JP7348341B2 - 微生物培養用の寒天培地 - Google Patents
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Description
本発明は、微生物を培養する寒天培地、すなわち固化成分として寒天を含有する固体培地およびその製造方法に関するものである。
細菌、真菌などの微生物の検査は、臨床分野や獣医学分野における感染症診断の他、食品分野、環境分野における食中毒菌、衛生指標菌の検出などを目的として幅広い分野で実施されている。近年は、遺伝子法や免疫学的方法による迅速検査や自動分析機器が普及してきているものの、培養法により微生物の分離・同定を行うことは現在もなお微生物検査の基本である。
固化成分として寒天を使用する固体培地は、微生物の単離、鑑別用培地として使用され、また、薬剤感受性試験のディスク拡散法においても使用される。さらに、遺伝子法や直接ＥＩＡ法などのための試料調製を目的に、固体培地を使用する増菌培養が実施されることも多い。
寒天は、ガラクトースを基本骨格とする直鎖の多糖類であり、紅藻のうちテングサ属やオゴノリ属の海藻を原料として得られる。熱可塑性であり、蒸留水を加えて加熱溶解すると１００℃前後で液化（ゾル化）し、それを冷却すると３５～４５℃付近で固化（ゲル化）する。
固体培地に含有されている寒天は、三次元の網目構造を形成してゲル状態で存在しているが、その網目構造中に多量の水分を蓄えていると考えられている。蓄えられた水は時間の経過によって、また、保存温度の変化に晒されることによって寒天から遊離する。遊離して出てきた水を一般に離水と呼び、容器内の固体培地の寒天ゲルの表面の離水が容器内で蒸発し、その水蒸気が凝結して容器の内壁や寒天ゲル表面に付着した水を凝水と呼ぶ。本明細書においては以下、特に断りの無い限り、離水と凝水を区別せずに凝水という。
固体培地の寒天ゲルの表面の凝水が多いと、培地に生育した菌が流れてコロニーが形成されないことや、コロニーを形成したとしてもコロニーの拡散やコロニー同士の融合により菌の分離が困難になること、その他、雑菌の混入（コンタミネーション）などの問題が生じ得る。
寒天培地の凝水の問題を回避する方法として、検体を接種する前に、平板培地の表面に付着している水滴を無菌的に乾燥させる方法がある。その場合、通常、３５～３７℃のインキュベーター中で、シャーレを倒置し、蓋の上に少し開くように本体の方を傾けて置いて培地表面を乾燥させる（非特許文献１）。乾燥時間は３０～６０分程度であるが、インキュベーターの棚の置き場所によって乾燥に要する時間が異なるため、複数の平板培地の表面を適度な乾燥状態にするためには、乾燥中にインキュベーターの棚の上のシャーレの位置を換える作業が必要になる。また、培地の種類によってはインキュベーター中に置いても乾燥しにくいものもある。そのため、凝水が出にくい寒天培地が望まれている。
血液寒天培地の離水を抑制するために、血液寒天培地に高濃度（２０～４０％）のトレハロースを添加する方法が提案されている（特許文献１）。しかしながら、トレハロースは価格が高価なため、トレハロースを高濃度で含有する培地は高コストであるという問題がある。
微生物検査ナビ，第２版，ｐ．８，２０１６
本発明は、上記の現状に鑑みてなされたものであり、凝水が抑制され、調製が容易な微生物培養用の寒天培地およびその製造方法を提供することを目的としている。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、従来、微生物培養用の寒天培地で使用されている重量平均分子量が３０万～４５万である寒天（以下、従来の微生物培養用の寒天という。）を固化成分とする寒天培地に、重量平均分子量が１５万以下、特に２万～１５万である低分子量寒天を固化成分として添加することにより、４℃～２５℃の保存温度の変化に晒した場合に培地表面に付着する凝水が抑制されることを新たに見出した。さらに、本発明者は、重量平均分子量が２万～１５万である低分子量寒天の添加量を、重量平均分子量が３０万～４５万である従来の微生物培養用の寒天の含有量に対して５％～５０％の割合とすることにより、凝水を抑制しつつ培地表面をコロニー形成に適切な状態に保ち、コロニーの微小化を抑えることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のような構成からなるものである。
（１）少なくとも（ａ）および（ｂ）を固化成分として含有することを特徴とする、微生物の培養に用いる固体培地。
（ａ）重量平均分子量が３０万～４５万である寒天、
（ｂ）重量平均分子量が１５万以下である低分子量寒天。
（２）前記低分子量寒天の重量平均分子量が２万～１５万であることを特徴とする（１）に記載の固体培地。
（３）前記重量平均分子量が３０万～４５万である寒天の含有量（Ａ）に対する前記低分子量寒天の含有量（Ｂ）の比が０．０５以上０．５以下であることを特徴とする（１）または（２）に記載の固体培地。
（４）微生物の培養に用いる固体培地の製造方法であって、固化成分として（ａ）および（ｂ）を使用することを特徴とする固体培地の製造方法。
（ａ）重量平均分子量が３０万～４５万である寒天、
（ｂ）重量平均分子量が１５万以下である低分子量寒天。
（５）前記低分子量寒天の重量平均分子量が２万～１５万であることを特徴とする（４）に記載の固体培地の製造方法。
（６）前記重量平均分子量が３０万～４５万である寒天の含有量（Ａ）に対する前記低分子量寒天の含有量（Ｂ）の比が０．０５以上０．５以下であることを特徴とする（４）または（５）に記載の固体培地の製造方法。
（１）少なくとも（ａ）および（ｂ）を固化成分として含有することを特徴とする、微生物の培養に用いる固体培地。
（ａ）重量平均分子量が３０万～４５万である寒天、
（ｂ）重量平均分子量が１５万以下である低分子量寒天。
（２）前記低分子量寒天の重量平均分子量が２万～１５万であることを特徴とする（１）に記載の固体培地。
（３）前記重量平均分子量が３０万～４５万である寒天の含有量（Ａ）に対する前記低分子量寒天の含有量（Ｂ）の比が０．０５以上０．５以下であることを特徴とする（１）または（２）に記載の固体培地。
（４）微生物の培養に用いる固体培地の製造方法であって、固化成分として（ａ）および（ｂ）を使用することを特徴とする固体培地の製造方法。
（ａ）重量平均分子量が３０万～４５万である寒天、
（ｂ）重量平均分子量が１５万以下である低分子量寒天。
（５）前記低分子量寒天の重量平均分子量が２万～１５万であることを特徴とする（４）に記載の固体培地の製造方法。
（６）前記重量平均分子量が３０万～４５万である寒天の含有量（Ａ）に対する前記低分子量寒天の含有量（Ｂ）の比が０．０５以上０．５以下であることを特徴とする（４）または（５）に記載の固体培地の製造方法。
本発明によれば、固化成分として従来の微生物培養用の寒天を使用する固体培地に、重量平均分子量が１５万以下、特に２万～１５万である低分子量寒天を固化成分として添加することによって、ゲル状態の寒天の三次元網目構造の中に低分子量の寒天が入り込んで網目構造を補強し、離水が抑制され、結果として凝水を抑制可能な寒天培地とすることができる。
さらに、重量平均分子量が２万～１５万である低分子量寒天の添加量を重量平均分子量が３０万～４５万である従来の微生物培養用の寒天の含有量に対して５％～５０％の割合とすることにより、凝水を抑制しつつ培地表面をコロニー形成に適した状態とし、コロニーの微小化を抑えることができる。
また、本発明によれば、従来の微生物培養用の寒天を固化成分として使用する固体培地に、重量平均分子量が２万～１５万である低分子量寒天を固化成分として添加することにより固体培地を製造することができるため、特別な操作を要することなく、容易に培地を製造することができる。
