CN108374057B - 一种人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人员防护装备微生物防护性能评价用病毒标准物质及其制备方法。该标准物质由含噬菌体ΦX174菌体和保护剂的冻干物以及用于噬菌体冻干物复水的稳定剂水溶液组成。经实验证明，该标准物质具有良好的均匀性和稳定性，在用于人员防护装备防护性能评价中使用方便，可以节省人力和时间，大大提高人员防护装备防护性能评价效率。本发明还提供了该标准物质的定值方法，可以确保噬菌体ΦX174活菌浓度精确，提高了人员防护装备性能评价的准确性。

Description

一种人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质及其制备 方法
技术领域：
本发明涉及一种人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质及其制备方法，属于生物安全技术领域。
背景技术：
人员防护装备和设施的防护性能评价中，微生物(如病毒、细菌等)的防护性能评价最为关键。
噬菌体ΦX174是一种空气生物学模式病毒，其粒径集中在27～30nm。由于噬菌体具有培养和计数方法相对简单，实验安全性高，计数效果明显等优点。而且，噬菌体ΦX174具有病毒的共性，又是一种以病毒作为宿主的病毒，因此适合作为生物检测指示病毒，应用于生物安全柜等人员防护装备的防护性能评价中。
但是，由于目前没有评价用病毒标准物质，在人员防护装备防护性能测试的实际现场实验中，检验人员往往只能根据工作经验配置指示病毒悬液，很难保证其量值完全一致，造成检测误差。此外，配置指示病毒悬液的过程比较琐碎，因而耗费大量人力、物力和时间，从而大大影响了评价结果的准确性和评价工作的效率。
因此，为保证人员防护装备防护性能评价的准确性和可比性，并且提高评价工作的效率，非常有必要研制一种人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种人员防护装备微生物防护性能评价的病毒标准物质，以及所述标准物质的制备方法。
为实施上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种人员防护装备微生物防护性能评价用病毒标准物质，其特征在于，包括有噬菌体ΦX174。
所述噬菌体ΦX174用1mL稳定剂水溶液复水后，噬菌体ΦX174活菌浓度为1.0×108～9.9×109PFU/mL
所述的标准物质，由两个组分组成：
1)噬菌体ΦX174，为含噬菌体ΦX174菌体和菌体保护剂的冻干物；
2)用于菌体冻干物复水的稳定剂水溶液。
所述菌体保护剂，其成分选自蔗糖、谷氨酸钠、BSA中的一种或多种；所述冻干物的形状，优选为饼状或球状颗粒；
所述稳定剂水溶液，是含无机盐、牛血清白蛋白和抗坏血酸的水溶液。
优选的稳定剂水溶液，含如下质量体积百分比的成分：0.1～1.0％的氯化钠、0.1～1.0％的牛血清白蛋白和0.2～2％的抗坏血酸，其余是水。
制成所述菌体保护剂的原料组成为：蔗糖0～10重量份，谷氨酸钠0～10重量份，牛血清白蛋白0～10重量份；优选的组成为：蔗糖5～7重量份，谷氨酸钠1～2重量份，牛血清白蛋白3～5重量份。
上述标准物质的制备方法，其特征是，用磷酸盐缓冲溶液将噬菌体ΦX174菌体稀释至109级，将配制成新鲜菌匀液与保护剂按照1:1的体积比混合，于-70℃下预冻4h后冻干，得到所述标准物质。
所用的噬菌体ΦX174的培养方法是：挑取宿主菌大肠杆菌13706单噬菌斑落于已高压灭菌的营养肉汤中，36℃±1℃下，180×g摇床培养5h。再加入5ml噬菌体ΦX174菌液，36℃±1℃下，180rpm摇床培养6h。
制备得到的标准物质于-20℃下保存。
所述标准物质的定值方法，为噬菌斑计数法，具体操作如下：
用1mL稳定剂水溶液对标准物质进行复水溶解，充分混匀后制备成S0样品匀液；
