CN114609396A - 血清基质的胃功能三项复合质控品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学检测领域，特别涉及血清基质的胃功能三项复合质控品及其制备方法。本发明提供了血清基质的胃功能三项复合质控品，将混合血清经过56℃下进行灭活，再加入1％～5％(v/v)的血液促凝剂，过滤，得到质控品基质液，攻克了G‑17在常规血清基质中不稳定的技术难题，从而实现了将PGI、PGII、G‑17做成血清基质的复合质控品的可行性。该质控的基质与临床样本的基质接近，从而有效避免了基质效应问题的发生。此外，采用三合一的胃功能复合质控品，为临床实验室的使用提供了极大的方便，提高了工作效率。

Description

血清基质的胃功能三项复合质控品及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学检测领域，特别涉及血清基质的胃功能三项复合质控品及其制备方法。
背景技术
胃功能三项包括胃蛋白酶原I(PGI)、胃蛋白酶原II(PGII)、胃泌素17(G-17),是目前临床上评估胃功能常用的三个血清学检测指标。中国早期胃癌筛查流程专家共识意见(2017年，上海)提出了一种新型胃癌筛查评分系统，根据年龄、性别、HP感染、PGI、PGII、G-17几个指标给出综合评分，根据分值高低，确认筛查者是否属于胃癌高风险人群，是否需要进一步进行胃镜检查。只需要抽一管血，就可以实现对胃功能的评估，与做胃镜相比较，具有成本低、无侵入性、可接受度高等优势，逐渐被广泛接受。
为保证胃功能三项的检测结果准确性，实验室每天都要进行三个项目的质控品检测，确保质控在控才能进行临床样本的检测。然而，目前市面上常见的质控并不理想。
G-17在血清中很不稳定(刘志敏,周海青,李静.不同分离时间和保存方法对胃泌素17测定的影响[J].实验与检验医学,2017,035(005):717-718.)，所以，现有的G-17质控品都不是血清基质，一般都是采用在含有BSA、酪蛋白等保护蛋白的缓冲液中添加G-17抗原的形式。该类质控品由于采用的不是血清基质、与真实临床样本之间往往会存在一定的基质效应问题。
虽然PGI和PGII在血清中稳定性相对较好，不存在上述G-17面临的问题，但是，如果想做成一种便于临床实验室使用的血清基质的胃功能三项复合质控品，最大的难点是要解决G-17在血清基质中不稳定的技术难题。
有的厂家可以提供PGI和PGII的血清基质复合质控品，但G-17是单独一种质控基质的质控品。专利CN111024964A报道了胃功能检测用复合质控品及检测试剂盒，其提供了一种胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II和胃泌素17复合质控品，但该质控品不是血清基质的复合质控品。所以，尚未见报道有血清基质的胃功能三项复合质控品。
根据WS/T 641—2018《临床实验室定量测定室内质量控制指南》的要求，质控品应与患者待测样本具有相似或相同的基质。质控品应均一和稳定，如条件允许，可储存一年或以上的用量。瓶间变异性应小于分析系统的变异。因此，开发一种血清基质的胃功能三项复合质控品是临床实验室的迫切需求。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种血清基质的胃功能三项复合质控品及其制备方法；用于胃功能三项检测试剂盒的质量控制。采用一种独特的技术方案、攻克了G-17在血清样本中不稳定的技术难题，从而实现了制备血清基质的胃功能三项复合质控品的可能性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了血液促凝剂在提高血清基质中G-17稳定性中的应用。具体的，血液促凝剂能够抑制血清中蛋白酶对G-17的降解。
第二方面，本发明还提供了血液促凝剂在制备胃功能三项复合质控品和/或胃功能三项检测试剂盒中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，以所述血清基质为基准，所述血液促凝剂的添加量为1％～5％(v/v)。
第三方面，本发明还提供了血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液的制备方法，取血清灭活后，与血液促凝剂、防腐剂混合，滤膜过滤，制得所述血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液。
在本发明的一些具体实施方案中，以所述血清基质为基准，所述血液促凝剂的添加量为1％～5％(v/v)；所述防腐剂的添加量为0.2％(v/v)。
