ml 0.05mol/L的Na2B4O7溶液与2ml 0.2mol/L的H3BO3溶液混合，定容至80ml得0.05mol/L硼酸缓冲液；
(3)终洗液的配制：
称取2.78g Na2HPO4溶于100ml纯水得0.2mol/L Na2HPO4溶液；
称取1.2g NaH2PO4溶于50ml纯水得0.2mol/L NaH2PO4溶液；
取81ml 0.2mol/LNa2HPO4溶液与19ml 0.2mol/L NaH2PO4溶液混合，得0.2mol/L PB缓冲溶液得0.2mol/LPB缓冲溶液；
取50ml 0.2mol/L PB缓冲液，2倍稀释到100ml，加入0.9gNaCl,0.5g0.5％-1％BSA，0.02-0.03％生物防腐剂、0.05％吐温20，充分溶解混匀；
(4)封闭液的配制：
取100ml Tris缓冲液，将溶液的pH调节成8.5-9.0之间；
向其中加入2％BSA；
(5)EDC溶液和NHS溶液的配制：
称取25mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，溶解于1ml的初洗缓冲液中，配制成25mg/ml的EDC溶液；
称取25mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶解于初洗缓冲液中，配置成25mg/ml NHS溶液；
(6)磁珠包被过程：
A、初洗：取100μl磁珠，将其稀释成10mg/ml的磁珠浓度，从中吸取100μl；磁分离架上分离，去上清；用初洗液250μl洗涤三次，磁分离，去上清；
B、活化：取初洗完成的磁珠加入150μlMES，再加入50μl EDC及50μl的NHS溶液，充分混匀。室温下25℃活化30min，活化完成磁分离去上清，以250μl偶联缓冲液重悬洗涤三次，分离去上清；
C、稀释抗G-17单克隆抗体：
将抗G-17单克隆抗体从-20℃冰箱中取出，待其融化后取出20μl，用偶联缓冲液1:20稀释到400μl，稀释后的抗体浓度为0.0397mg/ml。
D、偶联：
加入400μl用偶联缓冲液稀释的抗G-17单克隆抗体重悬活化后的磁珠，充分混匀，其磁珠包被比率为1mg磁珠：0.0159mg抗体；
37℃偶联2h，37℃摇床摇晃恒温混匀；
E、封闭：
将偶联结束的磁珠于磁分离架上分离，去上清；
加入400μl封闭液，37℃摇床封闭1h；
封闭结束后去除上清；
F、终洗保存：
以400μl终洗液洗涤封闭完成的磁珠，重复三次，最终定容到500μl。
本发明的工作原理为双抗体夹心法化学发光与免疫磁珠技术相结合的一种检测方法。在标本中加入定量的包被抗胃泌素-17单克隆抗体的免疫磁珠和HRP标记抗G-17单克隆抗体。37℃孵育后，包被抗胃泌素-17单克隆抗体的免疫磁珠与HRP标记抗G-17单克隆抗体分别与标本中G-17分子的不同表位结合，形成磁珠-抗体-抗原-抗体复合物。在外加磁场中直接沉淀，即可分离。弃去上清液，清洗沉淀的复合物，然后加入酶促化学发光底物。底物在酶的作用下催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出了光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度，根据标准曲线即可算出样品中G-17含量。在检测范围中，发光强度与样本中的G-17浓度成正比。
本发明的特征在于：检测血清中胃泌素-17的方法使用了以下的试剂：
本发明使用酶标液为HRP标记抗G-17单克隆抗体
本发明的胃泌素-17标准品是含有一定量G-17抗原的BSA蛋白溶液。
本发明所含的样本稀释液是含有1％BSA的PBS溶液。
本发明的化学发光底物液为酶促化学发光底物溶液。
本发明的洗涤液是含有吐温-20和ProCline-300的缓冲液。
本发明所述的胃泌素-17酶促化学发光检测试剂盒操作方法如下：
一、磁珠包被缓冲液配制：
1.初洗缓冲液的配制：
1.1称取0.1952g的MES hygrate于100ml的纯水中，调整pH至5.0。
1.2加入50μl吐温20，配成0.01mol/L MES缓冲液，调整pH至5.0。
2.偶联缓冲液的配制：
2.1称取0.38138g Na2B4O7·10H2O溶于40ml纯水中，得到0.05mol/L的硼砂溶液。