再用无菌磷酸盐缓冲液对充分溶解后的样品S0进行10倍系列稀释；根据给出的噬菌体ΦX174活菌浓度范围进行估算，选择三个稀释度的样品匀液分别吸取0.2mL噬菌体匀液和0.2mL培养好的宿主13706于10mL的无菌试管中，轻轻混匀，然后再加4-6mL半固体培养基于试管中，直接倾注于营养琼脂平板表面，轻轻摇晃，使离心管中的样品均匀铺于固体培养基上。将平板静置10min，待琼脂凝固后，正置于培养箱，36±1℃下培养6～12h。
选择有典型的噬菌体ΦX174典型噬菌斑且噬菌斑数在15PFU～150PFU之间的平板，计数典型噬菌斑数和记录稀释因子；噬菌斑计数以噬菌斑形成单位PFU表示，实验结果以活菌浓度表示，计数该稀释度平板上的典型噬菌斑，计算标准值；定值
结果表示为：标准值±扩展不确定度；
所述计算标准值按如下公式：
Figure GDA0003228621510000021
式中：
C——噬菌体ΦX174标准物质样品活噬菌体浓度，PFU/mL；
N——平板上噬菌体ΦX174典型噬菌斑的总数，PFU；
d——稀释因子，无量纲；
v——平板上噬菌体ΦX174匀液接种体积，mL。
本发明的优点如下：
1、本发明通过对保护剂成分的筛选和优化，提供了适合噬菌体ΦX174稳定保存的冻干保护剂配方。该保护剂配方可以有效降低噬菌体ΦX174在冷冻干燥过程中的死亡率。
2、本发明提供的用于菌体冻干物复水的稳定剂水溶液可以保证标准物质复水溶解后在4℃下稳定保存8小时。
3、制备的病毒标准物质在4℃下，可储存14天；在-20℃下可长期储存，且便于运输，其均匀性、稳定性符合人员防护装备防护性能评价工作的要求。
4、该标准物质使用方便，按照使用说明将第二组分加入第一组分中进行复水溶解后，即可使用，避免了每次现场测试评价前，人工配制指示病毒匀液耗时和操作繁琐的缺点。
5、通过对平板计数方法的优化，建立了适合噬菌体ΦX174标准物质的定值方法—噬菌斑计数法，并建立了定值结果的计算公式。
附图说明：
图1实施例1制备的病毒标准物质的短期稳定性考察结果；
图2实施例1制备的病毒标准物质的长期稳定性考察结果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式详细说明本发明技术方案，并不以此限定本发明的实施范围。凡依照本发明的思路和精神所做的类似替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质(噬菌体ΦX174标准物质)的制备
一、材料、仪器与方法
1.试验材料
噬菌体ΦX174(ATCC 13706B1)和宿主大肠杆菌13706(ATCC 13706)(军事医学科学院微生物流行病研究所菌种保藏库)；营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、磷酸缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline，PBS)、无菌生理盐水(0.85％)(北京陆桥技术有限责任公司)；海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠、蔗糖、葡萄糖、抗坏血酸钠、BSA(美国Sigma公司)；棕色西林瓶(深圳市宝安区沙井博海玻璃制品厂)。
2.仪器与设备
Beta1-8 LD plus冷冻干燥机(德国Christ公司)；CR21G高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)；HVE-50高压灭菌锅(日本Hirayama公司)；HWS-400恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；Milli-Q Advantage纯水仪(美国Millipore公司)；CP225D电子天平(德国Sartorius公司)。
3.主要培养基的配制
(1)营养肉汤(NB)