第四方面，本发明还提供了所述制备方法制得的所述血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液。
第五方面，本发明还提供了血清基质的胃功能三项复合质控品，包括所述血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液，胃蛋白酶原I抗原、胃蛋白酶原II抗原和胃泌素17抗原，以及可接受的辅料或助剂。
第六方面，本发明还提供了所述的血清基质的胃功能三项复合质控品的制备方法，按照所述制备方法制得所述血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液，与胃蛋白酶原I抗原、胃蛋白酶原II抗原和胃泌素17抗原混合，分装，冷冻干燥，制得所述血清基质的胃功能三项复合质控品。
第七方面，本发明还提供了所述血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液，所述血清基质的胃功能三项复合质控品，或所述制备方法制得的血清基质的所述胃功能三项复合质控品在制备血清基质的胃功能三项检测试剂盒中的应用。
第八方面，本发明还提供了血清基质的胃功能三项检测试剂盒，包括所述血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液，所述血清基质的胃功能三项复合质控品，或所述制备方法制得的所述血清基质的胃功能三项复合质控品，以及可接受的辅料、助剂或载体。
综上，本发明提供了血清基质的胃功能三项复合质控品，将混合血清经过56℃下进行灭活，再加入1％-5％(v/v)的血液促凝剂，过滤，得到质控品基质液，攻克了G-17在常规血清基质中不稳定的技术难题，从而实现了将PGI、PGII、G-17做成血清基质的复合质控品的可行性。该质控的基质与临床样本的基质接近，从而有效避免了基质效应问题的发生。此外，采用三合一的复合质控品，为临床实验室的使用提供了极大的方便，提高了工作效率。
具体实施方式
本发明公开了血清基质的胃功能三项复合质控品及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的目的在于提供一种血清基质的胃功能三项复合质控品及其制备方法。为临床实验室提供一种便于使用、稳定性好的血清基质的胃功能三项复合质控品，以满足临床实验室对胃功能三项质量控制的需求。
为实现上述目的，本发明可采用以下技术方案。
本发明所述的一种血清基质的胃功能三项复合质控品，包括以下具体制备步骤：
①取正常人混合血清1000mL，在56℃下进行灭活处理30-120min，冷却至室温备用；
②在①制备的灭活的正常混合人血清中，加入1％-5％(v/v)的血液促凝剂，再加入0.2％(v/v)的防腐剂Proclin300，搅拌均匀，用0.22um无菌滤膜过滤，得到质控品基质液；
③分别将适量PGI、PGII和G-17的抗原投到②中制备的质控品基质液中，搅拌均匀，配制成需要浓度的液态质控品；
④将③中得到的液态质控品按照指定规格进行分装、采用真空冷冻干燥机进行冻干，即得到血清基质的胃功能三项复合质控品，置于2-8℃保存。
所述的正常人混合血清可以替换为去激素血清、或者血浆经过某种工艺处理得到的血清，后续步骤无变化。
本发明提供的血清基质的胃功能三项复合质控品，将混合血清经过56℃下进行灭活，再加入1％-5％(v/v)的血液促凝剂，过滤，得到质控品基质液，攻克了G-17在常规血清基质中不稳定的技术难题，从而实现了将PGI、PGII、G-17做成血清基质的复合质控品的可行性。该质控的基质与临床样本的基质接近，从而有效避免了的基质效应问题的发生。此外，采用三合一的复合质控品，为临床实验室的使用提供了极大的方便，提高了工作效率。
本发明的关键点是发现了一种质控基质液的配方和制备工艺，将血清灭活处理，并加入适量血液促凝剂，从而解决G-17在血清中不稳定的技术难题，进而实现了一种血清基质的胃功能三项复合质控品的制备；填补了没有血清基质胃功能三项复合质控品的技术空白。
将G-17抗原直接投到血清中，稳定性较差；如果将血清提前灭活处理，再加入G-17抗原，稳定性有一定提升；作者在研究不同的真空采血管中G-17样本稳定性时意外发现，使用A厂家的促凝管或分离胶促凝管时，G-17样本稳定性较好；其他厂家的促凝管或分离胶促凝管则不行，主要原因是不同厂家的促凝管或分离胶促凝管中用的促凝剂配方不同。除了促凝管或分离胶促凝管，用其他类型的采血管G-17均不稳定。于是将A厂家的促凝管或分离胶促凝管中使用的促凝剂(本文中使用的血液促凝剂)加入到血清中，G-17样本稳定性较好。将血清灭活，并加入血液促凝剂，再加入G-17抗原，其稳定性有了显著的提升，2-8度保存时间可从8h延长到7天；