2.2称取0.1237g H3BO3溶于10ml纯水中，得到0.2mol/L的硼酸溶液。
2.3取18ml 0.05mol/L的Na2B4O7溶液与2ml 0.2mol/L的H3BO3溶液混合，定容至80ml得0.05mol/L硼酸缓冲液。
3.终洗液的配制：
3.1称取2.78g Na2HPO4溶于100ml纯水得0.2mol/L Na2HPO4溶液。
3.2称取1.2g NaH2PO4溶于50ml纯水得0.2mol/L NaH2PO4溶液。
3.3取81ml 0.2mol/LNa2HPO4溶液与19ml 0.2mol/L NaH2PO4溶液混合，得0.2mol/L PB缓冲溶液得0.2mol/LPB缓冲溶液。
3.3取50ml 0.2mol/L PB缓冲液，2倍稀释到100ml，加入0.9gNaCl,0.5g0.5％-1％BSA、0.02-0.03％生物防腐剂、0.05％吐温20，充分溶解混匀。
4.封闭液的配制：
4.1取100ml Tris缓冲液，将溶液的pH调节成8.5-9.0期间。
4.2向其加入2％BSA。
5.EDC溶液和NHS溶液的配制：
5.1称取25mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，溶解于1ml的初洗缓冲液中，配制成25mg/ml的EDC溶液。
5.2称取25mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶解于初洗缓冲液中，配置成25mg/mlNHS溶液。
二、磁珠包被过程
1.初洗：
1.1取100μl磁珠，将其稀释成10mg/ml的磁珠浓度，从中吸取100μl。
1.2磁分离架上分离，去上清。
1.3用初洗液250μl洗涤三次，磁分离，去上清。
2.活化：
2.1取初洗完成的磁珠加入150μl MES，再加入50μl EDC及50μl的NHS溶液,充分混匀。室温下25℃活化30min。
2.2活化完成磁分离去上清，以250μl偶联缓冲液重悬洗涤三次，分离去上清。
3.稀释抗G-17单克隆抗体：
将抗G-17单克隆抗体从-20℃冰箱中取出，待其融化后取出20μl，用偶联缓冲液1:20稀释到400μl，稀释后的抗体浓度为0.0397mg/ml。
4.偶联：
4.1加入400μl用偶联缓冲液稀释的抗G-17单克隆抗体重悬活化后的磁珠，充分混匀，其磁珠包被比率为1mg磁珠：0.0159mg抗体。
4.237℃偶联2h，37℃摇床摇晃恒温混匀。
5.封闭：
5.1将偶联结束的磁珠于磁分离架上分离，去上清。
5.2加入400μl封闭液，37℃摇床封闭1h。
5.3封闭结束后去除上清。
6.终洗保存：
6.1以400μl终洗液洗涤封闭完成的磁珠，重复三次。
6.3最终定容到500μl。
三、样本稀释液配制
在纯化水中加入NaH2PO4、Na2HPO4、配制100ml磷酸盐缓冲液，加入酪蛋白、吐温-20、ProClin 300、红色染料，调节PH值至7.4-7.6。
四、胃泌素-17标准品的配制
配制3瓶G-17标准品，含有0.1％ProCline 300为防腐剂。每批试剂盒中G-17标准液的浓度为5pmol/L、10pmol/L、40pmol/L。
五、酶标液的配制
配制0.2ml辣根过氧化物酶(HRP)标记抗G-17单克隆抗体，保存在0.02％methylosothiazolone，0.02％bromonitrodioxne稳定剂及0.002％active isothiazolone化防腐剂中。
六、酶标稀释液的配制
配制15ml磷酸缓冲液，含有防腐剂。
七、洗涤液的配制
配制20ml(20倍稀释后使用)的浓缩磷酸盐缓冲液，含有吐温-20和0.1％ProCline-300为防腐剂
八、底物液的配置
1.配制底物缓冲液
1.1称取4.542gTris,称取0.458g硼酸钠，定容到300ml,调节pH至8.7-9.0。
2.配制底物A液
2.1称取0.023g过氧化氢脲，称取0.024g 4-Morpholinopyridine(稳定剂)。
2.2用Tris-HCl加硼酸钠缓冲液定容到100ml，室温保存。
3.配制底物B液
3.1称取0.088g鲁米诺，称取0.051g 3-(10-phenothiazinyl)propane-1-sulfonate(增强剂)。