称取10.0g蛋白胨，3.0g牛肉粉，1.0g葡萄糖，5.0g氯化钠于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调pH值至7.5±0.2，分装试管，121℃高压灭菌15min备用。
(2)营养琼脂(NA)
称取10.0g蛋白胨，3.0g牛肉粉，5.0g氯化钠，15.0g琼脂于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调pH值至7.3±0.2，分装试管，121℃高压灭菌15min备用。
(3)半固体营养琼脂(SNA)
称取5.0g蛋白胨，1.5g牛肉粉，2.5g氯化钠，7.5g琼脂于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调pH值至7.3±0.2，分装试管，121℃高压灭菌15min备用。
(4)磷酸盐(PBS)缓冲液
pH7.2～7.4PBS的磷酸盐储存液：磷酸二氢钾34.0g，氢氧化钠7.0g，加蒸馏水溶解，调节pH值后用容量瓶定容至1000mL，装入高压灭菌瓶，121℃高压灭菌30min；pH7.2～7.4PBS的磷酸盐稀释液：取1.25mL磷酸盐储存液加入蒸馏水，调节pH值后用容量瓶定容至1000mL，装入高压灭菌瓶，121℃高压灭菌30min。
3.噬菌体ΦX174的制备
首先将噬菌体ΦX174的宿主菌E.coli 13706，在营养琼脂平板上划线复活，36℃±1℃温度下培养18～24h后，从营养琼脂平板上挑取某个单一的菌落接种到营养肉汤进行宿主菌E.coli 13706的增殖，37℃摇床培养3～4h直到营养肉汤变浑浊；然后吸取5mL噬菌体ΦX174溶液加入宿主菌E.coli 13706中，37℃摇床培养直至培养物变清澈；最后加入10mL氯仿，37℃水浴恒温震荡培养10min，即得到噬菌体ΦX174溶液，用噬斑计数法测量噬菌体ΦX174浓度。
4.保护剂的配制
选择蔗糖、谷氨酸钠、BSA中的一种或多种作为病毒保护剂成分。其重量百分比分别为蔗糖5～7％，谷氨酸钠1～2％，BSA 3～5％冻干保护剂用磷酸盐缓冲液溶解；且保护剂和磷酸盐缓冲液均需要灭菌；灭菌方法为辐照灭菌或高压灭菌；比如，冷冻干燥保护剂经过4kGy的Co60进行辐照灭菌，磷酸盐缓冲液采用高温高压灭菌121℃，20min。
4.冻干
将制备好噬菌体ΦX174溶液用0.1μm滤膜过滤后，用PBS稀释至109级，将保护剂与PBS稀释至109级的新鲜病毒匀液按照1:1比例配制混合液，用移液器分装1mL至棕色西林瓶中。将分装好的噬菌体ΦX174匀液与隔板在-80℃冰箱中预冻4h以上后，在冷冻干燥机上选择隔板最终温度20℃，0.370mbar进行冷冻干燥36-48h。冻干完成后，充氮气压盖密封，共制备200瓶噬菌体ΦX174标准物质样品。
5.冻干存活率检测
取3份冻干前噬菌体ΦX174与冻干保护剂的混合液，每份各1mL，采用经验证的噬菌斑计数法测定其活噬菌体浓度。随即取3个单元噬菌体ΦX174冻干标准物质，用1mL磷酸盐缓冲液作为稀释液将噬菌体ΦX174冻干样品进行复溶后，同样采用经验证的噬菌斑计数法测定其活噬菌体浓度。采用公式①计算冻干存活率(freeze-drying viability,FDV)。
Figure GDA0003228621510000051
式中，FDV为噬菌体ΦX174冻干存活率；C1为冻干前噬菌体ΦX174活噬菌体浓度；C2为冻干后噬菌体ΦX174活噬菌体浓度。
6.标准物质的定值
每批次至少抽取9个单元的标准物质进行定值实验。每个单元均按照以下步骤完成实验：用1mL稳定剂水溶液对标准物质进行复水溶解，充分混匀后制备成S0样品匀液；再用无菌磷酸盐缓冲液对充分溶解后的样品S0进行10倍系列稀释；根据给出的噬菌体ΦX174活病毒浓度范围进行估算，选择三个稀释度的样品匀液分别吸取0.2mL噬菌体匀液和0.2mL培养好的宿主13706于10mL的无菌试管中，轻轻混匀，然后再加4-6mL半固体培养基于试管中，直接倾注于营养琼脂平板表面，轻轻摇晃，使离心管中的样品均匀铺于固体培养基上。将平板静置10min，待琼脂凝固后，正置于培养箱，36±1℃下培养6～12h；选择有典型的噬菌体ΦX174噬菌斑且噬菌斑数在15PFU～150PFU之间的平板，计数典型噬菌斑数和记录稀释因子。噬菌斑计数法是以噬菌斑形成单位(plaque forming units，PFU)表示，实验结果以噬菌斑浓度即活噬菌体浓度(PFU/mL)表示。计数该稀释度平板上的典型噬菌斑，按照