本発明の固体培地は、従来の微生物培養用の寒天に加えて、重量平均分子量が１５万以下、特に２万～１５万である低分子量寒天を固化成分として含有することを特徴とする。低分子量寒天を添加すると、ゲル状態において従来の微生物培養用の寒天が形成する三次元の網目構造の中に低分子量の寒天が入り込み、網目構造を複雑化して補強する。それにより、網目構造が保持できる水分量が増え、かつ、温度変化による網目構造の変化が起きにくくなることで離水が抑制され、結果として凝水を抑制可能になる。後に実施例で示す様に、重量平均分子量２万～１５万の低分子量寒天を用いることで前記の効果が得られる。
実際に微生物を培養する際には、従来の微生物培養用の寒天を含有する基礎培地の成分に加えて重量平均分子量が１５万以下、特に２万～１５万である低分子量寒天を添加したものを本発明の培地として用いることができる。なお、寒天の重量平均分子量の測定方法は特に限定されないが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるゲル浸透クロマトグラフィー法（ＧＰＣ法）により測定することができる。具体的には、国際公開第２０１６／１６７３７３号公報に記載されているように、寒天を０．１５％濃度となるよう精製水に懸濁し、９５℃～９７℃で加温溶解後、５０℃に冷却し、カラム（ＴＯＳＯＨ ＴＳＫ－ＧＥＬ ｆｏｒ ＨＰＬＣ，ＴＳＫ－ＧＥＬ ＧＭＰＷＸＬ等）を使用し、分子量既知のプルランを標準物質として測定することができる。
実際に微生物を培養する際には、従来の微生物培養用の寒天を含有する基礎培地の成分に加えて重量平均分子量が１５万以下、特に２万～１５万である低分子量寒天を添加したものを本発明の培地として用いることができる。なお、寒天の重量平均分子量の測定方法は特に限定されないが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるゲル浸透クロマトグラフィー法（ＧＰＣ法）により測定することができる。具体的には、国際公開第２０１６／１６７３７３号公報に記載されているように、寒天を０．１５％濃度となるよう精製水に懸濁し、９５℃～９７℃で加温溶解後、５０℃に冷却し、カラム（ＴＯＳＯＨ ＴＳＫ－ＧＥＬ ｆｏｒ ＨＰＬＣ，ＴＳＫ－ＧＥＬ ＧＭＰＷＸＬ等）を使用し、分子量既知のプルランを標準物質として測定することができる。
本発明で使用する低分子量寒天の重量平均分子量は２万～１５万であり、ゼリー強度（１．５％濃度のゲル。以下、濃度の記載は省略する。）は３０～２２０ｇ／ｃｍ２程度である。凝水抑制効果を高めるために、添加する低分子量寒天の重量平均分子量を２万～１２万とすることが好ましく、７万～１２万とすることがより好ましく、８万～１１万とすることがさらに好ましく、９万～１０．５万とすることがよりさらに好ましく、９．５万～１０．２万とすることが特に好ましい。また、低分子量寒天の重量平均分子量が２万～１２万である場合は、ゼリー強度が３０～１８０ｇ／ｃｍ２であることが好ましく、低分子量寒天の重量平均分子量が７万～１２万である場合は、ゼリー強度が１００～１８０ｇ／ｃｍ２であることが好ましく、低分子量寒天の重量平均分子量が８万～１１万である場合は、ゼリー強度は１２０～１７０ｇ／ｃｍ２であることが好ましく、低分子量寒天の重量平均分子量が９万～１０．５万である場合は、ゼリー強度が１３０～１６０ｇ／ｃｍ２であることが好ましく、低分子量寒天の重量平均分子量が９．５万～１０．２万である場合は、ゼリー強度が１４０～１５０ｇ／ｃｍ２であることが好ましい。
本発明で使用する低分子量寒天は、重量平均分子量２万～１５万である。製造方法は特に限定されないが、特開平５－３１７００８号公報や特開平１０－１４６１７４号公報に記載されているように、重量平均分子量が約２０万～約４０万である市販の一般的な寒天の製造工程に酸処理や熱処理、酵素処理などにより寒天分子を切断する工程を追加することにより製造されたものであっても良い。使用する酸濃度、加熱温度などを調節することにより分子量やゼリー強度を適宜調節する技術も公知である（梅村澄夫ら，低分子量寒天の開発と利用に関する研究（第１報），岐阜県産業技術センター研究報告，２００９）。
なお、本発明で使用できる市販の低分子量寒天としては、例えば、ウルトラ寒天ＡＸ－３０（伊那食品工業株式会社、ゼリー強度：３０～６０ｇ／ｃｍ２）、ウルトラ寒天ＡＸ－１００（伊那食品工業株式会社製、ゼリー強度：１００～１５０ｇ／ｃｍ２）、ウルトラ寒天ＢＸ－３０（伊那食品工業株式会社製、ゼリー強度：３０～６０ｇ／ｃｍ２）、ウルトラ寒天ＢＸ－１００（伊那食品工業株式会社製、ゼリー強度：１００～１５０ｇ／ｃｍ２）、ウルトラ寒天ＵＸ－３０（伊那食品工業株式会社製、ゼリー強度：３０～６０ｇ／ｃｍ２）、ウルトラ寒天ＵＸ－１００（伊那食品工業株式会社、ゼリー強度：１００～１５０ｇ／ｃｍ２）などが挙げられる。
なお、本発明で使用できる市販の低分子量寒天としては、例えば、ウルトラ寒天ＡＸ－３０（伊那食品工業株式会社、ゼリー強度：３０～６０ｇ／ｃｍ２）、ウルトラ寒天ＡＸ－１００（伊那食品工業株式会社製、ゼリー強度：１００～１５０ｇ／ｃｍ２）、ウルトラ寒天ＢＸ－３０（伊那食品工業株式会社製、ゼリー強度：３０～６０ｇ／ｃｍ２）、ウルトラ寒天ＢＸ－１００（伊那食品工業株式会社製、ゼリー強度：１００～１５０ｇ／ｃｍ２）、ウルトラ寒天ＵＸ－３０（伊那食品工業株式会社製、ゼリー強度：３０～６０ｇ／ｃｍ２）、ウルトラ寒天ＵＸ－１００（伊那食品工業株式会社、ゼリー強度：１００～１５０ｇ／ｃｍ２）などが挙げられる。
従来の微生物培養用の寒天の重量平均分子量は約４０万、より詳細には３０万～４５万程度であり、ゼリー強度は５００～８００ｇ／ｃｍ２程度である。本発明において寒天培地に固化成分として使用する従来の微生物培養用の寒天の量は、それぞれの培地に応じて適宜選択すれば良いが、例えば培地１Ｌ当たり８ｇ～２０ｇの範囲から適宜含有量を選択できる。
後に実施例に示す様に、従来の微生物培養用の寒天の含有量を一定にし、重量平均分子量２万～１５万の低分子量寒天の添加量を変化させると、低分子量寒天の添加量が増加するのに伴い、凝水量が減少する傾向がある。凝水量が減少すれば、発育したコロニーが流れてコロニーが形成されない問題が改善される。一方、低分子量寒天の添加によりゼリー強度が大きく上昇する（低分子量寒天を添加していない培地と比較したゼリー強度の上昇値が約１００ｇ／ｃｍ２を超える）と、発育した微生物のコロニー形成状態（拡がり状態）に影響し、コロニーが微小化する傾向がある。
そのため、本発明の固体培地で使用する低分子量寒天の添加量は、凝水量およびゼリー強度の両面において培地表面をコロニー形成に適切な状態に保ち、コロニーの微小化を抑えつつ凝水を抑制できる範囲とすることが好ましい。当業者であれば本発明の実施例を参考にして低分子量寒天の添加量を設定することができる。例えば、培地１Ｌ当たりの低分子量寒天の添加量を０．８ｇ以上とすることが好ましく、１ｇ以上とすることがより好ましく、２ｇ以上とすることがさらに好ましく、２．５ｇ以上とすることがよりさらに好ましい。また、培地１Ｌ当たりの低分子量寒天の添加量を７．５ｇ以下とすることが好ましく、６ｇ以下とすることがより好ましく、５ｇ以下とすることがさらに好ましいが、低分子量寒天の添加によるゼリー強度の上昇に起因するコロニーの微小化の状況に応じて、適宜、低分子量寒天の添加量を４ｇ以下、３．５ｇ以下などとすることができる。