3.2用Tris-HCl加硼酸钠缓冲液定容到100ml。
3.3用锡箔纸将配好的B液包裹起来，室温保存。
八、本发明提供的试剂盒，包括以下组分：
试剂名称 装量 使用方式
包被胃泌素-17单克隆抗体的免疫磁珠 3ml 直接使用
洗涤液 20ml 20倍稀释后使用
样本稀释液 100ml 直接使用
胃泌素-17标准品 1.5ml，3瓶 直接使用
酶标液 15ml 直接使用
化学发光底物液 15ml 直接使用
本发明具有以下创新之处：
1.本发明提供了一种胃泌素-17化学发光检测试剂盒，可用于萎缩性胃炎诊断及早期胃癌筛查。
2.使用的捕获抗体和酶标抗体为单克隆抗体，使反应的亲和力更高，非特异吸附减小，而且单克隆抗体的生产批间差异相对小，更容易保证产品的批间稳定。
附图说明
图1为1mg磁珠包被0.0157mgG-17单克隆抗体后对于不同浓度的G-17抗原得到的化学发光值的趋势线。
具体实施方式
第一步：包被胃泌素-17单克隆抗体的免疫磁珠的制备
一、磁珠活化缓冲液的制备：
1.初洗缓冲液的配制：
1.1称取0.1952g的MES hygrate于100ml的纯水中，调整pH至5.0。
1.2加入50μl吐温-20，配成0.01mol/L MES缓冲液，调整pH至5.0。
2.偶联缓冲液的配制：
2.1称取0.38138g Na2B4O7·10H2O溶于40ml纯水中，得到0.05mol/L的硼砂溶液。
2.2称取0.1237g H3BO3溶于10ml纯水中，得到0.2mol/L的硼酸溶液。
2.3取18ml 0.05mol/L的Na2B4O7溶液与2ml 0.2mol/L的H3BO3溶液混合，定容至80ml得0.05mol/L硼酸缓冲液。
3.终洗液的配制：
3.1称取2.78g Na2HPO4溶于100ml纯水得0.2mol/L Na2HPO4溶液。
3.2称取1.2g NaH2PO4溶于50ml纯水得0.2mol/L NaH2PO4溶液。
3.3取81ml 0.2mol/LNa2HPO4溶液与19ml 0.2mol/L NaH2PO4溶液混合，得0.2mol/LPB缓冲溶液得0.2mol/L PB缓冲溶液。
3.3取50ml 0.2mol/L PB缓冲液，2倍稀释到100ml，加入0.9gNaCl,0.5g0.5％-1％BSA、0.02-0.03％生物防腐剂、0.05％吐温-20，充分溶解混匀。
4.封闭液的配制：
4.1取100ml Tris缓冲液，将溶液的pH调节成8.5-9.0期间。
4.2向其加入2％BSA。
5.EDC溶液和NHS溶液的配制：
5.1称取25mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，溶解于1ml的初洗缓冲液中，配制成25mg/ml的EDC溶液。
5.2称取25mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶解于初洗缓冲液中，配置成25mg/ml NHS溶液。
二、磁珠活化缓冲液的操作步骤：
1.初洗：
1.1取100μl磁珠，将其稀释成10mg/ml的磁珠浓度，从中吸取100μl。
1.2磁分离架上分离，去上清。
1.3用初洗液250μl洗涤三次，磁分离，去上清。
2.活化：
2.1取初洗完成的磁珠加入150μl MES，再加入50μl EDC及50μl的NHS溶液,充分混匀。室温下25℃活化30min。
2.2活化完成磁分离去上清，以250μl偶联缓冲液重悬洗涤三次，分离去上清。
3.稀释抗G-17单克隆抗体
将抗G-17单克隆抗体从-20℃冰箱中取出，待其融化后取出20μl，用硼酸缓冲液1:20稀释到400μl。
5.偶联：
4.1加入400μl用偶联液稀释的不同浓度的抗体重悬活化完的磁珠，充分混匀。
4.2 37℃偶联2h，37℃摇床摇晃恒温混匀。
5.封闭
5.1将偶联结束的磁珠于磁分离架上分离，去上清。
5.2加入400μl封闭液，37℃摇床封闭1h。
5.3封闭结束后去除上清。
6.终洗保存
6.1以400μl终洗液洗涤封闭完成的磁珠，重复三次。
6.3最终定容到250μl,用时将其稀释到500μl。
第二步：样本稀释液配制
在纯化水中加入NaH2PO4、Na2HPO4、配制100ml磷酸盐缓冲液，加入牛血清蛋白、吐温-20、ProClin 300、红色染料，调节PH值至7.4-7.6。