Figure GDA0003228621510000061
式中，C为噬菌体ΦX174活菌浓度；N为平板上噬菌体ΦX174典型噬菌斑总数；m为典型噬菌斑数在15PFU～150PFU范围的平板数；d为稀释因子；v为平板上噬菌体ΦX174匀液接种体积。
7.标准物质的保存
制备好的标准物质于-20℃下保存。
二、实验结果
1.冻干存活率检测结果
取3份冻干前噬菌体ΦX174与冻干保护剂的混合液，每份各1mL，采用经验证的噬菌斑计数法测定其活菌浓度。随即取3个单元噬菌体ΦX174冻干标准物质，用1mL磷酸盐缓冲液作为稀释液将噬菌体ΦX174冻干样品进行复溶后，同样采用经验证的噬菌斑计数法测定其活噬菌体浓度。采用公式①计算冻干存活率(freeze-drying viability,FDV)。采用公式①计算冻干存活率为95.44％，检测数据与计算结果见表1，证明噬菌体ΦX174与保护剂混合后具有极高的存活率
Figure GDA0003228621510000062
式中，FDV为噬菌体ΦX174冻干存活率；C1为冻干前噬菌体ΦX174活噬菌体浓度；C2为冻干后噬菌体ΦX174活噬菌体浓度。
表1噬菌体ΦX174冻干存活率结果
Figure GDA0003228621510000063
Figure GDA0003228621510000071
2.标准物质的定值结果
将随机抽取的9个单元的标准物质分别采用噬菌斑计数法进行测试，每个单元标准物质重复3次。将培养后的平板放置在生物安全柜中观察，选择有典型的噬菌体ΦX174噬菌斑且噬菌斑在15PFU～150PFU之间的S8平板(稀释因子为10-8)计数，根据平板上的噬菌斑数按照公式②计算噬菌体ΦX174样品的活噬菌体浓度(见表2)。按照JJF1343《标准物质定值的通用原则及统计学原理》对定值数据进行正态分布检验、可疑值检验和等精度检验合格后，取算数平均值作为标准物质的标准值，量值为2.40×109PFU/mL，相对标准偏差为7.91％(见表2)。
表2噬菌体ΦX174标准物质的定值结果(m＝9，n＝3)
Figure GDA0003228621510000072
以上实验证明，通过加入保护剂，可以有效的降低噬菌体在冷冻干燥过程中的死亡率，本发明的标准物质冻干存活率95.44％，冻干保护效果很好；本发明得到的人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质的标准值为2.40×109PFU/mL，符合人员防护装备防护性能评价工作的要求。
以下各实验所用噬菌体ΦX174标准物质样品为按实施例1方法制备。
实施例2标准物质的均匀性检验
一、实验方法
1.均匀性检验方法
根据单元样品抽取原则，抽取单元数以及每个样品的重复测量次数应适合所采用的统计检验要求。总体单元数为N<200时，抽取单元数不少于11个；当200＜N＜500时，抽取单元数不少于15个；当500＜N＜1000时，抽取单元数不少于30个；当总体单元数N＞1000时，按
Figure GDA0003228621510000081
来计算出抽取样品数。对于均匀性好的样品，当N＜500时，抽取单元数可不少于10个；当N＞500时，抽取单元数可不少于15个。因此，从200瓶噬菌体ΦX174标准物质样品中随机抽取15瓶，每瓶样品中加入1mL磷酸盐缓冲液复水后，采用噬菌斑计数法按照实施例1中的步骤9中的操作进行检验，每瓶样品重复检测3次。最后，将计算结果通过F检验法进行均匀性检验。
2.均匀性分析方法
为检验样品均匀性，设抽取了m个样品，用精密度高的实验方法，在相同条件下得m组等精度测量数据如下：
1.