本发明的一个关键点在于：一种血清基质的胃功能三项复合质控品及其制备方法；(因为G-17在血清中不稳定是行业的技术难题、目前尚未见到过这种质控品及其报道；专利CN111024964A报道的是缓冲液基质的复合质控品，非血清基质)。
注：PGI、PGII在血清中是稳定的，目前有两项的血清基质质控品。
本发明的另一个关键点在于：血清基质质控品的基质液的制备工艺，工艺的关键点，首先是要将血清灭活处理，其次加入血液促凝剂，从而实现了G-17抗原稳定的目的。血液促凝剂，一般适用于真空采血管的促凝剂使用，本发明使用血液促凝剂作为G-17的稳定剂，获得了意想不到的效果。
本发明提供的血清基质的胃功能三项复合质控品除了本发明中做成冻干态的除外，还可以做成液态的，但是，液态的不能在2-8℃保存，需要保存于-20℃以及下，会增加运输和保存的成本。而且有效期可能会短于冻干态的质控品。
本发明质控品的基质液中添加了血液促凝剂(液体)，也可以用血液促凝粉(固体)代替血液促凝剂。
与现有技术相比，本发明突破了G-17在血清中不稳定的行业技术难题，首次公开了一种血清基质的胃功能三项复合质控品。基质为血清基质，和临床样本基质较为接近，可以有效降低基质效应问题的发生。
本发明提供的血清基质的胃功能三项复合质控品及其制备方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。其中，血液促凝剂购自阳普医疗。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
预实验例1不同厂家、不同类型真空采血管中胃泌素17稳定性考核
我们在使用阳普的促凝管采集样本时，意外发现，G-17样本较之前稳定，和既往经验不一致，怀疑不同真空采血管之间会有差异。于是我们验证了不同厂家、不同类型采血管对胃泌素17样本稳定性的影响。分别使用四个厂家(三力、阳普、康健和积水)各六种真空采血管(普通管、促凝管、分离胶促凝管、EDTA-K2管、柠檬酸钠管和肝素钠管)采集样本，离心后置于2-8℃保存，分别在0h、3h、1天、2天、3天、5天和7天的时间点进行检测，每一种管均和0h的结果进行比较，变幅＜10％对应的时间为样本保存时间。结果见表1：
表1不同厂家、不同类型真空采血管中胃泌素17稳定性考核
Figure BDA0003537988580000061
Figure BDA0003537988580000071
由表5可知，当使用阳普的促凝管和分离胶促凝管时，G-17在2-8℃的样本保存时间长达5天，具有显著优势。当使用阳普的其他类型采血管、或者其他厂家的采血管时，G-17在2-8℃的样本保存时间仅为3h。证实了不同真空采血管对G-17的样本稳定性有影响。
预实验例2促凝剂对G-17的稳定效果考核
在预实验例1中，阳普的促凝管和分离胶促凝管的共性是均含有促凝剂，推测该促凝剂是使G-17样本稳定的主要因素。因此，我们采购了阳普的血液促凝剂，验证其效果。使用三力、康健和积水三个厂家的普通管采集样本各两管，第一管作为对照，第二管添加5％的血液促凝剂、室温温育30min，离心处理后，置于2-8℃保存，分别在0h、3h、1天、2天、3天、5天和7天的时间点进行检测，每一种管均和0h的结果进行比较，变幅＜10％对应的时间为样本保存时间。结果见表2：
表2促凝剂对G-17稳定效果考核
Figure BDA0003537988580000072
Figure BDA0003537988580000081
由上表可知，三力、康健和积水三个厂家普通管中G-17的保存时间仅为3h，但在三个厂家的普通管中添加阳普的血液促凝剂之后，G-17的样本保存时间可延长到5天，进一步证明了阳普的血液促凝剂对延长G-17的样本保存时间具有积极作用。这一发现为胃功能三项复合质控品的研制奠定了基础，于是就有了本发明的血清基质的胃功能复合质控品。
实施例1本发明质控基质液的制备方法
量取正常人混合血清1000mL，在56℃下进行灭活处理60min，冷却至室温备用；加入5％(v/v)的血液促凝剂，再加入0.2％(v/v)的防腐剂Proclin300，搅拌均匀，用0.22um无菌滤膜过滤，得到质控品基质液；
实施例2血清基质的胃功能复合质控的制备
取实施例1中制备的质控品基质液，分别投入适量PGI、PGII和G-17的抗原，搅拌均匀，配制成需要浓度的液态质控品；按照指定规格进行分装、采用真空冷冻干燥机进行冻干，即得到血清基质的胃功能三项复合质控品，置于2-8℃保存。