そのため、本発明の固体培地で使用する低分子量寒天の添加量は、凝水量およびゼリー強度の両面において培地表面をコロニー形成に適切な状態に保ち、コロニーの微小化を抑えつつ凝水を抑制できる範囲とすることが好ましい。当業者であれば本発明の実施例を参考にして低分子量寒天の添加量を設定することができる。例えば、培地１Ｌ当たりの低分子量寒天の添加量を０．８ｇ以上とすることが好ましく、１ｇ以上とすることがより好ましく、２ｇ以上とすることがさらに好ましく、２．５ｇ以上とすることがよりさらに好ましい。また、培地１Ｌ当たりの低分子量寒天の添加量を７．５ｇ以下とすることが好ましく、６ｇ以下とすることがより好ましく、５ｇ以下とすることがさらに好ましいが、低分子量寒天の添加によるゼリー強度の上昇に起因するコロニーの微小化の状況に応じて、適宜、低分子量寒天の添加量を４ｇ以下、３．５ｇ以下などとすることができる。
本発明の固体培地において使用する従来の微生物培養用の寒天の含有量（Ａ）に対する低分子量寒天の添加量（Ｂ）の比（Ｂ／Ａ）は、培地表面をコロニー形成に適切な状態に保ち、コロニーの微小化を抑えつつ凝水を抑制できる範囲とすることが好ましい。例えば、本発明の固体培地において使用する従来の微生物培養用の寒天の含有量（Ａ）に対する低分子量寒天の添加量（Ｂ）の比（Ｂ／Ａ）を、０．０５以上（例えば０．８ｇ／１５ｇ）とすることが好ましいが、０．１以上（例えば１．５ｇ／１５ｇ）とすることがより好ましく、０．１２以上（例えば１．８ｇ／１５ｇ）とすることがさらに好ましく、０．１４以上（例えば２．１ｇ／１５ｇ）とすることがよりさらに好ましく、０．１６以上（例えば２．５ｇ／１５ｇ）とすることが特に好ましい。また、従来の微生物培養用の寒天の含有量（Ａ）に対する低分子量寒天の添加量（Ｂ）の比（Ｂ／Ａ）は、０．５以下（例えば７．５ｇ／１５ｇ）とすることが好ましく、０．４以下（例えば６ｇ／１５ｇ）とすることがより好ましく、０．３４以下（例えば５ｇ／１５ｇ）とすることがさらに好ましいが、低分子量寒天の添加によるゼリー強度の上昇に起因するコロニーの微小化の状況に応じて、適宜、０．３以下（例えば４．５ｇ／１５ｇ）、０．２７以下（例えば４ｇ／１５ｇ）、０．２５以下（例えば３．７ｇ／１５ｇ）、０．２３以下（例えば３．４ｇ／１５ｇ）、０．２以下（例えば３．０ｇ／１５ｇ）などとすることができる。
本発明の固体培地において培養の対象となる微生物は、寒天培地に生育し得る細菌または真菌である。細菌の具体例として、Staphylococcus属菌、Streptococcus属菌、Enterococcus属菌、Bacillus属菌、Corynebacterium属菌、Listeria属菌、Peptococcus属菌、Clostridium属菌、Eubacterium属菌、Propionibacterium属菌、Lactobacillus属菌、Actinomyces属菌、Nocardia属菌、Mycobacterium属菌などのグラム陽性菌、Neisseria属菌、Branhamella属菌、Haemophilus属菌、Escherichia属菌、Salmonella属菌、Shigella属菌、Klebsiella属菌、Bordetella属菌、Enterobacter属菌、Serratia属菌、Campylobacter属菌、Vibrio属菌、Pseudomonas属菌、Aeromonas属菌、Acinetobacter属菌、Brucella属菌、Legionella属菌、Citrobacter属菌、Hafnia属菌、Proteus属菌、Morganella属菌、Providencia属菌、Yersinia属菌、Xanthomonas属菌、Flavobacterium属菌、Helicobacter属菌、Veillonella属菌、Bacteroides属菌、Fusobacterium属菌、Treponema属菌、Leptospira属菌、Mycoplasma属菌、Ureaplasma属菌などのグラム陰性菌が挙げられ、真菌の具体例として、Aspergillus属菌、Candida属菌、Cryptococcus属菌、Mucor属菌、Mortierella属菌、Trichophyton属菌、Histoplasma属菌などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の固体培地の基礎培地となる培地は、細菌、真菌が発育可能な寒天培地である。具体例として普通寒天培地、標準寒天培地、トリプトソイ寒天培地（SCD寒天培地）、血液寒天培地、チョコレート寒天培地、マンニット食塩培地、エッグヨーク食塩寒天培地、スタフィロコッカスＮｏ．１１０培地、マッコンキー寒天培地、CT-SMAC寒天培地、ドリガルスキー寒天培地（DRIG培地）、ドリガルスキー改良培地（BTB乳糖寒天培地）、デスオキシコーレイト寒天培地、DHL寒天培地、ハートインフュジョン寒天培地、ブレインハートインフュジョン寒天培地、SSB寒天培地、サルモネラ・シゲラ寒天培地(SS寒天培地)、TCBS寒天培地、ビブリオ寒天培地、TSI寒天培地、クリグラー寒天培地、アルギニン・グリセロール・塩類寒天培地（AGS寒天培地）、ベアードパーカー寒天培地、NAC寒天培地、スキロー培地、NGKG寒天培地、ミュラーヒントン寒天培地、サブロー寒天培地、ポテトデキストロース寒天培地、カンジダ寒天培地などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の固体培地は、固化成分として従来の微生物培養用の寒天に加えて重量平均分子量２万～１５万の低分子量寒天を使用することにより製造することができる。後に実施例に示す様に、固化成分として従来の微生物培養用の寒天に加えて重量平均分子量２万～１５万の低分子量寒天を添加する以外は、基礎培地となる培地の製造方法と同様の工程を経て製造され得る。すなわち、固化成分として（ａ）重量平均分子量が３０万から４５万である寒天、および（ｂ）重量平均分子量２万～１５万の低分子量寒天、を使用して調製した培地成分溶液に滅菌処理を施した後、シャーレなどの容器に分注して固化することにより製造することができる。
本発明に使用される試料は、細菌、真菌を含む可能性のある試料であれば特に限定されない。ヒト、他の動物の生体由来、食品、環境由来の検体、それらの培養液、さらには、医薬品、化粧品の成分などが試料として挙げられる。これらの試料は、抽出、濃縮などの前処理を行っても良い。
本発明の固体培地は、必要に応じて、分離対象とする微生物に適した発色酵素基質、分離対象とする微生物以外の発育を抑制するための選択剤、その他の成分をさらに添加することもできる。通常、選択分離培地で使用され得る成分の種類、濃度における添加であれば、本発明の効果に影響することはない。
本発明の固体培地は、微生物の単離、鑑別用培地としての使用の他に、薬剤感受性試験のディスク拡散法においても使用することができ、さらには、遺伝子法や直接ＥＩＡ法などのための試料調製を目的にした、増菌培養用の培地としても使用することができる。
本発明の固体培地の形態は特に限定されないが、優れた凝水抑制効果という観点から、平板固形培地の形態が最も好ましい。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
（血液寒天培地における凝水試験）
羊血液寒天培地を基礎培地とし、低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加して凝水抑制効果を調べた。
羊血液寒天培地を基礎培地とし、低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加して凝水抑制効果を調べた。
（１）培地の準備
以下の表１に示した培地成分１を秤量し、以下の（２）で羊血液を添加した後の培地量が２Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表１において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷを寒天Ｂと記載する。