第三步：胃泌素-17标准品的配制
配制3瓶G-17标准品，含有0.1％ProCline 300为防腐剂。每批试剂盒中G-17标准液的浓度为5pmol/L、10pmol/L、40pmol/L。
第四步：酶标液的配制
配制15mL HRP标记抗G-17单克隆抗体，保存在0.02％methylosothiazolone，0.02％bromonitrodioxne稳定剂及0.002％activeisothiazolone化防腐剂中。
第五步：洗涤液的配制
配制20ml(20倍稀释后使用)的浓缩磷酸盐缓冲液，含有吐温-20和0.1％ProCline-300为防腐剂。
第六步：底物液的配置
1.配制底物缓冲液：
称取4.542g Tris,称取0.458g硼酸钠，定容到300ml,调节pH至8.7-9.0。
2.配制底物A液
2.1称取0.023g过氧化氢脲，称取0.024g 4-Morpholinopyridine(稳定剂)。
2.2用Tris-HCl加硼酸钠缓冲液定容到100ml，室温保存。
3.配制底物B液
3.1称取0.088g鲁米诺，称取0.051g3-(10-phenothiazinyl)propane-1-sulfonate。
3.2用Tris-HCl加硼酸钠缓冲液定容到100ml。
3.3用锡箔纸将配好的B液包裹起来，室温保存。
第七步：本发明用全自动化学发光检测仪器检测方式如下：
1.仪器洗涤
对仪器的测量室和清洗站进行10-15次洗涤，待其背景值下降，以及底物发光值测量达到平稳，方可开始测量。
2.加样与免疫反应
2.1将足够量的磁珠，酶标抗G-17抗体依次加入全自动化学发光检测仪的试剂盒中。
2.2在4ml试管中加入50-100μl血清或血浆样本标准品，依次放入全自动化学发光仪器的样本盘中。
2.3一次反应吸取30μl G-17抗体磁珠试剂，酶标抗体一次加100μl，抗原标准液加80μl。混匀后37℃温育30min。
3.启动仪器，检测全程包括：加样，孵育，洗涤，测量。
4.洗涤反应杯：机械臂将孵育槽中的的反应杯夹到动化学发光仪器的清洗站，清洗站槽下为磁力吸附，仪器一支吸头是将上清吸取，一支管头是喷出洗涤液，清洗盘转一圈共洗涤6次。
7.加样结束后，在37℃温育槽孵育30min后，反应杯被机械臂夹到清洗站，洗涤
反应杯：清洗站槽下为磁力吸附，仪器一支吸头是将上清吸取，一支管头是喷出洗涤液，清洗盘转一圈共洗涤6次。
8.加发光底物工作液：两个针管先后向反应杯中加入100μl底物液，孵育100s后准备测量。
9.读取发光值：将反应杯从清洗站转移到测量室中，测量，得到数值。
第八步：临床样本检测
1.检测方案
本试剂检测样本为人血清或血浆。
采血前10小时应保持空腹。为确保检测最高的敏感度和特异性，建议检测受蛋白质刺激的餐后血清或血浆中G-17的含量。通过隔夜的空腹(至少10小时)刺激G-17的分泌。在服用蛋白质物刺激之前及20分钟之后采集静脉血样,或只采集餐后血样(参见13章刺激G-17的释放)。将血样置于无添加剂的塑料试管或有EDTA或肝素抗凝管内，及时上下颠倒试管5～6次以混匀样本。血清测试管的凝结在室温20℃～25℃不应超过30分钟。由于G-17在较高温下会变质，建议采集到的血清管应置于碎冰(或冰水)浴内凝结，冰浴时间不超过60分钟。血清凝集后，立即用离心方法(如用塑料试管，加速至2000G，离心10～15分钟)分离血清和血浆。将样本分成几份至不同管中，如需更长时间的储存应冷冻，适宜在－70℃～－20℃储存。样本在解冻后应混匀。避免反复冻融。避免使用含有溶血素、油脂或污浊不纯的样本。
标本采自1000例正常体检、供血者。血清样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病，半年内无输液和大手术史，妇女不在妊娠期和哺乳期。将测值进行统计学分析。正常人群G-17含量为1～15pmol/L。
2.本发明试剂盒性能指标
灵敏度：最低检出值0.1pmol/L；精密性：批内变异CV％<10.0％、批间变异CV％<15.0％；线性系数：r>0.9900；线性范围：1～40pmol/L。
图1为1mg磁珠包被0.0157mgG-17单克隆抗体后对于不同浓度的G-17抗原得到的化学发光值的趋势线。

Claims (4)