对比例1质控品基质液的制备方法(血清未灭活，未加血液促凝剂)
量取正常人混合血清1000mL，再加入0.2％(v/v)的防腐剂Proclin300，搅拌均匀，用0.22um无菌滤膜过滤，得到质控品基质液。
对比例2质控品基质液的制备方法(血清未灭活，加5％血液促凝剂)
量取正常人混合血清1000mL，加入5％(v/v)的血液促凝剂，再加入0.2％(v/v)的防腐剂Proclin300，搅拌均匀，用0.22um无菌滤膜过滤，得到质控品基质液。
对比例3质控品基质液的制备方法(血清灭活，未加血液促凝剂)
量取正常人混合血清1000mL，在56℃下进行灭活处理60min，冷却至室温备用；加入0.2％(v/v)的防腐剂Proclin300，搅拌均匀，用0.22um无菌滤膜过滤，得到质控品基质液。
对比例4质控品基质液的制备方法(血清灭活，加0.5％血液促凝剂)
量取正常人混合血清1000mL，在56℃下进行灭活处理60min冷却至室温备用；加入0.5％(v/v)的血液促凝剂，加入0.2％(v/v)的防腐剂Proclin300，搅拌均匀，用0.22um无菌滤膜过滤，得到质控品基质液。
测试例1不同质控基质液制备的质控品的复溶稳定性效果考核
分别使用实施例1中本发明的质控品基质液、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4中的质控品基质液，按照实施例2中描述的方法制备五种胃功能复合质控品，依次是：
质控品1：实施例1，血清已灭活、添加5％(v/v)血液促凝剂；
质控品2：对比例1，血清未灭活、未添加血液促凝剂；
质控品3：对比例2，血清未灭活、添加5％(v/v)血液促凝剂；
质控品4：对比例3，血清已灭活、未添加血液促凝剂；
质控品5：对比例4，血清已灭活、添加0.5％(v/v)血液促凝剂。
将五种冻干质控品复溶后在2-8℃保存，使用AutoLumo A2000 plus检测系统及其配套的试剂盒，对五种复合质控品中的PGI、PGII和G-17进行检测，考核时间点分别设置在0h、8h、1天、3天、5天、7天，每个质控点检测复孔求均值，比较五种质控品的稳定性有无差异。结果见表3：
表3 2-8℃条件下五种复合质控品复溶稳定性考核
Figure BDA0003537988580000091
Figure BDA0003537988580000101
Figure BDA0003537988580000111
设定变幅＜10％为满足要求，由表1的实验数据可以看出，本发明提供的质控品1在2-8℃可以稳定保存至少7天；质控品2(对比例1)在2-8℃可以稳定保存8h；质控品3(对比例2)在2-8℃最多可以稳定保存5天；质控品4(对比例3)在2-8℃最多可以稳定保存1天；质控品5(对比例4)在2-8℃最多可以稳定保存1天；对比例中PGI、PGII的稳定性均满足要求，主要是G-17稳定性变幅超过了10％。这一点正是本发明质控品与对比例最大的优势所在。
测试例2本发明质控品的热加速稳定性考核
考核本发明(实施例2制得)质控品的热加速破坏稳定性，采用倒序的形式将质控品置于37℃的温箱中分别放置14天、10天和7天，到时间后一块取出，恢复室温后，与2-8℃保存的对照一块进行考核，比较热加速破坏后质控品的稳定性变幅，结果见表4：
表4本发明质控品的热加速稳定性考核
Figure BDA0003537988580000112
Figure BDA0003537988580000121
由表4数据可知，本发明的质控品在37度放置7天、10天、14天后，与2-8℃保存的质控品相比，稳定性变幅＜10％，满足要求。
测试例3本发明质控品的实时稳定性考核
将配套考核试剂盒冻存于-20℃以下，每次使用时拿出来一套。考核本发明(实施例2制得)质控品在2-8℃实时保存0个月、3个月、6个月、12个月、18个月、24个月的稳定性，均与0个月的检测结果进行比较，观察质控品在2-8℃是实时保存稳定性的变幅，以确定质控品的有效期，结果见表5：
表5本发明质控品的实时稳定性考核
Figure BDA0003537988580000122
Figure BDA0003537988580000131
由表5可知，本发明的质控品在2-8℃实时保存24个月后，与0个月相比，PGI、PGII和G-17的变幅均小于10％，满足要求。所以，本发明质控品的有效期可定为24个月。
测试例4本发明质控品的均匀性考核
按照下列方法对本发明(实施例2制得)质控品进行均匀性检验，并计算瓶内变异系数(CV瓶内)和瓶间变异系数(CV瓶间)，结果应不大于10％。
随机抽取10套质控品，每个浓度随机编号1～10，按照下列顺序分别测量3次。