以下の表１に示した培地成分１を秤量し、以下の（２）で羊血液を添加した後の培地量が２Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表１において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷを寒天Ｂと記載する。
（２）羊血液の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め無菌的に採取した羊脱繊維血液を、培地１Ｌ当たり５０ｍＬとなるように添加した。その後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め無菌的に採取した羊脱繊維血液を、培地１Ｌ当たり５０ｍＬとなるように添加した。その後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
（３）凝水量の測定
（１）、（２）で調製した培地入りシャーレを４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した。
なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につき１０枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（１）、（２）で調製した培地入りシャーレを４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した。
なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につき１０枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（４）培地のゼリー強度の測定
（１）、（２）で調製した培地を上記（３）の凝水量測定用のものとは別に用意し、２０℃の恒温槽にて２０時間保存した後、レオメーター（ＦＵＤＯＨ ＲＨＥＯ ＭＥＴＥＲ ＲＴＣ－３００２Ｄ）（株式会社レイテック製）の測定部が培地に１ｍｍ侵入する強度をゼリー強度として測定した。なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につきシャーレ１枚をゼリー強度測定の対象とし、１枚のシャーレの３箇所を測定して平均値をゼリー強度として算出した。
（１）、（２）で調製した培地を上記（３）の凝水量測定用のものとは別に用意し、２０℃の恒温槽にて２０時間保存した後、レオメーター（ＦＵＤＯＨ ＲＨＥＯ ＭＥＴＥＲ ＲＴＣ－３００２Ｄ）（株式会社レイテック製）の測定部が培地に１ｍｍ侵入する強度をゼリー強度として測定した。なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につきシャーレ１枚をゼリー強度測定の対象とし、１枚のシャーレの３箇所を測定して平均値をゼリー強度として算出した。
（５）結果
培地の凝水量およびゼリー強度の測定結果を表２に示す。凝水量の測定結果は、低分子量寒天ＳＷの各添加量における平均凝水量を、低分子量寒天ＳＷを添加していない培地（Ｎｏ．１）の平均凝水量と比較した凝水削減量および凝水削減率とともに表示し、また、ゼリー強度は、低分子量寒天ＳＷを添加していない培地（Ｎｏ．１）のゼリー強度からの上昇値とともに表示している。
培地の凝水量およびゼリー強度の測定結果を表２に示す。凝水量の測定結果は、低分子量寒天ＳＷの各添加量における平均凝水量を、低分子量寒天ＳＷを添加していない培地（Ｎｏ．１）の平均凝水量と比較した凝水削減量および凝水削減率とともに表示し、また、ゼリー強度は、低分子量寒天ＳＷを添加していない培地（Ｎｏ．１）のゼリー強度からの上昇値とともに表示している。
表２に示した様に、培地１Ｌ当たりの低分子量寒天ＳＷの添加量が１ｇの培地（Ｎｏ．２）においても、低分子量寒天ＳＷを添加していない培地（Ｎｏ．１）の凝水量と比較した削減率は６４．６％という良好な値であった。また、凝水削減率は低分子量寒天ＳＷの添加量の増加に伴い上昇し、培地１Ｌ当たりの低分子量寒天ＳＷの添加量が３ｇ以上の培地では７６．０％以上という非常に良好な凝水削減率を示した。一方、ゼリー強度は、低分子量寒天ＳＷの添加量の増加に伴い上昇し、培地１Ｌ当たりの低分子量寒天ＳＷの添加量が４ｇの培地（Ｎｏ．５）では、低分子量寒天ＳＷを添加していない培地（Ｎｏ．１）のゼリー強度よりも１１０ｇ／ｃｍ２高い値を示した。また、培地１Ｌ当たりの低分子量寒天ＳＷの添加量が５ｇの培地（Ｎｏ．６）のゼリー強度は７００ｇ／ｃｍ２を超えていた。
（血液寒天培地における培養試験）
羊血液寒天培地を基礎培地として低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加した培地にStreptococcus pyogenes、Streptococcus agalactiae、Streptococcus intermedius、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus Group G、Enterobacter cloacae、Moraxella catarrhalis、Staphylococcus aureusを接種し、菌の発育状況を調べた。
羊血液寒天培地を基礎培地として低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加した培地にStreptococcus pyogenes、Streptococcus agalactiae、Streptococcus intermedius、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus Group G、Enterobacter cloacae、Moraxella catarrhalis、Staphylococcus aureusを接種し、菌の発育状況を調べた。
（１）培地の準備
以下の表３に示した培地成分２を秤量し、以下の（２）で羊血液を添加した後の培地量が３Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。表３において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷを寒天Ｂと記載する。
以下の表３に示した培地成分２を秤量し、以下の（２）で羊血液を添加した後の培地量が３Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。表３において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷを寒天Ｂと記載する。
（２）羊血液の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め無菌的に採取した羊脱繊維血液を、培地１Ｌ当たり５０ｍＬとなるように添加した。その後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め無菌的に採取した羊脱繊維血液を、培地１Ｌ当たり５０ｍＬとなるように添加した。その後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で１８時間、５％炭酸ガス環境下での培養または好気培養を行い、発育した細菌のコロニーサイズを測定した。なお、シャーレ１枚につき１菌株を接種して培養試験を行い、優勢に発育した１コロニーを代表としてサイズの測定を行った。
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で１８時間、５％炭酸ガス環境下での培養または好気培養を行い、発育した細菌のコロニーサイズを測定した。なお、シャーレ１枚につき１菌株を接種して培養試験を行い、優勢に発育した１コロニーを代表としてサイズの測定を行った。