1.一种胃泌素-17酶促化学发光检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括酶标液、胃泌素-17标准品、包被抗胃泌素-17单克隆抗体的免疫磁珠、样本稀释液、酶标稀释液、化学发光底物液、洗涤液。
2.按照权利要求1所述的一种胃泌素-17酶促化学发光检测试剂盒，其特征在于，
其将抗胃泌素-17单克隆抗体包被在磁珠微球表面，经捕捉样本中的胃泌素-17以及加入酶标胃泌素-17单克隆抗体试剂后，形成固相-抗体-抗原-酶标抗体夹心免疫复合物。
3.按照权利要求1所述的一种胃泌素-17酶促化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的包被胃泌素-17单克隆抗体的免疫磁珠为含有标记有抗胃泌素-17单克隆抗体的磁性微球；
 所述的酶标液中酶标抗体的酶是辣根过氧化物酶；
 所述的洗涤液是含有吐温-20的缓冲液；
 所述的化学发光底物液是酶促化学发光底物溶液。
4.如权利要求1或2所述的一种试剂盒，其特征在于，所述包被抗胃泌素-17单克隆抗体的免疫磁珠按如下方法制得：
（1）初洗缓冲液的配制：
称取0.1952g的MES hygrate于100ml的纯水中，调整pH至5.0；
加入50μl吐温-20，配成0.01mol/L MES缓冲液，调整pH至5.0；
（2）偶联缓冲液的配制：
称取0.38138g Na2B4O7·10H2O溶于40ml纯水中，得到0.05mol/L的硼砂溶液；
称取0.1237g H3BO3溶于10ml纯水中，得到0.2mol/L的硼酸溶液；
取18ml 0.05mol/L的Na2B4O7溶液与2ml 0.2mol/L的H3BO3溶液混合，定容至80ml得0.05mol/L硼酸缓冲液；
（3）终洗液的配制：
称取2.78g Na2HPO4溶于100ml纯水得0.2mol/L Na2HPO4溶液；
称取1.2g NaH2PO4溶于50ml纯水得0.2mol/L NaH2PO4溶液；
取81ml 0.2mol/LNa2HPO4溶液与19ml 0.2mol/L NaH2PO4溶液混合，得0.2mol/L PB缓冲溶液得0.2mol/LPB缓冲溶液；
取50ml 0.2mol/L PB缓冲液，2倍稀释到100ml，加入0.9gNaCl, 0.5g0.5%-1%BSA，0.02-0.03%生物防腐剂、0.05%吐温20，充分溶解混匀；
（4）封闭液的配制：
取100ml Tris缓冲液，将溶液的pH调节成8.5-9.0之间；
向其中加入2%BSA；
（5）EDC溶液和NHS溶液的配制：
称取25mg/ml的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺，溶解于1ml的初洗缓冲液中，配制成25mg/ml的EDC溶液；
称取25mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶解于初洗缓冲液中，配置成25mg/ml NHS溶液；
（6）磁珠包被过程：
A、初洗：取100μl磁珠，将其稀释成10mg/ml的磁珠浓度，从中吸取100μl；磁分离架上分离，去上清；用初洗液250μl洗涤三次，磁分离，去上清；
B、活化：取初洗完成的磁珠加入150μlMES，再加入50μl EDC及50μl的NHS溶液，充分混匀；室温下25℃活化30min，活化完成磁分离去上清，以250μl偶联缓冲液重悬洗涤三次，分离去上清；
C、稀释抗G-17单克隆抗体：
将抗G-17单克隆抗体从-20℃冰箱中取出，待其融化后取出20μl，用偶联缓冲液1:20稀释到400μl，稀释后的抗体浓度为0.0397mg/ml；
D、偶联：
加入400μl用偶联缓冲液稀释的抗G-17单克隆抗体重悬活化后的磁珠，充分混匀，其磁珠包被比率为1mg磁珠：0.0159mg抗体；
37℃偶联2h，37℃摇床摇晃恒温混匀；
E、封闭：
将偶联结束的磁珠于磁分离架上分离，去上清；
加入400μl封闭液，37℃摇床封闭1h；
封闭结束后去除上清；
F、终洗保存：
以400μl终洗液洗涤封闭完成的磁珠，重复三次，最终定容到500μl。
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