Figure GDA0003228621510000082
平均值
Figure GDA0003228621510000083
2.
Figure GDA00032286215100000812
平均值
Figure GDA0003228621510000085
…………
Figure GDA00032286215100000813
平均值
Figure GDA0003228621510000087
设
Figure GDA0003228621510000088
Figure GDA0003228621510000089
则组间差方和
Figure GDA00032286215100000810
组内差方和
Figure GDA00032286215100000811
记ν1＝m-1(组间自由度)
ν2＝N-m(组内自由度)
Figure GDA0003228621510000091
Figure GDA0003228621510000092
作统计量F；
Figure GDA0003228621510000093
由此可见，该统计量是自由度(ν1,ν2)的F分布变量。
根据自由度(ν1,ν2)及给定的显著性水平α，可由F表查得临界的Fα值。若F＜Fα,则认为组内与组间无明显差异，样品是均匀的，若F≥Fα,则怀疑各组间有系统差异，即样品之间存在差异，若记这个差异的标准偏差为Sbb，则有
Figure GDA0003228621510000094
若各ni均相同均为n时，则上式变成：
Figure GDA0003228621510000095
如果
Figure GDA0003228621510000096
此时均匀性产生的标准偏差可按下式计算：
Figure GDA0003228621510000097
二、实验结果
采用方差分析法对人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质进行均匀性检验，根据自由度为(vl＝14，v2＝30)及给定的显著性水平α＝0.05，可由表查得的F临界值为2.04，经过公式计算得F值＝1.36<F查表值，组内与组间无明显差异，因此样品是均匀的瓶间标准偏差Sbb为0.09×109PFU/mL(详见表3)。
表3标准物质样品均匀性检验(m＝15，n＝3)
Figure GDA0003228621510000098
Figure GDA0003228621510000101
以上实验证明，本发明得到的人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质的均匀性良好。
实施例3标准物质的稳定性考察
一、实验方法
1.短期稳定性考察方法
短期稳定性考察，主要涉及标准物质在运输过程中的稳定性，因此对标准物质在不同温度下进行短期稳定性统计评估。短期稳定性考察选取不同温度(-20℃、4℃，25℃和37℃)，不同时间点(0，7，14，21和28天)，采用噬菌斑计数法进行测试，每次随机选取3瓶样品，每瓶重复测3次(N＝3，n＝3)，取平均值得出人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质短期稳定性考察实验数据。根据人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质在不同温度下其活噬菌体浓度随时间的变化来描绘出活噬菌体浓度Y与时间X的关系，拟合成一条直线。
2.长期稳定性考察方法
将实施例1中制备得到的人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质储存在-20℃下，分别在0、1、2、3、4、5、6个月时每次随机抽取3个单元的标准物质，采用噬菌斑计数法进行测试，每个单元标准物质重复测3次(N＝3，n＝3)，取平均值得出噬菌体ΦX174标准物质长期稳定性考察实验数据，描绘出特性活噬菌体浓度Y与时间X的关系，拟合成一条直线。
3.稳定性考察分析方法
通过如下公式计算斜率b1及其不确定度s(b1)：
Figure GDA0003228621510000111
Figure GDA0003228621510000112
式中，
Figure GDA0003228621510000113
为时间平均值；
Figure GDA0003228621510000114