（４）結果
５％炭酸ガス環境下での培養により発育したコロニーのサイズを表４に、また、好気培養により発育したコロニーのサイズを表５に示す。
５％炭酸ガス環境下での培養により発育したコロニーのサイズを表４に、また、好気培養により発育したコロニーのサイズを表５に示す。
表４および５に示した様に、５％炭酸ガス環境下での培養、好気培養のいずれにおいても、培地１Ｌ当たりの低分子量寒天ＳＷの添加量が３ｇの培地では低分子量寒天ＳＷを添加していない培地と同等のコロニーサイズであったが、培地１Ｌ当たりの低分子量寒天ＳＷの添加量が４ｇの培地ではコロニーサイズが小さくなる傾向が見られ、培地１Ｌ当たりの低分子量寒天ＳＷの添加量が５ｇの培地では、コロニーサイズがさらに小さくなっていた。
実施例１の結果（表２）によると、培地１Ｌ当たりの低分子量寒天ＳＷの添加量が４ｇ、５ｇの培地では、低分子量寒天ＳＷを添加していない培地と比較したゼリー強度の上昇値がそれぞれ１１０ｇ／ｃｍ２、１５０ｇ／ｃｍ２であることから、低分子量寒天を添加していない培地と比較してゼリー強度が約１００ｇ／ｃｍ２以上上昇している培地（低分子量寒天ＳＷの場合には、培地１Ｌ当たりの添加量が４ｇ以上の培地）ではゼリー強度が上昇する程、コロニーが小さくなることが示唆された。
（低分子量寒天ＳＷのゼリー強度測定）
低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万）の３種類のロットについて、ゼリー強度を調べた。
低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万）の３種類のロットについて、ゼリー強度を調べた。
（１）寒天ゲルの準備
各ロットの低分子量寒天ＳＷを１．５％濃度となるように精製水に懸濁し、ｐＨを７．０に調整した。寒天懸濁液を１００℃で４０分間加温溶解した。５０℃に冷却した後、１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
各ロットの低分子量寒天ＳＷを１．５％濃度となるように精製水に懸濁し、ｐＨを７．０に調整した。寒天懸濁液を１００℃で４０分間加温溶解した。５０℃に冷却した後、１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
（２）ゼリー強度の測定
（１）で調製した寒天ゲルを２０℃の恒温槽にて２０時間保存した後、レオメーター（ＦＵＤＯＨ ＲＨＥＯ ＭＥＴＥＲ ＲＴＣ－３００２Ｄ）（株式会社レイテック製）の測定部が培地に１ｍｍ侵入する強度をゼリー強度として測定した。なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につきシャーレ１枚をゼリー強度測定の対象とし、１枚のシャーレの３箇所を測定して平均値をゼリー強度として算出した。
（１）で調製した寒天ゲルを２０℃の恒温槽にて２０時間保存した後、レオメーター（ＦＵＤＯＨ ＲＨＥＯ ＭＥＴＥＲ ＲＴＣ－３００２Ｄ）（株式会社レイテック製）の測定部が培地に１ｍｍ侵入する強度をゼリー強度として測定した。なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につきシャーレ１枚をゼリー強度測定の対象とし、１枚のシャーレの３箇所を測定して平均値をゼリー強度として算出した。
（３）結果
寒天ゲルのゼリー強度の測定結果を溶液のｐＨ実測値とともに表６に示す。
寒天ゲルのゼリー強度の測定結果を溶液のｐＨ実測値とともに表６に示す。
低分子量寒天ＳＷのゼリー強度は、表６に示したとおり、１４０／ｃｍ２または１５０ｇ／ｃｍ２であった。
（低分子量寒天添加培地の経時変化試験１）
羊血液寒天培地を基礎培地とし、低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加して調製後、１０℃、倒置にて３．５ヶ月保存した培地における凝水試験を行った。
羊血液寒天培地を基礎培地とし、低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加して調製後、１０℃、倒置にて３．５ヶ月保存した培地における凝水試験を行った。
（１）培地の準備
以下の表７に示した培地成分３を秤量し、以下の（２）で羊血液を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表７において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷを寒天Ｂと記載する。
以下の表７に示した培地成分３を秤量し、以下の（２）で羊血液を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表７において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷを寒天Ｂと記載する。
（２）羊血液の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め無菌的に採取した羊脱繊維血液を、培地１Ｌ当たり５０ｍＬとなるように添加した。その後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め無菌的に採取した羊脱繊維血液を、培地１Ｌ当たり５０ｍＬとなるように添加した。その後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
（３）凝水量の測定
（１）、（２）で調製した培地入りシャーレを１０℃、倒置にて３．５ヶ月保存した（培地調製日、保存開始日とも２０１６年１２月８日）。その後、４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した（凝水量測定日は２０１７年３月２２日）。
なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につき９枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（１）、（２）で調製した培地入りシャーレを１０℃、倒置にて３．５ヶ月保存した（培地調製日、保存開始日とも２０１６年１２月８日）。その後、４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した（凝水量測定日は２０１７年３月２２日）。
なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につき９枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（４）結果
培地の凝水量の測定結果を表８に示す。
培地の凝水量の測定結果を表８に示す。
表８に示した様に、１０℃にて３．５ヶ月保存後において、低分子量寒天ＳＷの添加培地の凝水量は、良好に抑制されていた。
（ドリガルスキー改良培地における凝水試験）
ドリガルスキー改良培地（BTB乳糖寒天培地）を基礎培地とし、低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加して凝水抑制効果を調べた。
ドリガルスキー改良培地（BTB乳糖寒天培地）を基礎培地とし、低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加して凝水抑制効果を調べた。
（１）培地の準備
以下の表９に示した培地成分４を秤量し、精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。滅菌後、５０℃に冷却した後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。なお、従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表９において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷを寒天Ｂと記載する。