测量顺序：1、3、5、7、9、2、4、6、8、10、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、2、4、6、8、10、1、3、5、7、9。
记录测量结果，并按照式(2)～(11)进行计算F、sbb、sr、CV瓶内和CV瓶间：
式2
Figure BDA0003537988580000132
式3
Figure BDA0003537988580000133
式4SS瓶内＝SS总和-SS瓶间
式5
Figure BDA0003537988580000134
式6
Figure BDA0003537988580000141
式7
Figure BDA0003537988580000142
式8
Figure BDA0003537988580000143
式9
Figure BDA0003537988580000144
式10
Figure BDA0003537988580000145
式11
Figure BDA0003537988580000146
式中：
SS—方差；
v—自由度；
MS—均方；
F—F检验值；
ni—样品i重复测量次数；
n0—有效测量次数；
sbb—瓶间标准差；
sr—重复性标准差；
x—测量或计算结果；
Figure BDA0003537988580000147
—总平均值；
当统计结果F值小于等于10时，认为质控品瓶间均匀性较好，可以作为校准物，并计算所有测试结果的平均值，然后进行CV瓶内和CV瓶间的计算；当统计结果F值大于10时，认为质控品瓶间均匀性较差，不宜作为质控品，同时不再计算CV瓶内和CV瓶间。
当统计结果F≤1时，以瓶内标准差代替瓶间标准差即sbb＝sr。
结果见表6：
表6本发明质控品的均匀性考核结果
Figure BDA0003537988580000151
由表6可知，本发明质控品中PGI、PGII和G-17的瓶内、瓶间变异系数均小于10％，满足要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.血液促凝剂在提高血清基质中G-17稳定性中的应用。
2.血液促凝剂在制备胃功能三项复合质控品和/或胃功能三项检测试剂盒中的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，以所述血清基质为基准，所述血液促凝剂的添加量为1％～5％(v/v)。
4.血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液的制备方法，其特征在于，取血清灭活后，与血液促凝剂、防腐剂混合，滤膜过滤，制得所述血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，以所述血清基质为基准，所述血液促凝剂的添加量为1％～5％(v/v)；所述防腐剂的添加量为0.2％(v/v)。
6.如权利要求4或5所述的制备方法制得的所述血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液。
7.血清基质的胃功能三项复合质控品，其特征在于，包括如权利要求6所述的血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液，胃蛋白酶原I抗原、胃蛋白酶原II抗原和胃泌素17抗原，以及可接受的辅料或助剂。
8.如权利要求7所述的血清基质的胃功能三项复合质控品的制备方法，其特征在于，按照权利要求4或5所述的制备方法制得所述血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液，与胃蛋白酶原I抗原、胃蛋白酶原II抗原和胃泌素17抗原混合，分装，冷冻干燥，制得所述血清基质的胃功能三项复合质控品。
9.如权利要求6所述的血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液，如权利要求7所述的血清基质的胃功能三项复合质控品，或如权利要求8所述的制备方法制得的血清基质的所述胃功能三项复合质控品在制备血清基质的胃功能三项检测试剂盒中的应用。
10.血清基质的胃功能三项检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求6所述的血清基质的胃功能三项复合质控品的基质液，如权利要求7所述的血清基质的胃功能三项复合质控品，或如权利要求8所述的制备方法制得的所述血清基质的胃功能三项复合质控品，以及可接受的辅料、助剂或载体。
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