为稳定性检验时测定数据的平均值；b0为拟合直线的截距。通过查表得置信水平0.95的t分布因子，同计算斜率b1不确定度s(b1)相乘后与斜率b1的绝对值比较，若|b1|<t0.95,n-2·s(b1)则表明斜率是不显著的，标准物质样品稳定性良好。
二、实验结果
1.短期稳定性考察结果
采用稳定性考察分析方法中的公式分析标准物质在不同温度(-20℃、4℃，25℃和37℃)和不同时间点(0，7，14，21和28天)的短期稳定性考察实验数据(表4)，结果显示(见图1)：当标准物质在-20℃保存时，通过公式计算斜率b1值为-2574003，t0.95,n-2·s(b1)值为16370656，可得|b1|<t0.95,n-2·s(b1)，所以噬菌体ΦX174标准物质在-20℃温度下，可以稳定保存28天；而在4℃温度下，可以稳定保存7天；在25℃和37℃温度下，标准物质不稳定。
表4标准物质样品短期稳定性实验数据
Figure GDA0003228621510000115
Figure GDA0003228621510000121
2.长期稳定性测试
采用稳定性考察分析方法中的公式分析标准物质在-20℃下，储存0、1、2、3、4、5、6个月的长期稳定性考察实验数据(表5)，结果显示(见图2)：当标准物质在-20℃保存时，通过公式计算斜率b1值为-12870013，t0.95,n-2·s(b1)值为77152544，可得|b1|<t0.95,n-2·s(b1)，所以噬菌体ΦX174标准物质长期稳定性考察结果显示：噬菌体ΦX174标准物质在-20℃下可以稳定保存6个月
表5标准物质长期稳定性考察实验数据
Figure GDA0003228621510000122
以上实验证明，本发明得到的人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质，在4℃下，可储存14天，便于运输；在-20℃下，可储存6个月以上，具有优异的长期稳定性。实施例4标准物质的不确定度评定
一、实验方法
标准物质的总不确定度由4部分组成。第1部分是通过定值数据的标准偏差、测试次数及所要求的置信水平按统计学方法计算出A类相对标准不确定度urel(B)；第2部分是定值过程中B类相对标准不确定度urel(B)，它的主要来源包括：移液器带来的不确定度、样品稀释因子带来的不确定度；第3部分是标准物质均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)；第4部分是标准物质的稳定性引入的相对标准不确定度urel(s)。将这4部分相对标准不确定度合成后计算得到标准值的合成不确定度uC和扩展不确定度U＝kuC(k＝2，置信概率95％)。
1.A类相对标准不确定度urel(A)
将随机抽取的9个单元的标准物质分别采用噬菌斑计数法进行测试，每个单元标准物质重复3次，将3次重复测试结果取平均值得出每个单元标准物质的实验数据按如下贝塞尔公式计算出标准偏差
Figure GDA0003228621510000131
再通过公式计算得出A类相对标准不确定度urel(A)。
Figure GDA0003228621510000132
式中，uA为A类标准不确定度；
Figure GDA0003228621510000133
为平均值的标准偏差；
Figure GDA0003228621510000134
为平均值；Xi为每次测量数据；n为测量次数。
Figure GDA0003228621510000135
式中，urel(A)为A类相对标准不确定度；uA为A类标准不确定度；
Figure GDA0003228621510000136
为平均值。
2.B类相对标准不确定度urel(B)
由噬菌斑计数法结果计算公式②以及对测量过程的分析，B类相对标准不确定度主要来源包括：a)移液器带来的相对标准不确定度urel(v)，查询证书得0.02；b)样品稀释因子带来的相对标准不确定度urel(d)。样品稀释是由1mL噬菌体匀液加入9mL，因此设噬菌体匀液体积为a，稀释液体积为b，1mL移液器的的相对标准不确定度查证书urel(a)＝2％，9mL移液器的的相对标准不确定度查证urel(b)＝1％，ub＝urel(b)*b，稀释倍数k。按照公式如下计算得到为urel(d)。
Figure GDA0003228621510000137