以下の表９に示した培地成分４を秤量し、精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。滅菌後、５０℃に冷却した後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。なお、従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表９において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷを寒天Ｂと記載する。
（２）凝水量の測定
（１）で調製した培地入りシャーレを４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した。
なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につき１０枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（１）で調製した培地入りシャーレを４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した。
なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につき１０枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（３）結果
低分子量寒天ＳＷを添加した培地の平均凝水量を、低分子量寒天ＳＷを添加していない培地の平均凝水量と比較した凝水削減量および凝水削減率とともに表１０に示す。
低分子量寒天ＳＷを添加した培地の平均凝水量を、低分子量寒天ＳＷを添加していない培地の平均凝水量と比較した凝水削減量および凝水削減率とともに表１０に示す。
表１０に示した様に、ドリガルスキー改良培地（BTB乳糖寒天培地）を基礎培地とした場合も、低分子量寒天ＳＷの添加による凝水抑制効果が認められた。
（カンジダ鑑別用寒天培地における凝水試験）
カンジダ鑑別用寒天培地を基礎培地とし、低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加して凝水抑制効果を調べた。
カンジダ鑑別用寒天培地を基礎培地とし、低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加して凝水抑制効果を調べた。
（１）培地の準備
以下の表１１に示した培地成分５を秤量し、精製水に懸濁後、１００℃で４０分間加温溶解した。５０℃に冷却した後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。なお、従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表１１において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷを寒天Ｂと記載する。
以下の表１１に示した培地成分５を秤量し、精製水に懸濁後、１００℃で４０分間加温溶解した。５０℃に冷却した後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。なお、従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表１１において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷを寒天Ｂと記載する。
（２）凝水量の測定
（１）で調製した培地入りシャーレを４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した。
なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につき１０枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（１）で調製した培地入りシャーレを４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した。
なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につき１０枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（３）結果
低分子量寒天ＳＷを添加した培地の平均凝水量を、低分子量寒天ＳＷを添加していない培地の平均凝水量と比較した凝水削減量および凝水削減率とともに表１２に示す。
低分子量寒天ＳＷを添加した培地の平均凝水量を、低分子量寒天ＳＷを添加していない培地の平均凝水量と比較した凝水削減量および凝水削減率とともに表１２に示す。
表１２に示した様に、カンジダ鑑別用寒天培地を基礎培地とした場合も、低分子量寒天ＳＷの添加による凝水抑制効果が認められた。
（低分子量寒天の種類の検討１）
羊血液寒天培地を基礎培地とし、低分子量寒天であるＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）またはウルトラ寒天ＢＸ－３０（伊那食品工業株式会社製、重量平均分子量：２万～５万程度、ゼリー強度：３０～６０ｇ／ｃｍ２）を添加して凝水抑制効果を調べた。
羊血液寒天培地を基礎培地とし、低分子量寒天であるＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）またはウルトラ寒天ＢＸ－３０（伊那食品工業株式会社製、重量平均分子量：２万～５万程度、ゼリー強度：３０～６０ｇ／ｃｍ２）を添加して凝水抑制効果を調べた。
（１）培地の準備
以下の表１３に示した培地成分６を秤量し、以下の（２）で羊血液を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表１３において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷまたはウルトラ寒天ＢＸ－３０を寒天Ｂと記載する。
以下の表１３に示した培地成分６を秤量し、以下の（２）で羊血液を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表１３において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷまたはウルトラ寒天ＢＸ－３０を寒天Ｂと記載する。
（２）羊血液の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め無菌的に採取した羊脱繊維血液を、培地１Ｌ当たり５０ｍＬとなるように添加した。その後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め無菌的に採取した羊脱繊維血液を、培地１Ｌ当たり５０ｍＬとなるように添加した。その後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
（３）凝水量の測定
（１）、（２）で調製した培地入りシャーレを４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した。
なお、低分子量寒天の各添加量につき９枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（１）、（２）で調製した培地入りシャーレを４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した。
なお、低分子量寒天の各添加量につき９枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（４）培地のゼリー強度の測定
（１）、（２）で調製した培地を上記（３）の凝水量測定用のものとは別に用意し、２０℃の恒温槽にて２０時間保存した後、レオメーター（ＦＵＤＯＨ ＲＨＥＯ ＭＥＴＥＲ ＲＴＣ－３００２Ｄ）（株式会社レイテック製）の測定部が培地に１ｍｍ侵入する強度をゼリー強度として測定した。なお、低分子量寒天の各添加量につきシャーレ１枚をゼリー強度測定の対象とし、１枚のシャーレの３箇所を測定して平均値をゼリー強度として算出した。
（１）、（２）で調製した培地を上記（３）の凝水量測定用のものとは別に用意し、２０℃の恒温槽にて２０時間保存した後、レオメーター（ＦＵＤＯＨ ＲＨＥＯ ＭＥＴＥＲ ＲＴＣ－３００２Ｄ）（株式会社レイテック製）の測定部が培地に１ｍｍ侵入する強度をゼリー強度として測定した。なお、低分子量寒天の各添加量につきシャーレ１枚をゼリー強度測定の対象とし、１枚のシャーレの３箇所を測定して平均値をゼリー強度として算出した。
（５）結果
培地の凝水量およびゼリー強度の測定結果を表１４に示す。凝水量の測定結果は、寒天Ｂ（低分子量寒天ＳＷまたはウルトラ寒天ＢＸ－３０）の各添加量における平均凝水量を、寒天Ｂを添加していない培地の平均凝水量と比較した凝水削減量および凝水削減率とともに表示し、また、ゼリー強度は、寒天Ｂを添加していない培地のゼリー強度からの上昇値とともに表示している。
培地の凝水量およびゼリー強度の測定結果を表１４に示す。凝水量の測定結果は、寒天Ｂ（低分子量寒天ＳＷまたはウルトラ寒天ＢＸ－３０）の各添加量における平均凝水量を、寒天Ｂを添加していない培地の平均凝水量と比較した凝水削減量および凝水削減率とともに表示し、また、ゼリー強度は、寒天Ｂを添加していない培地のゼリー強度からの上昇値とともに表示している。
表１４に示した様に、低分子量寒天ＳＷを添加した場合、ウルトラ寒天ＢＸ－３０を添加した場合ともに良好な凝水抑制効果が認められた。また、ウルトラ寒天ＢＸ－３０は、培地１Ｌ当たりの添加量が４ｇ、５ｇの場合もゼリー強度の上昇値が１０ｇ／ｃｍ２と小さいため、この程度の添加濃度では発育した菌のコロニー形成状態（拡がり状態）には影響しないと考えられた。
（低分子量寒天の種類の検討２）
羊血液寒天培地を基礎培地とし、低分子量寒天であるＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）、ウルトラ寒天ＢＸ－３０（伊那食品工業株式会社製、重量平均分子量：２万～５万程度、ゼリー強度：３０～６０ｇ／ｃｍ２）またはウルトラ寒天ＢＸ－１００（伊那食品工業株式会社製、重量平均分子量：７万～１０万程度、ゼリー強度：１００～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加して凝水抑制効果を調べた。
羊血液寒天培地を基礎培地とし、低分子量寒天であるＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）、ウルトラ寒天ＢＸ－３０（伊那食品工業株式会社製、重量平均分子量：２万～５万程度、ゼリー強度：３０～６０ｇ／ｃｍ２）またはウルトラ寒天ＢＸ－１００（伊那食品工業株式会社製、重量平均分子量：７万～１０万程度、ゼリー強度：１００～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加して凝水抑制効果を調べた。
（１）培地の準備
以下の表１５に示した培地成分７を秤量し、以下の（２）で羊血液を添加した後の培地量が２Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表１５において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷ、ウルトラ寒天ＢＸ－３０またはウルトラ寒天ＢＸ－１００を寒天Ｂと記載する。
以下の表１５に示した培地成分７を秤量し、以下の（２）で羊血液を添加した後の培地量が２Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表１５において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷ、ウルトラ寒天ＢＸ－３０またはウルトラ寒天ＢＸ－１００を寒天Ｂと記載する。
（２）羊血液の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め無菌的に採取した羊脱繊維血液を、培地１Ｌ当たり５０ｍＬとなるように添加した。その後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め無菌的に採取した羊脱繊維血液を、培地１Ｌ当たり５０ｍＬとなるように添加した。その後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
（３）凝水量の測定
（１）、（２）で調製した培地入りシャーレを４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した。
なお、低分子量寒天の各添加量につき１０枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（１）、（２）で調製した培地入りシャーレを４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した。
なお、低分子量寒天の各添加量につき１０枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（４）培地のゼリー強度の測定
（１）、（２）で調製した培地を上記（３）の凝水量測定用のものとは別に用意し、２０℃の恒温槽にて２０時間保存した後、レオメーター（ＦＵＤＯＨ ＲＨＥＯ ＭＥＴＥＲ ＲＴＣ－３００２Ｄ）（株式会社レイテック製）の測定部が培地に１ｍｍ侵入する強度をゼリー強度として測定した。なお、低分子量寒天の各添加量につきシャーレ１枚をゼリー強度測定の対象とし、１枚のシャーレの３箇所を測定して平均値をゼリー強度として算出した。
（１）、（２）で調製した培地を上記（３）の凝水量測定用のものとは別に用意し、２０℃の恒温槽にて２０時間保存した後、レオメーター（ＦＵＤＯＨ ＲＨＥＯ ＭＥＴＥＲ ＲＴＣ－３００２Ｄ）（株式会社レイテック製）の測定部が培地に１ｍｍ侵入する強度をゼリー強度として測定した。なお、低分子量寒天の各添加量につきシャーレ１枚をゼリー強度測定の対象とし、１枚のシャーレの３箇所を測定して平均値をゼリー強度として算出した。
（５）結果
培地の凝水量およびゼリー強度の測定結果を表１６に示す。凝水量の測定結果は、寒天Ｂ（低分子量寒天ＳＷ、ウルトラ寒天ＢＸ－３０またはウルトラ寒天ＢＸ－１００）の各添加量における平均凝水量を、寒天Ｂを添加していない培地の平均凝水量と比較した凝水削減量および凝水削減率とともに表示し、また、ゼリー強度は、寒天Ｂを添加していない培地のゼリー強度からの上昇値とともに表示している。
培地の凝水量およびゼリー強度の測定結果を表１６に示す。凝水量の測定結果は、寒天Ｂ（低分子量寒天ＳＷ、ウルトラ寒天ＢＸ－３０またはウルトラ寒天ＢＸ－１００）の各添加量における平均凝水量を、寒天Ｂを添加していない培地の平均凝水量と比較した凝水削減量および凝水削減率とともに表示し、また、ゼリー強度は、寒天Ｂを添加していない培地のゼリー強度からの上昇値とともに表示している。