式中，urel(d)为样品稀释因子的相对标准不确定度；k为稀释倍数；a为噬菌体匀液体积(1mL)；b为稀释液体积(9mL)；ub为稀释液体积的标准不确定度；urel(a)为噬菌体匀液体积的相对标准不确定度。
再通过如下公式计算合成B类相对标准不确定度urel(B)。
Figure GDA0003228621510000138
2.均匀性引入的相对标准不确定度评定urel(bb)
均匀性引入的标准不确定度ubb是将实施例2中的均匀性检验数据通过如下公式计算标准偏差为Sbb获得。
组间差方和
Figure GDA0003228621510000141
组内差方和
Figure GDA0003228621510000142
记ν1＝m-1(组间自由度)
ν2＝N-m(组内自由度)
Figure GDA0003228621510000143
Figure GDA0003228621510000144
(1)如果S1 2﹥S2 2，则均匀性的标准偏差Sbb和标准不确定度ubb按如下公式计算：
Figure GDA0003228621510000145
(2)如果S1 2＜S2 2，则均匀性的标准偏差Sbb和标准不确定度ubb按如下公式计算：
Figure GDA0003228621510000146
均匀性引入的相对标准不确定度评定urel(bb)按如下公式计算：
Figure GDA0003228621510000147
式中，
Figure GDA0003228621510000148
为平均值。
4.稳定性引入的相对标准不确定度评定urel(s)
将实施例3中的长期稳定性考察数据通过在不同温度下其活噬菌体浓度随时间的变化来描绘出活噬菌体浓度Y与时间X的关系，拟合成一条直线，通过如下公式计算斜率b1不确定度s(b)1，再通过如下公式计算稳定性的标准偏差Ss和稳定性的标准不确定度us。
Figure GDA0003228621510000149
us＝Ss＝s(b1)·t
式中，t为给定的保存期限。
Figure GDA0003228621510000151
式中，
Figure GDA0003228621510000152
为平均值。
4.合成相对标准不确定度urel(c)和扩展不确定度U
将A类相对标准不确定度urel(A)、B类相对标准不确定度urel(B)、均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)和稳定性引入的相对标准不确定度urel(s)按照如下公式合成得出标准物质的合成相对标准不确定度urel(c)和扩展不确定度U。
合成标准不确定度urel(c)为：
Figure GDA0003228621510000153
扩展不确定度U为：
Figure GDA0003228621510000154
(k＝＝2，置信概率95％)
式中，
Figure GDA0003228621510000155
为标准物质的标准值。
二、实验结果
1.A类相对标准不确定度评定urel(A)评定结果
将随机抽取的9个单元的标准物质分别采用噬菌斑计数法进行测试，每个单元标准物质重复3次，将3次重复测试结果取平均值得出每个单元标准物质的实验数据按贝塞尔公式计算出标准偏差
Figure GDA0003228621510000156
为1.89×108PFU/mL，再通过公式计算得出A类相对标准不确定度urel(A)为2.64％，结果见表6。
表6标准物质A类相对标准不确定度评定结果(m＝9)
Figure GDA0003228621510000157
Figure GDA0003228621510000161
2.B类相对标准不确定度urel(B)评定结果
B类相对标准不确定度主要来源包括：
(1)移液器带来的相对标准不确定度urel(v)，查询证书得1％(k＝2)，urel(v)＝uv/k＝1％/2＝0.5％；
(2)样品稀释因子带来的相对标准不确定度urel(d)。样品稀释是由1mL噬菌体匀液加入9mL无菌磷酸盐缓冲液进行稀释，因此设噬菌体匀液体积为a，稀释液体积为b，1mL移液器的的相对标准不确定度查证书urel(a)为2％，9mL移液器的的相对标准不确定度查证书urel(b)为1％，ub＝urel(b)*b＝1％*9mL＝0.09mL，稀释液体积的标准不确定度实际测量经过是经过7次稀释，稀释倍数k为7。按照公式计算得到为urel(d)为5.29％。
Figure GDA0003228621510000162