表１６に示した様に、低分子量寒天ＳＷを添加した場合、ウルトラ寒天ＢＸ－３０を添加した場合、ウルトラ寒天ＢＸ－１００を添加した場合ともに良好な凝水抑制効果が認められた。また、ウルトラ寒天ＢＸ－３０、ウルトラ寒天ＢＸ－１００は培地１Ｌ当たりの添加量が４ｇの場合もゼリー強度の上昇値がそれぞれ１０ｇ／ｃｍ２、２０ｇ／ｃｍ２と小さいため、この程度の添加濃度では発育した菌のコロニー形成状態（拡がり状態）には影響しないと考えられた。
（低分子量寒天添加培地の経時変化試験２）
羊血液寒天培地を基礎培地とし、低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加して調製後、１０℃、倒置にて３．５ヶ月保存した培地における凝水試験を行った。
羊血液寒天培地を基礎培地とし、低分子量寒天ＳＷ（ＳＳＫセールス株式会社製、重量平均分子量：約１０万、ゼリー強度：１４０～１５０ｇ／ｃｍ２）を添加して調製後、１０℃、倒置にて３．５ヶ月保存した培地における凝水試験を行った。
（１）培地の準備
以下の表１７に示した培地成分８を秤量し、以下の（２）で羊血液を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表１７において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷを寒天Ｂと記載する。
以下の表１７に示した培地成分８を秤量し、以下の（２）で羊血液を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。従来の微生物培養用の寒天と低分子量寒天を区別するため、表１７において、従来の微生物培養用の寒天を寒天Ａ、低分子量寒天ＳＷを寒天Ｂと記載する。
（２）羊血液の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め無菌的に採取した羊脱繊維血液を、培地１Ｌ当たり５０ｍＬとなるように添加した。その後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め無菌的に採取した羊脱繊維血液を、培地１Ｌ当たり５０ｍＬとなるように添加した。その後、培地を１８ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
（３）凝水量の測定
（１）、（２）で調製した培地入りシャーレを１０℃、倒置にて３．５ヶ月保存した（培地調製日、保存開始日とも２０１７年６月１３日）。その後、４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した（凝水量測定日は２０１７年９月２７日）。
なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につき９枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（１）、（２）で調製した培地入りシャーレを１０℃、倒置にて３．５ヶ月保存した（培地調製日、保存開始日とも２０１７年６月１３日）。その後、４℃、倒置にて２０時間保存した後、２５℃、倒置にてシャーレを３０分間放置し、その後、培地入りシャーレの重量を電子天秤にて測定した。続いてシャーレを縦置きにして３０分間放置して培地表面に滲み出た水を濾紙によって拭き取った後、再び培地入りシャーレの重量を測定し、（滲み出た水の拭き取り前のシャーレの重量）－（滲み出た水を拭き取った後のシャーレの重量）を凝水量として算出した（凝水量測定日は２０１７年９月２７日）。
なお、低分子量寒天ＳＷの各添加量につき９枚のシャーレを凝水試験対象とし、重量の測定はシャーレ１枚毎に行った。
（４）結果
培地の凝水量の測定結果を表１８に示す。
培地の凝水量の測定結果を表１８に示す。
表１８に示した様に、１０℃にて３．５ヶ月保存後において、低分子量寒天ＳＷの添加培地の凝水量は、良好に抑制されていた。
本発明による微生物培養用の固体培地は、固化成分として従来の微生物培養用の寒天に加えて、重量平均分子量が２万～１５万である低分子量寒天を使用することにより培地表面をコロニー形成に適切な状態に保ち、凝水を抑制可能である。また、特別な操作を要することなく、容易に培地を製造することができる。そのため、本発明の固体培地は、臨床をはじめ、食品、環境などの幅広い領域において有用である。
Claims (6)
- 少なくとも以下の（ａ）および（ｂ）を固化成分として含有すること、並びに、
基礎培地が普通寒天培地、標準寒天培地、トリプトソイ寒天培地（SCD寒天培地）、血液寒天培地、チョコレート寒天培地、マンニット食塩培地、エッグヨーク食塩寒天培地、スタフィロコッカスＮｏ．１１０培地、マッコンキー寒天培地、CT-SMAC寒天培地、ドリガルスキー寒天培地（DRIG培地）、ドリガルスキー改良培地（BTB乳糖寒天培地）、デスオキシコーレイト寒天培地、DHL寒天培地、ハートインフュジョン寒天培地、ブレインハートインフュジョン寒天培地、SSB寒天培地、サルモネラ・シゲラ寒天培地(SS寒天培地)、TCBS寒天培地、ビブリオ寒天培地、TSI寒天培地、クリグラー寒天培地、アルギニン・グリセロール・塩類寒天培地（AGS寒天培地）、ベアードパーカー寒天培地、NAC寒天培地、スキロー培地、NGKG寒天培地、ミュラーヒントン寒天培地、サブロー寒天培地、ポテトデキストロース寒天培地およびカンジダ鑑別用寒天培地からなる群より選択されることを特徴とする、微生物の培養に用いる固体培地。
（ａ）重量平均分子量が３０万～４５万である寒天、
（ｂ）重量平均分子量が１５万以下である低分子量寒天。 - 基礎培地が普通寒天培地、血液寒天培地、チョコレート寒天培地、ドリガルスキー改良培地（BTB乳糖寒天培地）、ハートインフュジョン寒天培地、サブロー寒天培地およびカンジダ鑑別用寒天培地からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の固体培地。
- 微生物の培養に用いる固体培地の製造方法であって、固化成分として以下の（ａ）および（ｂ）を使用すること、並びに、
基礎培地が普通寒天培地、標準寒天培地、トリプトソイ寒天培地（SCD寒天培地）、血液寒天培地、チョコレート寒天培地、マンニット食塩培地、エッグヨーク食塩寒天培地、スタフィロコッカスＮｏ．１１０培地、マッコンキー寒天培地、CT-SMAC寒天培地、ドリガルスキー寒天培地（DRIG培地）、ドリガルスキー改良培地（BTB乳糖寒天培地）、デスオキシコーレイト寒天培地、DHL寒天培地、ハートインフュジョン寒天培地、ブレインハートインフュジョン寒天培地、SSB寒天培地、サルモネラ・シゲラ寒天培地(SS寒天培地)、TCBS寒天培地、ビブリオ寒天培地、TSI寒天培地、クリグラー寒天培地、アルギニン・グリセロール・塩類寒天培地（AGS寒天培地）、ベアードパーカー寒天培地、NAC寒天培地、スキロー培地、NGKG寒天培地、ミュラーヒントン寒天培地、サブロー寒天培地、ポテトデキストロース寒天培地およびカンジダ鑑別用寒天培地からなる群より選択されることを特徴とする固体培地の製造方法。
（ａ）重量平均分子量が３０万～４５万である寒天、
（ｂ）重量平均分子量が１５万以下である低分子量寒天。 - 基礎培地が普通寒天培地、血液寒天培地、チョコレート寒天培地、ドリガルスキー改良培地（BTB乳糖寒天培地）、ハートインフュジョン寒天培地、サブロー寒天培地およびカンジダ鑑別用寒天培地からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３に記載の固体培地の製造方法。
- 請求項１または２に記載の固体培地を４℃～２５℃で保存する工程を含む、微生物の培養に用いる固体培地の保存方法。
- 微生物の培養に用いる培地を請求項１または２に記載の固体培地とすることを特徴とする、培地の凝水を抑制するための方法。
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