式中，urel(d)为样品稀释因子的相对标准不确定度；k为稀释倍数；a为噬菌体匀液体积(1mL)；b为稀释液体积(9mL)；ub为稀释液体积的标准不确定度；urel(a)为噬菌体匀液体积的相对标准不确定度。
按照如下公式计算合成B类相对标准不确定度为5.7％。
Figure GDA0003228621510000163
3.均匀性引起的相对标准不确定度评定urel(bb)评定结果
将实施例2中的均匀性检验数据通过公式计算标准偏差为Sbb为9.0×107PFU/mL，均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)为3.8％，结果见表7。
表7标准物质均匀性引起的相对标准不确定度评定结果
Figure GDA0003228621510000164
4.稳定性引入的相对标准不确定度urel(s)评定结果
将实施例3中的长期稳定性考察数据通过在不同温度下其活噬菌体浓度随时间的变化来描绘出活噬菌体浓度Y与时间X的关系，拟合成一条直线，通过公式计算斜率b1不确定度s(b1)，再通过公式计算稳定性的标准偏差Ss为1.7×108PFU/mL和稳定性的标准不确定度us为7.1％，结果见表8。
表8标准物质稳定性引起的相对标准不确定
Figure GDA0003228621510000171
5.合成相对标准不确定度urel(c)和扩展不确定度U评定结果
将A类相对标准不确定度、B类相对标准不确定度、均匀性引起的相对标准不确定度和稳定性引起的相对标准不确定度按照公式合成得出标准物质的合成相对标准不确定度为10％，再按照公式计算得扩展不确定度为4.8×108PFU/mL(k＝2)，结果见表9。合成标准不确定度urel(c)为：
Figure GDA0003228621510000172
Figure GDA0003228621510000173
扩展不确定度U为：
U＝kuC(k＝2，置信概率95％)
表9标准物质不确定度评定结果
Figure GDA0003228621510000174
以上实验证明，本发明得到的人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质定值结果的不确定度来源包括：A类标准不确定度、B类标准不确定度、均匀性引起的标准不确定度和稳定性引起的标准不确定度。标准物质的扩展不确定度为0.48×109PFU/mL(k＝2)。通过实施例1-4的实验证明，本发明得到的人员防护装备防护性能评价用病毒标准物质分装在棕色西林瓶中，呈饼状，1个/瓶；当使用时，吸取1mL复水的水溶液加入棕色西林瓶中复溶标准物质，其标准值为：(2.40±0.48)×109PFU/mL，符合人员防护装备防护性能评价工作的要求；该标准物质均匀性良好；在4℃下，可储存14天，便于运输；在-20℃下，可储存6个月以上，具有优异的长期稳定性。

Claims (5)

1.一种人员防护装备微生物防护性能评价用病毒标准物质，其特征在于，包括有噬菌体ΦX174；所述的病毒标准物质，由两个组分组成：
1)噬菌体ΦX174，是含有噬菌体ΦX174菌体和菌体保护剂的冻干物；
2)用于菌体冻干物复水的稳定剂水溶液；
制成所述菌体保护剂的原料组成为：蔗糖5～7重量份，谷氨酸钠1～2重量份，牛血清白蛋白3～5重量份；
所述稳定剂水溶液中各成分的质量体积百分比是：0.1～1.0％的氯化钠、0.1～1.0％的牛血清白蛋白和0.2～2％的抗坏血酸，其余是水；
所述病毒标准物质的制备方法是，用磷酸盐缓冲溶液将噬菌体ΦX174菌体稀释至109级，制成新鲜病毒匀液，再与保护剂按照1:1的体积比混合，于-70℃下预冻4h后冻干，得到所述标准物质。
2.权利要求1所述的病毒标准物质，其特征在于，所述噬菌体ΦX174用稳定剂水溶液复水后，噬菌体ΦX174活菌浓度为1.0×108～9.9×109PFU/mL。
3.权利要求1所述的病毒标准物质，所述冻干物的形状是饼状或球状的颗粒。
4.权利要求1所述的病毒标准物质，所述的制备方法中，所用的噬菌体ΦX174的培养方法是：挑取宿主菌大肠杆菌13706的单菌落于已高压灭菌的营养肉汤中，36℃±1℃下，180×g摇床培养5h；再加入5ml噬菌体ΦX174菌液，36℃±1℃下，180×g摇床培养6h。
5.权利要求1所述的病毒标准物质，制备得到的标准物质于-20℃下保存。
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